XX/TXXXXX—XXXX2口蹄疫疫苗抗原定量ELISA檢測(cè)技術(shù)要求下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適GB/T33087儀器分析用高4縮略語FMD：口蹄疫（Foot-and-MouthDiseaFMDV：口蹄疫病毒（Foot-and-MoELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-LinkedImmunosorbentAsXX/TXXXXX—XXXX3PBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferSaHRP：辣根過氧化物酶（HorseradishPeroxidasTMB：四甲基乙二胺聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’OD450nm：450nm波長處的吸光值（Absorbanceat450nm）在酶標(biāo)板上包被抗O型FMDV146S抗原原-抗體的“夾心”結(jié)構(gòu)，洗去多余抗體后，加入HRP標(biāo)記鏈霉親和（TMB）底物后顯色，顯色強(qiáng)度與樣本中的O型FMDV抗原濃度成正相關(guān)；當(dāng)待檢樣本中無O型XX/TXXXXX—XXXX4FMDV抗原，待檢抗原不能與捕獲抗體結(jié)合，加入底物后不顯色；根據(jù)測(cè)定樣品的OD450nm吸光值，XX/TXXXXX—XXXX5該方法適合對(duì)微量抗原樣本進(jìn)行定量檢測(cè)，其檢測(cè)置信區(qū)間為：0.0625～2.2，細(xì)胞培養(yǎng)的病毒抗原，需在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室5000rpm離心20min,去除細(xì)胞碎10min，管內(nèi)液體分為上層油相、中層固相、下層水相，將下層水相（含疫苗抗原）小心地另外，按照《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進(jìn)行樣品XX/TXXXXX—XXXX6A1和A2孔加標(biāo)準(zhǔn)抗原（使用稀釋液將標(biāo)排依次進(jìn)行2倍稀釋，最后一排棄去100μL，輕微振蕩混勻后，于室溫（24～30℃)孵育45min。檢測(cè)抗體用PBST100倍稀釋（1份加99份PBST）后8.3.8讀值以系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗原Log10（OD450nm）值為Y軸數(shù)值，軸數(shù)值，建立散點(diǎn)圖曲線（選擇線性回歸曲線）R2>0.95，并得出該曲線的回歸方程式。將待檢樣品的Log10（OD450nm）數(shù)值帶入方程式的Y計(jì)9.1操作步驟9.1.1樣品采集與保存該方法適合對(duì)微量抗原樣本進(jìn)行定量檢測(cè)，其檢測(cè)置信區(qū)間為：0.0625～2.2，細(xì)胞培養(yǎng)的病毒抗原，需在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室5000rpm離心20min,去除細(xì)胞碎片XX/TXXXXX—XXXX710min，管內(nèi)液體分為上層油相、中層固相、下層水相，將下層水相（含疫苗抗原）小心地另外，按照《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進(jìn)行樣品A1和A2孔加標(biāo)準(zhǔn)抗原（使用稀釋液將排依次進(jìn)行2倍稀釋，最后一排棄去100μL，輕微振蕩混勻后，于室溫（24～30℃)孵育45min。XX/TXXXXX—XXXX8檢測(cè)抗體用PBST100倍稀釋（1份加99份PBST）后以系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗原Log10（OD450nm）值為Y軸數(shù)值，軸數(shù)值，建立散點(diǎn)圖曲線（選擇線性回歸曲線）R2>0.95，并得出該曲線的回歸方程式。將待檢樣品的Log10（OD450nm）數(shù)值帶入方程式的Y計(jì)XX/TXXXXX—XXXX9A.1.1O型FMDV培養(yǎng)擴(kuò)增使用BHK-21細(xì)胞系，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞過蔗糖密度梯度超速離心分離純化的抗原，500μL/管收集，采用Nano-One型紫外分光光度計(jì)，分別測(cè)定抗原樣品在260nm和280nm波長下的吸光度值（OD???和OD???),通過吸光值比值（OD???/OD???)積計(jì)算其濃度。依據(jù)抗原濃度加入保護(hù)劑（30%甘油+30%蔗糖+0.3%BSA）于-20℃冷凍保存。A.2A型FMDV抗原標(biāo)準(zhǔn)品制備A.2.1A型FMDV培養(yǎng)擴(kuò)增使用BHK-21細(xì)胞系，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞在T-175瓶中長至70%單層時(shí)用PBS（pH=7.2）洗滌，加入病毒液(A/GDMM/CHA/2013毒株)，吸附60XX/TXXXXX—XXXX過蔗糖密度梯度超速離心分離純化的抗原，500μL/管收集，采用Nano-One型紫外分光光度計(jì)，分別積計(jì)算其濃度。依據(jù)抗原濃度加入保護(hù)劑（30%甘油+30%蔗糖+0.3%BSA）于-20℃冷凍保存。XX/TXXXXX—XXXXpTT5-Ab1,pTT5-Ab2，pTT5-Ab3由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所保存。分別將pTT5-Ab1XX/TXXXXX—XXXXXX/TXXXXX—XXXX稱取氯化鈉（NaCl）4g，氯化鉀（KCl）0.1g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4）0.72g，磷酸二氫鉀稱取氯化鈉（NaCl）80g、氯化鉀（KCl）2g、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2