微生物檢驗實驗操作程序一、實驗操作程序概述

微生物檢驗實驗操作程序是確保樣品中微生物含量準(zhǔn)確測定的關(guān)鍵流程。本程序旨在通過標(biāo)準(zhǔn)化的采樣、處理、培養(yǎng)和計數(shù)步驟，保證實驗結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。操作時需嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則，防止環(huán)境污染，并按照規(guī)定的步驟進行。

二、實驗準(zhǔn)備與材料

（一）實驗材料

1.無菌采樣工具（如無菌棉簽、取樣勺）

2.培養(yǎng)基（如瓊脂平板、肉湯培養(yǎng)基）

3.酶聯(lián)免疫吸附板（ELISA板，如適用）

4.顯微鏡（用于顯微鏡計數(shù)）

5.恒溫培養(yǎng)箱（溫度范圍35-37℃）

6.無菌操作臺（帶超凈風(fēng)過濾）

（二）實驗環(huán)境要求

1.實驗室溫度應(yīng)控制在20-25℃之間，濕度50%-60%。

2.操作前需對無菌操作臺進行紫外線消毒30分鐘，并開啟通風(fēng)30分鐘。

三、樣品采集與處理

（一）樣品采集

1.使用無菌工具采集樣品，避免污染。

2.樣品類型包括液體、固體或表面拭子，根據(jù)檢測需求選擇。

3.采集量：液體樣品取1-5mL，固體樣品取1-5g，表面拭子擦拭指定面積（如100cm2）。

（二）樣品處理

1.液體樣品：直接接種于培養(yǎng)基或進行梯度稀釋（如10?1至10??）。

2.固體樣品：研磨后取適量樣品，加入無菌生理鹽水（如1:10稀釋）。

3.表面拭子：將棉簽在培養(yǎng)基表面均勻涂抹三次，每次旋轉(zhuǎn)90°。

四、微生物培養(yǎng)

（一）培養(yǎng)基選擇

1.總菌落數(shù)檢測：使用PCA（胰酪大豆胨瓊脂）平板。

2.大腸菌群檢測：使用伊紅美藍(lán)（EMB）瓊脂平板。

3.霉菌檢測：使用沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）平板。

（二）培養(yǎng)步驟

1.將處理后的樣品傾注或涂布于培養(yǎng)基表面。

2.超過15mL液體樣品需使用無菌無菌玻璃珠振蕩混勻。

3.置于35-37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24-48小時。

五、菌落計數(shù)與結(jié)果分析

（一）菌落計數(shù)方法

1.選擇菌落數(shù)在30-300的平板進行計數(shù)。

2.采用傾注平板法時，每克樣品菌落數(shù)（CFU/g）=（平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）/樣品重量。

3.采用表面涂布法時，每平方厘米菌落數(shù)（CFU/cm2）=（平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）/涂抹面積。

（二）結(jié)果判定

1.大腸菌群陽性：EMB平板出現(xiàn)典型紫色菌落。

2.霉菌計數(shù)：SDA平板菌落計數(shù)≥102CFU/g或cm2為污染。

3.總菌落數(shù)：PCA平板菌落計數(shù)≤10?CFU/g或cm2為合格。

六、實驗注意事項

1.操作全程需佩戴無菌手套，避免手部接觸培養(yǎng)基。

2.培養(yǎng)基使用前需檢查有無霉變或過期。

3.培養(yǎng)結(jié)束后及時處理廢棄培養(yǎng)基，防止交叉污染。

4.計數(shù)時避免菌落重疊，可使用菌落計數(shù)器輔助。

七、質(zhì)量控制

（一）空白對照

每次實驗需設(shè)置無菌培養(yǎng)基空白對照，確認(rèn)無污染。

（二）重復(fù)性驗證

對樣品進行至少兩次平行檢測，結(jié)果差異≤20%視為合格。

（三）標(biāo)準(zhǔn)曲線建立（如適用）

使用已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品制作ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測靈敏度需≥0.1pg/mL。

一、實驗操作程序概述

微生物檢驗實驗操作程序是確保樣品中微生物含量準(zhǔn)確測定的關(guān)鍵流程。本程序旨在通過標(biāo)準(zhǔn)化的采樣、處理、培養(yǎng)和計數(shù)步驟，保證實驗結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。操作時需嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則，防止環(huán)境污染，并按照規(guī)定的步驟進行。

二、實驗準(zhǔn)備與材料

（一）實驗材料

1.無菌采樣工具：

（1）無菌棉簽：選擇帶塑料桿的7號或9號棉簽，確保無菌包裝完整。

（2）取樣勺/鏟：一次性無菌塑料材質(zhì)，用于固體樣品采集。

（3）無菌注射器：1mL或5mL規(guī)格，用于液體樣品吸取。

2.培養(yǎng)基：

（1）PCA（胰酪大豆胨瓊脂）：用于總菌落數(shù)培養(yǎng)，成分包括胰蛋白胨、大豆蛋白胨、瓊脂和酵母提取物。

（2）EMB（伊紅美藍(lán)）瓊脂：用于大腸菌群檢測，含有伊紅Y和美藍(lán)染料。

（3）SDA（沙氏葡萄糖瓊脂）：用于霉菌和酵母菌培養(yǎng)，成分包括葡萄糖、蛋白胨和瓊脂。

3.酶聯(lián)免疫吸附板（ELISA板）：

（1）板型：96孔可讀板，材質(zhì)為聚苯乙烯。

（2）配套試劑：洗液（PBS緩沖液）、封閉液（5%牛血清白蛋白）、顯色液（TMB/H2O2）。

4.顯微鏡：

（1）配置：配備計數(shù)目鏡（刻度0.1mm2）和10×-40×物鏡。

（2）校準(zhǔn)：每月使用標(biāo)準(zhǔn)粒子板校準(zhǔn)計數(shù)精度。

5.恒溫培養(yǎng)箱：

（1）溫度范圍：35-37℃，精度±0.5℃。

（2）濕度控制：內(nèi)置除濕裝置，相對濕度≤60%。

6.無菌操作臺：

（1）配置：紫外燈（30W）、超凈風(fēng)過濾系統(tǒng)（≥30L/min）。

（2）消毒流程：每日開啟紫外燈照射30分鐘，工作前使用75%酒精噴灑表面。

（二）實驗環(huán)境要求

1.溫度與濕度：實驗區(qū)域溫度20-25℃，濕度50%-60%，避免陽光直射。

2.潔凈度：操作臺表面使用電子塵埃粒子計數(shù)器檢測，≥3.5μm粒子≤5CFU/ft3。

3.空氣流向：確保操作區(qū)形成單向流，避免交叉污染。

三、樣品采集與處理

（一）樣品采集

1.液體樣品：

（1）打開容器蓋前，使用75%酒精擦拭瓶口30秒。

（2）用無菌注射器吸取1-5mL樣品，避免氣泡混入。

（3）若需梯度稀釋，逐級加入無菌生理鹽水（每級稀釋10倍）。

2.固體樣品：

（1）使用無菌取樣勺取1-5g樣品，置于無菌研缽中。

（2）加入9mL無菌生理鹽水，研磨均勻后靜置1小時。

（3）若檢測表面污染，使用無菌棉簽在100cm2區(qū)域內(nèi)擦拭3次，旋轉(zhuǎn)90°確保全覆蓋。

3.表面拭子：

（1）選擇直徑9cm無菌棉簽，浸濕生理鹽水（濕度飽和）。

（2）沿對角線方向擦拭物體表面，棉簽頭保留至少2/3未接觸表面。

（3）將棉簽頭置于無菌試管中，加入5mL生理鹽水振蕩混勻。

（二）樣品處理

1.液體樣品處理：

（1）傾注平板法：取1mL樣品傾注15mLPCA平板，37℃培養(yǎng)48小時。

（2）涂布平板法：用無菌涂布棒將樣品均勻涂抹在PCA平板表面。

2.固體樣品處理：

（1）勻漿法：將樣品與生理鹽水按1:10比例混合，高速勻漿3分鐘。

（2）傾注法：取1mL勻漿液傾注15mLSDA平板，37℃培養(yǎng)72小時。

3.比濁法（用于菌液定量）：

（1）使用麥?zhǔn)媳葷峁軐⒕赫{(diào)至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)（約1.5×10?CFU/mL）。

（2）取0.1mL菌液稀釋至10mL生理鹽水，用于平板接種。

四、微生物培養(yǎng)

（一）培養(yǎng)基選擇與制備

1.PCA培養(yǎng)基：

（1）稱量胰蛋白胨28g、大豆蛋白胨12g、酵母提取物5g，溶解于1L蒸餾水中。

（2）調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2，分裝三角瓶，高壓滅菌121℃15分鐘。

2.EMB培養(yǎng)基：

（1）稱量乳糖10g、伊紅Y2g、美藍(lán)5g、瓊脂15g，溶解于1L蒸餾水中。

（2）調(diào)節(jié)pH至6.9±0.2，冷卻后加入5mL伊紅美藍(lán)粉末，滅菌后傾注平板。

3.SDA培養(yǎng)基：

（1）稱量葡萄糖40g、蛋白胨10g、瓊脂15g，溶解于900mL蒸餾水中。

（2）調(diào)節(jié)pH至3.8±0.2，分裝后高壓滅菌，制備時補足葡萄糖至終濃度40g/L。

（二）培養(yǎng)步驟

1.平板培養(yǎng)：

（1）傾注法：培養(yǎng)基冷卻至45℃±0.5℃，快速倒入培養(yǎng)皿（≤15秒）。

（2）涂布法：使用涂布棒將菌液在平板表面三區(qū)交叉涂布。

2.滅菌處理：

（1）未使用培養(yǎng)基需冷藏保存（2-8℃），有效期≤2周。

（2）過期培養(yǎng)基需高壓滅菌30分鐘后排入專用廢棄物桶。

3.培養(yǎng)條件：

（1）總菌落數(shù)：35±0.5℃恒溫培養(yǎng)，48±2小時觀察。

（2）霉菌檢測：25±0.5℃培養(yǎng)，72±4小時觀察。

五、菌落計數(shù)與結(jié)果分析

（一）菌落計數(shù)方法

1.估計菌落計數(shù)（用于液體樣品）：

（1）取0.1mL樣品在PCA平板上涂布，計數(shù)菌落數(shù)（CFU/100mL）。

（2）若菌落數(shù)>300，需用0.01mL涂布；<30則用1mL涂布。

2.表面污染計數(shù)：

（1）選擇典型單菌落，菌落直徑0.5-1.5mm為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

（2）計算公式：CFU/cm2=（平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）/涂抹面積。

（二）結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.總菌落數(shù)：≤10?CFU/g或cm2為合格，>10?為不合格。

2.大腸菌群：EMB平板典型紫色菌落≥102CFU/g為陽性。

3.霉菌計數(shù)：SDA平板菌落≥102CFU/g為污染。

（三）顯微鏡計數(shù)（用于定量檢測）：

1.制片：取0.1mL菌液涂片，自然風(fēng)干后染色（革蘭染色或復(fù)紅染色）。

2.計數(shù)：顯微鏡×100倍視野下，計數(shù)≥30個視野中的總菌落數(shù)。

3.計算公式：CFU/mL=（視野菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）/視野面積（0.1mm2）。

六、實驗注意事項

1.無菌操作要點：

（1）手部消毒：使用70%酒精擦拭手部并等待30秒。

（2）工具滅菌：所有金屬工具需火焰滅菌，塑料工具使用75%酒精擦拭。

（3）容器處理：所有玻璃器皿需高壓滅菌，塑料耗材使用前檢查包裝完整性。

2.防污染措施：

（1）操作臺使用前開啟紫外燈30分鐘，工作過程中保持30L/min超凈風(fēng)。

（2）避免培養(yǎng)基表面暴露超過5分鐘，傾注時動作需快速連貫。

3.數(shù)據(jù)記錄：

（1）使用電子記錄儀或表格，實時錄入菌落形態(tài)、顏色等特征。

（2）異?，F(xiàn)象（如培養(yǎng)基變形、菌落異常）需標(biāo)注并拍照存檔。

七、質(zhì)量控制

（一）空白對照設(shè)置

1.每批實驗需設(shè)置3個無菌培養(yǎng)基空白對照，檢測是否污染。

2.若空白對照出現(xiàn)菌落，需重新制備培養(yǎng)基并重復(fù)實驗。

（二）重復(fù)性驗證

1.同一樣品需進行至少2次平行檢測，結(jié)果差異≤20%為合格。

2.不合格樣品需進行第三次檢測，若仍不合格需分析原因（如稀釋誤差）。

（三）標(biāo)準(zhǔn)曲線建立（ELISA檢測時）

1.使用標(biāo)準(zhǔn)品（100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.檢測靈敏度需≥0.1pg/mL，R2值≥0.98。

八、實驗廢棄物處理

1.培養(yǎng)基廢棄物：高壓滅菌30分鐘后排入醫(yī)療廢棄物桶。

2.棉簽/注射器：裝入專用銳器盒，定期交由專業(yè)機構(gòu)處理。

3.廢棄培養(yǎng)基：冷藏保存2周后傾倒，表面用70%酒精消毒。

九、附錄

（一）培養(yǎng)基配方表

|培養(yǎng)基類型|成分（g/L）|滅菌條件|

|------------|------------|---------|

|PCA|胰蛋白胨28|121℃15′|

||大豆蛋白胨12||

||酵母提取物5||

|EMB|乳糖10|121℃15′|

||伊紅美藍(lán)7||

||瓊脂15||

（二）菌落形態(tài)特征表

|微生物類型|菌落顏色|形狀|

|------------|----------|-------|

|大腸菌群|紫色|邊緣整齊|

|鏈球菌|無色透明|圓形凸起|

|霉菌|棕色/綠色|纖維狀|

一、實驗操作程序概述

微生物檢驗實驗操作程序是確保樣品中微生物含量準(zhǔn)確測定的關(guān)鍵流程。本程序旨在通過標(biāo)準(zhǔn)化的采樣、處理、培養(yǎng)和計數(shù)步驟，保證實驗結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。操作時需嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則，防止環(huán)境污染，并按照規(guī)定的步驟進行。

二、實驗準(zhǔn)備與材料

（一）實驗材料

1.無菌采樣工具（如無菌棉簽、取樣勺）

2.培養(yǎng)基（如瓊脂平板、肉湯培養(yǎng)基）

3.酶聯(lián)免疫吸附板（ELISA板，如適用）

4.顯微鏡（用于顯微鏡計數(shù)）

5.恒溫培養(yǎng)箱（溫度范圍35-37℃）

6.無菌操作臺（帶超凈風(fēng)過濾）

（二）實驗環(huán)境要求

1.實驗室溫度應(yīng)控制在20-25℃之間，濕度50%-60%。

2.操作前需對無菌操作臺進行紫外線消毒30分鐘，并開啟通風(fēng)30分鐘。

三、樣品采集與處理

（一）樣品采集

1.使用無菌工具采集樣品，避免污染。

2.樣品類型包括液體、固體或表面拭子，根據(jù)檢測需求選擇。

3.采集量：液體樣品取1-5mL，固體樣品取1-5g，表面拭子擦拭指定面積（如100cm2）。

（二）樣品處理

1.液體樣品：直接接種于培養(yǎng)基或進行梯度稀釋（如10?1至10??）。

2.固體樣品：研磨后取適量樣品，加入無菌生理鹽水（如1:10稀釋）。

3.表面拭子：將棉簽在培養(yǎng)基表面均勻涂抹三次，每次旋轉(zhuǎn)90°。

四、微生物培養(yǎng)

（一）培養(yǎng)基選擇

1.總菌落數(shù)檢測：使用PCA（胰酪大豆胨瓊脂）平板。

2.大腸菌群檢測：使用伊紅美藍(lán)（EMB）瓊脂平板。

3.霉菌檢測：使用沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）平板。

（二）培養(yǎng)步驟

1.將處理后的樣品傾注或涂布于培養(yǎng)基表面。

2.超過15mL液體樣品需使用無菌無菌玻璃珠振蕩混勻。

3.置于35-37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24-48小時。

五、菌落計數(shù)與結(jié)果分析

（一）菌落計數(shù)方法

1.選擇菌落數(shù)在30-300的平板進行計數(shù)。

2.采用傾注平板法時，每克樣品菌落數(shù)（CFU/g）=（平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）/樣品重量。

3.采用表面涂布法時，每平方厘米菌落數(shù)（CFU/cm2）=（平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）/涂抹面積。

（二）結(jié)果判定

1.大腸菌群陽性：EMB平板出現(xiàn)典型紫色菌落。

2.霉菌計數(shù)：SDA平板菌落計數(shù)≥102CFU/g或cm2為污染。

3.總菌落數(shù)：PCA平板菌落計數(shù)≤10?CFU/g或cm2為合格。

六、實驗注意事項

1.操作全程需佩戴無菌手套，避免手部接觸培養(yǎng)基。

2.培養(yǎng)基使用前需檢查有無霉變或過期。

3.培養(yǎng)結(jié)束后及時處理廢棄培養(yǎng)基，防止交叉污染。

4.計數(shù)時避免菌落重疊，可使用菌落計數(shù)器輔助。

七、質(zhì)量控制

（一）空白對照

每次實驗需設(shè)置無菌培養(yǎng)基空白對照，確認(rèn)無污染。

（二）重復(fù)性驗證

對樣品進行至少兩次平行檢測，結(jié)果差異≤20%視為合格。

（三）標(biāo)準(zhǔn)曲線建立（如適用）

使用已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品制作ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測靈敏度需≥0.1pg/mL。

一、實驗操作程序概述

微生物檢驗實驗操作程序是確保樣品中微生物含量準(zhǔn)確測定的關(guān)鍵流程。本程序旨在通過標(biāo)準(zhǔn)化的采樣、處理、培養(yǎng)和計數(shù)步驟，保證實驗結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。操作時需嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則，防止環(huán)境污染，并按照規(guī)定的步驟進行。

二、實驗準(zhǔn)備與材料

（一）實驗材料

1.無菌采樣工具：

（1）無菌棉簽：選擇帶塑料桿的7號或9號棉簽，確保無菌包裝完整。

（2）取樣勺/鏟：一次性無菌塑料材質(zhì)，用于固體樣品采集。

（3）無菌注射器：1mL或5mL規(guī)格，用于液體樣品吸取。

2.培養(yǎng)基：

（1）PCA（胰酪大豆胨瓊脂）：用于總菌落數(shù)培養(yǎng)，成分包括胰蛋白胨、大豆蛋白胨、瓊脂和酵母提取物。

（2）EMB（伊紅美藍(lán)）瓊脂：用于大腸菌群檢測，含有伊紅Y和美藍(lán)染料。

（3）SDA（沙氏葡萄糖瓊脂）：用于霉菌和酵母菌培養(yǎng)，成分包括葡萄糖、蛋白胨和瓊脂。

3.酶聯(lián)免疫吸附板（ELISA板）：

（1）板型：96孔可讀板，材質(zhì)為聚苯乙烯。

（2）配套試劑：洗液（PBS緩沖液）、封閉液（5%牛血清白蛋白）、顯色液（TMB/H2O2）。

4.顯微鏡：

（1）配置：配備計數(shù)目鏡（刻度0.1mm2）和10×-40×物鏡。

（2）校準(zhǔn)：每月使用標(biāo)準(zhǔn)粒子板校準(zhǔn)計數(shù)精度。

5.恒溫培養(yǎng)箱：

（1）溫度范圍：35-37℃，精度±0.5℃。

（2）濕度控制：內(nèi)置除濕裝置，相對濕度≤60%。

6.無菌操作臺：

（1）配置：紫外燈（30W）、超凈風(fēng)過濾系統(tǒng)（≥30L/min）。

（2）消毒流程：每日開啟紫外燈照射30分鐘，工作前使用75%酒精噴灑表面。

（二）實驗環(huán)境要求

1.溫度與濕度：實驗區(qū)域溫度20-25℃，濕度50%-60%，避免陽光直射。

2.潔凈度：操作臺表面使用電子塵埃粒子計數(shù)器檢測，≥3.5μm粒子≤5CFU/ft3。

3.空氣流向：確保操作區(qū)形成單向流，避免交叉污染。

三、樣品采集與處理

（一）樣品采集

1.液體樣品：

（1）打開容器蓋前，使用75%酒精擦拭瓶口30秒。

（2）用無菌注射器吸取1-5mL樣品，避免氣泡混入。

（3）若需梯度稀釋，逐級加入無菌生理鹽水（每級稀釋10倍）。

2.固體樣品：

（1）使用無菌取樣勺取1-5g樣品，置于無菌研缽中。

（2）加入9mL無菌生理鹽水，研磨均勻后靜置1小時。

（3）若檢測表面污染，使用無菌棉簽在100cm2區(qū)域內(nèi)擦拭3次，旋轉(zhuǎn)90°確保全覆蓋。

3.表面拭子：

（1）選擇直徑9cm無菌棉簽，浸濕生理鹽水（濕度飽和）。

（2）沿對角線方向擦拭物體表面，棉簽頭保留至少2/3未接觸表面。

（3）將棉簽頭置于無菌試管中，加入5mL生理鹽水振蕩混勻。

（二）樣品處理

1.液體樣品處理：

（1）傾注平板法：取1mL樣品傾注15mLPCA平板，37℃培養(yǎng)48小時。

（2）涂布平板法：用無菌涂布棒將樣品均勻涂抹在PCA平板表面。

2.固體樣品處理：

（1）勻漿法：將樣品與生理鹽水按1:10比例混合，高速勻漿3分鐘。

（2）傾注法：取1mL勻漿液傾注15mLSDA平板，37℃培養(yǎng)72小時。

3.比濁法（用于菌液定量）：

（1）使用麥?zhǔn)媳葷峁軐⒕赫{(diào)至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)（約1.5×10?CFU/mL）。

（2）取0.1mL菌液稀釋至10mL生理鹽水，用于平板接種。

四、微生物培養(yǎng)

（一）培養(yǎng)基選擇與制備

1.PCA培養(yǎng)基：

（1）稱量胰蛋白胨28g、大豆蛋白胨12g、酵母提取物5g，溶解于1L蒸餾水中。

（2）調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2，分裝三角瓶，高壓滅菌121℃15分鐘。

2.EMB培養(yǎng)基：

（1）稱量乳糖10g、伊紅Y2g、美藍(lán)5g、瓊脂15g，溶解于1L蒸餾水中。

（2）調(diào)節(jié)pH至6.9±0.2，冷卻后加入5mL伊紅美藍(lán)粉末，滅菌后傾注平板。

3.SDA培養(yǎng)基：

（1）稱量葡萄糖40g、蛋白胨10g、瓊脂15g，溶解于900mL蒸餾水中。

（2）調(diào)節(jié)pH至3.8±0.2，分裝后高壓滅菌，制備時補足葡萄糖至終濃度40g/L。

（二）培養(yǎng)步驟

1.平板培養(yǎng)：

（1）傾注法：培養(yǎng)基冷卻至45℃±0.5℃，快速倒入培養(yǎng)皿（≤15秒）。

（2）涂布法：使用涂布棒將菌液在平板表面三區(qū)交叉涂布。

2.滅菌處理：

（1）未使用培養(yǎng)基需冷藏保存（2-8℃），有效期≤2周。

（2）過期培養(yǎng)基需高壓滅菌30分鐘后排入專用廢棄物桶。

3.培養(yǎng)條件：

（1）總菌落數(shù)：35±0.5℃恒溫培養(yǎng)，48±2小時觀察。

（2）霉菌檢測：25±0.5℃培養(yǎng)，72±4小時觀察。

五、菌落計數(shù)與結(jié)果分析

（一）菌落計數(shù)方法

1.估計菌落計數(shù)（用于液體樣品）：

（1）取0.1mL樣品在PCA平板上涂布，計數(shù)菌落數(shù)（CFU/100mL）。

（2）若菌落數(shù)>300，需用0.01mL涂布；<30則用1mL涂布。

2.表面污染計數(shù)：

（1）選擇典型單菌落，菌落直徑0.5-1.5mm為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

（2）計算公式：CFU/cm2=（平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）/涂抹面積。

（二）結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.總菌落數(shù)：≤10?CFU/g或cm2為合格，>10?為不合格。

2.大腸菌群：EMB平板典型紫色菌落≥102CFU/g為陽性。

3.霉菌計數(shù)：SDA平板菌落≥102CFU/g為污染。

（三）顯微鏡計數(shù)（用于定量檢測）：

1.制片：取0.1mL菌液涂片，自然風(fēng)干后染色（革蘭染色或復(fù)紅染色）。

2.計數(shù)：顯微鏡×100倍視野下，計數(shù)≥30個視野中的總菌落數(shù)。

3.計算公式：CFU/mL=（視野菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）/視野面積（0.1mm2）。

六、實驗注意事項

1.無菌操作要點：

（1）手部消毒：使用70%酒精擦拭手部并等待30秒。

（2）工具滅菌：所有金屬工具需火焰滅菌，塑料工具使用75%酒精擦拭。

（3）容器處理：所有玻璃器皿需高壓滅菌，塑料耗材使用前檢查包裝完整性。

2.防污染措施：

（1）操作臺使用