大鼠脊髓MAPK信號通路在脛骨癌痛中的作用及水蛭素的影響一、研究背景癌癥疼痛嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，脛骨癌痛是常見癌痛類型之一。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在痛覺調(diào)制中起關(guān)鍵作用，其在脊髓水平的激活與多種病理性疼痛密切相關(guān)。水蛭素是水蛭的主要活性成分，近年研究發(fā)現(xiàn)其可能具有潛在的鎮(zhèn)痛作用，但具體機制不明，尤其是在癌痛領(lǐng)域及與脊髓MAPK信號通路的關(guān)系研究較少。深入探究大鼠脊髓MAPK信號通路在脛骨癌痛中的作用以及水蛭素對其影響，有望為癌痛治療提供新靶點和策略。二、實驗材料與方法（一）實驗動物選取健康成年雄性SD大鼠若干，體重[X]-[X]g，購自[動物供應(yīng)單位]。實驗動物飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中，12h光照/黑暗循環(huán)，自由進(jìn)食和飲水。（二）主要試劑與儀器試劑：水蛭素（純度≥[X]%，購自[試劑公司]）、Walker256乳腺癌細(xì)胞株（購自[細(xì)胞庫]）、兔抗大鼠p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK多克隆抗體（[抗體公司]）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（[公司]）、BCA蛋白定量試劑盒（[公司]）等。儀器：電子秤、vonFrey纖維絲、熱板儀、冰凍切片機、熒光顯微鏡、Westernblot電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備等。（三）實驗分組將大鼠隨機分為以下幾組：對照組：大鼠脛骨內(nèi)注射無菌生理鹽水。模型組：大鼠脛骨內(nèi)注射Walker256乳腺癌細(xì)胞懸液建立脛骨癌痛模型。水蛭素低劑量組：在建立脛骨癌痛模型后，腹腔注射低劑量水蛭素（[劑量1]mg/kg）。水蛭素高劑量組：在建立脛骨癌痛模型后，腹腔注射高劑量水蛭素（[劑量2]mg/kg）。陽性對照組：給予已知具有鎮(zhèn)痛作用的藥物（如嗎啡，[劑量]mg/kg，腹腔注射）。（四）脛骨癌痛模型建立采用改良的脛骨內(nèi)注射法。將Walker256乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用無菌PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為[X]個/mL。大鼠經(jīng)[麻醉方式]麻醉后，在無菌條件下暴露右側(cè)脛骨近端，用微量注射器將50μL細(xì)胞懸液緩慢注入脛骨骨髓腔，然后縫合創(chuàng)口。對照組大鼠注射等量無菌生理鹽水。（五）行為學(xué)檢測機械縮足閾值（PWT）測定：在建模前及建模后第1、3、5、7、9、11天，使用vonFrey纖維絲測定大鼠右后足的PWT。將大鼠置于底部為金屬網(wǎng)的透明塑料盒內(nèi)適應(yīng)30min，然后從2g的vonFrey纖維絲開始垂直刺激大鼠右后足底中部，持續(xù)時間約6s，若大鼠出現(xiàn)迅速縮足、舔足等反應(yīng)，則判斷為陽性反應(yīng)，記錄該纖維絲的力度。若未出現(xiàn)陽性反應(yīng)，則更換高一級力度的纖維絲繼續(xù)刺激，直至出現(xiàn)陽性反應(yīng)或使用最大力度（[X]g）纖維絲仍無反應(yīng)。熱縮足潛伏期（TWL）測定：在建模前及建模后第1、3、5、7、9、11天，使用熱板儀測定大鼠右后足的TWL。將大鼠置于溫度設(shè)定為（52±0.5）℃的熱板上，記錄大鼠從放置到出現(xiàn)舔足或跳躍反應(yīng)的時間作為TWL，每次測試間隔至少15min，避免熱損傷，若60s內(nèi)未出現(xiàn)反應(yīng)，則終止測試并記錄為60s。（六）Westernblot檢測脊髓MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)在建模后第11天，每組隨機選取部分大鼠，經(jīng)[麻醉方式]深度麻醉后，迅速取出脊髓L4-L6節(jié)段。將脊髓組織剪碎，加入適量蛋白裂解液，冰上勻漿，4℃、12000r/min離心15min，取上清液用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h，分別加入兔抗大鼠p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1h，再次用TBST洗膜3次，每次10min。最后采用化學(xué)發(fā)光法顯影，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK蛋白相對表達(dá)量。（七）免疫熒光染色檢測脊髓p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK陽性細(xì)胞表達(dá)取部分脊髓L4-L6節(jié)段，用4%多聚甲醛固定24h，常規(guī)脫水、包埋，制成冰凍切片（厚度[X]μm）。切片用PBS洗3次，每次5min，然后用0.3%TritonX-100室溫通透30min，5%正常山羊血清封閉1h，分別加入兔抗大鼠p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，PBS洗3次，每次5min，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:200稀釋），室溫避光孵育1h，PBS洗3次，每次5min，用DAPI復(fù)染細(xì)胞核5min，再次PBS洗3次，每次5min。用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，隨機選取5個視野，計數(shù)p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK陽性細(xì)胞數(shù)，計算陽性細(xì)胞率。三、實驗結(jié)果（一）行為學(xué)結(jié)果PWT變化：建模前，各組大鼠PWT無顯著差異（P>0.05）。建模后，模型組大鼠PWT在第1天開始顯著降低（P<0.05），并在隨后時間點持續(xù)維持在較低水平。與模型組相比，水蛭素低劑量組和高劑量組大鼠PWT在給藥后第3天開始逐漸升高（P<0.05），且高劑量組升高更為明顯。陽性對照組大鼠PWT在給藥后也顯著升高（P<0.05），與水蛭素高劑量組效果相近。TWL變化：建模前，各組大鼠TWL無顯著差異（P>0.05）。建模后，模型組大鼠TWL在第1天開始顯著縮短（P<0.05），且持續(xù)至實驗結(jié)束。水蛭素低劑量組和高劑量組大鼠TWL在給藥后第3天開始逐漸延長（P<0.05），高劑量組延長效果更顯著。陽性對照組大鼠TWL在給藥后顯著延長（P<0.05），與水蛭素高劑量組效果相當(dāng)。（二）Westernblot結(jié)果模型組大鼠脊髓p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK蛋白相對表達(dá)量較對照組顯著升高（P<0.05）。水蛭素低劑量組和高劑量組大鼠脊髓p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK蛋白相對表達(dá)量較模型組均顯著降低（P<0.05），且高劑量組降低更為明顯。陽性對照組大鼠脊髓p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK蛋白相對表達(dá)量也顯著低于模型組（P<0.05），與水蛭素高劑量組相近。（三）免疫熒光染色結(jié)果模型組大鼠脊髓背角p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK陽性細(xì)胞率較對照組顯著增加（P<0.05）。水蛭素低劑量組和高劑量組大鼠脊髓背角p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK陽性細(xì)胞率較模型組均顯著降低（P<0.05），高劑量組降低幅度更大。陽性對照組大鼠脊髓背角p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK陽性細(xì)胞率顯著低于模型組（P<0.05），與水蛭素高劑量組相似。四、討論本研究結(jié)果表明，建立脛骨癌痛模型后，大鼠出現(xiàn)明顯的機械痛敏和熱痛敏，同時脊髓MAPK信號通路中的關(guān)鍵蛋白p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK表達(dá)顯著增加，提示脊髓MAPK信號通路在脛骨癌痛的發(fā)生發(fā)展中被激活，參與了癌痛的形成和維持。給予水蛭素干預(yù)后，水蛭素低劑量組和高劑量組大鼠的機械痛敏和熱痛敏癥狀得到明顯緩解，脊髓p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)及陽性細(xì)胞率顯著降低，且高劑量組效果更優(yōu)。這表明水蛭素可能通過抑制脊髓MAPK信號通路的激活，發(fā)揮對脛骨癌痛的鎮(zhèn)痛作用，且具有一定的劑量依賴性。陽性對照組使用的嗎啡作為經(jīng)典的鎮(zhèn)痛