第八章抑菌效力檢查第一節(jié)概述第二節(jié)藥品抑菌效力檢查法目錄第八章抑菌效力檢查學(xué)習目標第八章抑菌效力檢查掌握

掌握抑菌劑、抑菌效力檢查的概念；

抑菌效力檢查結(jié)果的判斷標準。

了解了解抑菌效力檢查的原理和意義；

抑菌效力檢查的相關(guān)要求。學(xué)會

抑菌效力檢查方法。概述第一節(jié)第八章抑菌效力檢查第一節(jié)概述1.抑菌劑的概念抑菌劑是指能夠抑制微生物生長繁殖的化學(xué)物質(zhì)，有時也稱為防腐劑。2.抑菌劑的作用抑制藥品中的微生物，防止藥品因微生物的作用而變質(zhì)。3.常見的抑菌劑苯甲酸與苯甲酸鈉、對羥基苯甲酸酯類、山梨酸與山梨酸鉀等。一.抑菌效力檢查的概念某些藥物中的抑菌劑第一節(jié)概述抑菌劑都具有一定的毒性，為保證用藥全，成品制劑中的抑菌劑有效濃度應(yīng)低于對人體的有害濃度。而對于供靜脈或椎管用注射液，除特殊規(guī)定外，一般均不得加入抑菌劑。抑菌劑的合理使用第一節(jié)概述4.抑菌效力檢查的概念

抑菌效力檢查法系用于測定無菌及非無菌制劑中抑菌劑的抑菌活性，該檢查應(yīng)按照《中國藥典》（2015年版）抑菌效力檢查法（通則1121）的有關(guān)要求進行。主要環(huán)節(jié)包括供試菌菌夜制備、方法適用性檢查、供試品接種、存活菌數(shù)測定、標準及結(jié)果判斷。對于加入抑菌劑的藥物制劑，在生產(chǎn)與貯存期間應(yīng)該符合抑菌效力檢查的有關(guān)要求。第一節(jié)概述1.抑菌效力檢查的原理

抑菌效力檢查是采用微生物法進行，供試品中含有的抑菌劑會對加入其中的微生物產(chǎn)生抑制作用，時間越長抑制作用越強，存活的微生物數(shù)量越少。抑菌效力檢查是采用微生物法進行。用嚴格的無菌操作法，制備試驗菌株新鮮培養(yǎng)物，然后再經(jīng)過稀釋制成濃度適宜的菌懸液或孢子懸液，按照一定的接種量接種于適量的供試品中，置于適宜溫度下培養(yǎng)，按照規(guī)定的時間間隔，分別從供試品中取樣適量，接種于適合微生物生長的不同培養(yǎng)基中，以測定供試品中所含存活菌數(shù)。通過比較供試品在不同時間間隔中所含微生物數(shù)量的變化來判斷供試品是否會對試驗菌產(chǎn)生抑制作用而進行抑菌效力檢查。二.抑菌效力檢查的原理和意義第一節(jié)概述（2）抑菌效力檢查的意義

①在藥品的研發(fā)階段，無論是添加抑菌劑，還是藥物本身具有抗菌活性，都應(yīng)通過抑菌效力檢查確認其抗菌效力。②在藥品的生產(chǎn)階段，在藥物制劑的制備過程中要完全防止微生物污染是很困難的，通過加入適當?shù)囊志鷦┛梢杂行н_到抑菌防腐的目的。抑菌效力檢查可以幫助篩選和確定抑菌劑及其使用濃度。③在藥品的貯存階段，抑菌劑的效力可能因貯存時間、貯存條件、藥品包裝材料等因素發(fā)生變化，抑菌效力檢查可以檢查成品制劑的抑菌效力在有效期內(nèi)是否發(fā)生變化。藥品抑菌效力檢查方法第二節(jié)第八章抑菌效力檢查第二節(jié)藥品抑菌效力檢查方法1.培養(yǎng)基的制備（1）胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（2）胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（3）沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（4）沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體（瓊脂）培養(yǎng)基用于細菌的培養(yǎng)。沙氏葡萄糖液體（瓊脂）培養(yǎng)基用于真菌的培養(yǎng)。一.試驗前準備培養(yǎng)基除了按處方配制外，也可以采用按處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基或者成品培養(yǎng)基。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)該避光保存在2~25℃的環(huán)境中，若保存于非密閉容器中，一般在3周內(nèi)使用，若保存在密閉容器中，一般可在一年內(nèi)使用。第二節(jié)藥品抑菌效力檢查方法2.培養(yǎng)基適用性檢查（1）菌種試驗菌株試驗培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時間金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC(B)26003]胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基30~35℃18~24小時銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC(B)10104]胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基30~35℃18~24小時大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基30~35℃18~24小時白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC(F)98001]沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20~25℃24~48小時黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC(F)98003]沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20~25℃5~7天或直到獲得豐富孢子培養(yǎng)基適用性檢查、方法適用性試驗、抑菌效力測定用的試驗菌及新鮮培養(yǎng)物制備

第二節(jié)藥品抑菌效力檢查方法（2）稀釋液和沖洗液①0.1%無菌蛋白胨水溶液②pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液根據(jù)供試品的特性，可選用其他經(jīng)驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液（如0.9%無菌氯化鈉溶液）。如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后加人表面活性劑或中和劑等。第二節(jié)藥品抑菌效力檢查方法（3）菌液制備取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在2~8°C，可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2~8°C，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。第二節(jié)藥品抑菌效力檢查方法（4）培養(yǎng)基適用性檢查分別接種不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌的菌液至胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平板，混勻，水平靜置凝固，置于30~35°C培養(yǎng)不超過3天，計數(shù)；分別接種不大100cfu的白念珠菌、黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平板，混勻，水平靜置凝固，置于20~25°C培養(yǎng)不超過5天，計數(shù)；同時，用對應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。第二節(jié)藥品抑菌效力檢查方法（5）結(jié)果判定若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對照培養(yǎng)基上菌落平均數(shù)的70%，且菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基上的菌落一致，判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。第二節(jié)藥品抑菌效力檢查方法1.菌種二.抑菌效力檢查操作過程培養(yǎng)基適用性檢查、方法適用性試驗、抑菌效力測定用的試驗菌及新鮮培養(yǎng)物制備

試驗菌株試驗培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時間金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC(B)26003]胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基30~35℃18~24小時銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC(B)10104]胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基30~35℃18~24小時大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基30~35℃18~24小時白念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC(F)98001]沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20~25℃24~48小時黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC(F)98003]沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20~25℃5~7天或直到獲得豐富孢子第二節(jié)藥品抑菌效力檢查方法2.菌液制備取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在2~8°C，可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2~8°C，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。若需要，制劑中常見的污染微生物也可作為試驗菌株。第二節(jié)藥品抑菌效力檢查方法3.供試品接種取包裝完整的供試品至少5份，直接接種試驗菌，或取適量供試品分別轉(zhuǎn)移至5個適宜的無菌容器中（若試驗菌株數(shù)超過5株，應(yīng)增加相應(yīng)的供試品份數(shù)），每一容器接種一種試驗菌，1g或1ml供試品中接菌量為105~106cfu，接種菌液的體積不得超過供試品體積的1%，充分混合，使供試品中的試驗菌均勻分布，然后置20~25℃避光貯存。只要供試品每個包裝容器的裝量足夠試驗用，同時容器便于按無菌操作技術(shù)接入試驗菌液、混合及取樣等，一般應(yīng)將試驗菌直接接種于供試品原包裝容器中進行試驗。若因供試品的性狀或每個容器裝量等因素需將供試品轉(zhuǎn)移至無菌容器時，該容器的材質(zhì)不得影響供試品的特性(如吸附作用），特別應(yīng)注意不得影響供試品的pH，pH對抑菌劑的活性影響很大。第二節(jié)藥品抑菌效力檢查方法4.存活菌數(shù)測定根據(jù)產(chǎn)品類型，按照規(guī)定的間隔時間，分別從上述每個容器中取供試品1ml(g)，測定每份供試品中所含的菌數(shù)，測定細菌用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，測定真菌用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。計數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（MPN法）。應(yīng)根據(jù)供試品特性，如劑型、水溶性等選擇計數(shù)方法。根據(jù)存活菌數(shù)測定結(jié)果，計算1ml(g)供試品各試驗菌所加的菌數(shù)及各間隔時間的菌數(shù)，并換算成lg值。無論選擇哪種計數(shù)方法，都需要進行方法適用性檢查，以確認所采用的計數(shù)方法適合于該供試品的微生物計數(shù)。

不同類型的藥物制劑，其取樣的時間間隔不同。

第二節(jié)藥品抑菌效力檢查方法減少的lg值6h24h7d14d28d細菌A23——NRB—13—NI真菌A——2—NIB———1NI注射劑、眼用制劑、用于子宮和乳腺的制劑抑菌效力判斷標準

注：NR：試驗菌未恢復(fù)生長。

NI：未增加，是指對前一個測定時間，試驗菌增加的數(shù)量不超過0.5lg第二節(jié)藥品抑菌效力檢查方法耳用制劑、鼻用制劑、皮膚給藥制劑、吸入制劑抑菌效力判斷標準

注：NI：未增加，是指對前一個測定時間，試驗菌增加的數(shù)量不超過0.5lg減少的lg值2d7d14d28d細菌A23—NIB——3NI真菌A——2NIB——1NI第二節(jié)藥品抑菌效力檢查方法口服制劑、口腔黏膜制劑、直腸給藥制劑的抑菌效力判斷標準

注：NI：未增加，是指對前一個測定時間，試驗菌增加的數(shù)量不超過0.5lg減少的lg值14d28d細菌3NI真菌1NI第二節(jié)藥品抑菌效力檢查方法供試品抑菌效力評價標準，表中的“減少的lg值”是指各間隔時間測定的菌數(shù)lg值與1ml(g)供試品中接種的菌數(shù)lg值的相差值。表中“A”是指應(yīng)達到的抑菌效力標準，特殊情況下，如抑菌劑可能增加不良反應(yīng)的風險，則至少應(yīng)達到“B”的抑菌效力標準。三.結(jié)果判斷第二節(jié)藥品抑菌效力檢查方法抑菌效力檢查的主要操作過程第二節(jié)藥品抑菌效力檢查方法1.抑菌效力檢查法用于包裝未開啟的成品制劑。供試品檢驗之前應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴禁開啟，包裝已開啟的樣品不得作為供試品。2.在抑菌效力檢查試驗中，涉及微生物的接種、培養(yǎng)、稀釋、計數(shù)等試驗操作，所以，抑菌效力檢查試驗應(yīng)嚴格無菌操作。3.除另有規(guī)定外，抑菌效力檢查法中細菌的培養(yǎng)溫度為