ICS65.020.01CCSN33Maizechloroticmottlevirus--Morphologicalidentificationm中關(guān)村材料試驗(yàn)技術(shù)聯(lián)盟發(fā)布T/CSTM00999—2023本文件參照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》，GB/T20001.4《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中國材料與試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會科學(xué)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化領(lǐng)域委員會（CSTM/FC98）提出。本文件由中國材料與試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會科學(xué)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化領(lǐng)域委員會（CSTM/FC98）歸口。2T/CSTM00999—2023玉米褪綠斑駁病毒（maizechloroticmottlevirus,MCMV）是侵染玉米的重要檢疫性病毒病原，被列入《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》。該病毒與馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）的幾種病毒之一復(fù)合侵染引起的玉米致死壞死病（cornlethalnecrosis，CLN是玉米生產(chǎn)的毀滅性病害，一旦發(fā)生將帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。MCMV為直徑30nm的二十面體對稱球狀粒子，可經(jīng)汁液、介體葉甲和薊馬傳播，也可經(jīng)種子傳播，田間擴(kuò)散容易，在病毒分類學(xué)上歸屬于類番茄叢矮病毒目（Tolivirales）、番茄叢矮病毒科（Tombusviridae）、玉米褪綠斑駁病毒屬（Machlomovirus附錄A）。應(yīng)用透射電子顯微鏡可觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞病理學(xué)特征，是驗(yàn)證抗體檢測和分子檢測結(jié)果的重要形態(tài)學(xué)檢測依據(jù)。透射電鏡制樣方法的細(xì)節(jié)以及制樣質(zhì)量直接關(guān)系到該病毒的形態(tài)成像及正確鑒定，為了正確指導(dǎo)玉米褪綠斑駁病毒形態(tài)學(xué)檢測診斷工作，特制定該病毒透射電子顯微鏡形態(tài)學(xué)檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)。T/CSTM00999—2023玉米褪綠斑駁病毒形態(tài)學(xué)檢測透射電子顯微鏡法重要提示：使用本文件的人員應(yīng)有植物病毒檢測能力的實(shí)驗(yàn)室工作實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。本文件并未指出所有可能的安全問題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧⒈ＷC符合國家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。本文件規(guī)定了應(yīng)用透射電子顯微鏡對玉米褪綠斑駁病毒進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測的方法。本文件適用于玉米褪綠斑駁病毒的形態(tài)學(xué)鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T31810玉米褪綠斑駁病毒檢疫鑒定方法JY/T0581透射電子顯微鏡分析方法通則SN/T2122進(jìn)出境植物及植物產(chǎn)品檢疫抽樣方法SN/T2964植物病毒檢測規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1病毒virus由核酸和蛋白質(zhì)外殼組成，具有侵染活性并能夠在寄主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的非細(xì)胞生物。3.2病毒粒子virion成熟的或結(jié)構(gòu)完整、具有侵染性的病毒個體。3.3玉米褪綠斑駁病毒maizechloroticmottlevirusMCMV一種嚴(yán)重侵害玉米等作物的檢疫性植物病毒，詳見附錄A。3.4抗原antigenT/CSTM00999—20234能刺激動物機(jī)體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞并能與之發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)。3.5抗體antibody動物機(jī)體受到抗原刺激而產(chǎn)生的、能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)的一種免疫球蛋白。3.6負(fù)染色negativestain采用高密度的重金屬鹽染色液提高生物樣品顆粒背景電子密度的染色方法。3.7免疫電子顯微術(shù)immunoelectronmicroscopy利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理在超微結(jié)構(gòu)水平上定位、定性及半定量顯示抗原的技術(shù)方法，分為免疫復(fù)合物電鏡技術(shù)和免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)兩大類。3.8超薄切片術(shù)ultrathinsectiontechnique采用超薄切片機(jī)把經(jīng)過包埋后的樣品切成厚度為50nm~100nm薄片的方法。4原理4.1負(fù)染色技術(shù)原理：采用高密度的重金屬鹽染色液（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾等）包圍低密度的樣品顆粒，使樣品顆粒周圍的電子密度得到增強(qiáng)，在透射電鏡下顯示暗背景襯托的淺色樣品顆粒形態(tài)及微細(xì)結(jié)構(gòu)，圖像呈現(xiàn)負(fù)反差。該方法直接對病毒懸液樣品進(jìn)行負(fù)染色，操作簡便，可用于多數(shù)病毒快速檢測。4.2免疫復(fù)合物電鏡技術(shù)原理：在電鏡載網(wǎng)上進(jìn)行抗原抗體免疫反應(yīng)，然后對免疫反應(yīng)復(fù)合物進(jìn)行負(fù)染色電鏡觀察，適用于病毒快速檢測診斷。4.3超薄切片技術(shù)原理：將經(jīng)過固定和脫水的生物樣品包埋在樹脂介質(zhì)中，采用超薄切片機(jī)將含有樣品的聚合樹脂包埋塊切成厚度為50nm~100nm的薄片，供透射電鏡觀察。5儀器設(shè)備、試劑和材料、實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)及環(huán)境條件5.1儀器設(shè)備5.1.1透射電子顯微鏡；5.1.2超薄切片機(jī)；5.1.3玻璃制刀機(jī)；5.1.4高速離心機(jī)；5.1.5光學(xué)顯微鏡；5.1.6渦旋振蕩儀；5.1.7輝光放電儀；T/CSTM00999—202355.1.8包埋聚合箱；5.1.9移液器。5.2試劑和材料5.2.1磷酸二氫鈉（分析純）；5.2.2磷酸氫二鈉（分析純）；5.2.3戊二醛（分析純）；5.2.4四氧化鋨（結(jié)晶體）；5.2.5丙酮（分析純）；5.2.6乙醇（分析純）；5.2.7環(huán)氧樹脂包埋劑；5.2.8醋酸雙氧鈾（分析純）；5.2.9檸檬酸鉛（分析純）；5.2.10磷鎢酸（分析純）；5.2.11亞甲基藍(lán)；5.2.12玉米褪綠斑駁病毒多克隆抗體；5.2.13PCR檢測離心管（0.5mL，1.5mL）；5.2.14封口膜；5.2.15濾紙；5.2.16包埋管；5.2.17覆Formvar膜的200目電鏡銅網(wǎng)。5.3實(shí)驗(yàn)室安全資質(zhì)及環(huán)境條件5.3.1實(shí)驗(yàn)室安全資質(zhì)：植物病毒對于哺乳動物和人不具感染性，本文件規(guī)定的實(shí)驗(yàn)操作可以在普通生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。5.3.2環(huán)境條件：超薄切片機(jī)、透射電鏡應(yīng)安裝在獨(dú)立的房間內(nèi)，工作環(huán)境應(yīng)符合以下要求。a)超薄切片機(jī)：相對濕度小于60%，溫度（20±5）℃,電源電壓（220±22）V，電源頻率（50±1）Hz，滿足防振要求；b)透射電鏡：相對濕度小于60%，溫度（20±5）℃,電源電壓（220±22）V，電源頻率（50±1）Hz，具備儀器專用地線，接地電阻值參照儀器說明書的要求。6樣品6.1樣品類型6.1.1玉米種子。6.1.2田間的玉米病株葉片、莖等新鮮材料。T/CSTM00999—202366.1.3人工接種MCMV的玉米葉片、莖等新鮮材料。6.2取樣要求6.2.1田間作物取樣及樣品處理按SN/T2964的規(guī)定執(zhí)行。6.2.2進(jìn)出境植物檢疫的取樣按SN/T2122的規(guī)定執(zhí)行。6.2.3其他來樣按送檢要求進(jìn)行取樣。6.3樣品貯存和傳遞待檢種子樣品可保存于室溫或4℃冰箱內(nèi)；用于超薄切片的葉片樣品應(yīng)保濕存放于4℃冰箱內(nèi)，其它病株樣品可在-20℃以下冰箱凍存。種子樣品在室溫下傳遞，新鮮病株樣品須0℃~15℃保濕傳遞。6.4樣品預(yù)處理6.4.1組織粗汁液樣品：將玉米葉片組織加等體積0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.0在研缽中研磨，過濾或離心后獲得粗汁液；小片的組織可用微型研磨器研磨；種子取種皮在液氮中研磨制備組織粗汁液，也可以在適當(dāng)溫度和光照條件下使其發(fā)芽后再制備獲取組織粗汁液。6.4.2提純病毒樣品：將分離提純的MCMV樣品用雙蒸餾水或0.01mol/L的磷酸緩沖液（pH7.0）稀釋至適合電鏡觀察的濃度。6.4.3超薄切片樣品：選擇有明顯褪綠斑駁癥狀的玉米葉片，用雙面刀片切取病葉的褪綠斑駁邊緣部位供超薄切片制樣之用。7檢測步驟7.1電鏡樣品制備7.1.1負(fù)染色樣品制備懸滴法：以鑷子夾持銅網(wǎng)，用移液器吸一滴病毒樣品液體滴在覆膜的銅網(wǎng)上，吸附1min~2min，然后用濾紙片從銅網(wǎng)邊緣吸掉多余液體，待液體完全干燥前，用2%磷鎢酸負(fù)染色液（pH6.8）進(jìn)行負(fù)染色，染色時間1min~2min，用濾紙片從銅網(wǎng)邊緣吸掉多余染色液，干燥后待檢。負(fù)染色液配制參見附錄B。漂浮法：在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪封口膜，用移液器吸一滴病毒樣品液體滴在封口膜上，將銅網(wǎng)膜面朝下倒扣在病毒懸液滴上靜置1min~2min，然后夾起銅網(wǎng)，用濾紙片從銅網(wǎng)邊緣吸掉多余液體，再將銅網(wǎng)倒扣在2%磷鎢酸負(fù)染色液滴（pH6.8）上進(jìn)行負(fù)染色，染色時間1min~2min，用濾紙片從銅網(wǎng)邊緣吸掉多余染色液，干燥后待檢。7.1.2免疫吸附樣品制備在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪上封口膜，用移液器吸一滴1:10~1:100倍稀釋的MCMV抗體滴在封口膜上，將銅網(wǎng)膜面朝下放置于抗體液滴上，在培養(yǎng)皿中保濕15min。用濾紙片吸掉抗體余液后，將銅網(wǎng)膜面朝下放置于病毒樣品懸液滴上，在培養(yǎng)皿中保濕反應(yīng)30min（如種子的病毒含量低，反應(yīng)時間可延長至數(shù)小時或過夜）。T/CSTM00999—2023反應(yīng)結(jié)束后用20滴0.05mol/L的磷酸緩沖液、30滴雙蒸餾水先后連續(xù)滴洗樣品銅網(wǎng)。用濾紙片吸除余液后，用2%磷鎢酸（pH值6.8）進(jìn)行負(fù)染色，染色時間1min~2min，干燥后待檢。7.1.3超薄切片樣品制備前固定：將病株葉片切成1mm×3mm的小塊，置于0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.2）配制的2%~3%戊二醛固定液中前固定2h（4℃)。戊二醛固定液配制參見附錄B。漂洗：用0.1mol/L磷酸緩沖液充分漂洗三次，每次10min~15min。后固定：經(jīng)過漂洗后的樣品置于0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.2）配制的1%四氧化鋨固定液中后固定1h~2h（4℃),再用相同緩沖液充分漂洗三次，每次10min~15min。四氧化鋨固定液配制參見附錄B。脫水：采用50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脫水，各濃度脫水時間為10min~15min，然后用100％丙酮脫水2次，每次30min。浸透與包埋：樣品脫水后在丙酮：包埋劑（1：1）浸透1h1：3）浸透3h，然后在純包埋劑中浸透過夜，用膠囊或包埋管進(jìn)行樣品包埋。推薦采用Spurr低粘度包埋劑，其配制參見附錄B。聚合：包埋后的樣品在包埋聚合器或恒溫烘箱內(nèi)進(jìn)行聚合。修塊和定位：聚合后的包埋塊修成易于超薄切片的形狀，然后在超薄切片機(jī)上用玻璃刀進(jìn)行半薄切片，切片厚度為0.5μm~1μm，經(jīng)1%亞甲基藍(lán)染色后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病變細(xì)胞定位。超薄切片：修塊和定位后的包埋塊在超薄切片機(jī)上用玻璃刀或鉆石刀切成超薄切片，切片厚度50nm~100nm，用覆膜銅網(wǎng)撈取超薄切片。染色：采用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛在室溫下對超薄切片進(jìn)行雙重染色，醋酸雙氧鈾染色時間15min~30min，檸檬酸鉛染色時間5min~10min，干燥后待檢。染色液的配制參見附錄B。7.2透射電鏡檢測步驟7.2.1按照透射電鏡操作程序開機(jī)，抽真空至正常工作狀態(tài)，精確合軸，消除聚光鏡和物鏡像散，使儀器處于最佳工作狀態(tài)。7.2.2透射電鏡放大倍數(shù)校準(zhǔn)按JY/T0581的規(guī)定進(jìn)行。7.2.3推薦加速電壓范圍：60kV~80kV。7.2.4推薦放大倍率范圍：4,000×~50,000×。7.2.5負(fù)染色樣品和免疫吸附樣品的觀察：先在低倍率（4,000×左右）下選擇負(fù)染色劑著色的電子密度較大斑塊，觀察樣品全貌。逐步提高放大倍率，仔細(xì)尋找直徑30nm的球狀病毒粒子，由于田間樣品往往是MCMV與另一種線狀植物病毒復(fù)合侵染，因此在負(fù)染色樣品中可以同時觀察到長度約600nm-900nm線狀病毒粒子。種子樣品中的病毒含量通常較低，電鏡視野下可觀察到的病毒粒子較少。病毒粒子圖像精細(xì)聚焦后用CMOS或CCD相機(jī)記錄并儲存。MCMV病毒粒子的典型形態(tài)見附錄C。T/CSTM00999—202387.2.6超薄切片樣品的觀察：在低倍率模式（50×~1,000×)找到切片，切換到正常放大模式觀察呈現(xiàn)病變的細(xì)胞。逐步提高放大倍率，仔細(xì)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的異常變化。在MCMV侵染的病變細(xì)胞中可以觀察到大量直徑30nm典型的球狀病毒粒子分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，局部還有結(jié)晶狀排列的病毒聚集體；過氧化物酶體增生并聚集，在過氧化物酶體外膜周邊形成復(fù)制小泡；線粒體呈現(xiàn)囊泡化畸變，在囊泡結(jié)構(gòu)中積累了大量纖維狀物質(zhì)，后期線粒體崩解，纖維狀物質(zhì)釋放到細(xì)胞質(zhì)。MCMV感染的細(xì)胞圖像精確聚焦后用CMOS或CCD相機(jī)記錄并儲存。感染MCMV的病變細(xì)胞特征和健康對照圖片見附錄C。7.3結(jié)果判定電鏡下觀察到直徑30nm的球狀病毒粒子，病變細(xì)胞的線粒體呈現(xiàn)囊泡化畸變并含有纖維狀物質(zhì)，過氧化物酶體形成周邊復(fù)制小泡等細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，符合附錄A和附錄C的典型形態(tài)特征。在所有侵染玉米的植物病毒中，唯有MCMV才引起線粒體囊泡化畸變并含有纖維狀物質(zhì)，并且過氧化物酶體產(chǎn)生周邊復(fù)制小泡，根據(jù)這些細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征就可判定樣品攜帶MCMV。在僅對樣品進(jìn)行負(fù)染色電鏡觀察的情況下，或者有植物檢疫的技術(shù)要求，可按GB/T31810的規(guī)定進(jìn)一步做抗體檢測和分子檢測驗(yàn)證。8樣品無害化處理MCMV檢測過程中使用過的樣品材料，在檢測完畢后需要進(jìn)行消毒和無害化處理。送檢種子樣品保存在4℃冰箱內(nèi)，病葉樣品保存在-20℃以下冰箱或凍干保存三個月備查，保存期滿后及時進(jìn)行滅活銷毀，以防病毒在田間擴(kuò)散。9檢測報告檢測結(jié)果報告至少應(yīng)包括以下信息：a)檢測報告的唯一編號；b)樣品名稱；c)送檢人姓名、單位和地址；d)樣品的接收日期；e)檢測儀器及其工作條件；f)檢測依據(jù)；g)檢測結(jié)果和必要的說明；h)檢測人簽字；i)檢測報告負(fù)責(zé)人簽字；j)檢測報告的頁碼；k)檢測機(jī)構(gòu)名稱和地址；l)檢測報告的日期。T/CSTM00999—2023玉米褪綠斑駁病毒相關(guān)資料A.1病毒學(xué)名及分類學(xué)地位（引自：國際病毒分類委員會ICTV2021病毒分類系統(tǒng)。）目（Order類番茄叢矮病毒目（Tolivirales）科（Family）：番茄叢矮病毒科（Tombusviridae）屬（Genus）：玉米褪綠斑駁病毒屬（Machlomovirus）種（Species）：玉米褪綠斑駁病毒（Maizechloroticmottlevirus,MCMV）A.2寄主范圍玉米褪綠斑駁病毒的自然寄主為玉米，還可侵染小麥、大麥、燕麥、高粱、甘蔗等禾本科植物。A.3病害癥狀病毒引起褪綠斑駁、壞死、矮化、穗發(fā)育差或無穗、過早死亡等癥狀。常與甘蔗花葉病毒等馬鈴薯Y病毒科病毒共同復(fù)合侵染，產(chǎn)生更嚴(yán)重癥狀，造成嚴(yán)重危害。A.4傳播病毒易通過機(jī)械接種傳播，也可以經(jīng)種子、介體葉甲、薊馬傳毒，在田間擴(kuò)散容易。A.5地理分布分布于阿根廷、墨西哥、秘魯、美國，在東非和東南亞地區(qū)也有發(fā)現(xiàn)，2009年在中國云南首次發(fā)現(xiàn)并報道。A.6血清學(xué)特性MCMV具有中等到強(qiáng)的免疫原性，在凝膠擴(kuò)散中形成單條沉淀線，與其他一些禾谷類植物病毒無血清學(xué)關(guān)系。A.7病毒粒子形態(tài)病毒粒子為等軸對稱二十面體（T=3直徑為30nm，無包膜，有的被染色劑滲透，有180個蛋A.8理化特性相對分子質(zhì)量為6.1×106，標(biāo)準(zhǔn)沉降常數(shù)S（20W）=109S，在氯化銫中的浮力密度為1.365g/cm3，病毒對乙醚、氯仿和非離子去垢劑不敏感，在體外可穩(wěn)定33天以上，熱鈍化點(diǎn)在80℃~85℃,病毒在pH6穩(wěn)定，可由二價陽離子穩(wěn)定。A.9基因組結(jié)構(gòu)單分子正義單鏈RNA，長度為4437nt。RNA的3'端無Poly（A），5'端可能是未加帽的。病毒基因組含有4個ORF，ORF1編碼一個32kDa蛋白，ORF2編碼48kDa蛋白，對ORF2琥珀終止密碼子的超讀使翻譯持續(xù)到ORF2-RT，產(chǎn)生一個112kDa蛋白，該蛋白也可以在病毒RNA的體外翻譯中得到。ORF3編碼一個7kDa蛋白，推測對ORF3的UGA終止密碼子超讀產(chǎn)生一個33kDa蛋白。ORF4編碼25kDa的外殼蛋白，在體內(nèi)由其3'端亞基因組RNA表達(dá)產(chǎn)生。ORF1與ORF3編碼蛋白以及ORF3超讀產(chǎn)物的功能尚不清楚，ORF2編碼蛋白及其超讀產(chǎn)物可能是病毒的聚合酶。T/CSTM00999—2023A.10細(xì)胞病理學(xué)大量病毒粒子分布在細(xì)胞質(zhì)中；過氧化物酶體增生并聚集，形成周邊復(fù)制小泡；線粒體囊泡化，在由線粒體內(nèi)脊擴(kuò)張形變而成的囊泡中產(chǎn)生大量細(xì)纖維狀物質(zhì)。與馬鈴薯Y病毒科病毒復(fù)合侵染的細(xì)胞質(zhì)中可觀察到線狀病毒和風(fēng)輪狀內(nèi)含體。T/CSTM00999—2023常用試劑配方B.1磷酸緩沖液配方B.1.10.2mol/L磷酸緩沖液母液配制A液：0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液NaH2PO4.H2O27.60g（或NaH2PO4.2H2O加雙蒸餾水至1000mL，混勻。B液：0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液Na2HPO4.2H2O35.61g（或Na2HPO4.12H2O71.64g）加雙蒸餾水至1000mL，混勻。B.1.20.2mol/L磷酸緩沖液貯存液配制不同pH值磷酸緩沖液貯存液配制見表B.1，表B.1不同pH值磷酸緩沖液貯存液配制表pH值7.07.8A液73.562.551.039.028.0B液26.537.549.061.072.091.5B.1.30.1mol/L磷酸緩沖液配制取0.2mol/L磷酸緩沖液貯存液，加1倍雙蒸餾水即為0.1mol/L磷酸緩沖液。按不同比例稀釋可配制成不同濃度的磷酸緩沖液。B.2固定液配方B.2.1戊二醛固定液配制戊二醛固定液配制見表B.2。表B.20.1mol/L磷酸緩沖液配制的戊二醛固定液配制表0.2mol/L磷酸緩沖液/mL25%戊二醛水溶液/mL46820加雙蒸餾水至/mL戊二醛最終濃度2.0%2.5%4.0%T/CSTM00999—2023B.2.2四氧化鋨固定液配制B.2.2.12％四氧化鋨貯存液將裝有四氧化鋨晶體的安瓿（0.5g）清洗干凈，用玻璃劃割器在上面刻痕，再用雙蒸餾水沖洗幾次，放入潔凈棕色廣口瓶內(nèi)，加上25mL雙蒸餾水，用潔凈玻璃棒搗破安瓿，快速蓋上瓶蓋，用封口膜將瓶口密封，貼上標(biāo)簽并用黑紙包裹避光備用。B.2.2.20.1mol/L磷酸緩沖液配制的四氧化鋨固定液取等量的0.2mol/L磷酸緩沖液（pH7.2）與2％四氧化鋨貯存液混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。B.3包埋劑配方B.3.1Spurr低黏度包埋劑配制見表B.3。表B.3Spurr低黏度包埋劑配制表試劑標(biāo)準(zhǔn)偏硬性硬性軟性快速聚合慢速聚合ERL-4221DER-7364.0g7.0gNSA26.0g26.0g26.0g26.0g26.0g26.0gDMAE0.4mL0.4mL0.4mL0.4mL0.2mL聚合時間/h88883混合時間/d3~43~43~43~427B.3.2按表B.3比例將前三種成份混合均勻，再加DMAE催化劑攪拌。配好的包埋劑在低溫和防潮狀態(tài)下可保存數(shù)月。此包埋劑在聚合時包埋管需要加蓋，在70℃溫度下聚合8h即可完全聚合。此包埋劑不易受潮。B.4染色液配方B.4.12%磷鎢酸負(fù)染色液配制稱取1g磷鎢酸，用50mL雙蒸餾水配制成2%的水溶液，用1mol/LNaOH調(diào)至pH6.7~6.8，過濾后在4℃下保存?zhèn)溆?。B.4.2飽和醋酸雙氧鈾負(fù)染色液配制低鹽的病毒提純試樣也可用飽和醋酸雙氧鈾水溶液進(jìn)行負(fù)染色，具有更高的圖像分辨率。飽和醋酸雙氧鈾負(fù)染色液用雙蒸餾水配制，pH值4.2，室溫下避光保存?zhèn)溆?。B.4.3超薄切片染色液配制B.4.3.1醋酸雙氧鈾染色液：用50%乙醇配制成1%~3%的飽和溶液，呈淡黃色，室溫下避光保存。B.4.3.2檸檬酸鉛染色液：稱取硝酸鉛1.33g、檸檬酸三鈉1.76g，放入50mL容量瓶中，加預(yù)先煮沸過的雙蒸餾水30mL，混合后搖蕩30min，呈乳白色混懸液，加1mol/LNaOH溶液8mL，待混懸液逐漸變澄清，pH值為12，再加雙蒸餾水定容至50mL，封閉瓶口。T/CSTM00999—2023玉米褪綠斑駁病毒電鏡照片C.1玉米褪綠斑駁病毒（MCMV）的形態(tài)見圖C.1。AACBBD圖C.1玉米褪綠斑駁病毒（MCMV）的形態(tài)T/CSTM00999—2023C.2玉米褪綠斑駁病毒（MCMV）侵染玉米葉片的細(xì)胞病理特征見圖C.2。BDACBDAC圖C.2玉米褪綠斑駁病毒（MCMV）侵染玉米葉片的細(xì)胞病理特征T/CSTM00999—2023C.3健康對照玉米葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)見圖C.3。BABA圖C.3健康對照玉米葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)T/CSTM00999—2023本文件起草單位：浙江大學(xué)，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，拱北海關(guān)技術(shù)中心，上海海關(guān)動植物與