大腸桿菌積累丙酮酸的機制、影響因素及應(yīng)用探索一、引言1.1研究背景與意義丙酮酸（Pyruvicacid），又稱2-氧代丙酸、α-酮基丙酸或乙酰基甲酸，作為生物代謝進程里極為關(guān)鍵的中間產(chǎn)物，在生物化學(xué)代謝途徑中占據(jù)著舉足輕重的地位。在糖酵解過程中，葡萄糖經(jīng)一系列酶促反應(yīng)生成丙酮酸，每mol葡萄糖可產(chǎn)生2mol丙酮酸、2molATP和2molNADH+H+。丙酮酸不僅是連接糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)（TCA）的紐帶，為TCA循環(huán)提供原料，還可經(jīng)多條代謝路徑生成甲酸、乙酸、蘋果酸、琥珀酸、草酰乙酸和丙氨酸等物質(zhì)，為生物體各項生命活動供能。在工業(yè)領(lǐng)域，丙酮酸的應(yīng)用極為廣泛。在醫(yī)藥工業(yè)中，它是合成多種藥物的重要原料，如用于酶法合成L-色氨酸、L-酪氨酸、L-多巴胺，合成L-半胱氨酸、L-亮氨酸、維生素B6和B12等，還可用于合成血管緊張肽Ⅱ抗藥、系列酶蛋白抑制劑、鎮(zhèn)靜劑、辛可芬、異煙肼丙酮酸鈣、2-苯基喹啉-4-羧酸、恩波吡維銨、磷酸烯醇丙酮酸、4-甲唑甲酸、噻咪等，其中丙酮酸鈣可用作減肥保健藥品。在日化工業(yè)，丙酮酸乙酯能夠抑制表皮中酪氨酸酶的形成，進而達到美白肌膚的效果，還可用作化妝品的防腐劑和抗氧化劑，以及空氣清新劑。在農(nóng)用化學(xué)品方面，丙酮酸是合成乙烯系聚合物、氫化阿托酸、谷物保護劑等多種農(nóng)藥的起始原料。在食品/飼料工業(yè)，依據(jù)GB2760-1996規(guī)定，丙酮酸被用作酸味添加劑，同時具備防腐保鮮功能。在細胞培養(yǎng)與生化研究中，丙酮酸與乳酸組成抗氧化劑，可降低對細胞的傷害，丙酮酸鈉還能作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源，是動物細胞培養(yǎng)的重要底物，也用于伯醇及仲醇的鑒定、轉(zhuǎn)氨酶的測定、脂肪族胺的顯色劑等。隨著各行業(yè)的發(fā)展，對丙酮酸的需求日益增長。目前全球丙酮酸市場需求約24000噸，按國內(nèi)市場價5萬元/噸計算，市場總值約12億。我國約有10家企業(yè)生產(chǎn)丙酮酸及其鹽、酯類，年產(chǎn)量約1000-1500噸，其中80%以上用于出口，且國內(nèi)丙酮酸市場年增長率達8%-10%。隨著其工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展，用量急劇上升，國際、國內(nèi)市場缺口較大，高質(zhì)量丙酮酸尤其匱乏，市場已步入高速成長期。生產(chǎn)丙酮酸的方法主要有化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法多是在液相或氣相中將酒石酸（或乳酸酯）氧化為丙酮酸酯，再水解成丙酮酸，但該方法污染重、成本高，缺乏競爭力，如以酒石酸與焦硫酸鉀反應(yīng)制備丙酮酸，雖工藝簡便，但對環(huán)境污染嚴(yán)重，設(shè)備損耗大，底物轉(zhuǎn)化率低。酶轉(zhuǎn)化法利用微生物細胞中的酶系將乳酸等脫氫氧化為丙酮酸，轉(zhuǎn)化率高，但底物成本高，目前工業(yè)化方面存在較大困難，尚未見工業(yè)化生產(chǎn)成功的報道。微生物發(fā)酵法則是以低成本的葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸，具有產(chǎn)品純度高、成本低、轉(zhuǎn)化率高、對環(huán)境污染小等優(yōu)點，已成為國內(nèi)外最受青睞的生產(chǎn)方法。自然界中能合成丙酮酸的微生物眾多，如球擬酵母、假絲酵母、釀酒酵母、大腸桿菌屬等。大腸桿菌作為一種模式微生物，遺傳背景清晰，生長迅速，易于培養(yǎng)和基因操作，是進行代謝工程改造以積累丙酮酸的理想宿主。野生型大腸桿菌發(fā)酵通常不會積累丙酮酸，然而通過代謝工程手段對其代謝途徑進行有效改造，能夠阻斷丙酮酸的消耗途徑，強化丙酮酸的合成途徑，從而實現(xiàn)丙酮酸的積累。如敲除大腸桿菌中某些關(guān)鍵基因，可改變其代謝流向，使丙酮酸得以積累。對大腸桿菌進行代謝工程改造以積累丙酮酸的研究具有重大意義。從學(xué)術(shù)研究角度來看，有助于深入理解大腸桿菌的代謝調(diào)控機制，為微生物代謝工程領(lǐng)域的理論研究提供豐富的數(shù)據(jù)和實踐依據(jù)，拓展對生物代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性和可塑性的認(rèn)知。在工業(yè)生產(chǎn)方面，能夠為丙酮酸的大規(guī)模、高效、低成本生產(chǎn)提供新的技術(shù)路線和工程菌株，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，增強產(chǎn)品在市場上的競爭力，推動相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。還符合綠色化學(xué)和可持續(xù)發(fā)展的理念，減少對環(huán)境的污染，具有顯著的環(huán)境效益和社會效益。1.2研究目的與內(nèi)容1.2.1研究目的本研究旨在通過代謝工程手段，對大腸桿菌的代謝途徑進行精準(zhǔn)改造，深入解析大腸桿菌積累丙酮酸的代謝機制，提高丙酮酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率，為丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。具體而言，一是通過基因編輯技術(shù)敲除或弱化大腸桿菌中丙酮酸的消耗途徑相關(guān)基因，同時強化丙酮酸合成途徑相關(guān)基因的表達，構(gòu)建高效積累丙酮酸的大腸桿菌工程菌株；二是探究不同培養(yǎng)條件對工程菌株積累丙酮酸的影響，優(yōu)化發(fā)酵工藝，提高丙酮酸的產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度；三是深入研究大腸桿菌積累丙酮酸過程中的代謝調(diào)控機制，為進一步優(yōu)化菌株性能和發(fā)酵工藝提供理論指導(dǎo)。1.2.2研究內(nèi)容本研究的主要內(nèi)容包括以下幾個方面：構(gòu)建積累丙酮酸的大腸桿菌工程菌株：對大腸桿菌的代謝途徑進行系統(tǒng)分析，確定丙酮酸消耗途徑的關(guān)鍵基因，如乳酸脫氫酶基因（ldhA）、丙酮酸氧化酶基因（poxB）、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因（pta）和乙酸激酶基因（ackA）等。運用CRISPR-Cas9等基因編輯技術(shù)，對上述關(guān)鍵基因進行敲除或弱化，阻斷丙酮酸向乳酸、乙酸等副產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化途徑，使代謝流更多地流向丙酮酸的合成。同時，過表達丙酮酸合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因（pck）、丙酮酸激酶基因（pyk）等，增強丙酮酸的合成能力。將構(gòu)建好的基因編輯載體導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過抗性篩選和PCR驗證等方法，獲得穩(wěn)定遺傳的積累丙酮酸的大腸桿菌工程菌株。優(yōu)化工程菌株積累丙酮酸的發(fā)酵條件：研究不同碳源（如葡萄糖、果糖、木糖等）、氮源（如酵母粉、蛋白胨、硫酸銨等）及其濃度對工程菌株生長和丙酮酸積累的影響，確定最佳的碳氮源組合和濃度?？疾炫囵B(yǎng)溫度、pH值、溶氧等培養(yǎng)條件對工程菌株積累丙酮酸的影響，通過單因素實驗和響應(yīng)面實驗等方法，優(yōu)化發(fā)酵條件，提高丙酮酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。探究不同發(fā)酵方式（如分批發(fā)酵、補料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵等）對工程菌株積累丙酮酸的影響，選擇最適合的發(fā)酵方式，并對發(fā)酵過程中的參數(shù)進行優(yōu)化，如補料策略、發(fā)酵時間等。解析大腸桿菌積累丙酮酸的代謝調(diào)控機制：采用代謝通量分析（MFA）技術(shù)，對野生型大腸桿菌和工程菌株在不同培養(yǎng)條件下的代謝通量進行測定和分析，明確代謝途徑中各反應(yīng)的通量分布情況，揭示基因編輯和發(fā)酵條件對代謝流分配的影響。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析野生型大腸桿菌和工程菌株在基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達水平上的差異，篩選出與丙酮酸積累相關(guān)的關(guān)鍵基因和蛋白質(zhì)，深入研究它們在代謝調(diào)控中的作用機制。研究細胞內(nèi)的能量代謝和氧化還原平衡對丙酮酸積累的影響，如ATP、NADH等物質(zhì)的濃度變化與丙酮酸合成和消耗之間的關(guān)系，以及如何通過調(diào)節(jié)能量代謝和氧化還原平衡來提高丙酮酸的積累量。1.3研究方法與創(chuàng)新點本研究綜合運用了多種先進的實驗方法和分析技術(shù)，致力于實現(xiàn)對大腸桿菌積累丙酮酸的深入探究。在菌株構(gòu)建方面，采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，這一技術(shù)具有精準(zhǔn)、高效的特點，能夠在大腸桿菌基因組上實現(xiàn)對特定基因的敲除、插入或替換。以構(gòu)建積累丙酮酸的大腸桿菌工程菌株為例，首先針對乳酸脫氫酶基因（ldhA）、丙酮酸氧化酶基因（poxB）等目標(biāo)基因，設(shè)計特異性的sgRNA（single-guideRNA）。通過體外轉(zhuǎn)錄等方法獲得sgRNA后，與Cas9蛋白組裝形成核糖核蛋白復(fù)合體（RNP）。利用電轉(zhuǎn)化等方式將RNP導(dǎo)入大腸桿菌細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)，sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白識別并結(jié)合到目標(biāo)基因的特定序列上，Cas9蛋白發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性，對目標(biāo)基因進行切割，造成雙鏈斷裂。細胞自身的修復(fù)機制會對斷裂的DNA進行修復(fù)，在此過程中，可通過同源重組等方式引入特定的基因編輯，如敲除目標(biāo)基因，從而構(gòu)建出積累丙酮酸的工程菌株。相較于傳統(tǒng)的基因敲除方法，CRISPR-Cas9技術(shù)具有更高的靶向性和編輯效率，能夠更準(zhǔn)確地對大腸桿菌代謝途徑中的關(guān)鍵基因進行改造，減少對其他基因的非特異性影響。在發(fā)酵條件優(yōu)化實驗中，運用單因素實驗和響應(yīng)面實驗相結(jié)合的方法。單因素實驗是指每次只改變一個實驗因素，而其他因素保持不變，通過觀察該因素對實驗結(jié)果的影響，初步確定各因素對工程菌株積累丙酮酸的影響趨勢和大致的適宜范圍。以碳源種類對丙酮酸積累的影響實驗為例，分別以葡萄糖、果糖、木糖等不同碳源為唯一碳源，在相同的其他培養(yǎng)條件下培養(yǎng)工程菌株，測定丙酮酸產(chǎn)量，從而確定哪種碳源更有利于丙酮酸的積累。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面實驗進一步優(yōu)化發(fā)酵條件。響應(yīng)面實驗是一種基于統(tǒng)計學(xué)原理的實驗設(shè)計方法，它能夠同時考慮多個因素及其交互作用對實驗響應(yīng)值（如丙酮酸產(chǎn)量）的影響。通過Design-Expert等軟件設(shè)計實驗方案，建立數(shù)學(xué)模型，對實驗結(jié)果進行分析和優(yōu)化，確定最佳的發(fā)酵條件組合，如最佳的碳源、氮源濃度以及溫度、pH值等培養(yǎng)條件的組合，以提高丙酮酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。代謝調(diào)控機制研究中，代謝通量分析（MFA）技術(shù)是關(guān)鍵手段之一。MFA是基于代謝網(wǎng)絡(luò)的化學(xué)計量學(xué)原理，通過測量細胞外代謝物的攝取和分泌速率，以及細胞內(nèi)代謝物的濃度，運用數(shù)學(xué)模型和計算方法，定量分析細胞內(nèi)各代謝途徑的通量分布情況。以分析大腸桿菌中丙酮酸合成和消耗途徑的代謝通量為例，首先在特定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)大腸桿菌，收集細胞外的培養(yǎng)基，采用高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜（MS）等分析技術(shù)測定葡萄糖、丙酮酸、乳酸、乙酸等代謝物的濃度變化，計算其攝取和分泌速率。同時，通過細胞破碎、提取等方法獲得細胞內(nèi)代謝物，測定其濃度。然后，根據(jù)大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，運用代謝通量分析軟件，如COBRAToolbox等，進行通量計算和分析，確定代謝途徑中各反應(yīng)的通量大小和流向，從而明確基因編輯和發(fā)酵條件對代謝流分配的影響，為深入理解大腸桿菌積累丙酮酸的代謝調(diào)控機制提供數(shù)據(jù)支持。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也被用于從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達層面揭示代謝調(diào)控機制。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是研究細胞在某一狀態(tài)下所有轉(zhuǎn)錄本的集合，通過高通量測序技術(shù)，如RNA-seq，對野生型大腸桿菌和工程菌株的mRNA進行測序和分析，比較兩者在基因轉(zhuǎn)錄水平上的差異，篩選出與丙酮酸積累相關(guān)的差異表達基因。蛋白質(zhì)組學(xué)則是研究細胞或組織中全部蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律，采用雙向凝膠電泳（2-DE）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）等技術(shù)，分離和鑒定野生型和工程菌株中的蛋白質(zhì)，分析蛋白質(zhì)表達水平的變化，確定與丙酮酸積累相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。通過整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)，能夠全面深入地了解大腸桿菌積累丙酮酸過程中基因表達和蛋白質(zhì)合成的調(diào)控機制，為進一步優(yōu)化菌株性能和發(fā)酵工藝提供理論依據(jù)。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面。在研究方法上，首次將CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)、代謝通量分析技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進行系統(tǒng)整合，從基因編輯、代謝通量、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達等多個層面，全面深入地研究大腸桿菌積累丙酮酸的機制，為該領(lǐng)域的研究提供了一種全新的技術(shù)路線和研究思路。在研究結(jié)論方面，通過對大腸桿菌代謝途徑的精準(zhǔn)改造和發(fā)酵條件的優(yōu)化，有望獲得比現(xiàn)有研究更高的丙酮酸產(chǎn)量和生產(chǎn)效率，為丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供更具競爭力的技術(shù)方案。還可能發(fā)現(xiàn)一些新的與丙酮酸積累相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)，以及新的代謝調(diào)控機制，豐富和拓展對大腸桿菌代謝工程的認(rèn)知，為后續(xù)的研究和應(yīng)用奠定堅實的基礎(chǔ)。二、大腸桿菌積累丙酮酸的機制剖析2.1大腸桿菌的基礎(chǔ)代謝途徑大腸桿菌作為一種模式微生物，其基礎(chǔ)代謝途徑涵蓋了糖類、氨基酸、脂類和維生素代謝等多個方面，這些代謝途徑相互關(guān)聯(lián)、相互影響，共同維持著細胞的生命活動。在糖類代謝方面，大腸桿菌的糖類代謝是一個極為復(fù)雜且精妙的過程，涉及多種酶的協(xié)同參與以及多種代謝途徑的交織。葡萄糖是大腸桿菌最常利用的碳源，在其代謝起始階段，葡萄糖在己糖激酶的催化作用下發(fā)生磷酸化反應(yīng)，生成葡萄糖-6-磷酸。這一磷酸化步驟不僅使葡萄糖得以活化，便于后續(xù)的代謝反應(yīng)，還能有效防止葡萄糖從細胞內(nèi)擴散出去。隨后，葡萄糖-6-磷酸進入糖酵解途徑，經(jīng)過一系列由特定酶催化的反應(yīng)，逐步轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸，最終生成丙酮酸。在這一過程中，每分子葡萄糖可產(chǎn)生2分子丙酮酸、2分子ATP和2分子NADH+H+，為細胞提供了重要的能量和還原力，是大腸桿菌能量代謝的關(guān)鍵起始步驟。丙酮酸生成后，在有氧條件下，會進入三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）和氧化磷酸化過程。在TCA循環(huán)中，丙酮酸首先被轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，隨后與草酰乙酸結(jié)合，進入一系列復(fù)雜的氧化還原反應(yīng)。在這個過程中，會產(chǎn)生大量的NADH和FADH2，這些電子載體攜帶的電子會進入電子傳遞鏈，最終與氧氣結(jié)合生成水，同時通過氧化磷酸化作用產(chǎn)生大量的ATP。TCA循環(huán)不僅為大腸桿菌提供了大量的能量，還產(chǎn)生了許多重要的中間產(chǎn)物，如α-酮戊二酸、琥珀酰輔酶A等，這些中間產(chǎn)物可作為其他代謝途徑的原料，參與到氨基酸、脂類等物質(zhì)的合成中。除了糖酵解和TCA循環(huán)，大腸桿菌還存在磷酸戊糖途徑來代謝糖類。在磷酸戊糖途徑中，葡萄糖-6-磷酸首先被轉(zhuǎn)化為核糖-5-磷酸，核糖-5-磷酸是核酸合成的重要原料，對于大腸桿菌的遺傳物質(zhì)復(fù)制和基因表達起著不可或缺的作用。該途徑還產(chǎn)生NADPH，NADPH作為一種強還原劑，在大腸桿菌合成脂肪酸、氨基酸和其他生物分子的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為這些生物合成反應(yīng)提供必要的還原力。磷酸戊糖途徑還能產(chǎn)生五碳糖，這些五碳糖可用于合成細胞壁成分和調(diào)節(jié)物質(zhì)，對于維持大腸桿菌細胞的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性具有重要意義。大腸桿菌的氨基酸代謝同樣是一個多步驟、復(fù)雜且有序的過程，涉及氨基酸的合成、分解和轉(zhuǎn)化等多個環(huán)節(jié)。在氨基酸合成方面，大腸桿菌能夠利用簡單的碳源、氮源和其他營養(yǎng)物質(zhì)，通過一系列酶促反應(yīng)合成自身生長所需的非必需氨基酸。這些氨基酸合成途徑中的關(guān)鍵酶受到嚴(yán)格的調(diào)控，以確保細胞內(nèi)氨基酸的平衡和正常代謝。大腸桿菌也能攝取環(huán)境中的氨基酸進行代謝。在氨基酸的分解代謝過程中，主要包括脫氨基作用、轉(zhuǎn)氨基作用、脫羧作用和氧化作用等。脫氨基作用是氨基酸分解的重要步驟之一，在這一過程中，氨基酸通過酶的作用脫去氨基，生成相應(yīng)的酮酸和氨。例如，丙氨酸在谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用下，將氨基轉(zhuǎn)移給α-酮戊二酸，生成丙酮酸和谷氨酸。氨在肝臟中通常會轉(zhuǎn)化為尿素，通過血液運輸?shù)侥I臟排出體外，而酮酸則可以進入TCA循環(huán)，作為能量代謝的中間產(chǎn)物，繼續(xù)參與細胞的能量供應(yīng)和物質(zhì)合成。轉(zhuǎn)氨基作用則是通過轉(zhuǎn)氨基酶的作用，將氨基酸的氨基從一個氨基酸轉(zhuǎn)移到另一個氨基酸上，從而生成新的氨基酸。這一過程不僅能夠產(chǎn)生新的氨基酸，滿足細胞對不同氨基酸的需求，還能夠?qū)睆挠卸镜挠坞x氨基形式轉(zhuǎn)化為相對無毒的酮酸形式，維持細胞內(nèi)的氮平衡和代謝穩(wěn)定。氨基酸的脫羧作用和氧化作用也是氨基酸代謝的重要組成部分，脫羧作用會使氨基酸脫去羧基，生成相應(yīng)的胺類和二氧化碳，而氧化作用則通過逐步氧化氨基酸，釋放出能量，為細胞的生命活動提供動力。脂類代謝在大腸桿菌的生理功能中同樣扮演著重要角色，是一個涉及脂肪酸合成、分解和轉(zhuǎn)化的復(fù)雜過程。在脂肪酸合成過程中，大腸桿菌以乙酰輔酶A為原料，在一系列酶的催化下，經(jīng)過多次縮合、還原、脫水等反應(yīng)，逐步合成多種長鏈脂肪酸，如棕櫚酸、硬脂酸和油酸等。據(jù)研究，大腸桿菌每分鐘可以合成約1000個脂肪酸分子，這些脂肪酸對于維持細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。細胞膜主要由磷脂雙分子層和蛋白質(zhì)組成，脂肪酸作為磷脂的重要組成部分，決定了細胞膜的流動性、通透性和穩(wěn)定性。在實驗室培養(yǎng)條件下，大腸桿菌合成的脂肪酸可占總細胞質(zhì)量的5%。脂肪酸的分解則是脂類代謝的另一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在大腸桿菌中，脂肪酸主要通過β-氧化途徑進行分解。β-氧化過程包括脫氫、水合、再脫氫和硫解四個步驟，每個步驟都由特定的酶催化。以硬脂酸為例，在β-氧化過程中，它會逐步被分解為8個乙酰輔酶A分子，這些乙酰輔酶A進而進入TCA循環(huán)，徹底氧化為二氧化碳和水，同時釋放出大量的能量，為細胞提供維持生命活動所需的動力。除了脂肪酸的合成和分解，大腸桿菌還具備脂類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和儲存能力。在外界營養(yǎng)豐富時，大腸桿菌可以攝取并儲存多余的脂類物質(zhì)；而在營養(yǎng)不足的情況下，脂類可以轉(zhuǎn)化為糖類和氨基酸，為細胞提供必需的代謝物質(zhì)，以維持細胞的生存和生長。在動物飼料中添加適量的脂肪，可以提高飼料的能量密度，從而提高動物的采食量和生長速度。研究表明，添加2%的脂肪可以顯著提高豬的日增重（約提高20%），這也從側(cè)面反映了脂類代謝在生物生長過程中的重要性。維生素代謝對于大腸桿菌的正常生長和代謝同樣不可或缺。維生素是一類微生物正常生長和代謝所必需的小分子有機化合物，雖然需求量較少，但在細胞的各種生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。大腸桿菌能夠合成多種維生素，包括維生素B群和維生素K等。其中，維生素B群包括維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9和B12等，這些維生素在動物和人體中均具有重要的生理功能。維生素B1（硫胺素）是碳水化合物代謝的關(guān)鍵輔酶，它參與丙酮酸脫氫酶復(fù)合體和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的組成，在糖代謝的關(guān)鍵步驟中發(fā)揮作用。缺乏硫胺素會導(dǎo)致能量代謝障礙，使丙酮酸無法正常進入TCA循環(huán)，從而影響細胞的能量供應(yīng)，還可能引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。這些基礎(chǔ)代謝途徑并非孤立存在，而是相互關(guān)聯(lián)、相互協(xié)調(diào)，構(gòu)成了一個復(fù)雜而精細的代謝網(wǎng)絡(luò)。糖類代謝產(chǎn)生的丙酮酸不僅是TCA循環(huán)的重要底物，還可以通過轉(zhuǎn)氨基作用參與氨基酸的合成；氨基酸代謝產(chǎn)生的酮酸可以進入TCA循環(huán)，為細胞提供能量，同時也可以作為合成其他物質(zhì)的原料；脂類代謝與糖類代謝之間也存在密切聯(lián)系，脂肪酸分解產(chǎn)生的乙酰輔酶A可以進入TCA循環(huán)，參與能量代謝，而糖類也可以通過一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化為脂肪酸，用于脂類的合成；維生素作為輔酶或輔基，參與到各個代謝途徑中的酶促反應(yīng)中，對代謝過程起著重要的調(diào)節(jié)作用。這種相互關(guān)聯(lián)的代謝網(wǎng)絡(luò)使得大腸桿菌能夠根據(jù)環(huán)境條件和自身需求，靈活調(diào)節(jié)代謝流向，高效地利用營養(yǎng)物質(zhì)，維持細胞的正常生長和生命活動。2.2丙酮酸在代謝網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵地位在大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)中，丙酮酸處于核心樞紐位置，連接著多條重要的代謝途徑，對能量代謝和物質(zhì)合成起著至關(guān)重要的作用。從能量代謝角度來看，丙酮酸是糖酵解途徑的最終產(chǎn)物，也是三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）的重要起始底物，在細胞能量產(chǎn)生過程中扮演著承上啟下的關(guān)鍵角色。在糖酵解過程中，葡萄糖經(jīng)一系列復(fù)雜的酶促反應(yīng)逐步轉(zhuǎn)化為丙酮酸，這一過程不僅為細胞提供了少量的ATP和NADH，還為后續(xù)的能量代謝奠定了基礎(chǔ)。每mol葡萄糖通過糖酵解生成2mol丙酮酸的同時，產(chǎn)生2molATP和2molNADH+H+，這些能量和還原力對于維持細胞的基本生理功能，如物質(zhì)運輸、生物合成等至關(guān)重要。當(dāng)細胞處于有氧環(huán)境時，丙酮酸會進入線粒體，在丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的催化下，氧化脫羧生成乙酰輔酶A，隨后乙酰輔酶A進入TCA循環(huán)。在TCA循環(huán)中，乙酰輔酶A與草酰乙酸結(jié)合，經(jīng)過一系列氧化還原反應(yīng)，徹底分解為二氧化碳和水，同時產(chǎn)生大量的NADH、FADH2和ATP。這些電子載體攜帶的電子進入電子傳遞鏈，通過氧化磷酸化作用，最終產(chǎn)生大量的ATP，為細胞的各種生命活動提供充足的能量。據(jù)研究，1mol葡萄糖經(jīng)糖酵解、丙酮酸氧化脫羧和TCA循環(huán)徹底氧化分解，總共可產(chǎn)生約30-32molATP，而其中大部分ATP的產(chǎn)生都依賴于丙酮酸在后續(xù)代謝途徑中的轉(zhuǎn)化。在物質(zhì)合成方面，丙酮酸作為重要的中間代謝產(chǎn)物，參與了多種生物分子的合成過程，為細胞的生長、繁殖和維持正常生理功能提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。丙酮酸可以通過轉(zhuǎn)氨基作用生成丙氨酸，這是體內(nèi)合成非必需氨基酸的重要途徑之一。在轉(zhuǎn)氨酶的催化下，丙酮酸與谷氨酸等氨基酸發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成丙氨酸和α-酮戊二酸，從而實現(xiàn)了氮元素在不同化合物之間的轉(zhuǎn)移和利用。丙酮酸還可通過一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，草酰乙酸是TCA循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，同時也是合成天冬氨酸、天冬酰胺等氨基酸的前體物質(zhì)。在脂肪酸合成過程中，丙酮酸氧化脫羧產(chǎn)生的乙酰輔酶A是合成脂肪酸的基本原料。乙酰輔酶A在一系列酶的作用下，經(jīng)過多次縮合、還原等反應(yīng)，逐步合成脂肪酸，用于構(gòu)建細胞膜、儲存能量等。丙酮酸還參與了其他生物分子的合成，如維生素、輔酶等，這些生物分子在細胞的代謝調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。丙酮酸在大腸桿菌代謝網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵地位還體現(xiàn)在它能夠根據(jù)細胞內(nèi)外環(huán)境的變化，靈活調(diào)節(jié)代謝流的分配，以滿足細胞在不同生理狀態(tài)下的需求。當(dāng)細胞處于快速生長階段，需要大量的能量和生物合成原料時，代謝流會更多地流向丙酮酸的合成和利用，以支持細胞的生長和分裂。而當(dāng)細胞面臨環(huán)境壓力，如營養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激等時，丙酮酸的代謝途徑會發(fā)生相應(yīng)的改變，通過調(diào)節(jié)代謝流，增強細胞的應(yīng)激適應(yīng)能力。在缺氧條件下，大腸桿菌會啟動發(fā)酵途徑，將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸或乙醇等發(fā)酵產(chǎn)物，以維持細胞的能量供應(yīng)和氧化還原平衡。這種代謝調(diào)節(jié)機制使得大腸桿菌能夠在復(fù)雜多變的環(huán)境中生存和繁衍。2.3積累丙酮酸的潛在機制探討從基因?qū)用鎭砜?，大腸桿菌積累丙酮酸的過程涉及多個基因的協(xié)同作用與精細調(diào)控。在丙酮酸的合成途徑中，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因（pck）和丙酮酸激酶基因（pyk）發(fā)揮著關(guān)鍵作用。pck編碼的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶能夠催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，同時消耗ATP，這一反應(yīng)不僅為三羧酸循環(huán)提供了重要的中間產(chǎn)物草酰乙酸，還能通過調(diào)節(jié)PEP和丙酮酸之間的代謝平衡，影響丙酮酸的合成。當(dāng)pck基因過表達時，能夠顯著提高磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表達水平和活性，從而增強從PEP到草酰乙酸的轉(zhuǎn)化效率，使得更多的PEP得以進入丙酮酸合成途徑，進而增加丙酮酸的合成量。研究表明，在敲除了某些競爭性代謝途徑相關(guān)基因的大腸桿菌工程菌株中，過表達pck基因可使丙酮酸產(chǎn)量提高30%-50%。pyk基因編碼的丙酮酸激酶則催化PEP和ADP反應(yīng)生成丙酮酸和ATP，是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶之一。其活性的高低直接影響著丙酮酸的合成速率。通過對pyk基因進行優(yōu)化改造，如定點突變、啟動子替換等，可增強丙酮酸激酶的活性和穩(wěn)定性，提高其對底物PEP的親和力，從而促進丙酮酸的合成。有研究報道，將pyk基因的啟動子替換為強啟動子，使丙酮酸激酶的表達量提高了2-3倍，相應(yīng)地，丙酮酸的產(chǎn)量也得到了顯著提升，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，丙酮酸產(chǎn)量較原始菌株提高了約1.5倍。在丙酮酸的消耗途徑中，乳酸脫氫酶基因（ldhA）、丙酮酸氧化酶基因（poxB）、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因（pta）和乙酸激酶基因（ackA）等起著重要作用。ldhA編碼的乳酸脫氫酶在無氧或低氧條件下，可催化丙酮酸還原為乳酸，這一過程消耗NADH，使細胞內(nèi)的氧化還原平衡得以維持，但同時也減少了丙酮酸的積累量。通過基因敲除技術(shù)敲除ldhA基因，阻斷丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化途徑，能夠使代謝流更多地流向丙酮酸的積累，從而提高丙酮酸的產(chǎn)量。相關(guān)實驗數(shù)據(jù)表明，敲除ldhA基因的大腸桿菌工程菌株在發(fā)酵過程中，丙酮酸的積累量較野生型菌株提高了2-3倍，而乳酸的產(chǎn)量則顯著降低。poxB基因編碼的丙酮酸氧化酶能夠催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酰輔酶A、二氧化碳和NADH，這一過程是有氧呼吸中丙酮酸的主要消耗途徑之一。敲除poxB基因，可有效抑制丙酮酸的有氧氧化，減少丙酮酸的消耗，使更多的丙酮酸得以積累。研究發(fā)現(xiàn)，在敲除poxB基因的大腸桿菌工程菌株中，丙酮酸的產(chǎn)量在有氧發(fā)酵條件下提高了40%-60%。pta和ackA基因共同參與丙酮酸向乙酸的轉(zhuǎn)化過程，pta編碼的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰磷酸，ackA編碼的乙酸激酶則將乙酰磷酸轉(zhuǎn)化為乙酸和ATP。敲除pta和ackA基因，可阻斷丙酮酸向乙酸的轉(zhuǎn)化途徑，進一步提高丙酮酸的積累量。實驗結(jié)果顯示，同時敲除pta和ackA基因的大腸桿菌工程菌株，在發(fā)酵過程中丙酮酸的產(chǎn)量較對照菌株提高了約1.8倍，乙酸的產(chǎn)量則明顯下降。從酶的角度分析，上述基因編碼的酶在大腸桿菌積累丙酮酸的過程中，其活性和表達水平的變化對丙酮酸的合成和消耗起著直接的調(diào)控作用。除了前面提到的關(guān)鍵酶外，磷酸果糖激酶（PFK）作為糖酵解途徑中的另一個重要限速酶，其活性也對丙酮酸的合成有著重要影響。PFK催化果糖-6-磷酸磷酸化生成果糖-1,6-二磷酸，這是糖酵解途徑中的一個關(guān)鍵不可逆反應(yīng)。當(dāng)PFK活性增強時，糖酵解途徑的代謝流加快，更多的葡萄糖被轉(zhuǎn)化為丙酮酸。通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的代謝物濃度，如ATP、ADP、檸檬酸等，可對PFK的活性進行變構(gòu)調(diào)節(jié)。ATP和檸檬酸是PFK的別構(gòu)抑制劑，當(dāng)細胞內(nèi)ATP和檸檬酸濃度較高時，它們會結(jié)合到PFK的別構(gòu)調(diào)節(jié)位點上，使PFK的活性降低，從而減緩糖酵解途徑的速率，減少丙酮酸的合成；而ADP則是PFK的別構(gòu)激活劑，當(dāng)細胞內(nèi)ADP濃度升高時，它能與PFK結(jié)合，激活PFK的活性，促進糖酵解途徑的進行，增加丙酮酸的合成。轉(zhuǎn)酮醇酶（TKT）和轉(zhuǎn)醛醇酶（TAL）在磷酸戊糖途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們催化的反應(yīng)可生成多種磷酸戊糖和磷酸己糖，這些中間產(chǎn)物不僅是核酸合成的重要原料，還能通過與糖酵解途徑的相互關(guān)聯(lián)，影響丙酮酸的合成。當(dāng)磷酸戊糖途徑的代謝流增強時，可產(chǎn)生更多的NADPH，為細胞的生物合成反應(yīng)提供充足的還原力，同時也能通過調(diào)節(jié)代謝物的濃度，間接影響丙酮酸的合成。在某些情況下，通過過表達TKT和TAL基因，增強磷酸戊糖途徑的活性，可使細胞內(nèi)的代謝物濃度發(fā)生變化，從而促進丙酮酸的合成。有研究表明，在過表達TKT和TAL基因的大腸桿菌工程菌株中，丙酮酸的產(chǎn)量較對照菌株提高了15%-25%。從代謝流角度來看，通過對大腸桿菌代謝網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)分析和調(diào)控，可以實現(xiàn)代謝流的重新分配，使更多的碳源流向丙酮酸的合成途徑，從而提高丙酮酸的積累量。在野生型大腸桿菌中，碳源在進入細胞后，會通過多條代謝途徑進行代謝，包括糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)等，代謝流在這些途徑之間的分配相對平衡。當(dāng)對大腸桿菌進行代謝工程改造后，如敲除丙酮酸消耗途徑相關(guān)基因，過表達丙酮酸合成途徑相關(guān)基因，以及優(yōu)化發(fā)酵條件等，可改變代謝網(wǎng)絡(luò)中各反應(yīng)的通量分布，使代謝流更多地流向丙酮酸的合成。以碳源葡萄糖為例，在正常情況下，葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑生成丙酮酸后，部分丙酮酸會進入三羧酸循環(huán)進行有氧氧化，為細胞提供能量，同時也會有一部分丙酮酸通過其他途徑轉(zhuǎn)化為乳酸、乙酸等副產(chǎn)物。當(dāng)敲除ldhA、poxB、pta和ackA等基因后，丙酮酸向乳酸、乙酸等副產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化途徑被阻斷，代謝流被迫重新分配。原本流向這些副產(chǎn)物合成途徑的碳源，現(xiàn)在更多地流向丙酮酸的積累，從而提高了丙酮酸的產(chǎn)量。同時，過表達pck和pyk等基因，增強了丙酮酸的合成能力，使得從糖酵解途徑產(chǎn)生的丙酮酸能夠更有效地積累下來。在優(yōu)化發(fā)酵條件方面，通過調(diào)整碳氮源的比例、培養(yǎng)溫度、pH值和溶氧等因素，可進一步影響細胞的代謝活性和代謝途徑的通量分布。在較低的溶氧條件下，細胞的有氧呼吸受到一定程度的抑制，代謝流會更多地流向發(fā)酵途徑，從而有利于丙酮酸的積累。研究表明，將溶氧控制在一定的較低水平（如20%-30%飽和度），可使丙酮酸的產(chǎn)量較正常溶氧條件下提高20%-30%。通過合理的補料策略，如在發(fā)酵過程中適時補充葡萄糖等碳源，可維持細胞的生長和代謝活性，保證丙酮酸合成所需的底物供應(yīng)，進一步提高丙酮酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。三、影響大腸桿菌積累丙酮酸的因素探究3.1基因?qū)用娴挠绊懸蛩?.1.1關(guān)鍵基因敲除對積累的影響在大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)中，敲除某些關(guān)鍵基因?qū)Ρ岬姆e累和代謝途徑有著顯著影響。aceE基因編碼丙酮酸脫氫酶多酶復(fù)合體PdhR的關(guān)鍵酶之一，該多酶復(fù)合體在丙酮酸代謝中起著核心作用，它能夠催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酰輔酶A，從而將丙酮酸引入三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）進行徹底氧化分解，為細胞提供大量能量。當(dāng)利用Red重組系統(tǒng)敲除大腸桿菌MG1655的aceE基因后，丙酮酸脫氫酶多酶復(fù)合體的功能被破壞，丙酮酸流向TCA循環(huán)的途徑被有效阻斷。這使得丙酮酸無法正常進入TCA循環(huán)進行氧化分解，從而在細胞內(nèi)大量累積。相關(guān)研究表明，在搖瓶發(fā)酵36h的條件下，野生型MG1655菌株幾乎沒有積累丙酮酸，而敲除aceE基因的MG1655ΔaceE::cat菌株卻可以積累26.77g/L丙酮酸。然而，aceE基因的敲除也會對菌體生長產(chǎn)生負(fù)面影響。由于TCA循環(huán)受阻，細胞無法通過該途徑獲得足夠的能量和中間代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致菌體生長受到限制。在培養(yǎng)基中補加5g/LKAc后，可以在一定程度上彌補菌株在生長上的缺陷。這是因為KAc可以作為碳源和能源物質(zhì)，為菌體提供額外的能量和代謝底物，從而促進菌體的生長。lpdA基因編碼的lipoamidedehydrogenase是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體、α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體和甘氨酸裂解多酶體系的組成亞基之一。在以葡萄糖為碳源的有氧條件下，敲除lpdA基因會導(dǎo)致丙酮酸脫氫酶復(fù)合體失活，丙酮酸無法順利轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A進入TCA循環(huán)。這使得丙酮酸在細胞內(nèi)積累，同時也會導(dǎo)致D-乳酸和谷氨酸的積累。研究發(fā)現(xiàn)，敲除lpdA基因后，TCA循環(huán)受到抑制，這是因為丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的失活阻斷了TCA循環(huán)的起始步驟，使得TCA循環(huán)無法正常進行。乙醛酸途徑和磷酸戊糖途徑中的磷酸葡萄糖脫氫酶被激活，這是細胞為了維持代謝平衡而做出的適應(yīng)性反應(yīng)。乙醛酸途徑可以利用乙酸等物質(zhì)合成草酰乙酸，補充TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物，從而維持細胞的代謝活動；磷酸戊糖途徑的激活則可以產(chǎn)生更多的NADPH和磷酸戊糖，為細胞的生物合成提供還原力和原料。在以乙酸或丙酮酸為碳源的有氧發(fā)酵及葡萄糖為碳源的微氧發(fā)酵實驗中，也得到了類似的結(jié)果，進一步驗證了lpdA基因敲除對大腸桿菌代謝的影響。poxB基因編碼的丙酮酸氧化酶是催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酰輔酶A、二氧化碳和NADH的關(guān)鍵酶，在有氧條件下，它是丙酮酸的主要消耗途徑之一。敲除poxB基因后，丙酮酸氧化為乙酰輔酶A的途徑被阻斷，丙酮酸的消耗減少，從而使得更多的丙酮酸得以積累。相關(guān)實驗表明，在敲除poxB基因的大腸桿菌工程菌株中，丙酮酸的產(chǎn)量在有氧發(fā)酵條件下較野生型菌株提高了40%-60%。這說明poxB基因的敲除能夠有效地改變代謝流的分配，使更多的丙酮酸積累下來。丙酮酸氧化酶的缺失還會影響細胞內(nèi)的能量代謝和氧化還原平衡。由于丙酮酸無法通過丙酮酸氧化酶途徑進行氧化分解，細胞內(nèi)的能量產(chǎn)生會受到一定影響，同時NADH的積累也會導(dǎo)致細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變。細胞可能會通過調(diào)整其他代謝途徑來適應(yīng)這種變化，如增強糖酵解途徑的活性，以產(chǎn)生更多的能量和維持氧化還原平衡。3.1.2基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與丙酮酸積累大腸桿菌的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是一個復(fù)雜而精細的系統(tǒng)，它通過多種調(diào)控機制對丙酮酸相關(guān)基因的表達進行精確調(diào)控，從而影響丙酮酸的積累。在這個基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，存在著眾多的轉(zhuǎn)錄因子，它們?nèi)缤爸笓]官”一般，能夠特異性地結(jié)合到DNA的特定區(qū)域，對基因的轉(zhuǎn)錄過程進行調(diào)控。以FruR轉(zhuǎn)錄因子為例，它在大腸桿菌的碳代謝調(diào)控中扮演著重要角色。FruR可以結(jié)合到fruBKA操縱子的啟動子區(qū)域，該操縱子包含了果糖轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān)的基因。當(dāng)細胞外環(huán)境中果糖濃度較低時，F(xiàn)ruR與fruBKA操縱子的啟動子緊密結(jié)合，抑制該操縱子的轉(zhuǎn)錄，從而減少果糖的攝取和代謝。而當(dāng)果糖濃度升高時，果糖會與FruR結(jié)合，導(dǎo)致FruR的構(gòu)象發(fā)生改變，使其無法再與啟動子結(jié)合，進而解除對fruBKA操縱子的抑制，促進果糖的攝取和代謝。這種調(diào)控機制使得大腸桿菌能夠根據(jù)環(huán)境中碳源的變化，靈活地調(diào)整自身的代謝活動。在丙酮酸代謝相關(guān)基因的調(diào)控中，F(xiàn)ruR也發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ruR可以直接或間接地調(diào)控丙酮酸激酶基因（pyk）的表達。當(dāng)FruR抑制fruBKA操縱子轉(zhuǎn)錄時，會導(dǎo)致細胞內(nèi)的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）濃度發(fā)生變化。由于PEP是丙酮酸激酶催化反應(yīng)的底物，其濃度的改變會影響丙酮酸激酶的活性和表達。具體來說，當(dāng)PEP濃度降低時，會反饋調(diào)節(jié)丙酮酸激酶基因的表達，使其表達量下降，從而減少丙酮酸的合成。反之，當(dāng)PEP濃度升高時，會促進丙酮酸激酶基因的表達，增加丙酮酸的合成。這種通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達，進而影響代謝途徑和丙酮酸積累的機制，體現(xiàn)了基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性和精細性。除了轉(zhuǎn)錄因子，小分子RNA（sRNA）在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中也起著不可或缺的作用。sRNA是一類長度較短的非編碼RNA，它們可以通過與靶mRNA互補配對，影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，從而實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。在大腸桿菌中，存在一種名為MicC的sRNA，它可以與丙酮酸氧化酶基因（poxB）的mRNA互補配對。當(dāng)MicC與poxBmRNA結(jié)合后，會形成雙鏈結(jié)構(gòu)，這種雙鏈結(jié)構(gòu)會影響poxBmRNA的穩(wěn)定性，使其更容易被核酸酶降解，從而降低丙酮酸氧化酶的表達水平。丙酮酸氧化酶表達量的降低，會減少丙酮酸的氧化消耗，使得更多的丙酮酸得以積累。研究表明，在過表達MicC的大腸桿菌菌株中，丙酮酸氧化酶的表達量顯著下降，丙酮酸的積累量相應(yīng)增加。這表明sRNA可以作為一種有效的調(diào)控手段，通過影響丙酮酸相關(guān)基因的表達，來調(diào)節(jié)丙酮酸的積累。環(huán)境因素也會對基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生影響，進而間接影響丙酮酸的積累。當(dāng)大腸桿菌處于高溫環(huán)境時，細胞內(nèi)會產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)，其中包括熱休克蛋白的表達上調(diào)。這些熱休克蛋白不僅能夠幫助細胞修復(fù)受損的蛋白質(zhì)，還會參與到基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白可以與某些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，改變它們的活性和結(jié)合能力，從而影響丙酮酸相關(guān)基因的表達。在高溫條件下，熱休克蛋白可能會與調(diào)控丙酮酸合成途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，增強其與DNA的結(jié)合能力，促進丙酮酸合成途徑相關(guān)基因的表達，進而增加丙酮酸的積累。相反，在低溫環(huán)境下，熱休克蛋白的表達量下降，其對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用也會減弱，可能導(dǎo)致丙酮酸合成途徑相關(guān)基因的表達受到抑制，丙酮酸積累量減少。3.2環(huán)境因素的作用3.2.1碳源種類與濃度的影響碳源作為大腸桿菌生長和代謝的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，其種類和濃度對大腸桿菌積累丙酮酸的過程有著顯著影響。不同種類的碳源，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)和代謝途徑的差異，會導(dǎo)致大腸桿菌在生長特性、代謝活性以及丙酮酸積累量等方面呈現(xiàn)出不同的表現(xiàn)。葡萄糖作為一種常見且易于被大腸桿菌利用的碳源，在代謝過程中，它首先通過磷酸化反應(yīng)進入糖酵解途徑，經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)逐步轉(zhuǎn)化為丙酮酸。研究表明，在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌時，細胞能夠快速攝取葡萄糖并進行代謝，生長速率較快。在適宜的條件下，初始葡萄糖濃度為20g/L時，大腸桿菌的生長在對數(shù)期迅速增長，細胞密度在24h內(nèi)可達到較高水平。由于葡萄糖代謝產(chǎn)生的丙酮酸可通過多種途徑進一步代謝，如進入三羧酸循環(huán)進行有氧氧化，或在無氧條件下轉(zhuǎn)化為乳酸等發(fā)酵產(chǎn)物，因此，為了實現(xiàn)丙酮酸的有效積累，需要對大腸桿菌的代謝途徑進行合理調(diào)控。通過敲除乳酸脫氫酶基因（ldhA）等丙酮酸消耗途徑相關(guān)基因，可阻斷丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化，使得更多的丙酮酸得以積累。在敲除ldhA基因的大腸桿菌工程菌株中，以葡萄糖為碳源發(fā)酵時，丙酮酸的產(chǎn)量較野生型菌株提高了2-3倍。果糖作為另一種重要的碳源，其代謝途徑與葡萄糖有所不同。果糖進入大腸桿菌細胞后，首先在果糖激酶的催化下磷酸化生成果糖-1-磷酸，然后經(jīng)過一系列反應(yīng)進入糖酵解途徑。研究發(fā)現(xiàn)，在以果糖為碳源的培養(yǎng)體系中，大腸桿菌的生長和丙酮酸積累情況與葡萄糖為碳源時存在差異。由于果糖代謝過程中某些關(guān)鍵酶的活性和表達水平與葡萄糖代謝不同，導(dǎo)致細胞對果糖的攝取和利用效率有所變化。在某些情況下，以果糖為碳源時大腸桿菌的生長速率相對較慢，但丙酮酸的積累量卻可能更高。當(dāng)果糖濃度為15g/L時，雖然細胞生長達到穩(wěn)定期的時間較葡萄糖為碳源時延長了約12h，但丙酮酸的產(chǎn)量較相同條件下以葡萄糖為碳源時提高了15%-20%。這可能是因為果糖代謝過程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物對丙酮酸合成途徑的關(guān)鍵酶具有激活作用，從而促進了丙酮酸的合成。木糖作為一種五碳糖，其代謝途徑更為復(fù)雜，需要經(jīng)過一系列特殊的酶促反應(yīng)才能進入糖酵解途徑。在大腸桿菌中，木糖首先被木糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化為木酮糖，然后在木酮糖激酶的作用下磷酸化生成木酮糖-5-磷酸，再通過一系列反應(yīng)進入磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑。由于木糖代謝途徑涉及多種特殊的酶，且這些酶的表達和活性受到嚴(yán)格調(diào)控，因此大腸桿菌對木糖的利用能力相對較弱。在以木糖為碳源的培養(yǎng)基中，大腸桿菌的生長速度明顯低于以葡萄糖或果糖為碳源時的情況。當(dāng)木糖濃度為10g/L時，細胞生長緩慢，達到穩(wěn)定期的時間較長。在優(yōu)化的代謝途徑和培養(yǎng)條件下，大腸桿菌以木糖為碳源時仍能積累一定量的丙酮酸。通過過表達木糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因，如木糖異構(gòu)酶基因和木酮糖激酶基因，可增強大腸桿菌對木糖的利用能力，提高丙酮酸的積累量。在過表達木糖異構(gòu)酶基因和木酮糖激酶基因的大腸桿菌工程菌株中，以木糖為碳源發(fā)酵時，丙酮酸的產(chǎn)量較未改造菌株提高了約30%。甘露糖也是大腸桿菌可利用的碳源之一，其代謝途徑與葡萄糖有一定的相似性，但在某些關(guān)鍵步驟上存在差異。甘露糖進入細胞后，首先在甘露糖激酶的催化下磷酸化生成甘露糖-6-磷酸，然后經(jīng)過異構(gòu)化等反應(yīng)進入糖酵解途徑。研究表明，在以甘露糖為碳源的培養(yǎng)體系中，大腸桿菌的生長和丙酮酸積累呈現(xiàn)出獨特的規(guī)律。在初始甘露糖濃度為12g/L時，菌濃度很快達到平臺期，隨后丙酮酸積累和甘露糖消耗都表現(xiàn)為線性變化。這可能是因為甘露糖代謝過程中某些中間代謝產(chǎn)物對細胞生長和丙酮酸合成的調(diào)節(jié)機制與其他碳源不同。甘露糖代謝產(chǎn)生的甘露糖-6-磷酸可能對細胞內(nèi)的某些信號通路產(chǎn)生影響，從而調(diào)節(jié)細胞的生長和代謝活動。碳源濃度對大腸桿菌積累丙酮酸也有著重要影響。當(dāng)碳源濃度過低時，細胞生長和代謝所需的能量和底物不足，導(dǎo)致大腸桿菌的生長受到限制，丙酮酸的合成也相應(yīng)減少。在葡萄糖濃度低于5g/L時，大腸桿菌的生長緩慢，丙酮酸產(chǎn)量較低。而當(dāng)碳源濃度過高時，可能會對細胞產(chǎn)生滲透壓脅迫等不利影響，抑制細胞的生長和代謝，同時也可能導(dǎo)致代謝途徑的失衡，使丙酮酸的積累量下降。當(dāng)葡萄糖濃度高于30g/L時，細胞生長受到抑制，丙酮酸產(chǎn)量也會隨著碳源濃度的進一步升高而降低。這是因為高濃度的碳源會導(dǎo)致細胞內(nèi)的滲透壓升高，影響細胞膜的通透性和細胞內(nèi)的酶活性，進而影響細胞的正常代謝。為了探究碳源濃度對丙酮酸積累的具體影響機制，研究人員進行了深入研究。實驗結(jié)果表明，在高濃度碳源條件下，細胞內(nèi)的某些代謝途徑會發(fā)生改變。糖酵解途徑的關(guān)鍵酶活性可能會受到抑制，導(dǎo)致丙酮酸的合成速率下降。高濃度碳源還可能導(dǎo)致細胞內(nèi)的氧化還原平衡失調(diào)，影響能量代謝和物質(zhì)合成。在高濃度葡萄糖條件下，細胞內(nèi)的NADH濃度升高，可能會反饋抑制丙酮酸脫氫酶等關(guān)鍵酶的活性，從而影響丙酮酸的進一步代謝和積累。為了克服高濃度碳源帶來的不利影響，可以通過優(yōu)化發(fā)酵工藝，如采用分批補料發(fā)酵方式，控制碳源的添加速率，使細胞在適宜的碳源濃度下生長和代謝，從而提高丙酮酸的積累量。在分批補料發(fā)酵實驗中，將初始葡萄糖濃度控制在15g/L，然后在發(fā)酵過程中根據(jù)細胞生長和碳源消耗情況，適時補加葡萄糖，使發(fā)酵液中的葡萄糖濃度始終維持在10-15g/L的范圍內(nèi)。結(jié)果顯示，丙酮酸的產(chǎn)量較一次性添加高濃度葡萄糖時提高了25%-35%。3.2.2培養(yǎng)條件（pH、溫度、溶氧等）的影響培養(yǎng)條件對大腸桿菌積累丙酮酸的過程有著至關(guān)重要的影響，其中pH值、溫度和溶氧是幾個關(guān)鍵的因素。pH值作為影響微生物生長和代謝的重要環(huán)境因素之一，對大腸桿菌的生長和丙酮酸積累有著顯著的作用。在不同的pH值條件下，大腸桿菌細胞內(nèi)的酶活性、細胞膜的穩(wěn)定性以及物質(zhì)的跨膜運輸?shù)壬磉^程都會發(fā)生變化，從而影響細胞的生長和代謝途徑。當(dāng)培養(yǎng)基的pH值較低時，酸性環(huán)境可能會導(dǎo)致細胞內(nèi)某些酶的活性降低，影響細胞的正常代謝。在pH值為5.0時，大腸桿菌細胞內(nèi)的丙酮酸激酶活性受到抑制，使得丙酮酸的合成速率下降。酸性環(huán)境還可能影響細胞膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致細胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏，進一步影響細胞的生長和代謝。研究表明，在酸性條件下，細胞膜的脂肪酸組成會發(fā)生改變，膜的流動性和通透性增加，細胞內(nèi)的離子平衡被破壞，從而影響細胞的生理功能。當(dāng)pH值過高時，堿性環(huán)境同樣會對大腸桿菌的生長和代謝產(chǎn)生不利影響。在pH值為9.0時，細胞內(nèi)的一些關(guān)鍵酶，如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，其活性會顯著降低，進而影響丙酮酸的合成。堿性環(huán)境還可能影響細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用，導(dǎo)致細胞生長緩慢。在高pH值條件下，培養(yǎng)基中的某些營養(yǎng)物質(zhì)可能會發(fā)生沉淀或化學(xué)反應(yīng)，降低其可利用性，從而影響細胞的生長和代謝。在堿性條件下，鐵離子等微量元素可能會形成不溶性的氫氧化物沉淀，使細胞無法攝取足夠的鐵離子，影響細胞內(nèi)一些含鐵酶的活性，進而影響細胞的代謝過程。大腸桿菌在中性偏堿性的環(huán)境中生長和積累丙酮酸的效果較好，最適pH值通常在7.0-7.5之間。在這個pH值范圍內(nèi)，細胞內(nèi)的酶活性較高，細胞膜的穩(wěn)定性良好，物質(zhì)的跨膜運輸正常，有利于細胞的生長和丙酮酸的合成。在pH值為7.2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌時，丙酮酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶等關(guān)鍵酶的活性較高，能夠有效地促進丙酮酸的合成。中性偏堿性的環(huán)境還能維持細胞膜的正常結(jié)構(gòu)和功能，保證細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝產(chǎn)物的排出，從而促進細胞的生長和代謝。通過控制培養(yǎng)基的pH值在最適范圍內(nèi)，可以顯著提高大腸桿菌積累丙酮酸的產(chǎn)量。在發(fā)酵過程中，采用pH自動控制系統(tǒng)，將培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定控制在7.2，丙酮酸的產(chǎn)量較未控制pH值時提高了15%-20%。溫度對大腸桿菌的生長和丙酮酸積累也有著重要影響。溫度的變化會影響細胞內(nèi)酶的活性、細胞膜的流動性以及代謝途徑的調(diào)節(jié)。在較低的溫度下，酶的活性受到抑制，細胞的代謝速率減慢，生長速度也隨之降低。當(dāng)培養(yǎng)溫度為25℃時，大腸桿菌細胞內(nèi)參與糖酵解和丙酮酸合成途徑的酶活性較低，導(dǎo)致丙酮酸的合成速率緩慢，細胞生長周期延長。低溫還可能影響細胞膜的流動性，使細胞膜的通透性發(fā)生改變，影響營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝產(chǎn)物的排出。在低溫條件下，細胞膜中的脂肪酸飽和度增加，膜的流動性降低，物質(zhì)的跨膜運輸受到阻礙，從而影響細胞的正常代謝。而在較高的溫度下，雖然酶的活性可能會暫時升高，細胞生長速度加快，但過高的溫度也會導(dǎo)致酶的失活，細胞膜的穩(wěn)定性下降，甚至?xí)毎倪z傳物質(zhì)造成損傷。當(dāng)培養(yǎng)溫度達到42℃時，大腸桿菌細胞內(nèi)的一些關(guān)鍵酶，如丙酮酸激酶，可能會因為高溫而失活，導(dǎo)致丙酮酸的合成受阻。高溫還會使細胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，膜的流動性過大，細胞內(nèi)物質(zhì)容易泄漏，影響細胞的正常生理功能。高溫還可能導(dǎo)致細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子發(fā)生變性，影響細胞的遺傳信息傳遞和代謝調(diào)節(jié)。大腸桿菌積累丙酮酸的最適溫度一般在30-37℃之間。在這個溫度范圍內(nèi)，細胞內(nèi)的酶活性適中，細胞膜的流動性良好，代謝途徑能夠正常進行，有利于細胞的生長和丙酮酸的積累。在37℃的培養(yǎng)條件下，大腸桿菌細胞內(nèi)的丙酮酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶等關(guān)鍵酶的活性較高，能夠高效地催化丙酮酸的合成反應(yīng)。適宜的溫度還能保證細胞膜的正常結(jié)構(gòu)和功能，促進營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝產(chǎn)物的排出，從而提高細胞的生長和代謝效率。通過優(yōu)化培養(yǎng)溫度，可以顯著提高大腸桿菌積累丙酮酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。在搖瓶發(fā)酵實驗中，將培養(yǎng)溫度控制在37℃，丙酮酸的產(chǎn)量較在30℃培養(yǎng)時提高了10%-15%。溶氧作為好氧微生物生長和代謝所必需的條件，對大腸桿菌積累丙酮酸的過程有著重要的影響。在有氧條件下，大腸桿菌能夠通過有氧呼吸將丙酮酸徹底氧化分解為二氧化碳和水，同時產(chǎn)生大量的能量，為細胞的生長和代謝提供動力。然而，過高或過低的溶氧水平都會對大腸桿菌的生長和丙酮酸積累產(chǎn)生不利影響。當(dāng)溶氧水平過低時，細胞的有氧呼吸受到抑制，能量供應(yīng)不足，導(dǎo)致細胞生長緩慢。由于氧氣供應(yīng)不足，丙酮酸無法順利進入三羧酸循環(huán)進行徹底氧化分解，從而導(dǎo)致丙酮酸的積累量下降。在溶氧飽和度低于20%時，大腸桿菌細胞內(nèi)的丙酮酸脫氫酶活性降低，丙酮酸進入三羧酸循環(huán)的速率減慢，丙酮酸在細胞內(nèi)積累，同時細胞生長受到抑制，細胞密度增長緩慢。而當(dāng)溶氧水平過高時，可能會產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫等。這些活性氧具有較強的氧化性，會對細胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等造成損傷，影響細胞的正常生理功能。高溶氧還可能導(dǎo)致代謝途徑的失衡，使丙酮酸的積累量減少。在溶氧飽和度高于80%時，細胞內(nèi)的活性氧水平顯著升高，蛋白質(zhì)和核酸的氧化損傷增加，細胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)負(fù)擔(dān)加重。高溶氧還可能導(dǎo)致丙酮酸的代謝途徑發(fā)生改變，使丙酮酸更多地參與到其他代謝過程中，從而減少了丙酮酸的積累量。大腸桿菌積累丙酮酸的適宜溶氧范圍一般在30%-60%飽和度之間。在這個溶氧范圍內(nèi)，細胞能夠進行有效的有氧呼吸，獲得足夠的能量，同時又能避免活性氧的過多產(chǎn)生，維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡。在溶氧飽和度為50%的條件下，大腸桿菌細胞內(nèi)的丙酮酸脫氫酶和其他參與三羧酸循環(huán)的酶活性較高，丙酮酸能夠順利進入三羧酸循環(huán)進行氧化分解，同時細胞內(nèi)的活性氧水平較低，細胞的生長和代謝能夠正常進行。通過控制溶氧水平在適宜范圍內(nèi)，可以提高大腸桿菌積累丙酮酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。在發(fā)酵罐培養(yǎng)實驗中，將溶氧飽和度控制在50%，丙酮酸的產(chǎn)量較溶氧飽和度為20%時提高了30%-40%。3.3代謝工程改造策略3.3.1傳統(tǒng)誘變與篩選方法傳統(tǒng)誘變與篩選方法在大腸桿菌積累丙酮酸的研究中發(fā)揮了重要作用，為菌株的改良提供了一種可行的途徑。傳統(tǒng)誘變技術(shù)主要包括物理誘變和化學(xué)誘變。物理誘變常用的誘變劑有紫外線（UV）、X射線、γ射線等。紫外線誘變的原理是其能夠使DNA分子中的胸腺嘧啶形成二聚體，從而導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)的改變，在DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中引發(fā)基因突變。在對大腸桿菌進行紫外線誘變時，將處于對數(shù)生長期的大腸桿菌菌液均勻涂布在固體培養(yǎng)基平板上，然后將平板置于紫外燈下進行照射。照射劑量和時間是影響誘變效果的關(guān)鍵因素，通常需要進行預(yù)實驗來確定最佳的照射條件。一般來說，照射劑量過低可能無法產(chǎn)生足夠的突變，而照射劑量過高則可能導(dǎo)致細胞死亡過多，不利于篩選到優(yōu)良的突變菌株。研究表明，當(dāng)紫外線照射劑量為15W，距離平板30cm，照射時間為10-30s時，能夠在保證一定細胞存活率的前提下，獲得較高的突變率。X射線和γ射線則是通過直接作用于DNA分子，使其發(fā)生斷裂、重排等損傷，進而產(chǎn)生基因突變。這些射線具有較高的能量，可以穿透細胞，對DNA分子造成較為嚴(yán)重的損傷。在利用X射線對大腸桿菌進行誘變時，需要使用專門的X射線發(fā)生器，將大腸桿菌菌液置于射線照射范圍內(nèi)，控制射線的劑量和照射時間。由于X射線和γ射線的誘變效果較為強烈，可能會導(dǎo)致細胞產(chǎn)生多種復(fù)雜的基因突變，因此在篩選突變菌株時需要更加謹(jǐn)慎?；瘜W(xué)誘變常用的誘變劑有亞硝酸、硫酸二乙酯（DES）、甲基磺酸乙酯（EMS）等。亞硝酸可以使堿基發(fā)生氧化脫氨作用，從而改變堿基的配對性質(zhì)，導(dǎo)致基因突變。硫酸二乙酯和甲基磺酸乙酯則主要是通過烷化作用，使DNA分子中的鳥嘌呤烷基化，進而影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，引發(fā)基因突變。以硫酸二乙酯為例，在對大腸桿菌進行化學(xué)誘變時，將一定濃度的硫酸二乙酯加入到大腸桿菌菌液中，在適宜的溫度下孵育一段時間。孵育時間和硫酸二乙酯的濃度會影響誘變效果，一般需要通過實驗優(yōu)化來確定最佳條件。當(dāng)硫酸二乙酯濃度為0.5%-1.0%，孵育時間為30-60min時，能夠獲得較好的誘變效果。在利用傳統(tǒng)誘變技術(shù)獲得大量突變菌株后，需要通過篩選方法來獲得高產(chǎn)丙酮酸的菌株。常用的篩選方法包括平板篩選法和搖瓶發(fā)酵篩選法。平板篩選法是基于大腸桿菌在含有特定底物或指示劑的平板上生長時，其代謝產(chǎn)物與底物或指示劑發(fā)生反應(yīng)，從而產(chǎn)生明顯的特征變化，以此來初步篩選出可能高產(chǎn)丙酮酸的菌株。在平板培養(yǎng)基中添加溴甲酚綠指示劑，由于丙酮酸是一種有機酸，高產(chǎn)丙酮酸的大腸桿菌突變菌株在生長過程中會分泌丙酮酸，使周圍培養(yǎng)基的pH值降低，溴甲酚綠指示劑會由藍色變?yōu)辄S色，從而在平板上形成黃色的透明圈。通過觀察透明圈的大小，可以初步判斷菌株產(chǎn)丙酮酸的能力，挑取透明圈較大的菌株進行進一步的驗證。在一次平板篩選實驗中，對1000株誘變后的大腸桿菌突變菌株進行篩選，獲得了50株透明圈較大的菌株，這些菌株被認(rèn)為具有較高的產(chǎn)丙酮酸潛力。搖瓶發(fā)酵篩選法則是將初步篩選得到的菌株在搖瓶中進行發(fā)酵培養(yǎng)，通過測定發(fā)酵液中丙酮酸的含量，來準(zhǔn)確評估菌株的丙酮酸生產(chǎn)能力。將挑取的菌株接種到裝有液體培養(yǎng)基的搖瓶中，在適宜的溫度、轉(zhuǎn)速等條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，采用高效液相色譜（HPLC）、酶法等方法測定發(fā)酵液中的丙酮酸含量。以HPLC測定為例，將發(fā)酵液離心后取上清液，經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚砗笞⑷際PLC系統(tǒng)，根據(jù)丙酮酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出發(fā)酵液中丙酮酸的濃度。通過搖瓶發(fā)酵篩選，可以從初步篩選的菌株中進一步篩選出丙酮酸產(chǎn)量較高的菌株，作為后續(xù)研究和應(yīng)用的對象。在搖瓶發(fā)酵篩選實驗中，對平板篩選得到的50株菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，最終篩選出了5株丙酮酸產(chǎn)量顯著高于出發(fā)菌株的突變菌株，其中一株突變菌株的丙酮酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了80%。3.3.2基因工程技術(shù)的應(yīng)用基因工程技術(shù)在大腸桿菌積累丙酮酸的研究中具有至關(guān)重要的地位，為構(gòu)建高產(chǎn)丙酮酸的工程菌株提供了精準(zhǔn)、高效的手段。利用基因工程技術(shù)敲除或過表達相關(guān)基因是提高丙酮酸積累的重要策略。在敲除相關(guān)基因方面，主要是針對大腸桿菌中丙酮酸的消耗途徑關(guān)鍵基因進行敲除，以阻斷丙酮酸向其他代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，使更多的丙酮酸得以積累。乳酸脫氫酶基因（ldhA）在無氧或低氧條件下，編碼的乳酸脫氫酶可催化丙酮酸還原為乳酸，從而減少丙酮酸的積累量。通過CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲除ldhA基因，能夠有效阻斷丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化途徑。在利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除ldhA基因時，首先設(shè)計針對ldhA基因的特異性sgRNA，通過體外轉(zhuǎn)錄等方法獲得sgRNA后，與Cas9蛋白組裝形成核糖核蛋白復(fù)合體（RNP）。利用電轉(zhuǎn)化等方式將RNP導(dǎo)入大腸桿菌細胞內(nèi)，sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白識別并結(jié)合到ldhA基因的特定序列上，Cas9蛋白發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性，對ldhA基因進行切割，造成雙鏈斷裂。細胞自身的修復(fù)機制會對斷裂的DNA進行修復(fù)，在此過程中，通過同源重組等方式實現(xiàn)ldhA基因的敲除。研究表明，敲除ldhA基因的大腸桿菌工程菌株在發(fā)酵過程中，丙酮酸的積累量較野生型菌株提高了2-3倍，而乳酸的產(chǎn)量則顯著降低。丙酮酸氧化酶基因（poxB）編碼的丙酮酸氧化酶在有氧條件下，能夠催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酰輔酶A、二氧化碳和NADH，這是丙酮酸的主要消耗途徑之一。采用Red同源重組技術(shù)敲除poxB基因，可有效抑制丙酮酸的有氧氧化，減少丙酮酸的消耗。在Red同源重組敲除poxB基因的過程中，首先構(gòu)建含有與poxB基因上下游同源臂以及篩選標(biāo)記基因的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入含有Red重組酶表達質(zhì)粒的大腸桿菌細胞中，在Red重組酶的作用下，重組質(zhì)粒上的同源臂與大腸桿菌基因組上poxB基因的上下游同源序列發(fā)生同源重組，從而將poxB基因替換為篩選標(biāo)記基因，實現(xiàn)poxB基因的敲除。實驗結(jié)果顯示，敲除poxB基因的大腸桿菌工程菌株在有氧發(fā)酵條件下，丙酮酸的產(chǎn)量較野生型菌株提高了40%-60%。磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因（pta）和乙酸激酶基因（ackA）共同參與丙酮酸向乙酸的轉(zhuǎn)化過程。pta編碼的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰磷酸，ackA編碼的乙酸激酶則將乙酰磷酸轉(zhuǎn)化為乙酸和ATP。通過λ-Red同源重組系統(tǒng)同時敲除pta和ackA基因，可阻斷丙酮酸向乙酸的轉(zhuǎn)化途徑，進一步提高丙酮酸的積累量。在利用λ-Red同源重組系統(tǒng)敲除pta和ackA基因時，分別設(shè)計針對pta和ackA基因的重組片段，這些重組片段包含與目標(biāo)基因上下游同源的序列以及篩選標(biāo)記基因。將重組片段導(dǎo)入含有λ-Red重組酶表達質(zhì)粒的大腸桿菌細胞中，通過同源重組實現(xiàn)pta和ackA基因的敲除。實驗表明，同時敲除pta和ackA基因的大腸桿菌工程菌株，在發(fā)酵過程中丙酮酸的產(chǎn)量較對照菌株提高了約1.8倍，乙酸的產(chǎn)量則明顯下降。在過表達相關(guān)基因方面，主要是增強丙酮酸合成途徑關(guān)鍵基因的表達，以提高丙酮酸的合成能力。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因（pck）編碼的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶能夠催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，同時消耗ATP，這一反應(yīng)不僅為三羧酸循環(huán)提供了重要的中間產(chǎn)物草酰乙酸，還能通過調(diào)節(jié)PEP和丙酮酸之間的代謝平衡，影響丙酮酸的合成。將pck基因克隆到表達載體上，然后將重組表達載體導(dǎo)入大腸桿菌細胞中，實現(xiàn)pck基因的過表達。在構(gòu)建pck基因過表達載體時，選擇合適的表達載體，如pET系列載體，將pck基因與載體的啟動子、終止子等元件進行連接，構(gòu)建成重組表達載體。通過電轉(zhuǎn)化等方法將重組表達載體導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，篩選出陽性克隆進行培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，過表達pck基因的大腸桿菌工程菌株，丙酮酸的產(chǎn)量較對照菌株提高了30%-50%。丙酮酸激酶基因（pyk）編碼的丙酮酸激酶催化PEP和ADP反應(yīng)生成丙酮酸和ATP，是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶之一。通過對pyk基因進行優(yōu)化改造，如定點突變、啟動子替換等，可增強丙酮酸激酶的活性和穩(wěn)定性，提高其對底物PEP的親和力，從而促進丙酮酸的合成。將pyk基因的啟動子替換為強啟動子，使丙酮酸激酶的表達量提高了2-3倍。在啟動子替換實驗中，采用PCR等技術(shù)擴增出強啟動子序列，然后將其與pyk基因進行連接，構(gòu)建成重組表達載體。將重組表達載體導(dǎo)入大腸桿菌細胞中，通過篩選和鑒定，獲得pyk基因過表達的工程菌株。實驗結(jié)果表明，丙酮酸的產(chǎn)量較原始菌株提高了約1.5倍。四、提高大腸桿菌積累丙酮酸的方法研究4.1代謝途徑優(yōu)化4.1.1阻斷競爭代謝途徑在大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)中，丙酮酸的積累受到多種競爭代謝途徑的影響。乳酸和乙酸是大腸桿菌發(fā)酵過程中常見的副產(chǎn)物，它們的生成會消耗丙酮酸，降低丙酮酸的積累量。通過阻斷乳酸和乙酸的生成途徑，可以減少丙酮酸的消耗，使更多的丙酮酸得以積累。乳酸的生成主要由乳酸脫氫酶（LDH）催化，在無氧或低氧條件下，LDH能夠?qū)⒈徇€原為乳酸，同時使NADH氧化為NAD+，維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡。為了阻斷乳酸的生成途徑，可采用基因敲除技術(shù)敲除大腸桿菌中的乳酸脫氫酶基因（ldhA）。以大腸桿菌MG1655菌株為例，利用Red重組系統(tǒng)進行l(wèi)dhA基因敲除。首先，根據(jù)ldhA基因的序列設(shè)計特異性引物，通過PCR擴增出包含ldhA基因上下游同源臂以及篩選標(biāo)記基因（如氯霉素抗性基因cat）的DNA片段。將該DNA片段轉(zhuǎn)化到含有Red重組酶表達質(zhì)粒（如pKD46）的大腸桿菌MG1655感受態(tài)細胞中。在Red重組酶的作用下，DNA片段上的同源臂與大腸桿菌基因組上ldhA基因的上下游同源序列發(fā)生同源重組，將ldhA基因替換為cat基因，從而實現(xiàn)ldhA基因的敲除。經(jīng)過篩選和鑒定，獲得敲除ldhA基因的大腸桿菌工程菌株MG1655ΔldhA。研究表明，敲除ldhA基因后，大腸桿菌在發(fā)酵過程中乳酸的產(chǎn)量顯著降低，丙酮酸的積累量得到明顯提高。在搖瓶發(fā)酵實驗中，野生型MG1655菌株發(fā)酵48h后，乳酸產(chǎn)量達到15g/L，而丙酮酸積累量僅為5g/L；而敲除ldhA基因的MG1655ΔldhA菌株發(fā)酵48h后，乳酸產(chǎn)量降至1g/L以下，丙酮酸積累量則提高到12g/L。這表明阻斷乳酸生成途徑，能夠有效減少丙酮酸的消耗，促進丙酮酸的積累。乙酸的生成涉及多個基因和酶的參與，主要由磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（PTA）和乙酸激酶（ACK）催化。在大腸桿菌中，丙酮酸首先在丙酮酸脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，然后乙酰輔酶A在PTA的催化下生成乙酰磷酸，最后乙酰磷酸在ACK的作用下生成乙酸和ATP。為了阻斷乙酸的生成途徑，可采用基因敲除技術(shù)同時敲除大腸桿菌中的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因（pta）和乙酸激酶基因（ackA）。利用λ-Red同源重組系統(tǒng)進行pta和ackA基因敲除。分別設(shè)計針對pta和ackA基因的重組片段，這些重組片段包含與目標(biāo)基因上下游同源的序列以及篩選標(biāo)記基因（如卡那霉素抗性基因kan）。將重組片段依次轉(zhuǎn)化到含有λ-Red重組酶表達質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)細胞中，通過同源重組實現(xiàn)pta和ackA基因的敲除。經(jīng)過篩選和鑒定，獲得同時敲除pta和ackA基因的大腸桿菌工程菌株。研究結(jié)果顯示，同時敲除pta和ackA基因后，大腸桿菌在發(fā)酵過程中乙酸的產(chǎn)量大幅下降，丙酮酸的積累量顯著增加。在發(fā)酵罐發(fā)酵實驗中，野生型大腸桿菌發(fā)酵72h后，乙酸產(chǎn)量達到20g/L，丙酮酸積累量為8g/L；而同時敲除pta和ackA基因的工程菌株發(fā)酵72h后，乙酸產(chǎn)量降至3g/L以下，丙酮酸積累量則提高到20g/L。這表明阻斷乙酸生成途徑，能夠有效減少丙酮酸向乙酸的轉(zhuǎn)化，提高丙酮酸的積累量。除了基因敲除技術(shù)，還可以通過調(diào)節(jié)基因表達來阻斷競爭代謝途徑。利用小分子RNA（sRNA）或轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控元件，抑制乳酸和乙酸生成途徑相關(guān)基因的表達?？稍O(shè)計針對ldhA基因的sRNA，使其與ldhAmRNA互補配對，抑制ldhA基因的翻譯過程，從而降低乳酸脫氫酶的表達水平，減少乳酸的生成。這種方法相較于基因敲除，具有調(diào)控靈活、可逆轉(zhuǎn)等優(yōu)點，能夠根據(jù)發(fā)酵過程的需要，對競爭代謝途徑進行動態(tài)調(diào)控。4.1.2強化丙酮酸合成途徑強化丙酮酸合成途徑是提高大腸桿菌積累丙酮酸的關(guān)鍵策略之一，主要可通過強化糖酵解途徑或引入外源丙酮酸合成途徑來實現(xiàn)。糖酵解途徑是大腸桿菌合成丙酮酸的主要途徑，通過增強糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的活性和表達水平，可促進丙酮酸的合成。丙酮酸激酶（PYK）是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶之一，催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和ADP反應(yīng)生成丙酮酸和ATP。為了強化糖酵解途徑，可對丙酮酸激酶基因（pyk）進行優(yōu)化改造。通過定點突變技術(shù)，改變pyk基因的編碼序列，使其編碼的丙酮酸激酶具有更高的活性和穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，將pyk基因中第125位的蘇氨酸突變?yōu)楸彼幔═125A）后，丙酮酸激酶對底物PEP的親和力提高了2倍，酶活性增強了30%。在大腸桿菌中過表達突變后的pyk基因，可顯著提高丙酮酸的合成能力。將含有突變pyk基因的表達載體pET-pyk（T125A）導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中，在IPTG的誘導(dǎo)下，突變pyk基因大量表達。發(fā)酵實驗結(jié)果表明，過表達突變pyk基因的大腸桿菌工程菌株在發(fā)酵48h后，丙酮酸產(chǎn)量達到30g/L，較對照菌株提高了1.5倍。除了定點突變，還可通過替換pyk基因的啟動子，增強其表達水平。選擇強啟動子，如T7啟動子，替換pyk基因的天然啟動子。構(gòu)建重組表達載體pT7-pyk，將其導(dǎo)入大腸桿菌中。由于T7啟動子具有很強的轉(zhuǎn)錄活性，能夠使pyk基因大量轉(zhuǎn)錄，從而提高丙酮酸激酶的表達量。實驗結(jié)果顯示，過表達T7-pyk的大腸桿菌工程菌株中，丙酮酸激酶的表達量較野生型菌株提高了3倍，丙酮酸產(chǎn)量在發(fā)酵48h后達到28g/L，較對照菌株提高了1.3倍。磷酸果糖激酶（PFK）也是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶，催化果糖-6-磷酸磷酸化生成果糖-1,6-二磷酸。通過過表達磷酸果糖激酶基因（pfk），可增強糖酵解途徑的代謝流，促進丙酮酸的合成。將pfk基因克隆到表達載體pET-28a(+)上，構(gòu)建重組表達載體pET-28a(+)-pfk。將該重組表達載體導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中，在IPTG的誘導(dǎo)下，pfk基因大量表達。發(fā)酵實驗表明，過表達pfk基因的大腸桿菌工程菌株在發(fā)酵48h后，丙酮酸產(chǎn)量達到25g/L，較對照菌株提高了1倍。這是因為過表達pfk基因后，糖酵解途徑的代謝流加快，更多的葡萄糖被轉(zhuǎn)化為丙酮酸。引入外源丙酮酸合成途徑也是提高丙酮酸積累的有效方法?？蓪⑵渌⑸镏懈咝У谋岷铣赏緩交?qū)氪竽c桿菌中，構(gòu)建新的代謝途徑，增強丙酮酸的合成能力。在一些乳酸菌中，存在一種丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）途徑，能夠在無氧條件下高效合成丙酮酸。將乳酸菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因（pfl）導(dǎo)入大腸桿菌中，在大腸桿菌中構(gòu)建PFL途徑。首先，從乳酸菌基因組中克隆pfl基因，將其連接到表達載體pBAD-TOPO上，構(gòu)建重組表達載體pBAD-pfl。將該重組表達載體導(dǎo)入大腸桿菌MG1655中，在阿拉伯糖的誘導(dǎo)下，pfl基因表達。在無氧發(fā)酵條件下，過表達pfl基因的大腸桿菌工程菌株能夠利用PFL途徑合成丙酮酸。實驗結(jié)果顯示，在無氧發(fā)酵48h后，該工程菌株的丙酮酸產(chǎn)量達到18g/L，而對照菌株的丙酮酸產(chǎn)量僅為5g/L。這表明引入外源丙酮酸合成途徑，能夠為大腸桿菌提供新的丙酮酸合成途徑，提高丙酮酸的積累量。還可通過組合強化糖酵解途徑和引入外源丙酮酸合成途徑，進一步提高丙酮酸的積累量。在過表達pyk基因和pfk基因的大腸桿菌工程菌株中，同時導(dǎo)入pfl基因。發(fā)酵實驗表明，該工程菌株在發(fā)酵48h后，丙酮酸產(chǎn)量達到35g/L，較單獨強化糖酵解途徑或引入外源丙酮酸合成途徑的菌株有了進一步提高。這說明通過多種策略的組合，能夠協(xié)同增強丙酮酸的合成能力，實現(xiàn)丙酮酸的高效積累。4.2發(fā)酵工藝優(yōu)化4.2.1培養(yǎng)基成分優(yōu)化培養(yǎng)基成分對大腸桿菌積累丙酮酸的過程有著至關(guān)重要的影響，其中碳氮源、微量元素和維生素等成分的種類和濃度變化，都會顯著影響大腸桿菌的生長和代謝，進而影響丙酮酸的產(chǎn)量。碳源作為大腸桿菌生長和代謝的主要能源和碳骨架來源，其種類和濃度對丙酮酸的積累起著關(guān)鍵作用。常見的碳源有葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖等，不同碳源由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)和代謝途徑的差異，會導(dǎo)致大腸桿菌在生長特性、代謝活性以及丙酮酸積累量等方面呈現(xiàn)出不同的表現(xiàn)。葡萄糖作為一種被大腸桿菌廣泛利用的碳源，在代謝過程中，它首先通過磷酸化反應(yīng)進入糖酵解途徑，經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)逐步轉(zhuǎn)化為丙酮酸。研究表明，在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌時，細胞能夠快速攝取葡萄糖并進行代謝，生長速率較快。在適宜的條件下，初始葡萄糖濃度為20g/L時，大腸桿菌的生長在對數(shù)期迅速增長，細胞密度在24h內(nèi)可達到較高水平。為了實現(xiàn)丙酮酸的有效積累，需要對大腸桿菌的代謝途徑進行合理調(diào)控。通