微生物檢驗相關(guān)操作規(guī)定一、概述

微生物檢驗是評估樣品中微生物含量、種類及活性狀態(tài)的重要技術(shù)手段，廣泛應用于食品、藥品、環(huán)境、生物制品等領(lǐng)域。為確保檢驗結(jié)果的準確性、可靠性和一致性，必須嚴格遵守相關(guān)操作規(guī)定。本文件旨在規(guī)范微生物檢驗的各個環(huán)節(jié)，包括樣品處理、培養(yǎng)基制備、接種操作、培養(yǎng)觀察、結(jié)果判定等，以保障檢驗過程的專業(yè)性和規(guī)范性。

二、樣品處理

（一）樣品采集

1.選擇具有代表性的樣品，避免污染。

2.使用無菌工具（如無菌鑷子、手套）進行操作。

3.樣品量應根據(jù)檢驗要求確定，通常為10g或10mL（食品、液體樣品）。

4.采集后立即密封，冷藏保存（溫度4℃±2℃）。

（二）樣品前處理

1.表面消毒：對固體樣品（如食品表面）用75%酒精擦拭消毒。

2.均質(zhì)化處理：將樣品剪碎或使用均質(zhì)器充分混勻。

3.制備稀釋液：按1:10、1:100等比例稀釋，使用無菌生理鹽水或緩沖液。

三、培養(yǎng)基制備

（一）培養(yǎng)基配方

1.常用培養(yǎng)基包括：營養(yǎng)瓊脂（NA）、麥康凱瓊脂（MAC）、TSB（胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）。

2.配方需符合國家標準（如GB/T4789系列），稱量誤差不超過±1%。

（二）制備步驟

1.按配方稱量培養(yǎng)基粉末，加入蒸餾水。

2.攪拌溶解后，分裝于滅菌容器（如三角瓶、試管）。

3.滅菌：高壓蒸汽滅菌（121℃，15-20分鐘）。

4.冷卻后備用（平板需傾注，凝固后倒置）。

四、接種與培養(yǎng)

（一）平板接種

1.使用無菌接種環(huán)或接種針。

2.根據(jù)樣品類型選擇劃線或點種法：

(1)劃線法：在平板表面三區(qū)劃線分離菌落。

(2)點種法：每皿接種≤100μL液體樣品。

（二）液體培養(yǎng)

1.將樣品稀釋液接種至TSB等液體培養(yǎng)基，搖勻。

2.37℃恒溫培養(yǎng)24-48小時。

（三）培養(yǎng)條件

1.溫度：37℃±1℃。

2.濕度：培養(yǎng)箱內(nèi)相對濕度≥95%。

3.時間：根據(jù)目標微生物生長周期調(diào)整（如細菌24-48小時）。

五、結(jié)果觀察與判定

（一）菌落計數(shù)

1.選擇30-300CFU（菌落形成單位）的平板進行計數(shù)。

2.使用平板計數(shù)法（PC法）或MPN（最可能數(shù)法）。

（二）菌落形態(tài)觀察

1.通過顯微鏡初步鑒定形態(tài)（如大小、顏色、邊緣）。

2.結(jié)合生化試驗（如氧化酶、糖發(fā)酵試驗）輔助鑒定。

（三）結(jié)果記錄

1.記錄菌落數(shù)量、形態(tài)、生長速度等關(guān)鍵指標。

2.繪制生長曲線或保存典型菌落照片。

六、質(zhì)量控制

（一）陽性對照

1.每批檢驗加入已知濃度標準菌（如大腸菌群）。

2.陽性對照必須生長良好，否則檢驗無效。

（二）陰性對照

1.不接種樣品的培養(yǎng)基，用于檢測污染。

2.陰性對照不得有菌落生長。

（三）重復性檢驗

1.對可疑結(jié)果進行二次驗證。

2.不同批次檢驗結(jié)果偏差應≤20%。

七、注意事項

1.操作全程佩戴口罩、手套，避免交叉污染。

2.培養(yǎng)基和工具使用后及時滅菌處理。

3.檢驗完畢后記錄設(shè)備清潔狀態(tài)，并填寫使用日志。

八、附錄

（一）常用培養(yǎng)基參考配方

1.營養(yǎng)瓊脂：蛋白胨3g，牛肉浸膏10g，NaCl5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。

2.麥康凱瓊脂：乳糖10g，蔗糖10g，蛋白胨10g，瓊脂13g，牛膽鹽10g，蒸餾水1000mL。

（二）標準操作流程（SOP）編號

1.樣品采集：SOP-QC-001

2.培養(yǎng)基滅菌：SOP-MY-002

3.接種操作：SOP-IN-003

本文件內(nèi)容需根據(jù)實際實驗室條件進行調(diào)整，并定期更新以符合行業(yè)規(guī)范。

一、概述

微生物檢驗是評估樣品中微生物含量、種類及活性狀態(tài)的重要技術(shù)手段，廣泛應用于食品、藥品、環(huán)境、生物制品等領(lǐng)域。為確保檢驗結(jié)果的準確性、可靠性和一致性，必須嚴格遵守相關(guān)操作規(guī)定。本文件旨在規(guī)范微生物檢驗的各個環(huán)節(jié)，包括樣品處理、培養(yǎng)基制備、接種操作、培養(yǎng)觀察、結(jié)果判定等，以保障檢驗過程的專業(yè)性和規(guī)范性。

二、樣品處理

（一）樣品采集

1.**選擇代表性樣品**：

-目標是采集能夠反映整體狀況的樣品。對于散裝物料，應從不同部位（上、中、下）和不同層次隨機抽取。例如，食品罐頭需從頂部、中部和底部取樣；環(huán)境樣品（如空氣）需在不同距離和高度布點采集。

-樣品量應根據(jù)檢驗目標和后續(xù)操作確定，一般固體樣品取10-20g，液體樣品取10-50mL。

2.**使用無菌工具**：

-佩戴無菌手套，使用一次性無菌鑷子、剪刀或探子。工具需在火焰（如酒精燈）上滅菌后冷卻使用。

-采樣容器必須滅菌（如高壓蒸汽滅菌121℃，15分鐘）或使用無菌袋/瓶。

3.**避免污染措施**：

-采樣前清潔手部并消毒，避免直接接觸樣品表面。

-操作應在清潔區(qū)域（如超凈工作臺）進行，空氣流動速度控制在0.3-0.5m/s。

4.**樣品保存與運輸**：

-立即密封樣品容器，使用防水、防漏包裝。

-液體樣品需冷藏（4℃±2℃），固體樣品可冷藏或避光保存。運輸時間應控制在2小時內(nèi)，特殊情況使用保溫箱。

（二）樣品前處理

1.**表面消毒**：

-對于帶包裝的固體樣品（如袋裝食品），需在無菌條件下打開包裝，用75%酒精或有效氯消毒液擦拭表面，晾干后取樣。

-環(huán)境樣品（如設(shè)備表面）用無菌棉簽蘸取消毒液擦拭，再用無菌生理鹽水潤洗棉簽并混勻。

2.**均質(zhì)化處理**：

-固體樣品：使用組織搗碎機、研缽或絞肉機破碎樣品，確保無大塊殘留。食品樣品（如肉類）需混合均勻，避免脂肪分離。

-液體樣品：充分搖晃混勻，或使用高速攪拌器（10000rpm，60秒）。

3.**稀釋液選擇與制備**：

-常用稀釋液：無菌生理鹽水（0.9%NaCl）、緩沖蛋白胨水（BPW）、胰酪大豆胨水（TSB）。

-按梯度稀釋：取10g/10mL樣品加入90mL/90mL稀釋液中，依次制備1:10、1:100、1:1000等稀釋液。

4.**選擇性稀釋**：

-根據(jù)預估污染水平，選擇合適稀釋倍數(shù)。例如，高污染樣品先1:10稀釋，低污染樣品直接1:100稀釋。

三、培養(yǎng)基制備

（一）培養(yǎng)基配方

1.**通用培養(yǎng)基**：

-營養(yǎng)瓊脂（NA）：蛋白胨3g，牛肉浸膏10g，NaCl5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。用于通用菌落培養(yǎng)。

-麥康凱瓊脂（MAC）：乳糖10g，蔗糖10g，蛋白胨10g，瓊脂13g，牛膽鹽10g，膽汁酸納1g，蒸餾水1000mL。用于腸桿菌科選擇性培養(yǎng)。

2.**特殊培養(yǎng)基**：

-血瓊脂：NA基礎(chǔ)+10%新鮮血液。用于快idious菌（如鏈球菌）培養(yǎng)。

-厭氧培養(yǎng)基：含還原劑（如硫乙醇酸鹽）和維生素（如葉酸）。用于厭氧菌培養(yǎng)。

（二）制備步驟

1.**稱量與溶解**：

-精確稱量培養(yǎng)基粉末，加入蒸餾水。加熱攪拌至完全溶解（NA需煮沸1分鐘）。

-檢查pH值（常用培養(yǎng)基pH7.2-7.4，用pH計校準）。

2.**分裝與滅菌**：

-平板：每500mL分裝于三角瓶，加入15mL培養(yǎng)基。試管：按需分裝（如3mL/支）。

-高壓蒸汽滅菌：121℃，15-20分鐘（根據(jù)培養(yǎng)基體積調(diào)整時間）。

3.**冷卻與傾注**：

-滅菌后冷卻至45-50℃，傾注平板（每皿15-20mL）。

-傾注液體培養(yǎng)基后輕搖混勻。

4.**凝固與保存**：

-平板需倒置（防止冷凝水污染菌落），室溫凝固后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

-儲存時間：NA平板≤2周，MAC平板≤1周。

四、接種與培養(yǎng)

（一）平板接種

1.**直接劃線法**（用于分離純培養(yǎng)）：

-在超凈臺內(nèi)，將菌液滴加至平板表面。用接種環(huán)沿直徑劃三區(qū)：

(1)第一區(qū)：從滴點向外劃3-4條平行線。

(2)第二區(qū)：隔線橫劃第一區(qū)，相互垂直。

(3)第三區(qū)：重復第二區(qū)操作。

-每區(qū)結(jié)束后滅菌接種環(huán)，最后灼燒滅菌。

2.**傾注法**（用于計數(shù)或厭氧菌）：

-液體樣品取1mL加入無菌試管液體培養(yǎng)基，混勻后倒置培養(yǎng)。

-厭氧菌需用專用傾注杯，培養(yǎng)基冷卻后緩慢注入。

（二）液體培養(yǎng)

1.**接種量**：

-無菌移液器吸取1-5mL菌液加入TSB等液體培養(yǎng)基，混勻。

2.**培養(yǎng)條件**：

-振蕩：水平搖床180rpm，避免氣泡。

-厭氧培養(yǎng)：使用厭氧罐或?qū)Ｓ门囵B(yǎng)箱（氣體混合比：氫氣80%，氮氣10%，二氧化碳10%）。

（三）培養(yǎng)條件

1.**溫度控制**：

-常溫培養(yǎng)（如霉菌）：25℃±1℃。

-工業(yè)發(fā)酵：30-37℃±1℃。

2.**CO?濃度**：

-需氧菌：空氣。

-兼性厭氧菌：5%CO?（可用Na?CO?或NaHCO?調(diào)節(jié)）。

3.**培養(yǎng)時間**：

-厭氧菌：48-72小時。

-嗜冷菌：30℃培養(yǎng)7天。

五、結(jié)果觀察與判定

（一）菌落計數(shù)

1.**平板計數(shù)法（PC法）**：

-選擇30-300CFU的平板，記錄菌落數(shù)。計算公式：

CFU/mL=(N×稀釋倍數(shù))/樣品量

-復查：若相鄰兩皿計數(shù)差異＞30%，需重做。

2.**MPN法（最可能數(shù)法）**：

-按系列稀釋液接種至3管MPN管，培養(yǎng)后計算公式：

MPN/100mL=C×(1/r?+r?+r?)

其中C為陽性管稀釋倍數(shù)，r為陽性管序號。

（二）菌落形態(tài)觀察

1.**宏觀特征**：

-大?。褐睆?.5-2mm（葡萄球菌），2-5mm（大腸桿菌）。

-形態(tài)：圓形（典型）、類酵母形（霉菌）。

-顏色：黃色（金黃色葡萄球菌）、粉色（變形桿菌）。

-邊緣：整齊（葡萄球菌）、波狀（變形桿菌）。

2.**微觀特征**：

-顯微鏡×100-400倍觀察：球菌（鏈狀、葡萄狀）、桿菌（直/彎曲）。

（三）生化試驗

1.**氧化酶試驗**：

-用接種環(huán)蘸取菌液，滴加氧化酶試劑，30秒內(nèi)變紫為陽性。

2.**糖發(fā)酵試驗**：

-接種至含不同糖的TSI（三糖鐵瓊脂）或MR-VP（甲基紅/VP）管，觀察產(chǎn)氣、變色。

六、質(zhì)量控制

（一）陽性對照

1.**目的**：驗證培養(yǎng)基活性及操作有效性。

2.**操作**：每批檢驗加入已知濃度標準菌（如大腸菌群≥30CFU/g），37℃培養(yǎng)24-48小時。

3.**判定**：陽性對照必須生長良好，否則全批結(jié)果無效。

（二）陰性對照

1.**目的**：檢測培養(yǎng)基污染。

2.**操作**：不接種樣品的培養(yǎng)基按常規(guī)培養(yǎng)。

3.**判定**：陰性對照不得有菌落生長。

（三）重復性檢驗

1.**可疑結(jié)果驗證**：

-若菌落形態(tài)異常或數(shù)量超出標準范圍，需重新檢驗。

2.**批次間比對**：

-每月進行盲樣檢驗，結(jié)果偏差≤20%為合格。

七、注意事項

1.**無菌操作**：

-超凈臺使用前開啟30分鐘，定期更換濾網(wǎng)。

-接種環(huán)等工具使用后立即滅菌，冷卻再接觸培養(yǎng)基。

2.**生物安全**：

-高污染樣品需在生物安全柜中操作（級別II級）。

-厭氧菌培養(yǎng)需佩戴防護眼鏡。

3.**記錄管理**：

-每項操作需記錄時間、操作人、培養(yǎng)基批號等信息。

-電子記錄需定期備份，紙質(zhì)記錄存檔≥3年。

八、附錄

（一）常用培養(yǎng)基配方（精簡版）

1.無菌水：純化水+0.1%蛋白胨+0.5%酵母浸膏。

2.蛋白胨水：蛋白胨10g，蒸餾水1000mL。

（二）設(shè)備校準清單

1.pH計：每年校準2次（pH7.00、pH4.01）。

2.高壓滅菌鍋：每月生物指示劑測試。

本文件內(nèi)容需根據(jù)實際實驗室條件、設(shè)備性能及行業(yè)最新標準進行補充和修訂。

一、概述

微生物檢驗是評估樣品中微生物含量、種類及活性狀態(tài)的重要技術(shù)手段，廣泛應用于食品、藥品、環(huán)境、生物制品等領(lǐng)域。為確保檢驗結(jié)果的準確性、可靠性和一致性，必須嚴格遵守相關(guān)操作規(guī)定。本文件旨在規(guī)范微生物檢驗的各個環(huán)節(jié)，包括樣品處理、培養(yǎng)基制備、接種操作、培養(yǎng)觀察、結(jié)果判定等，以保障檢驗過程的專業(yè)性和規(guī)范性。

二、樣品處理

（一）樣品采集

1.選擇具有代表性的樣品，避免污染。

2.使用無菌工具（如無菌鑷子、手套）進行操作。

3.樣品量應根據(jù)檢驗要求確定，通常為10g或10mL（食品、液體樣品）。

4.采集后立即密封，冷藏保存（溫度4℃±2℃）。

（二）樣品前處理

1.表面消毒：對固體樣品（如食品表面）用75%酒精擦拭消毒。

2.均質(zhì)化處理：將樣品剪碎或使用均質(zhì)器充分混勻。

3.制備稀釋液：按1:10、1:100等比例稀釋，使用無菌生理鹽水或緩沖液。

三、培養(yǎng)基制備

（一）培養(yǎng)基配方

1.常用培養(yǎng)基包括：營養(yǎng)瓊脂（NA）、麥康凱瓊脂（MAC）、TSB（胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）。

2.配方需符合國家標準（如GB/T4789系列），稱量誤差不超過±1%。

（二）制備步驟

1.按配方稱量培養(yǎng)基粉末，加入蒸餾水。

2.攪拌溶解后，分裝于滅菌容器（如三角瓶、試管）。

3.滅菌：高壓蒸汽滅菌（121℃，15-20分鐘）。

4.冷卻后備用（平板需傾注，凝固后倒置）。

四、接種與培養(yǎng)

（一）平板接種

1.使用無菌接種環(huán)或接種針。

2.根據(jù)樣品類型選擇劃線或點種法：

(1)劃線法：在平板表面三區(qū)劃線分離菌落。

(2)點種法：每皿接種≤100μL液體樣品。

（二）液體培養(yǎng)

1.將樣品稀釋液接種至TSB等液體培養(yǎng)基，搖勻。

2.37℃恒溫培養(yǎng)24-48小時。

（三）培養(yǎng)條件

1.溫度：37℃±1℃。

2.濕度：培養(yǎng)箱內(nèi)相對濕度≥95%。

3.時間：根據(jù)目標微生物生長周期調(diào)整（如細菌24-48小時）。

五、結(jié)果觀察與判定

（一）菌落計數(shù)

1.選擇30-300CFU（菌落形成單位）的平板進行計數(shù)。

2.使用平板計數(shù)法（PC法）或MPN（最可能數(shù)法）。

（二）菌落形態(tài)觀察

1.通過顯微鏡初步鑒定形態(tài)（如大小、顏色、邊緣）。

2.結(jié)合生化試驗（如氧化酶、糖發(fā)酵試驗）輔助鑒定。

（三）結(jié)果記錄

1.記錄菌落數(shù)量、形態(tài)、生長速度等關(guān)鍵指標。

2.繪制生長曲線或保存典型菌落照片。

六、質(zhì)量控制

（一）陽性對照

1.每批檢驗加入已知濃度標準菌（如大腸菌群）。

2.陽性對照必須生長良好，否則檢驗無效。

（二）陰性對照

1.不接種樣品的培養(yǎng)基，用于檢測污染。

2.陰性對照不得有菌落生長。

（三）重復性檢驗

1.對可疑結(jié)果進行二次驗證。

2.不同批次檢驗結(jié)果偏差應≤20%。

七、注意事項

1.操作全程佩戴口罩、手套，避免交叉污染。

2.培養(yǎng)基和工具使用后及時滅菌處理。

3.檢驗完畢后記錄設(shè)備清潔狀態(tài)，并填寫使用日志。

八、附錄

（一）常用培養(yǎng)基參考配方

1.營養(yǎng)瓊脂：蛋白胨3g，牛肉浸膏10g，NaCl5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。

2.麥康凱瓊脂：乳糖10g，蔗糖10g，蛋白胨10g，瓊脂13g，牛膽鹽10g，蒸餾水1000mL。

（二）標準操作流程（SOP）編號

1.樣品采集：SOP-QC-001

2.培養(yǎng)基滅菌：SOP-MY-002

3.接種操作：SOP-IN-003

本文件內(nèi)容需根據(jù)實際實驗室條件進行調(diào)整，并定期更新以符合行業(yè)規(guī)范。

一、概述

微生物檢驗是評估樣品中微生物含量、種類及活性狀態(tài)的重要技術(shù)手段，廣泛應用于食品、藥品、環(huán)境、生物制品等領(lǐng)域。為確保檢驗結(jié)果的準確性、可靠性和一致性，必須嚴格遵守相關(guān)操作規(guī)定。本文件旨在規(guī)范微生物檢驗的各個環(huán)節(jié)，包括樣品處理、培養(yǎng)基制備、接種操作、培養(yǎng)觀察、結(jié)果判定等，以保障檢驗過程的專業(yè)性和規(guī)范性。

二、樣品處理

（一）樣品采集

1.**選擇代表性樣品**：

-目標是采集能夠反映整體狀況的樣品。對于散裝物料，應從不同部位（上、中、下）和不同層次隨機抽取。例如，食品罐頭需從頂部、中部和底部取樣；環(huán)境樣品（如空氣）需在不同距離和高度布點采集。

-樣品量應根據(jù)檢驗目標和后續(xù)操作確定，一般固體樣品取10-20g，液體樣品取10-50mL。

2.**使用無菌工具**：

-佩戴無菌手套，使用一次性無菌鑷子、剪刀或探子。工具需在火焰（如酒精燈）上滅菌后冷卻使用。

-采樣容器必須滅菌（如高壓蒸汽滅菌121℃，15分鐘）或使用無菌袋/瓶。

3.**避免污染措施**：

-采樣前清潔手部并消毒，避免直接接觸樣品表面。

-操作應在清潔區(qū)域（如超凈工作臺）進行，空氣流動速度控制在0.3-0.5m/s。

4.**樣品保存與運輸**：

-立即密封樣品容器，使用防水、防漏包裝。

-液體樣品需冷藏（4℃±2℃），固體樣品可冷藏或避光保存。運輸時間應控制在2小時內(nèi)，特殊情況使用保溫箱。

（二）樣品前處理

1.**表面消毒**：

-對于帶包裝的固體樣品（如袋裝食品），需在無菌條件下打開包裝，用75%酒精或有效氯消毒液擦拭表面，晾干后取樣。

-環(huán)境樣品（如設(shè)備表面）用無菌棉簽蘸取消毒液擦拭，再用無菌生理鹽水潤洗棉簽并混勻。

2.**均質(zhì)化處理**：

-固體樣品：使用組織搗碎機、研缽或絞肉機破碎樣品，確保無大塊殘留。食品樣品（如肉類）需混合均勻，避免脂肪分離。

-液體樣品：充分搖晃混勻，或使用高速攪拌器（10000rpm，60秒）。

3.**稀釋液選擇與制備**：

-常用稀釋液：無菌生理鹽水（0.9%NaCl）、緩沖蛋白胨水（BPW）、胰酪大豆胨水（TSB）。

-按梯度稀釋：取10g/10mL樣品加入90mL/90mL稀釋液中，依次制備1:10、1:100、1:1000等稀釋液。

4.**選擇性稀釋**：

-根據(jù)預估污染水平，選擇合適稀釋倍數(shù)。例如，高污染樣品先1:10稀釋，低污染樣品直接1:100稀釋。

三、培養(yǎng)基制備

（一）培養(yǎng)基配方

1.**通用培養(yǎng)基**：

-營養(yǎng)瓊脂（NA）：蛋白胨3g，牛肉浸膏10g，NaCl5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。用于通用菌落培養(yǎng)。

-麥康凱瓊脂（MAC）：乳糖10g，蔗糖10g，蛋白胨10g，瓊脂13g，牛膽鹽10g，膽汁酸納1g，蒸餾水1000mL。用于腸桿菌科選擇性培養(yǎng)。

2.**特殊培養(yǎng)基**：

-血瓊脂：NA基礎(chǔ)+10%新鮮血液。用于快idious菌（如鏈球菌）培養(yǎng)。

-厭氧培養(yǎng)基：含還原劑（如硫乙醇酸鹽）和維生素（如葉酸）。用于厭氧菌培養(yǎng)。

（二）制備步驟

1.**稱量與溶解**：

-精確稱量培養(yǎng)基粉末，加入蒸餾水。加熱攪拌至完全溶解（NA需煮沸1分鐘）。

-檢查pH值（常用培養(yǎng)基pH7.2-7.4，用pH計校準）。

2.**分裝與滅菌**：

-平板：每500mL分裝于三角瓶，加入15mL培養(yǎng)基。試管：按需分裝（如3mL/支）。

-高壓蒸汽滅菌：121℃，15-20分鐘（根據(jù)培養(yǎng)基體積調(diào)整時間）。

3.**冷卻與傾注**：

-滅菌后冷卻至45-50℃，傾注平板（每皿15-20mL）。

-傾注液體培養(yǎng)基后輕搖混勻。

4.**凝固與保存**：

-平板需倒置（防止冷凝水污染菌落），室溫凝固后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

-儲存時間：NA平板≤2周，MAC平板≤1周。

四、接種與培養(yǎng)

（一）平板接種

1.**直接劃線法**（用于分離純培養(yǎng)）：

-在超凈臺內(nèi)，將菌液滴加至平板表面。用接種環(huán)沿直徑劃三區(qū)：

(1)第一區(qū)：從滴點向外劃3-4條平行線。

(2)第二區(qū)：隔線橫劃第一區(qū)，相互垂直。

(3)第三區(qū)：重復第二區(qū)操作。

-每區(qū)結(jié)束后滅菌接種環(huán)，最后灼燒滅菌。

2.**傾注法**（用于計數(shù)或厭氧菌）：

-液體樣品取1mL加入無菌試管液體培養(yǎng)基，混勻后倒置培養(yǎng)。

-厭氧菌需用專用傾注杯，培養(yǎng)基冷卻后緩慢注入。

（二）液體培養(yǎng)

1.**接種量**：

-無菌移液器吸取1-5mL菌液加入TSB等液體培養(yǎng)基，混勻。

2.**培養(yǎng)條件**：

-振蕩：水平搖床180rpm，避免氣泡。

-厭氧培養(yǎng)：使用厭氧罐或?qū)Ｓ门囵B(yǎng)箱（氣體混合比：氫氣80%，氮氣10%，二氧化碳10%）。

（三）培養(yǎng)條件

1.**溫度控制**：

-常溫培養(yǎng)（如霉菌）：25℃±1℃。

-工業(yè)發(fā)酵：30-37℃±1℃。

2.**CO?濃度**：

-需氧菌：空氣。

-兼性厭氧菌：5%CO?（可用Na?CO?或NaHCO?調(diào)節(jié)）。

3.**培養(yǎng)時間**：

-厭氧菌：48-72小時。

-嗜冷菌：30℃培養(yǎng)7天。

五、結(jié)果觀察與判定

（一）菌落計數(shù)

1.**平板計數(shù)法（PC法）**：

-選擇30-300CFU的平板，記錄菌落數(shù)。計算公式：

CFU/mL=(N×稀釋倍數(shù))/樣品量

-復查：若相鄰兩皿計數(shù)差異＞30%，需重做。

2.**MPN法（最可能數(shù)法）**：

-按系列稀釋液接種至3管MPN管，培養(yǎng)后計算公式：

MPN/100mL=C×(1/r?+r?+r?)

其中C為陽性管稀釋倍數(shù)，