3產(chǎn)氣莢膜梭菌病診斷技術(shù)本文件適用于產(chǎn)氣莢膜梭菌病的臨床診斷、實(shí)4縮略語DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）PBS：磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsalinSPF：無特定病原體(specificpathoTaq：水生棲熱菌（thermusaqua5.1流行病學(xué)不同品種、性別、年齡的馬、牛、羊、兔等家畜均易感，仔豬較5.2.1.2通常臨床表現(xiàn)為發(fā)病迅速、死亡快速、死亡率高。發(fā)病牛突然不安5.2.1.3全身肌肉震顫、抽搐，行走不穩(wěn)口流白沫，最后倒地而死亡；同時(shí)也出現(xiàn)腹瀉，糞便含有大5.2.2羊5.2.2.2臨床表現(xiàn)為急性發(fā)作，病羊磨牙流涎，排帶黏液糞便，有的為黏液性黑色混血稀糞。死后不5.2.3豬5.2.3.2臨床表現(xiàn)為病程短，死亡快，死亡率高，一旦流行會(huì)導(dǎo)致大批仔豬死亡。病豬腹瀉、糞便呈5.2.4兔5.2.4.1主要由A型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起。5.2.4.2臨床表現(xiàn)為急性死亡，排黑色水樣或帶血膠凍樣糞便，肛門周圍、后肢及尾部被毛被稀糞污5.3病理變化5.3.2羊爛)，稍加觸壓即潰爛，水沖洗后，腎表面5.3.3豬5.3.4兔5.4結(jié)果判定易感動(dòng)物出現(xiàn)上述臨床癥狀并且符合以上病理變化，可初步判定為疑似C.perfringe6.2.1器械:解剖刀、剪刀、鑷子、注射6.2.4采樣記錄用品:采樣單、記號(hào)筆、6.2.5其他:無菌棉拭子、醫(yī)用棉簽、醫(yī)用紗布、封口膜、應(yīng)選新鮮糞便至少10g，使用帶螺帽容器或滅菌7.1.6冰箱（2℃~8℃、-20℃、-70℃)。將分離培養(yǎng)后帶有溶血環(huán)的灰色磨面粗糙菌落依次進(jìn)行卵磷脂酶試驗(yàn)、牛乳發(fā)酵試驗(yàn)和革蘭氏染挑取單個(gè)菌落接種至甘露醇卵黃瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h～24h，典型菌落在卵黃產(chǎn)生大量氣體使凝固的牛乳呈蜂窩狀，并置于培養(yǎng)基挑取單個(gè)菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢。產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性粗大的短桿菌，兩端鈍圓，7R8.2.51.5%瓊脂糖凝膠，配制方法按B.2。8.2.7細(xì)菌DNA提取試劑，配制方法按B.3。8.2.8C.perfringens陽性對(duì)照，滅活的含C.perfringens材料。8.2.9C.perfringens陰性對(duì)照，無核酸酶水。段ACG8.4.2將液體吸入吸附柱中，100008.4.5棄去收集管中液體，10000r/min離心2min，以除去殘留的洗滌液。r/min離心30s，無菌離心管中9b）出現(xiàn)325bp、196bp和584bpd）擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)325bp和584e）擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)325bp和443bp二條結(jié)果與目的基因序列一致（參見附錄C2-C5），則判9.1主要儀器和設(shè)備9.2主要試劑和材料9.2.2商品化2×實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混液（2×PCRmastermix）。9.2.3C.perfringens對(duì)照樣品：陽性對(duì)照同8.2.8；陰性對(duì)照同8.29.6判定方法9.6.1試驗(yàn)成立條件：陽性對(duì)照有特異性擴(kuò)增曲線且Ct值<30，陰性對(duì)照無Ct值或陰性對(duì)照Ct值>409.6.3被檢樣品無Ct值或Ct值>40，且無特異性擴(kuò)增曲線，判定為C.perfringen9.6.4被檢樣品有特異性擴(kuò)增C.perfringens核酸陰性。采用夾心ELISA方法檢測(cè)血清或血漿樣品中C.perfringens抗體：預(yù)包被高純度重組C.perfringens的α蛋白抗原，待檢血清中的抗C.perfringens抗體與包被抗原反應(yīng)，再與酶標(biāo)C.pe10.2.1C.perfringens細(xì)菌重組α毒素蛋白抗原，見附錄E。10.3.1包被：使用包被緩沖液將C.perfringen10.3.3封閉：每孔加入250μL封閉液，置于2℃~8℃封閉16h。10.3.5干燥：置于37℃干燥3h～5h。裝入鋁箔袋，加干燥劑，抽真空，置于2℃~8℃保存?zhèn)錅旌髴?yīng)棄去孔內(nèi)的液體。最后一次洗滌液棄去后，在吸水紙上S/P=(OD450-S—OD450-NC)/(OD450-PC—OD450-NC)…………（1）OD450-S——待檢血清樣品在450OD450-PC——陽性對(duì)照血清在450nm波長處的平均OD450-NC——陰性對(duì)照血清在450nm波長處的平均OD值。OD450-PC值≥0.8；且OD450-NC值＜0.3，試驗(yàn)結(jié)果有效；否則，應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。11.1符合第5.4條和第7條中任一項(xiàng)可判為C.perfringe定為相應(yīng)型的C.perfringens確診病A.2平衡鹽溶液A.2.3配制平衡鹽溶液用前，用無菌7%碳酸氫鈉溶液調(diào)平衡鹽溶液pH值至7.2～7.6。取43.2g磷酸氫二鈉、62.4g磷酸二氫鉀，滅菌去離子水B.5實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系如表B.2。1155C.1C.perfringensPCR鑒定判定標(biāo)準(zhǔn)如表C.1表C.1各型C.perfringensPCRC.perfringens菌種bp）+---+++-++--+-+-+--+注：“+”表示陽性，有擴(kuò)增產(chǎn)物，“-”表示陰性，無C.2C.perfringensα毒素基因PCR擴(kuò)增片段序列GCTAATGTTACTGCCGTTGATAGCGCAGGACATGTTWAGTTTGAGACTTTTGCAAGAACAGTATAAAATAAACACAGCAGGTTGCAAAACTAATGAGGATTTTTATGCTGATATAAAAACAAAGATTTTAATGCATGGTCAAAAGAATATGCAAGAGGTTTTGCTAAAACAGGCAATATACTATAGTCATGCTAGCATGAGTCATAGTTGGGATGATTGGGATTATGCAGCAAAGGTAACTCTAGCTAACTCTCAAAAAGGAACAGCGGKATATATTTATAGATTCTTACACGATGTC.3C.perfringensβ毒素基因PCR擴(kuò)增片段序列GCGAATATGCTGAATCATCTACAATAGAATATGTCCAACCTGATTTTTCTACTATCATTCAACCTCTAAAGCTTCATGGGATACAAAATTTACAGAAACTACTCGTGGTAAAATCAAACAACCCTGTATATGGAAATGAAATGTTTATGTACGGAAGATATACTAATCAGTATCTAATGAAATGTCCAAAAAAGCTTCTTATGATAATGTAGATACATTAATTGAGAAGATATAATACAAAATATAATTACTTAAAGAGAATGGAAAAATATTATCCTAATGCTTTTGATAAGGTTACTATAAATCCACAAGGAAATGATTTTTATATTAATAATCCTAAAGAGATGGAGAACCATCAATGAATTATCTTGAAGATGTTTATGTTGGAAAAGCTCTCTTAACTAATGATACTCAACAAGAACAAAAATTAAAATCACAATCATTCACTTGTAAAAATACTGATACAGGCAACTACTACTCCGACTGTGGGAACTTCGATACAAGCAACTGCTAAGTTTACTGTTCGAAACAGGAGTATCATTAACTACTAGTTATAGTTTTGCAAATACAAATACAAATACTAAGAAATTACTCATAATGTCCCTTCACAAGATATACTAGTACCAGCTAATACTACTGTAGTAGCATATTTAAAAAAAGTTAATGTTAAAGGAAATGTAAAGTTAGTAGGACACTACTCTCAGACAAGACAGTATTTTTACGACTATCAAATAGAATCAAATCCTAGAGAAAAATACAAAAATCTTAGAAATGCCATATCAAAAAATAAGATAGATAAACCTATAAATGTTTTGAGTCTCCAGAGAAATTTGCGTTTAATAAAGAAATAAGAACAGAAAATCAAAATGAAATTTAGAGAAATTTAATGAGTTGAAAGAAACTATTCAAGATAAATTGTTTAAACAAGATGGATTTAAGGATGTTTCTTTATATGAACCAGGTAATGGCGATGAAAAGCCTACACCACTACTTATAAATTACCAAAAAATACTGGTATGTTACCATATATAAATTCTAATGATGTAAAAACATTAACAAGACTATAGCATAAAGATAGACAAAATTGTTCGTATAGTAATAGAAGC.perfringens菌種+---+++-++--+-+-+--+注：“+”表示陽性，有擴(kuò)增曲線，“-”表示陰性，無E.1C.perfringens重組α毒素基因的擴(kuò)增和質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)C.perfringens毒株MN010568.1株的序列，利用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)一對(duì)含有限制性酶切位次；72℃延伸10min。將擴(kuò)增的α毒素基因?qū)⒑衟ET-32a-(α)重組質(zhì)粒的生產(chǎn)用菌種種子pET-32a-(α)-BL21(DE3)按1:100比例轉(zhuǎn)接含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基，置37將生產(chǎn)用菌液加入IPTG至終濃度為0.75mmoL/L，16℃將誘導(dǎo)后的菌液，在2℃~8℃條件下、以8000r/min離心10min，棄上清，收集菌體沉淀，用pH值7.4）重懸菌體沉淀，在150W功率的超聲波的作用下冰浴裂解，有效時(shí)間為10min，工作時(shí)間為5秒，間隔5秒。將超聲裂解物在2℃~8℃、以12000r/min離心15min，保留上清。緩沖液、40moL/L咪唑緩沖液、60mmoL/L咪唑緩沖液、80mmoL/L咪唑緩沖液、100產(chǎn)生的濾液通過Superdex200凝膠柱分子篩進(jìn)行進(jìn)一步精細(xì)純化，最后將純化后的蛋白吸出加到透析袋中（8kd）浸泡在2L的透析液中，過夜透析，-7F.1.2制備血清：室溫（15℃~25℃)待血液凝固后，37℃靜置2h后，然后2℃~8℃靜置1F.1.3血清的分裝及保存：將制備的血清混合均勻后，0.22μm濾F.2.1免疫與采血：用C.perfringens疫苗于每只C.perfringens抗體陰性羊尾根部皮內(nèi)注射，2mL/