再生醫(yī)學(xué)Westernblot技術(shù)員崗位考試試卷及答案一、單項選擇題（每題2分，共10題，20分）1.Westernblot中封閉的目的是（）A.增強(qiáng)抗體結(jié)合B.減少非特異性結(jié)合C.提高蛋白活性D.標(biāo)記蛋白答案：B2.轉(zhuǎn)膜時常用的膜是（）A.濾紙B.醋酸纖維素膜C.PVDF膜D.玻璃纖維膜答案：C3.用于檢測蛋白條帶的化學(xué)發(fā)光底物是（）A.DABB.魯米諾C.伊紅D.蘇木精答案：B4.蛋白質(zhì)樣品在進(jìn)行SDS前需要進(jìn)行（）處理。A.離心B.加熱變性C.透析D.超濾答案：B5.SDS在SDS中的作用是（）A.分離蛋白B.使蛋白帶上負(fù)電荷C.調(diào)節(jié)pHD.穩(wěn)定緩沖液答案：B6.一抗孵育的溫度通常是（）A.4℃B.37℃C.25℃D.60℃答案：A7.考馬斯亮藍(lán)染色的作用是（）A.檢測核酸B.檢測蛋白C.檢測多糖D.檢測脂肪答案：B8.通常用于配制分離膠的試劑是（）A.丙烯酰胺B.甲叉雙丙烯酰胺C.A和BD.過硫酸銨答案：C9.Westernblot實驗中，加樣順序是（）A.蛋白marker、樣品B.樣品、蛋白markerC.隨意D.先加緩沖液答案：A10.封閉液中常用的成分是（）A.BSAB.葡萄糖C.氯化鈉D.乙醇答案：A二、多項選擇題（每題2分，共10題，20分）1.Westernblot實驗中需要用到的儀器有（）A.電泳儀B.轉(zhuǎn)膜儀C.成像系統(tǒng)D.離心機(jī)答案：ABCD2.以下哪些是影響Westernblot結(jié)果的因素（）A.抗體質(zhì)量B.蛋白上樣量C.轉(zhuǎn)膜效率D.封閉時間答案：ABCD3.轉(zhuǎn)膜過程中可能出現(xiàn)的問題有（）A.轉(zhuǎn)膜不完全B.膜上有氣泡C.電流過大D.緩沖液滲漏答案：ABCD4.用于蛋白上樣緩沖液的成分有（）A.SDSB.甘油C.溴酚藍(lán)D.DTT答案：ABCD5.選擇一抗時需要考慮的因素有（）A.種屬來源B.特異性C.效價D.克隆性答案：ABCD6.二抗選擇需要注意（）A.與一抗種屬匹配B.標(biāo)記物C.濃度D.保存條件答案：ABC7.蛋白質(zhì)樣品制備過程中可能用到的方法有（）A.超聲破碎B.研磨C.化學(xué)裂解D.離心答案：ABC8.SDS膠的組成成分包括（）A.分離膠B.濃縮膠C.緩沖液D.催化劑答案：ABCD9.顯色方法有（）A.化學(xué)發(fā)光法B.底物顯色法C.熒光法D.放射性標(biāo)記法答案：ABC10.Westernblot實驗中的對照有（）A.陽性對照B.陰性對照C.空白對照D.內(nèi)參對照答案：ABD三、判斷題（每題2分，共10題，20分）1.Westernblot可以檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)量和分子量。（）答案：對2.轉(zhuǎn)膜時間越長越好。（）答案：錯3.一抗可以反復(fù)使用。（）答案：對4.SDS只能分離蛋白質(zhì)。（）答案：錯5.封閉時間過短會導(dǎo)致非特異性條帶增多。（）答案：對6.化學(xué)發(fā)光檢測比底物顯色檢測更靈敏。（）答案：對7.蛋白樣品可以長期保存在室溫。（）答案：錯8.二抗的濃度對結(jié)果沒有影響。（）答案：錯9.考馬斯亮藍(lán)染色可以區(qū)分不同的蛋白質(zhì)。（）答案：錯10.Westernblot實驗中不需要考慮實驗環(huán)境。（）答案：錯四、簡答題（每題5分，共4題，20分）1.簡述Westernblot的基本原理。答案：利用SDS分離不同分子量蛋白質(zhì)，通過轉(zhuǎn)膜將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到固相膜上，用封閉液封閉膜上非特異性結(jié)合位點，依次與一抗、二抗孵育，二抗標(biāo)記物與底物反應(yīng)顯色，根據(jù)條帶位置和強(qiáng)度分析蛋白分子量和表達(dá)量。2.轉(zhuǎn)膜過程中需要注意哪些問題？答案：要注意膜與凝膠的貼合，避免有氣泡；控制好轉(zhuǎn)膜電流和時間，電流過大易發(fā)熱影響轉(zhuǎn)膜效果，時間不足則轉(zhuǎn)膜不完全；緩沖液要足量且成分正確；轉(zhuǎn)膜裝置要安裝正確，防止短路。3.如何選擇合適的一抗？答案：首先考慮種屬來源，確保與待檢測樣本匹配；關(guān)注抗體特異性，保證能準(zhǔn)確識別目標(biāo)蛋白；查看效價，選擇效價高的抗體以保證檢測靈敏度；還需留意克隆性，單克隆抗體特異性強(qiáng)，多克隆抗體親和力高，根據(jù)需求選擇。4.簡述SDS在SDS中的作用。答案：SDS即十二烷基硫酸鈉，能與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上大量負(fù)電荷，掩蓋其原本電荷性質(zhì)，消除電荷差異對蛋白質(zhì)遷移率的影響，使蛋白質(zhì)在電場中僅依據(jù)分子量大小進(jìn)行分離，從而實現(xiàn)對不同分子量蛋白質(zhì)的有效分離。五、討論題（每題5分，共4題，20分）1.若Westernblot結(jié)果出現(xiàn)雜帶過多，可能的原因有哪些及如何解決？答案：原因可能是封閉不充分，可延長封閉時間或更換封閉液；抗體濃度過高或特異性差，需調(diào)整抗體濃度或更換抗體；樣本處理不當(dāng)，有蛋白降解，要優(yōu)化樣本制備流程，加蛋白酶抑制劑。解決時應(yīng)逐一排查，重新實驗驗證。2.在Westernblot實驗中，內(nèi)參的作用是什么，如何選擇合適的內(nèi)參？答案：內(nèi)參用于校正上樣量，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性，消除加樣誤差和蛋白總量差異對結(jié)果的影響。選擇內(nèi)參要考慮其在樣本中穩(wěn)定表達(dá)，與目標(biāo)蛋白分子量有差異以便區(qū)分，且抗體質(zhì)量可靠，常用的有GAPDH、β-actin等。3.對比化學(xué)發(fā)光法和底物顯色法在Westernblot中的優(yōu)缺點。答案：化學(xué)發(fā)光法優(yōu)點是靈敏度高，能檢測到低表達(dá)蛋白，線性范圍寬，成像快；缺點是試劑較貴，需暗室操作，發(fā)光信號持續(xù)時間有限。底物顯色法優(yōu)點是操作簡單，成本低，結(jié)果可長期保存；缺點是靈敏度低，線性范圍窄，背景可能較高。4.如何提高Westernblot實驗結(jié)果的重復(fù)性？