微生物檢驗實驗室操作規(guī)程一、總則

微生物檢驗實驗室操作規(guī)程旨在規(guī)范實驗室日常操作，確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和一致性。本規(guī)程適用于所有微生物檢驗活動，包括樣品采集、處理、培養(yǎng)、鑒定及數(shù)據(jù)分析等環(huán)節(jié)。實驗室人員必須嚴格遵守本規(guī)程，并接受相關(guān)培訓(xùn)，以保障操作安全與效率。

二、實驗室環(huán)境與設(shè)備

（一）實驗室環(huán)境

1.實驗室應(yīng)位于獨立區(qū)域，保持清潔、干燥，溫濕度符合標(biāo)準(zhǔn)（溫度20±2℃，濕度50±10%）。

2.實驗室應(yīng)劃分清潔區(qū)與污染區(qū)，并設(shè)置明顯的區(qū)域標(biāo)識。

3.定期進行環(huán)境消毒（如使用70-75%酒精或含氯消毒劑），并記錄消毒頻率與效果。

（二）設(shè)備要求

1.高壓滅菌鍋：溫度121±2℃，壓力≥103kPa，滅菌時間根據(jù)物品類型調(diào)整（如培養(yǎng)基15-20分鐘）。

2.超凈工作臺：空氣潔凈度達到30級，使用前需進行細菌監(jiān)測（如≥95%的菌落抑制）。

3.顯微鏡：放大倍數(shù)可達1000×，需定期校準(zhǔn)（如目鏡與物鏡校準(zhǔn)每年一次）。

4.培養(yǎng)箱：恒溫精度±0.5℃，需定期檢測溫度均勻性。

三、樣品采集與處理

（一）樣品采集

1.采集前需清潔雙手，避免污染。

2.根據(jù)樣品類型選擇合適的采集工具（如拭子、無菌管等）。

3.樣品采集量應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)（如液體樣品≥1mL，固體樣品≥10g）。

（二）樣品處理

1.樣品到達實驗室后，立即進行編號與登記。

2.液體樣品需進行系列稀釋（如10倍梯度稀釋，直至菌落計數(shù)在30-300CFU/mL）。

3.固體樣品需采用四區(qū)劃線法或傾注法處理（如劃線法需在瓊脂平板上均勻分布）。

四、微生物培養(yǎng)與鑒定

（一）培養(yǎng)基制備

1.按照說明書稱量培養(yǎng)基粉末，加入去離子水（如TSA培養(yǎng)基加水量為900mL/L）。

2.滅菌前檢查pH值（如MRS培養(yǎng)基pH6.4±0.2），并記錄滅菌參數(shù)。

（二）培養(yǎng)操作

1.培養(yǎng)基冷卻后傾注平板（厚度≤4mm）。

2.接種樣品后置于培養(yǎng)箱，厭氧菌需使用厭氧罐（如培養(yǎng)時間36-48小時）。

3.培養(yǎng)過程中避免頻繁開蓋，減少雜菌污染。

（三）菌落鑒定

1.觀察菌落形態(tài)（如顏色、大小、邊緣形狀）。

2.選擇典型菌落進行革蘭染色（如革蘭陽性菌呈紫色，陰性菌呈紅色）。

3.通過API系統(tǒng)或生化實驗進行種屬鑒定（如API20E系統(tǒng)需接種6個生化管）。

五、數(shù)據(jù)記錄與報告

（一）數(shù)據(jù)記錄

1.實驗過程需詳細記錄（如培養(yǎng)基批次、接種量、培養(yǎng)時間）。

2.菌落計數(shù)需使用數(shù)字顯微鏡（如放大100×，計數(shù)面積≥0.1cm2）。

（二）報告生成

1.檢驗結(jié)果需在24小時內(nèi)完成，并附上原始數(shù)據(jù)。

2.報告格式包括樣品編號、檢驗項目、菌落計數(shù)及鑒定結(jié)果。

六、安全與廢棄物處理

（一）個人防護

1.操作時需佩戴口罩、手套，并穿戴實驗服。

2.高風(fēng)險操作（如氣溶膠實驗）需佩戴防護面罩。

（二）廢棄物處理

1.培養(yǎng)廢棄物需高壓滅菌后丟棄（如滅菌時間15分鐘）。

2.化學(xué)試劑需分類存放（如酸堿廢液分開處理）。

七、質(zhì)量控制

（一）內(nèi)部質(zhì)控

1.每月進行空白對照實驗（如培養(yǎng)基無菌試驗）。

2.使用標(biāo)準(zhǔn)菌株進行平行實驗（如大腸桿菌ATCC25922）。

（二）外部質(zhì)控

1.定期參加能力驗證計劃（如ISO16140標(biāo)準(zhǔn)）。

2.對比其他實驗室結(jié)果，評估檢驗一致性。

一、總則

微生物檢驗實驗室操作規(guī)程旨在規(guī)范實驗室日常操作，確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和一致性。本規(guī)程適用于所有微生物檢驗活動，包括樣品采集、處理、培養(yǎng)、鑒定及數(shù)據(jù)分析等環(huán)節(jié)。實驗室人員必須嚴格遵守本規(guī)程，并接受相關(guān)培訓(xùn)，以保障操作安全與效率。

二、實驗室環(huán)境與設(shè)備

（一）實驗室環(huán)境

1.實驗室應(yīng)位于獨立區(qū)域，保持清潔、干燥，溫濕度符合標(biāo)準(zhǔn)（溫度20±2℃，濕度50±10%）。

2.實驗室應(yīng)劃分清潔區(qū)與污染區(qū)，并設(shè)置明顯的區(qū)域標(biāo)識。

（1）清潔區(qū)包括更衣室、準(zhǔn)備間和超凈工作臺，需定期進行空氣消毒（如使用紫外線燈或電子消毒柜，每日照射≥30分鐘）。

（2）污染區(qū)包括培養(yǎng)箱、滅菌鍋和廢棄物處理間，地面和墻面需鋪設(shè)易清潔材料（如環(huán)氧樹脂地坪）。

3.定期進行環(huán)境消毒（如使用70-75%酒精或含氯消毒劑），并記錄消毒頻率與效果。

（1）消毒頻率：每日操作前后進行表面消毒，每周進行一次全面消毒。

（2）效果監(jiān)測：使用settleplates法檢測空氣菌落濃度（如每立方米≤200CFU）。

（二）設(shè)備要求

1.高壓滅菌鍋：溫度121±2℃，壓力≥103kPa，滅菌時間根據(jù)物品類型調(diào)整（如培養(yǎng)基15-20分鐘，器械20-30分鐘）。

（1）滅菌前需檢查鍋內(nèi)水位（應(yīng)≥加水量），并確保密封圈完好。

（2）滅菌后需自然冷卻（避免強制排氣），使用壓力指示卡確認壓力歸零。

2.超凈工作臺：空氣潔凈度達到30級，使用前需進行細菌監(jiān)測（如≥95%的菌落抑制）。

（1）操作前需開啟紫外燈照射30分鐘進行空氣滅菌，使用后關(guān)閉紫外燈。

（2）臺面需使用70-75%酒精擦拭，并確保風(fēng)閥運行正常（風(fēng)速≥0.5m/s）。

3.顯微鏡：放大倍數(shù)可達1000×，需定期校準(zhǔn)（如目鏡與物鏡校準(zhǔn)每年一次）。

（1）使用前需用擦鏡紙蘸取酒精清潔物鏡和目鏡。

（2）油鏡使用后需立即用酒精清潔，并蓋上防塵蓋。

4.培養(yǎng)箱：恒溫精度±0.5℃，需定期檢測溫度均勻性。

（1）放置溫度計于箱內(nèi)中央，校準(zhǔn)誤差應(yīng)≤0.2℃。

（2）箱內(nèi)濕度需控制在40-60%，避免冷凝水滴落培養(yǎng)基。

三、樣品采集與處理

（一）樣品采集

1.采集前需清潔雙手，避免污染。

（1）使用75%酒精消毒雙手，并佩戴無菌手套。

（2）穿戴一次性實驗服，避免衣物接觸樣品。

2.根據(jù)樣品類型選擇合適的采集工具（如拭子、無菌管等）。

（1）液體樣品：使用無菌吸管或注射器抽取，避免震蕩。

（2）固體樣品：使用無菌鏟或鑷子取樣，每次取樣量≥10g。

3.樣品采集量應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)（如液體樣品≥1mL，固體樣品≥10g）。

（1）液體樣品需記錄實際采集量，并立即混勻。

（2）固體樣品需四區(qū)劃線，確保菌落分布均勻。

（二）樣品處理

1.樣品到達實驗室后，立即進行編號與登記。

（1）使用樣品標(biāo)簽（含編號、采集日期、類型等信息）。

（2）記錄樣品狀態(tài)（如是否冷藏、是否有異味）。

2.液體樣品需進行系列稀釋（如10倍梯度稀釋，直至菌落計數(shù)在30-300CFU/mL）。

（1）使用無菌移液器進行稀釋，每次稀釋需更換吸頭。

（2）每皿接種0.1mL或1mL，根據(jù)菌落密度調(diào)整。

3.固體樣品需采用四區(qū)劃線法或傾注法處理（如劃線法需在瓊脂平板上均勻分布）。

（1）四區(qū)劃線法：用接種環(huán)在平板上劃三條平行線，每區(qū)接種≥0.1g樣品。

（2）傾注法：稱取樣品溶于9mL無菌水，混勻后傾注30-50mL培養(yǎng)基。

四、微生物培養(yǎng)與鑒定

（一）培養(yǎng)基制備

1.按照說明書稱量培養(yǎng)基粉末，加入去離子水（如TSA培養(yǎng)基加水量為900mL/L）。

（1）使用電子天平稱量（精度±0.1g），并記錄粉末批號。

（2）攪拌溶解時避免劇烈搖晃，防止氣泡產(chǎn)生。

2.滅菌前檢查pH值（如MRS培養(yǎng)基pH6.4±0.2），并記錄滅菌參數(shù)。

（1）使用pH計校準(zhǔn)（每月一次），滴加指示劑后快速測量。

（2）滅菌參數(shù)記錄：溫度、壓力、時間（如高壓鍋121℃，15分鐘）。

（二）培養(yǎng)操作

1.培養(yǎng)基冷卻后傾注平板（厚度≤4mm）。

（1）使用傾注皿，培養(yǎng)基液面距離皿沿≤1cm。

（2）每個平板傾注15-20mL，確保表面平整。

2.接種樣品后置于培養(yǎng)箱，厭氧菌需使用厭氧罐（如培養(yǎng)時間36-48小時）。

（1）需氧菌培養(yǎng)溫度為35±2℃，厭氧菌使用CO?培養(yǎng)箱（37±1℃）。

（2）厭氧罐需先通氮氣置換空氣，再充入無氧氣體（如氫氮混合氣）。

3.培養(yǎng)過程中避免頻繁開蓋，減少雜菌污染。

（1）需氧培養(yǎng)箱門需每4小時開一次，每次≤30秒。

（2）厭氧罐需使用壓力指示卡監(jiān)測氣體狀態(tài)。

（三）菌落鑒定

1.觀察菌落形態(tài)（如顏色、大小、邊緣形狀）。

（1）使用放大鏡記錄菌落特征（如形狀、透明度、是否有溶血）。

（2）典型菌落需拍照存檔，并標(biāo)注培養(yǎng)條件。

2.選擇典型菌落進行革蘭染色（如革蘭陽性菌呈紫色，陰性菌呈紅色）。

（1）制備涂片：使用接種環(huán)挑取菌落，均勻涂抹于載玻片。

（2）染色步驟：初染（1分鐘）、碘液（1分鐘）、脫色（5-10秒）、復(fù)染（30秒）。

3.通過API系統(tǒng)或生化實驗進行種屬鑒定（如API20E系統(tǒng)需接種6個生化管）。

（1）API系統(tǒng)：使用專用接種針挑取菌落，逐孔接種。

（2）生化管培養(yǎng)：35±2℃培養(yǎng)48-72小時，記錄陽性/陰性反應(yīng)。

五、數(shù)據(jù)記錄與報告

（一）數(shù)據(jù)記錄

1.實驗過程需詳細記錄（如培養(yǎng)基批次、接種量、培養(yǎng)時間）。

（1）使用電子記錄本或紙質(zhì)日志，記錄時間需精確到分鐘。

（2）關(guān)鍵參數(shù)需標(biāo)注（如pH值、溫度波動）。

2.菌落計數(shù)需使用數(shù)字顯微鏡（如放大100×，計數(shù)面積≥0.1cm2）。

（1）每個平板隨機計數(shù)3個區(qū)域，取平均值。

（2）使用菌落計數(shù)軟件自動分析，減少人為誤差。

（二）報告生成

1.檢驗結(jié)果需在24小時內(nèi)完成，并附上原始數(shù)據(jù)。

（1）報告格式：樣品信息、檢驗項目、菌落計數(shù)、鑒定結(jié)果。

（2）附上革蘭染色圖和API鑒定圖譜。

2.報告格式包括樣品編號、檢驗項目、菌落計數(shù)及鑒定結(jié)果。

（1）樣品編號需與原始記錄一致。

（2）鑒定結(jié)果需注明置信度（如≥95%）。

六、安全與廢棄物處理

（一）個人防護

1.操作時需佩戴口罩、手套，并穿戴實驗服。

（1）口罩需每4小時更換一次，手套破損立即更換。

（2）高風(fēng)險操作（如氣溶膠實驗）需佩戴防護面罩和護目鏡。

2.高風(fēng)險操作（如氣溶膠實驗）需佩戴防護面罩。

（1）實驗前需進行風(fēng)險評估，并制定應(yīng)急預(yù)案。

（2）使用生物安全柜（BSL-2級）進行操作。

（二）廢棄物處理

1.培養(yǎng)廢棄物需高壓滅菌后丟棄（如滅菌時間15分鐘）。

（1）高壓滅菌后冷卻，使用專用轉(zhuǎn)運箱送至處理間。

（2）記錄滅菌批次和日期。

2.化學(xué)試劑需分類存放（如酸堿廢液分開處理）。

（1）酸堿廢液需中和后排放（如使用pH試紙監(jiān)測）。

（2）有機溶劑需使用專用回收桶。

七、質(zhì)量控制

（一）內(nèi)部質(zhì)控

1.每月進行空白對照實驗（如培養(yǎng)基無菌試驗）。

（1）每批培養(yǎng)基需做平行空白平板（≥3個）。

（2）未生長菌落即為合格，如有污染需追溯原因。

2.使用標(biāo)準(zhǔn)菌株進行平行實驗（如大腸桿菌ATCC25922）。

（1）標(biāo)準(zhǔn)菌株需定期復(fù)蘇（如每月一次）。

（2）檢驗結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值偏差≤5%即為合格。

（二）外部質(zhì)控

1.定期參加能力驗證計劃（如ISO16140標(biāo)準(zhǔn)）。

（1）每年提交至少2個盲樣檢測。

（2）結(jié)果符合要求后方可繼續(xù)參與。

2.對比其他實驗室結(jié)果，評估檢驗一致性。

（1）使用統(tǒng)計學(xué)方法（如F檢驗）分析數(shù)據(jù)。

（2）偏差超過±10%需進行方法驗證。

一、總則

微生物檢驗實驗室操作規(guī)程旨在規(guī)范實驗室日常操作，確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和一致性。本規(guī)程適用于所有微生物檢驗活動，包括樣品采集、處理、培養(yǎng)、鑒定及數(shù)據(jù)分析等環(huán)節(jié)。實驗室人員必須嚴格遵守本規(guī)程，并接受相關(guān)培訓(xùn)，以保障操作安全與效率。

二、實驗室環(huán)境與設(shè)備

（一）實驗室環(huán)境

1.實驗室應(yīng)位于獨立區(qū)域，保持清潔、干燥，溫濕度符合標(biāo)準(zhǔn)（溫度20±2℃，濕度50±10%）。

2.實驗室應(yīng)劃分清潔區(qū)與污染區(qū)，并設(shè)置明顯的區(qū)域標(biāo)識。

3.定期進行環(huán)境消毒（如使用70-75%酒精或含氯消毒劑），并記錄消毒頻率與效果。

（二）設(shè)備要求

1.高壓滅菌鍋：溫度121±2℃，壓力≥103kPa，滅菌時間根據(jù)物品類型調(diào)整（如培養(yǎng)基15-20分鐘）。

2.超凈工作臺：空氣潔凈度達到30級，使用前需進行細菌監(jiān)測（如≥95%的菌落抑制）。

3.顯微鏡：放大倍數(shù)可達1000×，需定期校準(zhǔn)（如目鏡與物鏡校準(zhǔn)每年一次）。

4.培養(yǎng)箱：恒溫精度±0.5℃，需定期檢測溫度均勻性。

三、樣品采集與處理

（一）樣品采集

1.采集前需清潔雙手，避免污染。

2.根據(jù)樣品類型選擇合適的采集工具（如拭子、無菌管等）。

3.樣品采集量應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)（如液體樣品≥1mL，固體樣品≥10g）。

（二）樣品處理

1.樣品到達實驗室后，立即進行編號與登記。

2.液體樣品需進行系列稀釋（如10倍梯度稀釋，直至菌落計數(shù)在30-300CFU/mL）。

3.固體樣品需采用四區(qū)劃線法或傾注法處理（如劃線法需在瓊脂平板上均勻分布）。

四、微生物培養(yǎng)與鑒定

（一）培養(yǎng)基制備

1.按照說明書稱量培養(yǎng)基粉末，加入去離子水（如TSA培養(yǎng)基加水量為900mL/L）。

2.滅菌前檢查pH值（如MRS培養(yǎng)基pH6.4±0.2），并記錄滅菌參數(shù)。

（二）培養(yǎng)操作

1.培養(yǎng)基冷卻后傾注平板（厚度≤4mm）。

2.接種樣品后置于培養(yǎng)箱，厭氧菌需使用厭氧罐（如培養(yǎng)時間36-48小時）。

3.培養(yǎng)過程中避免頻繁開蓋，減少雜菌污染。

（三）菌落鑒定

1.觀察菌落形態(tài)（如顏色、大小、邊緣形狀）。

2.選擇典型菌落進行革蘭染色（如革蘭陽性菌呈紫色，陰性菌呈紅色）。

3.通過API系統(tǒng)或生化實驗進行種屬鑒定（如API20E系統(tǒng)需接種6個生化管）。

五、數(shù)據(jù)記錄與報告

（一）數(shù)據(jù)記錄

1.實驗過程需詳細記錄（如培養(yǎng)基批次、接種量、培養(yǎng)時間）。

2.菌落計數(shù)需使用數(shù)字顯微鏡（如放大100×，計數(shù)面積≥0.1cm2）。

（二）報告生成

1.檢驗結(jié)果需在24小時內(nèi)完成，并附上原始數(shù)據(jù)。

2.報告格式包括樣品編號、檢驗項目、菌落計數(shù)及鑒定結(jié)果。

六、安全與廢棄物處理

（一）個人防護

1.操作時需佩戴口罩、手套，并穿戴實驗服。

2.高風(fēng)險操作（如氣溶膠實驗）需佩戴防護面罩。

（二）廢棄物處理

1.培養(yǎng)廢棄物需高壓滅菌后丟棄（如滅菌時間15分鐘）。

2.化學(xué)試劑需分類存放（如酸堿廢液分開處理）。

七、質(zhì)量控制

（一）內(nèi)部質(zhì)控

1.每月進行空白對照實驗（如培養(yǎng)基無菌試驗）。

2.使用標(biāo)準(zhǔn)菌株進行平行實驗（如大腸桿菌ATCC25922）。

（二）外部質(zhì)控

1.定期參加能力驗證計劃（如ISO16140標(biāo)準(zhǔn)）。

2.對比其他實驗室結(jié)果，評估檢驗一致性。

一、總則

微生物檢驗實驗室操作規(guī)程旨在規(guī)范實驗室日常操作，確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和一致性。本規(guī)程適用于所有微生物檢驗活動，包括樣品采集、處理、培養(yǎng)、鑒定及數(shù)據(jù)分析等環(huán)節(jié)。實驗室人員必須嚴格遵守本規(guī)程，并接受相關(guān)培訓(xùn)，以保障操作安全與效率。

二、實驗室環(huán)境與設(shè)備

（一）實驗室環(huán)境

1.實驗室應(yīng)位于獨立區(qū)域，保持清潔、干燥，溫濕度符合標(biāo)準(zhǔn)（溫度20±2℃，濕度50±10%）。

2.實驗室應(yīng)劃分清潔區(qū)與污染區(qū)，并設(shè)置明顯的區(qū)域標(biāo)識。

（1）清潔區(qū)包括更衣室、準(zhǔn)備間和超凈工作臺，需定期進行空氣消毒（如使用紫外線燈或電子消毒柜，每日照射≥30分鐘）。

（2）污染區(qū)包括培養(yǎng)箱、滅菌鍋和廢棄物處理間，地面和墻面需鋪設(shè)易清潔材料（如環(huán)氧樹脂地坪）。

3.定期進行環(huán)境消毒（如使用70-75%酒精或含氯消毒劑），并記錄消毒頻率與效果。

（1）消毒頻率：每日操作前后進行表面消毒，每周進行一次全面消毒。

（2）效果監(jiān)測：使用settleplates法檢測空氣菌落濃度（如每立方米≤200CFU）。

（二）設(shè)備要求

1.高壓滅菌鍋：溫度121±2℃，壓力≥103kPa，滅菌時間根據(jù)物品類型調(diào)整（如培養(yǎng)基15-20分鐘，器械20-30分鐘）。

（1）滅菌前需檢查鍋內(nèi)水位（應(yīng)≥加水量），并確保密封圈完好。

（2）滅菌后需自然冷卻（避免強制排氣），使用壓力指示卡確認壓力歸零。

2.超凈工作臺：空氣潔凈度達到30級，使用前需進行細菌監(jiān)測（如≥95%的菌落抑制）。

（1）操作前需開啟紫外燈照射30分鐘進行空氣滅菌，使用后關(guān)閉紫外燈。

（2）臺面需使用70-75%酒精擦拭，并確保風(fēng)閥運行正常（風(fēng)速≥0.5m/s）。

3.顯微鏡：放大倍數(shù)可達1000×，需定期校準(zhǔn)（如目鏡與物鏡校準(zhǔn)每年一次）。

（1）使用前需用擦鏡紙蘸取酒精清潔物鏡和目鏡。

（2）油鏡使用后需立即用酒精清潔，并蓋上防塵蓋。

4.培養(yǎng)箱：恒溫精度±0.5℃，需定期檢測溫度均勻性。

（1）放置溫度計于箱內(nèi)中央，校準(zhǔn)誤差應(yīng)≤0.2℃。

（2）箱內(nèi)濕度需控制在40-60%，避免冷凝水滴落培養(yǎng)基。

三、樣品采集與處理

（一）樣品采集

1.采集前需清潔雙手，避免污染。

（1）使用75%酒精消毒雙手，并佩戴無菌手套。

（2）穿戴一次性實驗服，避免衣物接觸樣品。

2.根據(jù)樣品類型選擇合適的采集工具（如拭子、無菌管等）。

（1）液體樣品：使用無菌吸管或注射器抽取，避免震蕩。

（2）固體樣品：使用無菌鏟或鑷子取樣，每次取樣量≥10g。

3.樣品采集量應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)（如液體樣品≥1mL，固體樣品≥10g）。

（1）液體樣品需記錄實際采集量，并立即混勻。

（2）固體樣品需四區(qū)劃線，確保菌落分布均勻。

（二）樣品處理

1.樣品到達實驗室后，立即進行編號與登記。

（1）使用樣品標(biāo)簽（含編號、采集日期、類型等信息）。

（2）記錄樣品狀態(tài)（如是否冷藏、是否有異味）。

2.液體樣品需進行系列稀釋（如10倍梯度稀釋，直至菌落計數(shù)在30-300CFU/mL）。

（1）使用無菌移液器進行稀釋，每次稀釋需更換吸頭。

（2）每皿接種0.1mL或1mL，根據(jù)菌落密度調(diào)整。

3.固體樣品需采用四區(qū)劃線法或傾注法處理（如劃線法需在瓊脂平板上均勻分布）。

（1）四區(qū)劃線法：用接種環(huán)在平板上劃三條平行線，每區(qū)接種≥0.1g樣品。

（2）傾注法：稱取樣品溶于9mL無菌水，混勻后傾注30-50mL培養(yǎng)基。

四、微生物培養(yǎng)與鑒定

（一）培養(yǎng)基制備

1.按照說明書稱量培養(yǎng)基粉末，加入去離子水（如TSA培養(yǎng)基加水量為900mL/L）。

（1）使用電子天平稱量（精度±0.1g），并記錄粉末批號。

（2）攪拌溶解時避免劇烈搖晃，防止氣泡產(chǎn)生。

2.滅菌前檢查pH值（如MRS培養(yǎng)基pH6.4±0.2），并記錄滅菌參數(shù)。

（1）使用pH計校準(zhǔn)（每月一次），滴加指示劑后快速測量。

（2）滅菌參數(shù)記錄：溫度、壓力、時間（如高壓鍋121℃，15分鐘）。

（二）培養(yǎng)操作

1.培養(yǎng)基冷卻后傾注平板（厚度≤4mm）。

（1）使用傾注皿，培養(yǎng)基液面距離皿沿≤1cm。

（2）每個平板傾注15-20mL，確保表面平整。

2.接種樣品后置于培養(yǎng)箱，厭氧菌需使用厭氧罐（如培養(yǎng)時間36-48小時）。

（1）需氧菌培養(yǎng)溫度為35±2℃，厭氧菌使用CO?培養(yǎng)箱（37±1℃）。

（2）厭氧罐需先通氮氣置換空氣，再充入無氧氣體（如氫氮混合氣）。

3.培養(yǎng)過程中避免頻繁開蓋，減少雜菌污染。

（1）需氧培養(yǎng)箱門需每4小時開一次，每次≤30秒。

（2）厭氧罐需使用壓力指示卡監(jiān)測氣體狀態(tài)。

（三）菌落鑒定

1.觀察菌落形態(tài)（如顏色、大小、邊緣形狀）。

（1）使用放大鏡記錄菌落特征（如形狀、透明度、是否有溶血）。

（2）典型菌落需拍照存檔，并標(biāo)注培養(yǎng)條件。

2.選擇典型菌落進行革蘭染色（如革蘭陽性菌呈紫色，陰性菌呈紅色）。

（1）制備涂片：使用接種環(huán)挑取菌落，均勻涂抹于載玻片。

（2）染色步驟：初染（1分鐘）、碘液（1分鐘）、脫色（5-10秒）、復(fù)染（30秒）。

3.通過API系統(tǒng)或生化實驗進行種屬鑒定（如API20E系統(tǒng)需接種6個生化管）。

（1）API系統(tǒng)：使用專用接種針挑取菌落，逐孔接種。

（2）生化管培養(yǎng)：35±2℃培養(yǎng)48-72小時，記錄陽性/陰性反應(yīng)。

五、數(shù)據(jù)記錄與報告

（一）數(shù)據(jù)記錄

1.實驗過程需詳細記錄（如培養(yǎng)基批次、