實時熒光定量PCR

技術(shù)在腫瘤分子病理檢測中的應用樣本選擇與前處理檢測流程與結(jié)果分析質(zhì)量控制常見問題與處理建議Contents

目

錄樣本選擇與前處理強烈推薦使用手術(shù)切除組織或活檢組織

FFPE樣

本在腫瘤分子病理檢測中，應優(yōu)先選擇手術(shù)

切除組織或活檢組織的福爾馬林固定石蠟

包埋樣本，以確保檢測結(jié)果的準確性和可

靠

性

。外周血等體液樣本作為最后選擇若組織和細胞學樣本均不可及，則推薦使

用外周血等體液樣本進行循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)

突變檢測，但需注意假陰性

風

險

。細胞學樣本作為替代選擇當無法及時獲取手術(shù)切除組織或活檢組織

時，可選用細胞學樣本進行檢測，尤其是

制備成細胞蠟塊后，其處理及檢測方式與

組織樣本相似。020301手術(shù)切除組織或活檢組織推薦對于質(zhì)控合格的細胞學樣本，可涂片

或液基細胞學制片，鏡下評估腫瘤細

胞數(shù)量及比例。強烈推薦將細胞學樣本制備成細胞蠟塊，使用4%中性甲醛或95%乙醇固定液進行固定。細胞學樣本的制備和保存細胞蠟塊制備

涂片與液基制片漿膜腔積液離心處理外周血ctDNA的定義與重要性循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA

)

是從血液中

檢測到的來自腫瘤細胞的DNA

片

段

，

對癌癥的早期診斷和治療監(jiān)測具有重

要意義。外周血ctDNA突變檢測的優(yōu)勢利

用qPCR

技術(shù)對外周血中的ctDNA

進

行突變檢測，具有操作簡便、耗時短

、靈敏度高的優(yōu)點，適用于無法獲取

組織樣本的情況。外周血ctDNA的采樣方法通過使用含有游離DNA保護劑和防細

胞裂解劑的專用采血管采集不少于10ml

的全血，然后進行血漿分離以提取

ctDNA。外周血ctDNA突變檢測檢測流程與結(jié)果分析吸附柱法

01吸附柱法利用特殊材料吸附核酸，適用于大多數(shù)樣本類型。磁珠法

02磁珠法通過磁性顆粒捕獲核酸，適合高純度核酸提取。商品化試劑盒與自建試劑選擇

03推薦使用經(jīng)NMPA

注冊/備案的商品化試劑盒，確保性能穩(wěn)定。核酸提取方法的選擇qPCR檢測與結(jié)果分析核酸提取與質(zhì)量評估核酸的質(zhì)量和純度是qPCR

檢測結(jié)

果準確可靠的基礎(chǔ)。推薦使用紫外分光光度計進行檢測，確保DNA

和RNA

的A260/280比值在規(guī)

定范圍內(nèi)。qPCR

檢測流程與結(jié)果分析強烈推薦采用經(jīng)NMPA

注冊/備案的商品化試劑盒進行qPCR

檢

測

，

并根據(jù)試劑盒說明書和實驗室實

際情況建立SOP。

加樣時避免氣

泡和核酸機械損傷，擴增完成后

先確認陰性質(zhì)控和陽性/弱陽性

質(zhì)控是否在控，再分析樣本檢測

結(jié)果。檢測報告出具各醫(yī)療機構(gòu)應根據(jù)實際情況，設(shè)

置符合規(guī)范的結(jié)果報告模版，由

病理醫(yī)師和分子檢測人員協(xié)同及

時、準確地完成分子病理診斷報

告，為患者診療提供參考。患者及樣本信息報告應包括患者的姓名、性別、年齡等基本信息，以及樣本來源、接收時間

和病理質(zhì)控信息。檢測項目與方法報告需明確指出檢測的基因變異位點，使用的qPCR

試劑盒及其性能參數(shù)，

如敏感度和特異度。檢測結(jié)果與局限性說明報告應詳細列出檢測到的基因變異位點和結(jié)果，同時注明檢測的責任范圍及

可能存在的局限性。檢測報告內(nèi)容及審核質(zhì)量控制試劑性能驗證01準確度驗證通過使用標準品和已知結(jié)果的臨床樣本進

行驗證，評估陽性符合率和陰性符合率。03精密度驗證包括重復性和重現(xiàn)性兩個方面，使用一定

數(shù)量的臨床樣本或標準品在不同條件下進

行多次檢測。02檢出限驗證使用已知濃度的標準品進行梯度稀釋至檢

出限濃度，重復測定多次，以確認穩(wěn)定性失控分析與糾正措施當室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果失控時，需立即進行

失控分析并采取相應的糾正和預防措

施，防止問題再次發(fā)生。質(zhì)控品的選擇和使用室內(nèi)質(zhì)控品應選擇商品化或自制質(zhì)控

品，確保其制備和驗證程序及記錄的

完整性。質(zhì)控品的分裝與保存質(zhì)控品在使用時應注意分裝，避免反

復凍融，以保證檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和

準確性。室內(nèi)質(zhì)控的實施定期參加室間質(zhì)評并通過評估，可

增強實驗室在行業(yè)內(nèi)的信譽和認可

度。提升實驗室信譽通過參加室間質(zhì)評，實驗室可以驗

證自身檢測結(jié)果的一致性和準確性提高檢測一致性識別并糾正偏差室間質(zhì)評幫助實驗室發(fā)現(xiàn)檢測方法中

的系統(tǒng)偏差，及時進行修正。室間質(zhì)評的重要性常見問題與處理建議樣本質(zhì)量問題的解決010203二腫瘤細胞含量評估對于FFPE樣本，應使用病理醫(yī)

師評估腫瘤細胞含量不少于200

個且占比不低于20%,避免使用

強酸脫鈣處理后的樣本。核酸提取過程優(yōu)化核酸提取過程中操作不規(guī)范，如

脫蠟不徹底、乙醇揮發(fā)不徹底等

,均會影響qPCR

檢測的準確性。保存年限和前處理樣本前處理不當或保存年限過長

,會導致提取的核酸質(zhì)量不佳，

影響qPCR

檢測?？赡苌婕皟x器、耗材、試劑及實驗

流程等方面問題，需要詳細檢查和

調(diào)整實驗設(shè)置。常見原因是污染和非特異性擴增，

需通過優(yōu)化實驗條件或更換試劑盒

進行解決?？赡苡蓪嶒炇噎h(huán)境不穩(wěn)定或PCR管

與儀器不匹配引起，需檢查并優(yōu)化

實驗環(huán)境及使用配套耗材。擴增曲線翹尾

擴增曲線下彎、彎折

部分孔位曲線異常擴增曲線異常的處理PCR

抑制物影響樣本中存在血紅素及其前體或降解產(chǎn)

物等PCR

抑制物，可能導致突變位點

Ct

值臨界或假陰性。同一批次鄰近樣本或連續(xù)多個樣