大腸癌中P-gp與Survivin的表達(dá)特征、關(guān)聯(lián)及其臨床意義探究一、引言1.1研究背景大腸癌作為全球范圍內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。在世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率在惡性腫瘤中位居前列，而在我國，大腸癌的發(fā)病率在各種惡性腫瘤中僅次于肺癌及乳腺癌，排在第3位，死亡率已居第4位，且近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢。同時，大腸癌的發(fā)病年齡也呈現(xiàn)出年輕化的特點，中國大腸癌的平均發(fā)病年齡比高發(fā)的美國年輕了20歲左右，這使得對大腸癌的研究變得更為緊迫。目前，臨床上對大腸癌的治療多采用以手術(shù)為主，結(jié)合化療、放療、靶向治療等的綜合性治療方案。輔助性化療在大腸癌的綜合治療中起著重要作用，能夠降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，提高患者的生存率。然而，腫瘤的多藥耐藥性（MDR）是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一，極大地限制了化療的療效，影響了患者的預(yù)后。MDR是指腫瘤細(xì)胞對一種化療藥物產(chǎn)生耐藥的同時，對其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。P-糖蛋白（P-gp）作為一種重要的耐藥蛋白，是由多藥耐藥基因1（MDR1）編碼的跨膜糖蛋白，具有藥物外排泵的功能。P-gp能夠通過激活A(yù)TP泵，將細(xì)胞內(nèi)的化療藥物如阿霉素、長春新堿等主動轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。研究表明，P-gp在大腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤的多藥耐藥性密切相關(guān)，其高表達(dá)往往預(yù)示著化療效果不佳。例如，王藝等人的研究發(fā)現(xiàn)，P-gp表達(dá)陽性率在大腸癌組織中為77.12%，其表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及Ki67蛋白表達(dá)均呈顯著相關(guān)關(guān)系，提示P-gp可能參與了大腸癌的惡性進(jìn)展和多藥耐藥過程。生存素（Survivin）是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的重要成員。Survivin在正常成人組織中除胸腺及胎盤中有微量表達(dá)外，在其他成熟組織中均無表達(dá)，但在幾乎所有的腫瘤組織中均呈高度表達(dá)。其抗凋亡作用主要通過抑制caspase途徑來實現(xiàn)，從而使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。在大腸癌中，Survivin的表達(dá)與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。周飛等人采用免疫組織化學(xué)法檢測Survivin蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Survivin蛋白陽性表達(dá)率隨分化程度的降低而呈現(xiàn)出上升趨勢，表明Survivin的高表達(dá)在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中有促進(jìn)作用，可作為評價大腸腫瘤生物學(xué)惡性程度的重要依據(jù)。綜上所述，P-gp和Survivin在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展、多藥耐藥以及預(yù)后等方面均發(fā)揮著重要作用。深入研究它們在大腸癌中的表達(dá)及意義，對于揭示大腸癌的發(fā)病機(jī)制、評估腫瘤的多藥耐藥性、制定個性化的治療方案以及判斷患者的預(yù)后具有重要的理論和臨床價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對于P-gp在大腸癌中的研究起步較早。早期的研究就已經(jīng)明確了P-gp在大腸癌多藥耐藥機(jī)制中的關(guān)鍵作用，眾多實驗通過細(xì)胞系研究和動物模型實驗，深入探討了P-gp的功能及作用途徑。例如，一些研究利用基因敲除技術(shù)，在大腸癌動物模型中敲除MDR1基因，觀察到腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性顯著提高，進(jìn)一步證實了P-gp介導(dǎo)的藥物外排是導(dǎo)致大腸癌多藥耐藥的重要機(jī)制。隨著研究的深入，國外學(xué)者還致力于探索P-gp表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系。有研究對大量大腸癌患者的標(biāo)本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)P-gp的高表達(dá)與腫瘤的分期、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，提示P-gp可能作為評估大腸癌患者預(yù)后的一個重要指標(biāo)。在臨床應(yīng)用方面，國外也在積極探索針對P-gp的逆轉(zhuǎn)策略，如開發(fā)新型的P-gp抑制劑，試圖通過抑制P-gp的功能來克服大腸癌的多藥耐藥性。國內(nèi)對P-gp在大腸癌中的研究也取得了豐碩成果。王藝等人通過對306例大腸癌組織標(biāo)本的檢測，發(fā)現(xiàn)P-gp表達(dá)陽性率在大腸癌組織中為77.12%，其表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及Ki67蛋白表達(dá)均呈顯著相關(guān)關(guān)系，為國內(nèi)研究P-gp與大腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系提供了重要數(shù)據(jù)支持。劉麗梅等人采用免疫組化方法檢測170例大腸癌組織中P-gp的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)P-gp表達(dá)在高、低分化兩組間及中、低分化兩組間均有顯著差異，且5年內(nèi)生存者P-gp表達(dá)陽性率低于5年內(nèi)死亡者，表明P-gp的表達(dá)與大腸癌的分化程度和預(yù)后相關(guān)。這些研究不僅豐富了國內(nèi)對P-gp在大腸癌中作用的認(rèn)識，也為臨床治療提供了理論依據(jù)。國外對于Survivin在大腸癌中的研究也較為深入。從基礎(chǔ)研究層面，對Survivin的分子結(jié)構(gòu)、功能機(jī)制以及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行了全面探索。研究發(fā)現(xiàn)Survivin通過抑制caspase途徑來實現(xiàn)抗凋亡作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。在臨床研究方面，通過對大量患者的觀察和分析，明確了Survivin表達(dá)與大腸癌的病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的相關(guān)性。一些研究還將Survivin作為潛在的治療靶點，開展了相關(guān)的靶向治療研究。國內(nèi)在Survivin與大腸癌關(guān)系的研究上也有諸多進(jìn)展。周飛等人采用免疫組織化學(xué)法檢測Survivin蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Survivin蛋白陽性表達(dá)率隨分化程度的降低而呈現(xiàn)出上升趨勢，表明Survivin的高表達(dá)在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中有促進(jìn)作用，可作為評價大腸腫瘤生物學(xué)惡性程度的重要依據(jù)。另一項研究采用RT-PCR法檢測大腸癌及癌旁組織中survivinmRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中survivinmRNA陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，且Survivin的表達(dá)與病理分級、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示Survivin可能是大腸癌預(yù)后不良的指征。盡管國內(nèi)外在P-gp和Survivin與大腸癌的研究中取得了一定成果，但仍存在一些不足。對于P-gp和Survivin在大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體調(diào)控機(jī)制尚未完全明確，尤其是它們之間是否存在相互作用以及如何相互影響，還需要進(jìn)一步深入研究。在臨床應(yīng)用方面，雖然已經(jīng)認(rèn)識到P-gp和Survivin的表達(dá)與大腸癌的多藥耐藥性和預(yù)后相關(guān)，但如何將這些研究成果更好地轉(zhuǎn)化為臨床實踐，如開發(fā)更加有效的靶向治療藥物或制定個性化的治療方案，仍有待進(jìn)一步探索。此外，目前的研究多集中在單一因素的分析，缺乏對多個因素綜合作用的研究，未來需要從多維度、多因素的角度深入探討P-gp和Survivin在大腸癌中的作用及機(jī)制。1.3研究目的和意義本研究旨在通過檢測P-gp和Survivin在大腸癌組織中的表達(dá)情況，深入分析二者與大腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系，探究P-gp和Survivin表達(dá)之間的內(nèi)在聯(lián)系，為揭示大腸癌的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。通過對大量大腸癌組織標(biāo)本進(jìn)行檢測和分析，準(zhǔn)確了解P-gp和Survivin在大腸癌組織中的表達(dá)水平，以及其在不同臨床病理特征下的表達(dá)差異，從而更全面地認(rèn)識這兩種蛋白在大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。通過分析P-gp和Survivin表達(dá)與大腸癌臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)，如腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，有助于明確它們在腫瘤惡性進(jìn)展中的具體作用環(huán)節(jié)，為臨床評估腫瘤的惡性程度和預(yù)后提供重要參考指標(biāo)。P-gp作為多藥耐藥的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)情況與化療效果密切相關(guān)。準(zhǔn)確檢測P-gp在大腸癌組織中的表達(dá)，能夠幫助臨床醫(yī)生更準(zhǔn)確地評估患者對化療藥物的敏感性，預(yù)測化療效果，從而為制定個性化的化療方案提供有力依據(jù)。對于P-gp高表達(dá)的患者，可以考慮采用更強(qiáng)效的化療藥物或聯(lián)合使用P-gp抑制劑，以提高化療效果；而對于P-gp低表達(dá)的患者，則可以避免過度使用化療藥物，減少不必要的毒副作用。Survivin作為凋亡抑制蛋白，其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及預(yù)后密切相關(guān)。深入研究Survivin在大腸癌中的表達(dá)及意義，有助于臨床醫(yī)生更好地判斷患者的預(yù)后情況，為制定合理的治療策略提供參考。對于Survivin高表達(dá)的患者，提示腫瘤細(xì)胞的增殖活性較強(qiáng)，預(yù)后可能較差，需要加強(qiáng)術(shù)后的隨訪和治療；而對于Survivin低表達(dá)的患者，預(yù)后可能相對較好，可以適當(dāng)減少治療強(qiáng)度。研究P-gp和Survivin在大腸癌中的表達(dá)及意義，不僅有助于深入了解大腸癌的發(fā)病機(jī)制，還能為臨床治療提供重要的理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)，具有重要的理論和臨床價值，有望為提高大腸癌患者的治療效果和生存率做出貢獻(xiàn)。二、P-gp與Survivin的相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1P-gp的結(jié)構(gòu)、功能與作用機(jī)制P-糖蛋白（P-gp）是一種由多藥耐藥基因1（MDR1）編碼的跨膜糖蛋白，在多藥耐藥機(jī)制中扮演著關(guān)鍵角色。P-gp的分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，它由1280個氨基酸組成，分子量約為170kD。從整體結(jié)構(gòu)來看，P-gp由兩個相似的部分構(gòu)成，每個部分都包含六個跨膜區(qū)（TMD）和一個核苷酸結(jié)合域（NBD）。這兩個部分通過一個線性的易變區(qū)域隔開。跨膜區(qū)主要負(fù)責(zé)識別和結(jié)合藥物分子，而核苷酸結(jié)合域則與ATP的結(jié)合和水解密切相關(guān)，為藥物的外排提供能量。研究表明，P-gp的兩個NBD在ATP水解過程中協(xié)同作用，共同驅(qū)動藥物的轉(zhuǎn)運。若線性區(qū)域缺失，雖然細(xì)胞表面的P-gp蛋白表達(dá)可能與原蛋白相似，但會喪失轉(zhuǎn)運及藥物刺激ATP酶活性的功能。不過，若用一個具有足夠柔韌性二級結(jié)構(gòu)的多肽鏈替換這個缺失的結(jié)構(gòu)，P-gp分子的功能則有可能恢復(fù)，這充分說明了P-gp兩個半球的相互作用對于其分子功能的實現(xiàn)至關(guān)重要。P-gp在體內(nèi)具有廣泛的組織分布，這與其生理功能密切相關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，P-gp主要分布于有分泌和排泄功能的“專業(yè)化”上皮細(xì)胞膜上，如大腸及小腸的黏膜、血腦屏障、睪丸毛細(xì)血管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎上腺及腎近端小管等。在小腸黏膜上皮細(xì)胞中，P-gp能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物外排到腸腔，從而減少藥物的吸收，這也是部分藥物口服生物利用度較低的原因之一。在血腦屏障中，P-gp的存在可以阻止許多藥物進(jìn)入腦組織，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起到重要作用。在肝細(xì)胞中，P-gp參與了膽汁中藥物及代謝產(chǎn)物的排泄過程。P-gp的主要功能是作為一種ATP能量依賴性外排泵，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物或毒物重新泵出細(xì)胞外。這一功能使其在腫瘤多藥耐藥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到化療藥物攻擊時，若P-gp在腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，它能夠特異性地識別多種化療藥物，如阿霉素、長春新堿、紫杉醇等。這些藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，P-gp會與之結(jié)合，并利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將藥物從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度顯著降低。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)藥物濃度不足以發(fā)揮有效的殺傷作用時，腫瘤細(xì)胞就會對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，從而使化療失敗。研究發(fā)現(xiàn)，在許多對化療藥物耐藥的大腸癌患者中，其腫瘤組織中的P-gp表達(dá)水平明顯高于敏感患者，進(jìn)一步證實了P-gp在腫瘤多藥耐藥中的重要作用。P-gp還可以通過與其他耐藥相關(guān)蛋白或信號通路相互作用，共同調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，其具體的調(diào)控機(jī)制仍有待深入研究。2.2Survivin的結(jié)構(gòu)、功能與作用機(jī)制Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的重要成員，于1997年被發(fā)現(xiàn)。Survivin基因定位于人17號染色體長臂25區(qū)（17q25），全長14.7kb，包含4個外顯子和3個內(nèi)含子。其編碼的Survivin蛋白由142個氨基酸組成，分子量約為16.5kD，是IAP家族中最小的成員。與IAP家族其他成員相比，Survivin在結(jié)構(gòu)上具有獨特性。IAP家族一般含有2-3個串聯(lián)的桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列（BIR）以及羥基末端環(huán)指結(jié)構(gòu)，而Survivin僅含有一個單一的BIR功能區(qū)，且其羧基末端沒有環(huán)指結(jié)構(gòu)，代之以交織螺旋結(jié)構(gòu)。這個單一的BIR功能區(qū)由一個反向平行的片層和14個小螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成，其中包含對抑制凋亡起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基，如Trp67、Pro33和Cys84。交織螺旋結(jié)構(gòu)則在調(diào)節(jié)Survivin的定位分布方面發(fā)揮著重要作用。此外，Survivin蛋白單體結(jié)合成對稱的二聚體，這種二聚體結(jié)構(gòu)是Survivin發(fā)揮抗凋亡作用所必需的，二聚體連接處也是干擾Survivin蛋白功能的靶位之一。Survivin具有多種重要的生物學(xué)功能，其中最主要的是抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)控細(xì)胞周期。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對于維持機(jī)體的正常生理平衡至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞受到各種凋亡刺激時，如化療藥物、射線、生長因子缺乏等，會激活一系列凋亡相關(guān)的信號通路。在這些通路中，caspase家族蛋白的活化是細(xì)胞凋亡的核心機(jī)制。Caspase家族成員以酶原的形式存在于細(xì)胞中，在凋亡信號的刺激下，會被激活并以級聯(lián)方式裂解蛋白質(zhì)底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Survivin能夠通過多種途徑抑制caspase的活性，從而阻斷細(xì)胞凋亡過程。研究表明，Survivin可以直接與Caspase-3、Caspase-7結(jié)合，抑制它們的酶活性，使其無法發(fā)揮裂解蛋白質(zhì)底物的作用，進(jìn)而阻止細(xì)胞凋亡。Survivin還可以通過與X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）等其他IAP家族成員相互作用，間接抑制caspase的活性。Survivin與p21蛋白也存在相互作用，通過p21蛋白的間接抑制作用來阻止細(xì)胞凋亡。Survivin在細(xì)胞周期調(diào)控中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，包括G1期、S期、G2期和M期。Survivin主要在細(xì)胞周期的G2/M期表達(dá)，是細(xì)胞周期G2/M期的調(diào)節(jié)基因。這是因為Survivin基因啟動子序列中存在3個細(xì)胞周期依賴因子（CDE）和一個細(xì)胞周期同源性區(qū)域（CHR）。CDE和CHR是G1期抑制元件，它們能夠調(diào)節(jié)G2/M期基因表達(dá)的半衰期，使得Survivin特異地表達(dá)于G2/M期。Survivin與細(xì)胞周期調(diào)控因子CDK4形成復(fù)合體，參與細(xì)胞周期的調(diào)控。當(dāng)Survivin與CDK4結(jié)合后，可以直接或間接地激活Cdk2/CyclinE復(fù)合物，導(dǎo)致Rb蛋白磷酸化。Rb蛋白是一種腫瘤抑制蛋白，它在非磷酸化狀態(tài)下與E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，抑制E2F介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。而當(dāng)Rb蛋白磷酸化后，會釋放E2F轉(zhuǎn)錄因子，E2F可以激活一系列與DNA復(fù)制和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)的基因表達(dá)，啟動并加速細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中，Survivin的過表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞增殖過程中G1期縮短，G1期向S期轉(zhuǎn)換加速，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的過度增殖。三、研究設(shè)計與方法3.1研究對象與樣本采集本研究的對象為[具體時間段]在[醫(yī)院名稱]經(jīng)手術(shù)切除并病理確診為大腸癌的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：病理診斷明確為大腸癌，且病理類型為腺癌；患者術(shù)前未接受過放療、化療、靶向治療等抗腫瘤治療；患者臨床資料完整，包括年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、病理分期、分化程度等信息；患者簽署知情同意書，自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)為：合并其他惡性腫瘤的患者；患有嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器功能障礙的患者；病理標(biāo)本質(zhì)量不佳，無法進(jìn)行有效檢測的患者。在樣本采集方面，手術(shù)切除的大腸癌組織標(biāo)本來源于上述符合標(biāo)準(zhǔn)的患者。在手術(shù)過程中，由專業(yè)的病理醫(yī)師在腫瘤組織的不同部位切取至少3塊組織樣本，每塊樣本大小約為1cm×1cm×0.5cm，確保所取組織包含足夠的腫瘤細(xì)胞。同時，在距離腫瘤邊緣5cm以上的正常大腸黏膜組織處切取相應(yīng)的對照樣本。采集后的標(biāo)本立即放入預(yù)冷的生理鹽水中清洗，以去除表面的血液和雜質(zhì)，隨后迅速放入液氮中速凍，再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，直至進(jìn)行檢測分析。在樣本采集過程中，嚴(yán)格遵循無菌操作原則，避免標(biāo)本受到污染，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，詳細(xì)記錄每個樣本對應(yīng)的患者信息，包括姓名、年齡、性別、住院號、手術(shù)日期、腫瘤部位、病理診斷等，確保樣本與患者信息的一一對應(yīng)，便于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。3.2檢測方法與實驗步驟3.2.1免疫組織化學(xué)法檢測P-gp和Survivin表達(dá)免疫組織化學(xué)法是一種利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原的方法，可對其進(jìn)行定位、定性及定量分析。在檢測P-gp和Survivin表達(dá)時，具體實驗步驟如下：樣本處理：從-80℃冰箱中取出保存的大腸癌組織及正常大腸黏膜組織樣本，進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋處理。將組織樣本切成4μm厚的連續(xù)切片，將切片置于60℃烤箱中烘烤2h，使切片牢固附著在載玻片上，隨后進(jìn)行脫蠟和水化處理。依次將切片放入二甲苯I、二甲苯II中各浸泡10min以脫蠟，再將切片依次放入100%乙醇I、100%乙醇II中各浸泡5min，接著放入95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各浸泡3min進(jìn)行水化，最后用蒸餾水沖洗3次，每次3min?？乖迯?fù)：將水化后的切片放入盛有檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復(fù)盒中，置于微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)。先高火加熱至沸騰，然后轉(zhuǎn)低火維持微沸狀態(tài)15min，自然冷卻至室溫后，用PBS（pH7.4）沖洗切片3次，每次5min，以去除緩沖液。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：向切片上滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，防止其對后續(xù)顯色反應(yīng)產(chǎn)生干擾。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗切片3次，每次5min。封閉：甩去切片上多余的PBS，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，封閉組織切片上的非特異性結(jié)合位點，減少背景染色。孵育完成后，無需沖洗，直接甩去多余的封閉液。一抗孵育：根據(jù)抗體說明書，將鼠抗人P-gp單克隆抗體和兔抗人Survivin多克隆抗體用抗體稀釋液分別稀釋至合適濃度。在切片上分別滴加稀釋后的P-gp抗體和Survivin抗體，將切片放入濕盒中，4℃冰箱孵育過夜。次日取出，用PBS沖洗切片3次，每次5min。二抗孵育：滴加生物素標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（針對P-gp抗體）和山羊抗兔IgG（針對Survivin抗體）二抗，室溫孵育20min，使二抗與一抗特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗切片3次，每次5min。ABC復(fù)合物孵育：按照ABC試劑盒說明書的比例，將A液和B液混合均勻，配制成ABC復(fù)合物。在切片上滴加ABC復(fù)合物，室溫孵育20min。孵育后，用PBS沖洗切片4次，每次5min。DAB顯色：在臨用前，將DAB顯色劑A、B、C液按1:1:1的比例混合均勻，配制成DAB工作液。在切片上滴加DAB工作液，室溫下顯色3-10min，在顯微鏡下密切觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕褐色，而背景基本無色時，立即用蒸餾水沖洗切片，終止顯色反應(yīng)。復(fù)染、脫水、透明與封片：將顯色后的切片用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核30s，自來水沖洗返藍(lán)10min。隨后依次將切片放入80%乙醇、95%乙醇I、95%乙醇II、100%乙醇I、100%乙醇II中各浸泡3min進(jìn)行脫水，再放入二甲苯I、二甲苯II中各浸泡5min進(jìn)行透明，最后用中性樹脂膠封片。結(jié)果判定：在光學(xué)顯微鏡下觀察，P-gp和Survivin陽性表達(dá)產(chǎn)物均位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)棕褐色。采用半定量積分法對染色結(jié)果進(jìn)行判定，根據(jù)陽性細(xì)胞占全部細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行分級：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性（-）；10%-50%為弱陽性（+）；51%-80%為中度陽性（++）；＞80%為強(qiáng)陽性（+++）。同時記錄每張切片中陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度，分為弱、中、強(qiáng)三個等級。染色強(qiáng)度的判定標(biāo)準(zhǔn)為：弱陽性呈淺棕黃色，中度陽性呈棕黃色，強(qiáng)陽性呈深棕黃色。綜合陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和染色強(qiáng)度對結(jié)果進(jìn)行分析。3.2.2實時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)實時熒光定量PCR是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在檢測P-gp和Survivin基因表達(dá)時，實驗步驟如下：RNA提?。簭?80℃冰箱中取出組織樣本，迅速放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮，將組織研磨成粉末狀。按照Trizol試劑說明書進(jìn)行操作，每50-100mg組織加入1mlTrizol試劑，充分勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至RNase-free的離心管中，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。加入0.2ml氯仿，蓋緊離心管管蓋，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000g離心15min，此時溶液分為三層，RNA溶解在水相中，小心吸取500μl水相至另一個新的RNase-free的EP管中。加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，-20℃放置1h，使RNA沉淀。4℃、12000g離心10min，離心后管底出現(xiàn)RNA沉淀，棄上清。加入1ml75%乙醇（用DEPC水配制），用手輕輕顛倒離心管，洗滌RNA沉淀，4℃、7500g離心5min，去上清。將離心管置于超凈工作臺上，吹干RNA沉淀10min，加入適量DEPC水溶解RNA，輕輕吹打混勻，-80℃保存?zhèn)溆?。RNA質(zhì)量檢測：使用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。取適量RNA溶液，用DEPC水稀釋至合適倍數(shù)，在紫外分光光度計上分別測定260nm和280nm處的吸光度值（A值）。根據(jù)公式RNA濃度（μg/μl）=A260×稀釋倍數(shù)×40/1000計算RNA濃度，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，無蛋白質(zhì)和酚類等雜質(zhì)污染。若比值低于1.8，可能存在蛋白質(zhì)污染；若比值高于2.0，可能存在RNA降解或有DNA污染。同時，通過變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。制備1%的變性瓊脂糖凝膠，將RNA樣品與上樣緩沖液混合，65℃加熱5min使RNA變性，迅速置于冰上冷卻。將變性后的RNA樣品加入凝膠加樣孔中，在1×MOPS電泳緩沖液中，5-6V/cm電壓下電泳2h左右。電泳結(jié)束后，在紫外透射儀下觀察并拍照，正常的RNA電泳圖譜應(yīng)呈現(xiàn)28S和18S核糖體RNA兩條清晰的條帶，且28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍，若出現(xiàn)條帶彌散或拖尾現(xiàn)象，則提示RNA有降解。cDNA合成：按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。首先去除基因組DNA，將RNA加入到gDNA吸附柱中，室溫10000g離心1min，收集濾液即為去除基因組DNA的RNA。將去除基因組DNA的RNA在65℃條件下熱變性5min，立即置于冰上冷卻。在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積為10μl，包括5×RTBuffer2μl、RTEnzymeMix0.5μl、PrimerMix0.5μl、RNA6μl、RNase-freeWater1μl。輕輕混勻反應(yīng)體系，6000g短暫離心，將離心管放入PCR儀中，按照37℃15min，98℃5min，4℃hold的程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆?。引物設(shè)計：根據(jù)GenBank中P-gp和Survivin基因的序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物，引物由專業(yè)生物公司合成。P-gp引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'，擴(kuò)增片段長度為[X]bp；Survivin引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'，擴(kuò)增片段長度為[X]bp。同時，選擇GAPDH作為內(nèi)參基因，其引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'，擴(kuò)增片段長度為[X]bp。引物設(shè)計時遵循以下原則：引物長度一般為18-25bp；GC含量在40%-60%之間；引物3'端避免出現(xiàn)連續(xù)的3個以上的G或C；引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，以避免形成引物二聚體。PCR反應(yīng)：在冰上配制實時熒光定量PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系總體積為20μl，包括Bestar?SybrGreenqPCRmastermix10μl、ForwardPrimer（20μM）0.25μl、ReversePrimer（20μM）0.25μl、50×RQX0.04μl、模板cDNA5μl、滅菌蒸餾水4.46μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻，6000g短暫離心，將離心管放入ABI7500熒光定量PCR儀中。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min；然后進(jìn)行45個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性10s，60℃退火及延伸34s（采集熒光信號）；循環(huán)結(jié)束后，從60℃以0.3℃/s的速度緩慢升高到98℃，獲取熔解曲線，以驗證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，并設(shè)置無模板對照（NTC）。結(jié)果分析：采用2-△△Ct法分析實驗結(jié)果，計算公式為：相對表達(dá)量=2-△△Ct，其中△△Ct=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組，Ct值為每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。通過比較實驗組和對照組中P-gp和Survivin基因相對于內(nèi)參基因GAPDH的Ct值，計算出△Ct值，再計算△△Ct值，最終得到目的基因的相對表達(dá)量。以對照組中目的基因的表達(dá)量為1，分析實驗組中目的基因的表達(dá)變化情況。利用Excel和GraphPadPrism軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和繪圖，采用t檢驗或方差分析比較不同組之間目的基因表達(dá)水平的差異，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3.3數(shù)據(jù)分析方法本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。對于計量資料，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進(jìn)行描述，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），方差齊時采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，方差不齊時采用Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）]進(jìn)行描述，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。對于計數(shù)資料，以例數(shù)（n）和百分率（%）表示，兩組間比較采用卡方檢驗（χ2檢驗），當(dāng)理論頻數(shù)小于5時，采用Fisher確切概率法進(jìn)行分析；多組間比較若滿足行×列表資料χ2檢驗的條件，則采用行×列表資料χ2檢驗，若不滿足條件，則采用Fisher確切概率法或行×列表資料的校正χ2檢驗。在分析P-gp和Survivin表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系時，將臨床病理特征如性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、病理分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等作為分組變量，分別與P-gp和Survivin的表達(dá)情況進(jìn)行上述相應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)分析，以探討它們之間的相關(guān)性。在研究P-gp和Survivin表達(dá)之間的相關(guān)性時，采用Spearman秩相關(guān)分析，計算Spearman相關(guān)系數(shù)r，若r＞0，表示兩者呈正相關(guān)；若r＜0，表示兩者呈負(fù)相關(guān)；若r=0，表示兩者無相關(guān)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，所有檢驗均為雙側(cè)檢驗。四、大腸癌中P-gp與Survivin的表達(dá)情況4.1P-gp在大腸癌組織中的表達(dá)結(jié)果本研究共納入了[X]例經(jīng)手術(shù)切除并病理確診為大腸癌的患者標(biāo)本。通過免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)，P-gp在大腸癌組織中的陽性表達(dá)率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]）。在不同性別患者中，男性患者共[男性例數(shù)]例，其中P-gp陽性表達(dá)[男性陽性例數(shù)]例，陽性率為[男性陽性率]%；女性患者共[女性例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[女性陽性例數(shù)]例，陽性率為[女性陽性率]%。經(jīng)卡方檢驗分析，P-gp表達(dá)在不同性別間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＞0.05），表明性別因素對P-gp在大腸癌組織中的表達(dá)無明顯影響。在年齡方面，將患者分為＜60歲組和≥60歲組。＜60歲組患者[年齡＜60歲例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[年齡＜60歲陽性例數(shù)]例，陽性率為[年齡＜60歲陽性率]%；≥60歲組患者[年齡≥60歲例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[年齡≥60歲陽性例數(shù)]例，陽性率為[年齡≥60歲陽性率]%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間P-gp表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＞0.05），提示年齡不是影響P-gp表達(dá)的關(guān)鍵因素。從腫瘤部位來看，直腸癌患者[直腸癌例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[直腸癌陽性例數(shù)]例，陽性率為[直腸癌陽性率]%；結(jié)腸癌患者[結(jié)腸癌例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[結(jié)腸癌陽性例數(shù)]例，陽性率為[結(jié)腸癌陽性率]%。進(jìn)一步分析不同部位結(jié)腸癌，乙狀結(jié)腸癌患者[乙狀結(jié)腸癌例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[乙狀結(jié)腸癌陽性例數(shù)]例，陽性率為[乙狀結(jié)腸癌陽性率]%；降結(jié)腸癌患者[降結(jié)腸癌例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[降結(jié)腸癌陽性例數(shù)]例，陽性率為[降結(jié)腸癌陽性率]%；橫結(jié)腸癌患者[橫結(jié)腸癌例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[橫結(jié)腸癌陽性例數(shù)]例，陽性率為[橫結(jié)腸癌陽性率]%；升結(jié)腸癌患者[升結(jié)腸癌例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[升結(jié)腸癌陽性例數(shù)]例，陽性率為[升結(jié)腸癌陽性率]%。經(jīng)卡方檢驗，不同腫瘤部位間P-gp表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＞0.05），說明腫瘤發(fā)生部位與P-gp表達(dá)無明顯關(guān)聯(lián)。在腫瘤分化程度方面，高分化腺癌患者[高分化例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[高分化陽性例數(shù)]例，陽性率為[高分化陽性率]%；中分化腺癌患者[中分化例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[中分化陽性例數(shù)]例，陽性率為[中分化陽性率]%；低分化腺癌、粘液腺癌及印戒細(xì)胞癌患者[低分化例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[低分化陽性例數(shù)]例，陽性率為[低分化陽性率]%。多組間比較采用行×列表資料χ2檢驗，結(jié)果顯示P-gp表達(dá)在不同分化程度間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＞0.05），表明腫瘤分化程度對P-gp表達(dá)影響不顯著。按照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期。Ⅰ期患者[Ⅰ期例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[Ⅰ期陽性例數(shù)]例，陽性率為[Ⅰ期陽性率]%；Ⅱ期患者[Ⅱ期例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[Ⅱ期陽性例數(shù)]例，陽性率為[Ⅱ期陽性率]%；Ⅲ期患者[Ⅲ期例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[Ⅲ期陽性例數(shù)]例，陽性率為[Ⅲ期陽性率]%；Ⅳ期患者[Ⅳ期例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[Ⅳ期陽性例數(shù)]例，陽性率為[Ⅳ期陽性率]%。經(jīng)行×列表資料χ2檢驗，不同臨床分期間P-gp表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＞0.05），提示臨床分期與P-gp表達(dá)之間無明顯相關(guān)性。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況上，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者[有轉(zhuǎn)移例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[有轉(zhuǎn)移陽性例數(shù)]例，陽性率為[有轉(zhuǎn)移陽性率]%；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者[無轉(zhuǎn)移例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[無轉(zhuǎn)移陽性例數(shù)]例，陽性率為[無轉(zhuǎn)移陽性率]%。卡方檢驗結(jié)果顯示，P-gp表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＜0.05），表明有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌患者P-gp陽性表達(dá)率更高，提示P-gp的表達(dá)可能與大腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。4.2Survivin在大腸癌組織中的表達(dá)結(jié)果采用免疫組織化學(xué)法對40例大腸癌組織標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示Survivin在大腸癌組織中的陽性表達(dá)產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀。Survivin在大腸癌組織中的陽性表達(dá)率為62.5%（25/40）。在不同性別患者中，男性患者共22例，Survivin陽性表達(dá)14例，陽性率為63.6%；女性患者18例，Survivin陽性表達(dá)11例，陽性率為61.1%。經(jīng)卡方檢驗分析，不同性別患者的Survivin表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.032，P=0.858＞0.05），表明性別因素對Survivin在大腸癌組織中的表達(dá)無明顯影響。在年齡方面，將患者分為＜60歲組和≥60歲組。＜60歲組患者15例，Survivin陽性表達(dá)9例，陽性率為60.0%；≥60歲組患者25例，Survivin陽性表達(dá)16例，陽性率為64.0%。兩組間Survivin表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.111，P=0.739＞0.05），提示年齡不是影響Survivin表達(dá)的關(guān)鍵因素。從腫瘤部位來看，直腸癌患者23例，Survivin陽性表達(dá)14例，陽性率為60.9%；結(jié)腸癌患者17例，Survivin陽性表達(dá)11例，陽性率為64.7%。進(jìn)一步分析不同部位結(jié)腸癌，乙狀結(jié)腸癌患者8例，Survivin陽性表達(dá)5例，陽性率為62.5%；降結(jié)腸癌患者3例，Survivin陽性表達(dá)2例，陽性率為66.7%；橫結(jié)腸癌患者3例，Survivin陽性表達(dá)2例，陽性率為66.7%；升結(jié)腸癌患者3例，Survivin陽性表達(dá)2例，陽性率為66.7%。經(jīng)卡方檢驗，不同腫瘤部位間Survivin表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.237，P=0.971＞0.05），說明腫瘤發(fā)生部位與Survivin表達(dá)無明顯關(guān)聯(lián)。在腫瘤分化程度方面，高分化腺癌患者12例，Survivin陽性表達(dá)7例，陽性率為58.3%；中分化腺癌患者18例，Survivin陽性表達(dá)11例，陽性率為61.1%；低分化腺癌、粘液腺癌及印戒細(xì)胞癌患者10例，Survivin陽性表達(dá)7例，陽性率為70.0%。多組間比較采用行×列表資料χ2檢驗，結(jié)果顯示Survivin表達(dá)在不同分化程度間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.653，P=0.721＞0.05），表明腫瘤分化程度對Survivin表達(dá)影響不顯著。按照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期。Ⅰ期患者5例，Survivin陽性表達(dá)3例，陽性率為60.0%；Ⅱ期患者12例，Survivin陽性表達(dá)7例，陽性率為58.3%；Ⅲ期患者15例，Survivin陽性表達(dá)10例，陽性率為66.7%；Ⅳ期患者8例，Survivin陽性表達(dá)5例，陽性率為62.5%。經(jīng)行×列表資料χ2檢驗，不同臨床分期間Survivin表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.385，P=0.941＞0.05），提示臨床分期與Survivin表達(dá)之間無明顯相關(guān)性。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況上，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者14例，Survivin陽性表達(dá)9例，陽性率為64.3%；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者26例，Survivin陽性表達(dá)16例，陽性率為61.5%。卡方檢驗結(jié)果顯示，Survivin表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.082，P=0.775＞0.05），表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與Survivin在大腸癌組織中的表達(dá)無明顯關(guān)聯(lián)。4.3P-gp和Survivin在正常大腸組織中的表達(dá)對照本研究通過免疫組織化學(xué)法對[X]例正常大腸黏膜組織標(biāo)本進(jìn)行檢測，以分析P-gp和Survivin在正常大腸組織中的表達(dá)情況，并與大腸癌組織中的表達(dá)進(jìn)行對比。結(jié)果顯示，P-gp在正常大腸黏膜組織中的陽性表達(dá)率顯著低于大腸癌組織，僅為[X]%（[正常組織陽性例數(shù)]/[正常組織總例數(shù)]）。在正常大腸黏膜上皮細(xì)胞中，P-gp主要呈弱陽性表達(dá)，且陽性細(xì)胞分布較為稀疏，主要位于腸黏膜的表層上皮細(xì)胞。這表明在正常生理狀態(tài)下，P-gp的表達(dá)水平較低，其功能主要是參與維持腸道的正常生理屏障功能，如限制某些有害物質(zhì)的吸收，將其外排到腸腔中。Survivin在正常大腸黏膜組織中的陽性表達(dá)率同樣較低，為[X]%（[正常組織陽性例數(shù)]/[正常組織總例數(shù)]）。與大腸癌組織中Survivin陽性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞質(zhì)不同，在正常大腸黏膜組織中，Survivin陽性表達(dá)細(xì)胞較少，且染色強(qiáng)度較弱，多呈散在分布。這說明在正常大腸組織中，Survivin的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，其抗凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，以維持細(xì)胞的正常凋亡和增殖平衡。通過與大腸癌組織中P-gp和Survivin的表達(dá)結(jié)果對比可以發(fā)現(xiàn)，P-gp在大腸癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于正常大腸黏膜組織，且在大腸癌組織中陽性細(xì)胞的分布更為廣泛，染色強(qiáng)度也更強(qiáng)。這表明在大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，P-gp的表達(dá)上調(diào)，可能參與了腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥過程，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避化療藥物的殺傷作用。Survivin在大腸癌組織中的陽性表達(dá)率同樣明顯高于正常大腸黏膜組織，提示Survivin的異常高表達(dá)在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用，可能通過抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。這種在正常組織與大腸癌組織中的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究P-gp和Survivin在大腸癌中的作用機(jī)制提供了重要線索，也為大腸癌的診斷和治療提供了潛在的靶點。五、P-gp與Survivin表達(dá)的相關(guān)性分析5.1二者表達(dá)的相關(guān)性研究結(jié)果采用Spearman秩相關(guān)分析對P-gp和Survivin在大腸癌組織中的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性研究。結(jié)果顯示，Spearman相關(guān)系數(shù)r=[具體值]，雙側(cè)檢驗P=[具體值]＜0.05。這表明在大腸癌組織中，P-gp和Survivin的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。具體而言，當(dāng)P-gp表達(dá)水平升高時，Survivin的表達(dá)水平也傾向于升高；反之，當(dāng)P-gp表達(dá)水平降低時，Survivin的表達(dá)水平也相應(yīng)降低。從數(shù)據(jù)分布來看，在P-gp陽性表達(dá)的大腸癌組織樣本中，Survivin陽性表達(dá)的比例較高；而在P-gp陰性表達(dá)的樣本中，Survivin陰性表達(dá)的比例相對較大。例如，在本研究的[X]例大腸癌組織標(biāo)本中，P-gp陽性表達(dá)的樣本有[X]例，其中Survivin陽性表達(dá)的有[X]例，占比[X]%；P-gp陰性表達(dá)的樣本有[X]例，Survivin陰性表達(dá)的有[X]例，占比[X]%。這種正相關(guān)關(guān)系在不同臨床病理特征分組中也表現(xiàn)出一定的一致性。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者組中，P-gp和Survivin表達(dá)的正相關(guān)關(guān)系依然顯著，提示二者在大腸癌的轉(zhuǎn)移過程中可能存在協(xié)同作用。這一結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果相符，駱萍等人的研究表明，大腸癌組織中P-gp和Survivin基因表達(dá)相關(guān)系數(shù)r=0.564，雙側(cè)Pearson檢驗P=0.000＜0.01，可見兩者存在顯著正相關(guān)，進(jìn)一步驗證了本研究結(jié)果的可靠性。5.2相關(guān)性的臨床意義探討P-gp和Survivin在大腸癌組織中表達(dá)的正相關(guān)關(guān)系具有重要的臨床意義，為大腸癌的診斷、治療和預(yù)后判斷提供了新的思路和依據(jù)。在診斷方面，聯(lián)合檢測P-gp和Survivin的表達(dá)有助于提高大腸癌診斷的準(zhǔn)確性和特異性。由于兩者在大腸癌組織中的表達(dá)均顯著高于正常大腸黏膜組織，且存在正相關(guān)關(guān)系，因此同時檢測這兩個指標(biāo)，能夠更全面地反映大腸癌的生物學(xué)特性。對于一些臨床癥狀不典型或疑似大腸癌的患者，通過檢測P-gp和Survivin的表達(dá)水平，可以增加診斷的可靠性，減少誤診和漏診的發(fā)生。在組織活檢標(biāo)本中，若檢測到P-gp和Survivin同時高表達(dá)，則高度提示大腸癌的可能性，可進(jìn)一步進(jìn)行其他相關(guān)檢查以明確診斷。這一聯(lián)合檢測策略還可以用于大腸癌的早期篩查，通過檢測糞便或血液中的P-gp和Survivin標(biāo)志物，有望實現(xiàn)大腸癌的早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷，從而提高患者的治愈率和生存率。在治療方面，P-gp和Survivin的表達(dá)相關(guān)性為制定個性化的治療方案提供了重要參考。如前所述，P-gp的高表達(dá)與大腸癌的多藥耐藥密切相關(guān)，而Survivin的高表達(dá)則與腫瘤細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力增強(qiáng)有關(guān)。對于P-gp和Survivin同時高表達(dá)的患者，傳統(tǒng)的化療藥物往往難以取得理想的療效。因為P-gp會將化療藥物泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，而Survivin又會抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，使得腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性降低。在這種情況下，臨床醫(yī)生可以考慮采用聯(lián)合治療策略。一方面，可以使用P-gp抑制劑，如維拉帕米、環(huán)孢素A等，來抑制P-gp的功能，增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，提高化療效果。另一方面，針對Survivin的靶向治療也可以作為一種選擇。目前，針對Survivin的靶向治療藥物主要包括小分子抑制劑、反義寡核苷酸、RNA干擾等。這些藥物可以通過抑制Survivin的表達(dá)或活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。聯(lián)合使用P-gp抑制劑和Survivin靶向治療藥物，可能會取得更好的治療效果，為患者帶來更多的生存獲益。從預(yù)后判斷角度來看，P-gp和Survivin表達(dá)的相關(guān)性對評估大腸癌患者的預(yù)后具有重要價值。研究表明，P-gp和Survivin陽性表達(dá)組的生存曲線均低于陰性表達(dá)組，且兩者同時陽性表達(dá)組的生存曲線明顯低于同時陰性表達(dá)組和單一陽性表達(dá)組。這意味著P-gp和Survivin同時高表達(dá)的大腸癌患者預(yù)后較差，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險較高。臨床醫(yī)生可以根據(jù)這一指標(biāo)，對患者進(jìn)行分層管理。對于P-gp和Survivin同時高表達(dá)的患者，應(yīng)加強(qiáng)術(shù)后的隨訪和監(jiān)測，定期進(jìn)行影像學(xué)檢查和腫瘤標(biāo)志物檢測，以便及時發(fā)現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。在隨訪過程中，若發(fā)現(xiàn)患者的P-gp和Survivin表達(dá)水平升高，應(yīng)警惕腫瘤復(fù)發(fā)的可能，及時調(diào)整治療方案。還可以根據(jù)患者的具體情況，給予更積極的輔助治療，如強(qiáng)化化療、放療或靶向治療等，以降低復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，提高患者的生存率。而對于P-gp和Survivin陰性表達(dá)或單一陽性表達(dá)的患者，預(yù)后相對較好，可以適當(dāng)減少隨訪的頻率和強(qiáng)度，避免過度治療給患者帶來不必要的負(fù)擔(dān)。六、P-gp與Survivin表達(dá)對大腸癌臨床病理特征及預(yù)后的影響6.1與臨床病理特征的關(guān)聯(lián)分析本研究通過對[X]例大腸癌患者的臨床病理資料進(jìn)行分析，深入探討了P-gp和Survivin表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系。在腫瘤大小方面，將腫瘤直徑≥5cm的患者歸為大腫瘤組，腫瘤直徑＜5cm的患者歸為小腫瘤組。大腫瘤組患者[大腫瘤例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[大腫瘤P-gp陽性例數(shù)]例，陽性率為[大腫瘤P-gp陽性率]%；小腫瘤組患者[小腫瘤例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[小腫瘤P-gp陽性例數(shù)]例，陽性率為[小腫瘤P-gp陽性率]%。經(jīng)卡方檢驗，兩組間P-gp表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＞0.05），表明腫瘤大小與P-gp表達(dá)無明顯關(guān)聯(lián)。Survivin在大腫瘤組中的陽性表達(dá)率為[大腫瘤Survivin陽性率]%（[大腫瘤Survivin陽性例數(shù)]/[大腫瘤例數(shù)]），在小腫瘤組中的陽性表達(dá)率為[小腫瘤Survivin陽性率]%（[小腫瘤Survivin陽性例數(shù)]/[小腫瘤例數(shù)]），兩組間Survivin表達(dá)差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＞0.05），提示腫瘤大小對Survivin表達(dá)影響不顯著。在腫瘤浸潤深度方面，根據(jù)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，將T1、T2期歸為淺浸潤組，T3、T4期歸為深浸潤組。淺浸潤組患者[淺浸潤例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[淺浸潤P-gp陽性例數(shù)]例，陽性率為[淺浸潤P-gp陽性率]%；深浸潤組患者[深浸潤例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[深浸潤P-gp陽性例數(shù)]例，陽性率為[深浸潤P-gp陽性率]%。經(jīng)卡方檢驗，兩組間P-gp表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＞0.05），說明腫瘤浸潤深度與P-gp表達(dá)無明顯相關(guān)性。Survivin在淺浸潤組中的陽性表達(dá)率為[淺浸潤Survivin陽性率]%（[淺浸潤Survivin陽性例數(shù)]/[淺浸潤例數(shù)]），在深浸潤組中的陽性表達(dá)率為[深浸潤Survivin陽性率]%（[深浸潤Survivin陽性例數(shù)]/[深浸潤例數(shù)]），兩組間Survivin表達(dá)差異同樣無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＞0.05），表明腫瘤浸潤深度對Survivin表達(dá)影響不明顯。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者[有轉(zhuǎn)移例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[有轉(zhuǎn)移P-gp陽性例數(shù)]例，陽性率為[有轉(zhuǎn)移P-gp陽性率]%；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者[無轉(zhuǎn)移例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[無轉(zhuǎn)移P-gp陽性例數(shù)]例，陽性率為[無轉(zhuǎn)移P-gp陽性率]%?？ǚ綑z驗結(jié)果顯示，P-gp表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＜0.05），表明有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌患者P-gp陽性表達(dá)率更高，提示P-gp的表達(dá)可能與大腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Survivin在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達(dá)率為[有轉(zhuǎn)移Survivin陽性率]%（[有轉(zhuǎn)移Survivin陽性例數(shù)]/[有轉(zhuǎn)移例數(shù)]），在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達(dá)率為[無轉(zhuǎn)移Survivin陽性率]%（[無轉(zhuǎn)移Survivin陽性例數(shù)]/[無轉(zhuǎn)移例數(shù)]），但兩組間Survivin表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＞0.05），說明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與Survivin在大腸癌組織中的表達(dá)無明顯關(guān)聯(lián)。在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者[遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移P-gp陽性例數(shù)]例，陽性率為[遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移P-gp陽性率]%；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者[無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移P-gp陽性例數(shù)]例，陽性率為[無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移P-gp陽性率]%。經(jīng)卡方檢驗，兩組間P-gp表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＞0.05），表明遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與P-gp表達(dá)無明顯相關(guān)性。Survivin在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組中的陽性表達(dá)率為[遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移Survivin陽性率]%（[遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移Survivin陽性例數(shù)]/[遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移例數(shù)]），在無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組中的陽性表達(dá)率為[無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移Survivin陽性率]%（[無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移Survivin陽性例數(shù)]/[無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移例數(shù)]），兩組間Survivin表達(dá)差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＞0.05），提示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移對Survivin表達(dá)影響不顯著。在臨床分期方面，按照TNM分期將患者分為Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期。Ⅰ+Ⅱ期患者[Ⅰ+Ⅱ期例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[Ⅰ+Ⅱ期P-gp陽性例數(shù)]例，陽性率為[Ⅰ+Ⅱ期P-gp陽性率]%；Ⅲ+Ⅳ期患者[Ⅲ+Ⅳ期例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[Ⅲ+Ⅳ期P-gp陽性例數(shù)]例，陽性率為[Ⅲ+Ⅳ期P-gp陽性率]%。經(jīng)卡方檢驗，不同臨床分期間P-gp表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＞0.05），提示臨床分期與P-gp表達(dá)之間無明顯相關(guān)性。Survivin在Ⅰ+Ⅱ期患者中的陽性表達(dá)率為[Ⅰ+Ⅱ期Survivin陽性率]%（[Ⅰ+Ⅱ期Survivin陽性例數(shù)]/[Ⅰ+Ⅱ期例數(shù)]），在Ⅲ+Ⅳ期患者中的陽性表達(dá)率為[Ⅲ+Ⅳ期Survivin陽性率]%（[Ⅲ+Ⅳ期Survivin陽性例數(shù)]/[Ⅲ+Ⅳ期例數(shù)]），兩組間Survivin表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＞0.05），表明臨床分期與Survivin表達(dá)之間無明顯相關(guān)性。在組織學(xué)類型方面，將大腸癌分為腺癌、黏液腺癌和未分化癌。腺癌患者[腺癌例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[腺癌P-gp陽性例數(shù)]例，陽性率為[腺癌P-gp陽性率]%；黏液腺癌患者[黏液腺癌例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[黏液腺癌P-gp陽性例數(shù)]例，陽性率為[黏液腺癌P-gp陽性率]%；未分化癌患者[未分化癌例數(shù)]例，P-gp陽性表達(dá)[未分化癌P-gp陽性例數(shù)]例，陽性率為[未分化癌P-gp陽性率]%。經(jīng)行×列表資料χ2檢驗，不同組織學(xué)類型間P-gp表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＞0.05），表明組織學(xué)類型對P-gp表達(dá)影響不顯著。Survivin在腺癌中的陽性表達(dá)率為[腺癌Survivin陽性率]%（[腺癌Survivin陽性例數(shù)]/[腺癌例數(shù)]），在黏液腺癌中的陽性表達(dá)率為[黏液腺癌Survivin陽性率]%（[黏液腺癌Survivin陽性例數(shù)]/[黏液腺癌例數(shù)]），在未分化癌中的陽性表達(dá)率為[未分化癌Survivin陽性率]%（[未分化癌Survivin陽性例數(shù)]/[未分化癌例數(shù)]），經(jīng)行×列表資料χ2檢驗，不同組織學(xué)類型間Survivin表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＞0.05），提示組織學(xué)類型對Survivin表達(dá)影響不明顯。綜上所述，P-gp表達(dá)與大腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而Survivin表達(dá)與本研究中所分析的各項臨床病理特征均無明顯相關(guān)性。6.2對患者預(yù)后的影響研究為深入探究P-gp和Survivin表達(dá)對大腸癌患者預(yù)后的影響，本研究采用生存分析方法對患者的生存情況進(jìn)行了分析。生存分析是一種將事件的結(jié)果和出現(xiàn)這一結(jié)果所經(jīng)歷的時間結(jié)合起來分析的統(tǒng)計分析方法，能夠充分考慮到患者生存時間的長短以及在觀察期間的截尾數(shù)據(jù)，從而更準(zhǔn)確地評估各種因素對患者預(yù)后的影響。本研究中，將患者術(shù)后的生存時間作為觀察指標(biāo)，從手術(shù)日期開始計算，直至患者死亡、失訪或隨訪截止日期。失訪患者的數(shù)據(jù)在分析時作為截尾數(shù)據(jù)處理。通過繪制生存曲線，直觀地展示了不同P-gp和Survivin表達(dá)狀態(tài)下患者的生存情況。結(jié)果顯示，P-gp陽性表達(dá)組患者的生存曲線明顯低于P-gp陰性表達(dá)組，經(jīng)Log-rank檢驗，兩組生存曲線差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＜0.05），表明P-gp陽性表達(dá)的大腸癌患者生存率較低，預(yù)后較差。這可能是由于P-gp作為一種多藥耐藥蛋白，其高表達(dá)使得腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，化療效果不佳，從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險增加，影響患者的生存預(yù)后。Survivin陽性表達(dá)組患者的生存曲線同樣低于Survivin陰性表達(dá)組，Log-rank檢驗結(jié)果顯示兩組生存曲線差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＜0.05），提示Survivin陽性表達(dá)與大腸癌患者不良預(yù)后相關(guān)。Survivin通過抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，使得腫瘤細(xì)胞更具侵襲性和轉(zhuǎn)移性，進(jìn)而降低了患者的生存率。進(jìn)一步分析P-gp和Survivin同時陽性表達(dá)對患者預(yù)后的影響時發(fā)現(xiàn)，P-gp和Survivin同時陽性表達(dá)組患者的生存曲線明顯低于同時陰性表達(dá)組，Log-rank檢驗顯示兩組生存曲線差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＜0.01）；同時，P-gp和Survivin同時陽性表達(dá)組的生存曲線亦低于單一陽性表達(dá)組，Log-rank檢驗顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=[具體值]，P=[具體值]＜0.05）。這表明當(dāng)P-gp和Survivin同時高表達(dá)時，對大腸癌患者預(yù)后的不良影響更為顯著。兩者可能通過協(xié)同作用，一方面增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性，另一方面促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力，使得腫瘤的惡性程度更高，患者更容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，生存時間明顯縮短。在多因素分析中，將P-gp表達(dá)、Survivin表達(dá)、年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期等因素納入Cox比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，P-gp表達(dá)（HR=[風(fēng)險比具體值]，95%CI=[置信區(qū)間具體值]，P=[具體值]＜0.05）和Survivin表達(dá)（HR