微生物檢驗操作手段規(guī)范一、概述

微生物檢驗是評估樣品中微生物含量、種類及活動狀態(tài)的重要技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境、生物制品等領(lǐng)域。為確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性，必須遵循標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)范。本規(guī)范旨在明確微生物檢驗的基本流程、關(guān)鍵步驟和質(zhì)量控制要求，以保障檢驗工作的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性。

二、檢驗準(zhǔn)備

（一）樣品采集與處理

1.采集樣品時應(yīng)使用無菌工具，避免污染。

2.樣品量應(yīng)根據(jù)檢驗?zāi)康暮臀⑸锓N類確定，一般取10g或10mL。

3.處理方法包括：均質(zhì)化、稀釋、表面消毒等，具體依據(jù)樣品特性選擇。

（二）培養(yǎng)基與試劑準(zhǔn)備

1.培養(yǎng)基應(yīng)使用商業(yè)成品或按標(biāo)準(zhǔn)配方自配，確保無菌。

2.常用培養(yǎng)基包括：營養(yǎng)瓊脂（NA）、麥康凱瓊脂（MAC）、血瓊脂（BA）等。

3.試劑如無菌水、消毒劑等需驗證有效性。

（三）設(shè)備與環(huán)境要求

1.使用超凈工作臺、生物安全柜等無菌操作設(shè)備。

2.環(huán)境溫度、濕度、空氣潔凈度需符合標(biāo)準(zhǔn)（如溫度22±2℃，濕度50±10%）。

三、檢驗操作流程

（一）平板計數(shù)法（MPN法）

1.**樣品稀釋**：取樣品10g/10mL，用無菌水系列稀釋至10?1至10??梯度。

2.**傾注平板**：取0.1mL稀釋液加入90mL培養(yǎng)基中，每梯度做3個平行皿。

3.**培養(yǎng)與計數(shù)**：37℃培養(yǎng)48-72小時，選擇菌落計數(shù)在30-300的平板進(jìn)行計數(shù)。

4.**結(jié)果計算**：根據(jù)MPN表查表計算每克/毫升樣品的菌落數(shù)（CFU/g或CFU/mL）。

（二）傾注平板法

1.**樣品制備**：稱取樣品加入無菌液體培養(yǎng)基中，充分混勻。

2.**傾注培養(yǎng)皿**：每皿加入15mL培養(yǎng)基，混勻后倒置。

3.**培養(yǎng)與觀察**：35℃培養(yǎng)24-48小時，記錄典型菌落特征。

（三）涂片鏡檢法

1.**制備涂片**：取少量樣品涂布在潔凈載玻片上，干燥固定。

2.**染色**：使用革蘭染色法或美蘭染色法。

3.**鏡檢**：使用油鏡觀察菌體形態(tài)、顏色及排列特征。

四、質(zhì)量控制

（一）陽性對照

1.每批檢驗需設(shè)置陽性對照，驗證培養(yǎng)基活性。

2.使用已知濃度菌懸液（如大腸桿菌10?CFU/mL）。

（二）陰性對照

1.使用無菌水代替樣品，排除假陽性。

2.陰性對照不得生長任何微生物。

（三）重復(fù)性檢驗

1.關(guān)鍵項目（如平板計數(shù)）需做2次平行實驗。

2.結(jié)果偏差超過±10%時需重新檢驗。

五、結(jié)果報告與記錄

（一）數(shù)據(jù)記錄

1.詳錄樣品編號、檢驗日期、操作人、菌落數(shù)等關(guān)鍵信息。

2.使用電子或紙質(zhì)記錄表，確?？勺匪菪浴?/p>

（二）報告規(guī)范

1.列出檢驗方法、菌落特征、數(shù)量等核心數(shù)據(jù)。

2.附上典型鏡檢照片（如適用）。

（三）異常處理

1.發(fā)現(xiàn)污染時需注明原因，重新檢驗。

2.結(jié)果與預(yù)期差異較大時需復(fù)核實驗步驟。

一、概述

微生物檢驗是評估樣品中微生物含量、種類及活動狀態(tài)的重要技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境、生物制品等領(lǐng)域。為確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性，必須遵循標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)范。本規(guī)范旨在明確微生物檢驗的基本流程、關(guān)鍵步驟和質(zhì)量控制要求，以保障檢驗工作的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性。

二、檢驗準(zhǔn)備

（一）樣品采集與處理

1.**樣品采集**：

-使用無菌采樣袋或容器，避免接觸樣品邊緣。

-根據(jù)樣品類型選擇合適工具（如剪刀、勺子、注射器）。

-每次采樣前后需用70-75%酒精擦拭采樣工具。

2.**樣品處理**：

-液體樣品：充分混勻后，取10g或10mL加入90mL無菌生理鹽水中。

-固體樣品：剪取表面無損傷部分，研磨成勻漿或剪碎混勻。

-食品表面樣品：使用無菌棉簽擦拭表面后，將棉簽放入含10mL無菌水的試管中振蕩。

3.**稀釋梯度**：

-一般設(shè)置10?1、10?2、10?3、10??、10??稀釋系列。

-每個梯度取0.1mL或1mL用于平板接種。

（二）培養(yǎng)基與試劑準(zhǔn)備

1.**培養(yǎng)基制備**：

-按說明書稱量瓊脂粉（如NA、MAC），溶解后分裝三角瓶。

-115℃高壓滅菌15-20分鐘，冷卻至45-50℃?zhèn)溆谩?/p>

-血瓊脂需用無菌牛血或羊血，56℃滅活30分鐘后再滅菌。

2.**常用培養(yǎng)基**：

-營養(yǎng)瓊脂（NA）：通用培養(yǎng)，用于總菌落數(shù)測定。

-麥康凱瓊脂（MAC）：選擇性培養(yǎng)，用于大腸菌群檢測。

-血瓊脂（BA）：需氧菌培養(yǎng)，用于鏈球菌鑒定。

3.**試劑準(zhǔn)備**：

-無菌水：蒸餾水或去離子水，18-22℃儲存，使用前滅菌。

-消毒劑：75%酒精或0.1%無菌生理鹽水，用于工具消毒。

（三）設(shè)備與環(huán)境要求

1.**無菌操作設(shè)備**：

-超凈工作臺：每日使用前紫外線照射30分鐘，再用70%酒精熏蒸。

-生物安全柜：定期檢測風(fēng)速、壓差、過濾效率（HEPA）。

2.**環(huán)境條件**：

-溫度：檢驗室22±2℃，培養(yǎng)箱37±1℃。

-濕度：50±10%，避免結(jié)露。

-空氣潔凈度：≥30,000級（操作臺局部）。

三、檢驗操作流程

（一）平板計數(shù)法（MPN法）

1.**樣品稀釋**：

-稱10g樣品，加入90mL無菌水，充分?jǐn)嚢琛?/p>

-取10mL稀釋液，加入90mL水，重復(fù)3次，得到10?3、10??、10??梯度。

2.**傾注平板**：

-每梯度取0.1mL（10?3）和1mL（10??）稀釋液，分別加入90mL培養(yǎng)基。

-攪拌混勻后倒入直徑9cm無菌平皿，靜置冷卻30分鐘。

3.**培養(yǎng)與計數(shù)**：

-37℃培養(yǎng)48-72小時，觀察菌落形態(tài)。

-選擇30-300CFU的平板，計數(shù)菌落數(shù)。

4.**結(jié)果計算**：

-查MPN表，根據(jù)陽性管數(shù)計算CFU/g或CFU/mL。

-示例：10?3梯度2管陽性，10??梯度1管陽性，MPN≈80CFU/mL。

（二）傾注平板法

1.**樣品制備**：

-取10g樣品，加入90mL營養(yǎng)肉湯或PBS緩沖液。

-35℃振蕩培養(yǎng)1-2小時，制備富集液。

2.**傾注培養(yǎng)皿**：

-取10mL富集液，加入90mLNA培養(yǎng)基。

-混勻后倒入平皿，37℃培養(yǎng)24-48小時。

3.**菌落挑取**：

-記錄典型菌落（如大腸菌群呈紅色）。

-挑取單個菌落進(jìn)行革蘭染色和生化試驗。

（三）涂片鏡檢法

1.**制備涂片**：

-將少量樣品涂抹在潔凈載玻片上，自然干燥。

-用酒精燈火焰加熱固定（快速通過火焰2-3次）。

2.**染色步驟**：

-革蘭染色：初染（結(jié)晶紫1分鐘）、碘液（1分鐘）、脫色（95%酒精30秒）、復(fù)染（沙弗寧30秒）。

-美蘭染色：初染（美蘭1分鐘）、脫色（水洗）、復(fù)染（堿性復(fù)紅30秒）。

3.**鏡檢操作**：

-使用油鏡（100×）觀察，調(diào)節(jié)亮度。

-記錄菌體形態(tài)（如球菌、桿菌）、顏色（革蘭氏染色結(jié)果）及排列方式。

四、質(zhì)量控制

（一）陽性對照

1.**設(shè)置要求**：

-每批次檢驗必須包含陽性對照。

-使用已知濃度的大腸桿菌懸液（10?-10?CFU/mL）。

2.**操作步驟**：

-取0.1mL陽性對照加入含90mL水的平板。

-與樣品檢驗同步培養(yǎng)，陽性對照應(yīng)長出典型菌落。

（二）陰性對照

1.**排除污染**：

-使用無菌水代替樣品，按相同方法操作。

-陰性對照不得有任何微生物生長。

2.**異常處理**：

-若陰性對照污染，需排查培養(yǎng)基、設(shè)備或操作環(huán)節(jié)。

（三）重復(fù)性檢驗

1.**平行實驗**：

-關(guān)鍵項目（如平板計數(shù)）需做2-3次平行實驗。

-允許誤差：平板計數(shù)偏差≤10%，MPN法≤15%。

2.**結(jié)果審核**：

-偏差超標(biāo)時需重新檢驗，并分析原因（如稀釋不準(zhǔn)）。

五、結(jié)果報告與記錄

（一）數(shù)據(jù)記錄

1.**記錄內(nèi)容**：

-樣品編號、檢驗日期、操作人、檢驗方法、菌落數(shù)、鏡檢結(jié)果。

-培養(yǎng)基批號、滅菌參數(shù)、環(huán)境條件（溫濕度）。

2.**記錄格式**：

-使用標(biāo)準(zhǔn)化表格，電子版存檔≥5年，紙質(zhì)版歸檔。

（二）報告規(guī)范

1.**報告要素**：

-標(biāo)題：微生物檢驗報告。

-附件：原始數(shù)據(jù)、鏡檢照片（如有）。

-結(jié)論：明確標(biāo)注菌落總數(shù)、致病菌檢測結(jié)果。

2.**示例報告**：

-樣品：A公司酸奶，檢驗方法：平板計數(shù)法。

-結(jié)果：總菌落數(shù)＜100CFU/g，大腸菌群陰性。

（三）異常處理

1.**污染處理**：

-立即廢棄受污染培養(yǎng)基，消毒操作區(qū)域。

-調(diào)整檢驗參數(shù)（如延長培養(yǎng)時間）。

2.**結(jié)果偏差**：

-分析可能原因：樣品處理不當(dāng)、培養(yǎng)基失效、設(shè)備故障。

-必要時重復(fù)檢驗或采用替代方法。

一、概述

微生物檢驗是評估樣品中微生物含量、種類及活動狀態(tài)的重要技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境、生物制品等領(lǐng)域。為確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性，必須遵循標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)范。本規(guī)范旨在明確微生物檢驗的基本流程、關(guān)鍵步驟和質(zhì)量控制要求，以保障檢驗工作的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性。

二、檢驗準(zhǔn)備

（一）樣品采集與處理

1.采集樣品時應(yīng)使用無菌工具，避免污染。

2.樣品量應(yīng)根據(jù)檢驗?zāi)康暮臀⑸锓N類確定，一般取10g或10mL。

3.處理方法包括：均質(zhì)化、稀釋、表面消毒等，具體依據(jù)樣品特性選擇。

（二）培養(yǎng)基與試劑準(zhǔn)備

1.培養(yǎng)基應(yīng)使用商業(yè)成品或按標(biāo)準(zhǔn)配方自配，確保無菌。

2.常用培養(yǎng)基包括：營養(yǎng)瓊脂（NA）、麥康凱瓊脂（MAC）、血瓊脂（BA）等。

3.試劑如無菌水、消毒劑等需驗證有效性。

（三）設(shè)備與環(huán)境要求

1.使用超凈工作臺、生物安全柜等無菌操作設(shè)備。

2.環(huán)境溫度、濕度、空氣潔凈度需符合標(biāo)準(zhǔn)（如溫度22±2℃，濕度50±10%）。

三、檢驗操作流程

（一）平板計數(shù)法（MPN法）

1.**樣品稀釋**：取樣品10g/10mL，用無菌水系列稀釋至10?1至10??梯度。

2.**傾注平板**：取0.1mL稀釋液加入90mL培養(yǎng)基中，每梯度做3個平行皿。

3.**培養(yǎng)與計數(shù)**：37℃培養(yǎng)48-72小時，選擇菌落計數(shù)在30-300的平板進(jìn)行計數(shù)。

4.**結(jié)果計算**：根據(jù)MPN表查表計算每克/毫升樣品的菌落數(shù)（CFU/g或CFU/mL）。

（二）傾注平板法

1.**樣品制備**：稱取樣品加入無菌液體培養(yǎng)基中，充分混勻。

2.**傾注培養(yǎng)皿**：每皿加入15mL培養(yǎng)基，混勻后倒置。

3.**培養(yǎng)與觀察**：35℃培養(yǎng)24-48小時，記錄典型菌落特征。

（三）涂片鏡檢法

1.**制備涂片**：取少量樣品涂布在潔凈載玻片上，干燥固定。

2.**染色**：使用革蘭染色法或美蘭染色法。

3.**鏡檢**：使用油鏡觀察菌體形態(tài)、顏色及排列特征。

四、質(zhì)量控制

（一）陽性對照

1.每批檢驗需設(shè)置陽性對照，驗證培養(yǎng)基活性。

2.使用已知濃度菌懸液（如大腸桿菌10?CFU/mL）。

（二）陰性對照

1.使用無菌水代替樣品，排除假陽性。

2.陰性對照不得生長任何微生物。

（三）重復(fù)性檢驗

1.關(guān)鍵項目（如平板計數(shù)）需做2次平行實驗。

2.結(jié)果偏差超過±10%時需重新檢驗。

五、結(jié)果報告與記錄

（一）數(shù)據(jù)記錄

1.詳錄樣品編號、檢驗日期、操作人、菌落數(shù)等關(guān)鍵信息。

2.使用電子或紙質(zhì)記錄表，確?？勺匪菪?。

（二）報告規(guī)范

1.列出檢驗方法、菌落特征、數(shù)量等核心數(shù)據(jù)。

2.附上典型鏡檢照片（如適用）。

（三）異常處理

1.發(fā)現(xiàn)污染時需注明原因，重新檢驗。

2.結(jié)果與預(yù)期差異較大時需復(fù)核實驗步驟。

一、概述

微生物檢驗是評估樣品中微生物含量、種類及活動狀態(tài)的重要技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境、生物制品等領(lǐng)域。為確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性，必須遵循標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)范。本規(guī)范旨在明確微生物檢驗的基本流程、關(guān)鍵步驟和質(zhì)量控制要求，以保障檢驗工作的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性。

二、檢驗準(zhǔn)備

（一）樣品采集與處理

1.**樣品采集**：

-使用無菌采樣袋或容器，避免接觸樣品邊緣。

-根據(jù)樣品類型選擇合適工具（如剪刀、勺子、注射器）。

-每次采樣前后需用70-75%酒精擦拭采樣工具。

2.**樣品處理**：

-液體樣品：充分混勻后，取10g或10mL加入90mL無菌生理鹽水中。

-固體樣品：剪取表面無損傷部分，研磨成勻漿或剪碎混勻。

-食品表面樣品：使用無菌棉簽擦拭表面后，將棉簽放入含10mL無菌水的試管中振蕩。

3.**稀釋梯度**：

-一般設(shè)置10?1、10?2、10?3、10??、10??稀釋系列。

-每個梯度取0.1mL或1mL用于平板接種。

（二）培養(yǎng)基與試劑準(zhǔn)備

1.**培養(yǎng)基制備**：

-按說明書稱量瓊脂粉（如NA、MAC），溶解后分裝三角瓶。

-115℃高壓滅菌15-20分鐘，冷卻至45-50℃?zhèn)溆谩?/p>

-血瓊脂需用無菌牛血或羊血，56℃滅活30分鐘后再滅菌。

2.**常用培養(yǎng)基**：

-營養(yǎng)瓊脂（NA）：通用培養(yǎng)，用于總菌落數(shù)測定。

-麥康凱瓊脂（MAC）：選擇性培養(yǎng)，用于大腸菌群檢測。

-血瓊脂（BA）：需氧菌培養(yǎng)，用于鏈球菌鑒定。

3.**試劑準(zhǔn)備**：

-無菌水：蒸餾水或去離子水，18-22℃儲存，使用前滅菌。

-消毒劑：75%酒精或0.1%無菌生理鹽水，用于工具消毒。

（三）設(shè)備與環(huán)境要求

1.**無菌操作設(shè)備**：

-超凈工作臺：每日使用前紫外線照射30分鐘，再用70%酒精熏蒸。

-生物安全柜：定期檢測風(fēng)速、壓差、過濾效率（HEPA）。

2.**環(huán)境條件**：

-溫度：檢驗室22±2℃，培養(yǎng)箱37±1℃。

-濕度：50±10%，避免結(jié)露。

-空氣潔凈度：≥30,000級（操作臺局部）。

三、檢驗操作流程

（一）平板計數(shù)法（MPN法）

1.**樣品稀釋**：

-稱10g樣品，加入90mL無菌水，充分?jǐn)嚢琛?/p>

-取10mL稀釋液，加入90mL水，重復(fù)3次，得到10?3、10??、10??梯度。

2.**傾注平板**：

-每梯度取0.1mL（10?3）和1mL（10??）稀釋液，分別加入90mL培養(yǎng)基。

-攪拌混勻后倒入直徑9cm無菌平皿，靜置冷卻30分鐘。

3.**培養(yǎng)與計數(shù)**：

-37℃培養(yǎng)48-72小時，觀察菌落形態(tài)。

-選擇30-300CFU的平板，計數(shù)菌落數(shù)。

4.**結(jié)果計算**：

-查MPN表，根據(jù)陽性管數(shù)計算CFU/g或CFU/mL。

-示例：10?3梯度2管陽性，10??梯度1管陽性，MPN≈80CFU/mL。

（二）傾注平板法

1.**樣品制備**：

-取10g樣品，加入90mL營養(yǎng)肉湯或PBS緩沖液。

-35℃振蕩培養(yǎng)1-2小時，制備富集液。

2.**傾注培養(yǎng)皿**：

-取10mL富集液，加入90mLNA培養(yǎng)基。

-混勻后倒入平皿，37℃培養(yǎng)24-48小時。

3.**菌落挑取**：

-記錄典型菌落（如大腸菌群呈紅色）。

-挑取單個菌落進(jìn)行革蘭染色和生化試驗。

（三）涂片鏡檢法

1.**制備涂片**：

-將少量樣品涂抹在潔凈載玻片上，自然干燥。

-用酒精燈火焰加熱固定（快速通過火焰2-3次）。

2.**染色步驟**：

-革蘭染色：初染（結(jié)晶紫1分鐘）、碘液（1分鐘）、脫色（95%酒精30秒）、復(fù)染（沙弗寧30秒）。

-美蘭染色：初染（美蘭1分鐘）、脫色（水洗）、復(fù)染（堿性復(fù)紅30秒）。

3.**鏡檢操作**：

-使用油鏡（100×）觀察，調(diào)節(jié)亮度。

-記錄菌體形態(tài)（如球菌、桿菌）、顏色（革蘭氏染色結(jié)果）及排列方式。

四、質(zhì)量控制

（一）陽性對照

1.**設(shè)