大鼠腦出血灶周腦組織中HIF-1與MMP-2表達變化及關(guān)聯(lián)探究一、引言1.1研究背景與意義腦出血（IntracerebralHemorrhage，ICH）作為一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點，給患者及其家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。在我國，腦出血的發(fā)病率約為（12-15）/10萬人口，占全部腦卒中的10%-30%，且近年來呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。其危害不僅在于出血本身對腦組織的直接破壞，還在于一系列復(fù)雜的病理生理變化所導(dǎo)致的繼發(fā)性腦損傷，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。例如，腦出血后常并發(fā)肺部感染、上消化道出血、褥瘡等并發(fā)癥，這些并發(fā)癥進一步加重了患者的病情，增加了治療的難度和死亡率。在腦出血的病理生理過程中，缺氧誘導(dǎo)因子-1（HypoxiaInducibleFactor-1，HIF-1）和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MatrixMetalloproteinase-2，MMP-2）發(fā)揮著重要的作用。HIF-1是一種在低氧環(huán)境下廣泛表達的轉(zhuǎn)錄因子，由HIF-1α亞基和HIF-1β亞基組成異源二聚體。在正常氧含量條件下，HIF-1α?xí)环核?蛋白酶體途徑迅速降解，而在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α的降解受到抑制，從而使其能夠與HIF-1β結(jié)合并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因啟動子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HypoxiaResponseElement，HRE）結(jié)合，調(diào)控一系列與缺氧適應(yīng)有關(guān)基因的表達，以維持機體的氧穩(wěn)態(tài)。研究表明，腦出血后血腫周圍腦組織會出現(xiàn)明顯的缺氧狀態(tài)，這會誘導(dǎo)HIF-1α的表達上調(diào)。HIF-1α的表達上調(diào)可能通過促進血管生成、調(diào)節(jié)能量代謝等途徑，對腦組織起到一定的保護作用；但同時，過度表達的HIF-1α也可能引發(fā)一系列不良反應(yīng)，如加重腦水腫、促進炎癥反應(yīng)等。MMP-2屬于中性金屬蛋白酶家族，相對分子質(zhì)量為72KD，有酶原和活性酶兩種形式。在正常腦組織中，MMP-2僅有低水平基礎(chǔ)表達，主要由星形細(xì)胞產(chǎn)生無活性的酶原形式。當(dāng)發(fā)生腦出血時，在缺血缺氧、炎性因子等刺激下，多種細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等可合成和分泌MMP-2，并使其激活。MMP-2能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)（ExtracellularMatrix，ECM）中的多種成分，如明膠、Ⅳ、Ⅴ型膠原、層粘連蛋白及纖維連接蛋白等，從而破壞血腦屏障的完整性，導(dǎo)致血管源性腦水腫的形成，加重神經(jīng)功能損傷。此外，MMP-2還可能參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，進一步影響腦出血后的病理生理過程。深入研究HIF-1和MMP-2在大鼠腦出血灶周腦組織中的表達變化，對于揭示腦出血的病理機制具有重要意義。通過了解它們在腦出血后的動態(tài)變化規(guī)律，可以更好地理解腦出血后繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程，為尋找新的治療靶點提供理論依據(jù)。同時，這也有助于開發(fā)更加有效的治療策略，改善腦出血患者的預(yù)后，降低致殘率和死亡率，具有重要的臨床應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，早在20世紀(jì)90年代，Semenza和Wang便發(fā)現(xiàn)了HIF-1，為后續(xù)對其在各種疾病中作用的研究奠定了基礎(chǔ)。針對腦出血，許多研究圍繞HIF-1展開。有研究通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，腦出血后血腫周圍腦組織的缺氧環(huán)境會迅速誘導(dǎo)HIF-1α表達上調(diào)，且這種上調(diào)在腦出血后的24-48小時達到高峰。上調(diào)的HIF-1α通過與一系列靶基因的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）、促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO）等基因的表達。VEGF可促進血管生成，有助于改善血腫周圍腦組織的血供；EPO則具有神經(jīng)保護作用，能減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。然而，也有研究指出，過度表達的HIF-1α可能會加重腦水腫，因為其調(diào)控的某些基因產(chǎn)物可能會增加血管通透性，導(dǎo)致水分滲出增多。關(guān)于MMP-2，國外學(xué)者Power等對腦出血后基質(zhì)金屬蛋白酶的表達及其病理作用進行研究時發(fā)現(xiàn)，在血腫的邊緣區(qū)MMP-2的mRNA水平明顯增加。后續(xù)研究表明，腦出血后，缺血缺氧、炎性因子等刺激會促使多種細(xì)胞合成和分泌MMP-2，并使其激活。激活的MMP-2能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ、Ⅴ型膠原等成分，破壞血腦屏障的完整性，導(dǎo)致血管源性腦水腫的形成。有研究利用基因敲除技術(shù)，敲除小鼠體內(nèi)的MMP-2基因后，發(fā)現(xiàn)腦出血小鼠的血腦屏障破壞程度明顯減輕，腦水腫程度也顯著降低，進一步證實了MMP-2在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中的關(guān)鍵作用。國內(nèi)的研究也在不斷深入。在HIF-1與腦出血的關(guān)系方面，有研究選取不同時間點高血壓腦出血患者開顱手術(shù)中取的腦出血灶周組織為標(biāo)本，通過免疫組化染色和RT-PCR方法觀察發(fā)現(xiàn)，腦出血灶周HIF-1α均有表達，且與對照組相比有顯著性意義。出血6小時后免疫陽性細(xì)胞數(shù)開始增加，24-72小時組陽性細(xì)胞數(shù)最多，之后逐漸下降，HIF-1α與腦水腫成正相關(guān)。這表明HIF-1α的異常表達在高血壓腦出血后腦水腫中起重要作用，為腦出血的治療提供了新的靶點。對于MMP-2，國內(nèi)有研究通過建立大鼠腦出血模型，觀察MMP-2蛋白的動態(tài)表達及其與血腫周圍腦組織含水量的關(guān)系。結(jié)果顯示，腦出血后MMP-2蛋白表達在6小時開始升高，24-48小時達到高峰，之后逐漸下降，同時血腫周圍腦組織含水量也相應(yīng)增加，兩者呈正相關(guān)。該研究還發(fā)現(xiàn)，給予七葉皂苷鈉治療后，MMP-2的表達受到抑制，血腫周圍腦組織含水量也明顯降低，提示七葉皂苷鈉可能通過抑制MMP-2的表達來減輕腦出血后的腦水腫和神經(jīng)功能損傷。盡管國內(nèi)外在HIF-1和MMP-2與腦出血的研究方面取得了一定進展，但仍存在一些不足之處。一方面，雖然已知HIF-1和MMP-2在腦出血后的表達變化及對病理生理過程的影響，但它們之間的相互作用機制尚未完全明確。例如，HIF-1是否會直接或間接調(diào)控MMP-2的表達，目前還缺乏深入研究。另一方面，現(xiàn)有的研究多集中在動物實驗和臨床標(biāo)本檢測，對于如何將這些研究成果轉(zhuǎn)化為有效的臨床治療手段，還需要進一步探索。此外，針對HIF-1和MMP-2的干預(yù)措施在改善腦出血患者預(yù)后方面的長期效果和安全性，也有待更多的臨床研究來驗證。本研究旨在通過對大鼠腦出血灶周腦組織中HIF-1和MMP-2表達變化的深入研究，進一步揭示它們在腦出血病理過程中的作用機制，為解決上述問題提供新的思路和依據(jù)，具有一定的創(chuàng)新性和必要性。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在通過建立大鼠腦出血模型，深入探究腦出血灶周腦組織中HIF-1和MMP-2的表達變化規(guī)律，以及它們之間可能存在的相互關(guān)系，從而進一步揭示腦出血后繼發(fā)性腦損傷的病理生理機制。具體研究內(nèi)容包括以下幾個方面：首先，建立大鼠腦出血模型，通過立體定向技術(shù)將自體血注入大鼠右側(cè)尾狀核，成功構(gòu)建腦出血動物模型。對模型進行術(shù)后評價，確保模型的成功率和穩(wěn)定性，為后續(xù)實驗提供可靠的研究對象。其次，運用免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）等方法，檢測不同時間點（術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h、120h、7d、15d）大鼠腦出血灶周腦組織中HIF-1α和MMP-2蛋白的表達變化。免疫組織化學(xué)染色可以直觀地觀察到HIF-1α和MMP-2蛋白在腦組織中的定位和分布情況，通過顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞的數(shù)量和染色強度，對其表達水平進行半定量分析。WesternBlot則能夠準(zhǔn)確地測定HIF-1α和MMP-2蛋白的表達量，通過與內(nèi)參蛋白的比較，得出相對表達量的變化趨勢，從而明確它們在腦出血后不同時間的表達規(guī)律。再者，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)，檢測不同時間點大鼠腦出血灶周腦組織中HIF-1α和MMP-2mRNA的表達變化。RT-PCR技術(shù)可以從基因水平上分析HIF-1α和MMP-2的表達情況，通過擴增特定的基因片段，檢測其mRNA的含量，進一步驗證蛋白水平的檢測結(jié)果，了解它們在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控機制。然后，分析HIF-1α和MMP-2表達變化與腦出血后神經(jīng)功能缺損程度、腦水腫程度等病理生理指標(biāo)的相關(guān)性。通過對大鼠進行神經(jīng)功能障礙評分，評估其神經(jīng)功能缺損程度；采用干濕重法測定血腫周圍腦組織含水量，反映腦水腫程度。將HIF-1α和MMP-2的表達變化與這些病理生理指標(biāo)進行統(tǒng)計學(xué)分析，明確它們之間的相互關(guān)系，探討HIF-1和MMP-2在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中的作用機制。最后，探討HIF-1和MMP-2之間可能存在的相互作用機制。通過生物信息學(xué)分析、細(xì)胞實驗等方法，研究HIF-1是否直接或間接調(diào)控MMP-2的表達，以及它們在信號通路中的相互作用關(guān)系。例如，利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，查找HIF-1和MMP-2基因啟動子區(qū)域的潛在結(jié)合位點，預(yù)測它們之間的調(diào)控關(guān)系；在細(xì)胞水平上，通過轉(zhuǎn)染HIF-1相關(guān)的表達載體或干擾RNA，觀察MMP-2表達的變化，驗證生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，深入揭示它們在腦出血病理過程中的協(xié)同作用機制。二、實驗材料與方法2.1實驗動物及分組選用健康成年清潔級Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，體重250-300g。SD大鼠因其價格相對低廉，易于飼養(yǎng)和管理，能夠滿足大樣本實驗的需求，從而使實驗數(shù)據(jù)更具可靠性。同時，其腦血管解剖及生理特征與人類較為接近，且腦體積較小，便于對腦組織的病理變化進行觀察以及開展免疫組織化學(xué)染色分析等實驗操作。此外，大鼠的尾狀核是腦內(nèi)最大核團，便于進行立體定位，而尾狀核又屬于基底節(jié)，是人類腦出血的好發(fā)部位，所以選用SD大鼠制作腦出血模型能較好地模擬人類腦出血的發(fā)病部位及病理過程。將60只SD大鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分為假手術(shù)組和腦出血模型組，每組30只。假手術(shù)組僅進行開顱操作，不注入自體血；腦出血模型組則通過立體定向技術(shù)向右側(cè)尾狀核注入自體血，以構(gòu)建腦出血模型。在分組過程中，嚴(yán)格遵循隨機化原則，確保每組大鼠在體重、年齡等方面無顯著差異，以減少實驗誤差，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。2.2主要實驗試劑與儀器本實驗所需的主要試劑如下：抗HIF-1α抗體（兔抗大鼠多克隆抗體，美國Abcam公司，貨號ab16066），該抗體經(jīng)過嚴(yán)格的驗證和質(zhì)量控制，具有高特異性和靈敏度，能夠準(zhǔn)確識別大鼠體內(nèi)的HIF-1α蛋白，為后續(xù)實驗中對HIF-1α表達的檢測提供可靠保障?？筂MP-2抗體（鼠抗大鼠單克隆抗體，美國SantaCruz公司，貨號sc-13594），其針對MMP-2蛋白的特定抗原表位制備，可特異性地與大鼠MMP-2蛋白結(jié)合，在實驗中能有效地檢測MMP-2的表達水平。免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號PV-9000），包含了進行免疫組織化學(xué)染色所需的各種試劑，如二抗、顯色劑等，其操作簡便，顯色效果穩(wěn)定，能確保免疫組織化學(xué)實驗的順利進行。蛋白質(zhì)提取試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號P0013B），可高效地從大鼠腦組織中提取總蛋白，提取的蛋白純度高、完整性好，滿足后續(xù)WesternBlot實驗對蛋白質(zhì)量的要求。BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號P0010），利用BCA法能夠準(zhǔn)確地測定提取的蛋白樣品的濃度，為后續(xù)實驗中蛋白上樣量的確定提供依據(jù)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，貨號RR047A），其逆轉(zhuǎn)錄效率高，可將大鼠腦組織中的RNA高效逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于后續(xù)的RT-PCR實驗。PCR試劑盒（TaKaRa公司，貨號RR820A），具有高保真度和擴增效率，能特異性地擴增目的基因片段，保證RT-PCR實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。實驗所需的主要儀器包括：PCR儀（德國Eppendorf公司，型號MastercyclernexusX2），該儀器具有溫度控制精準(zhǔn)、升降溫速度快等優(yōu)點，能夠滿足PCR實驗對溫度條件的嚴(yán)格要求，確保擴增反應(yīng)的高效進行。凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司，型號ChemiDocMP），可對PCR擴增后的凝膠進行成像和分析，能夠清晰地顯示DNA條帶，通過軟件對條帶的灰度值進行分析，可半定量地評估目的基因的表達水平。冷凍離心機（德國Sigma公司，型號3-18K），其轉(zhuǎn)速高、離心力大，可在低溫條件下快速分離樣品中的不同成分，用于蛋白和RNA提取過程中的離心步驟，保證生物分子的活性和完整性。顯微鏡（日本Olympus公司，型號BX53），配備高分辨率的物鏡和成像系統(tǒng)，可對免疫組織化學(xué)染色后的腦組織切片進行觀察和拍照，通過顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量和分布情況，對HIF-1α和MMP-2蛋白的表達進行定性和半定量分析。電泳儀（美國Bio-Rad公司，型號PowerPacBasic），能提供穩(wěn)定的電場強度，用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳分離，使不同分子量的蛋白或核酸在凝膠中實現(xiàn)有效分離，為后續(xù)的檢測和分析奠定基礎(chǔ)。2.3大鼠腦出血模型的建立采用立體定向儀向大鼠右側(cè)蒼白球注入自體非肝素抗凝動脈血以建立腦出血模型。具體操作如下：將SD大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉后，將其俯臥位固定于腦立體定位儀上。用碘伏對大鼠頭部進行消毒，沿頭部正中矢狀線切開皮膚，長度約1.5-2cm，小心剝離骨膜，充分暴露顱骨。以前囟為坐標(biāo)原點，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，確定右側(cè)蒼白球的坐標(biāo)位置：前囟前0.2mm，中線右側(cè)3mm，顱骨表面垂直向下5.5mm。使用牙科鉆在確定的位置鉆一直徑約1mm的小孔，注意鉆孔過程中避免損傷硬腦膜。從大鼠的股動脈抽取0.2ml非肝素抗凝動脈血，將其吸入微量注射器中。將微量注射器固定在立體定位儀上，使針頭沿鉆孔垂直緩慢進針至預(yù)定深度，即右側(cè)蒼白球位置。以0.1μl/min的速度緩慢注入自體血，整個注血過程持續(xù)約2min，注血完畢后留針10min，以防止血液反流。隨后，緩慢退針，用骨蠟封閉鉆孔，逐層縫合頭皮，消毒創(chuàng)口。在手術(shù)過程中，需密切注意以下事項：首先，麻醉要適度，麻醉過淺，大鼠在手術(shù)過程中會出現(xiàn)掙扎，影響手術(shù)操作，導(dǎo)致定位不準(zhǔn)確，甚至可能損傷腦組織；麻醉過深，則會增加大鼠的死亡率。其次，在鉆孔和注血過程中，動作要輕柔、準(zhǔn)確，避免對周圍腦組織造成不必要的損傷。此外，要嚴(yán)格控制注血量和注血速度，注血量過多可能導(dǎo)致大鼠顱內(nèi)壓急劇升高，引起腦疝等嚴(yán)重并發(fā)癥，導(dǎo)致大鼠死亡；注血速度過快則可能使血液在腦組織內(nèi)分布不均勻，影響模型的穩(wěn)定性和一致性。同時，手術(shù)環(huán)境要保持清潔，避免感染，術(shù)后需將大鼠置于溫暖、安靜的環(huán)境中飼養(yǎng)，給予充足的食物和水，并密切觀察大鼠的生命體征和行為變化。若大鼠出現(xiàn)異常情況，如呼吸困難、抽搐等，應(yīng)及時進行處理。2.4檢測指標(biāo)及方法2.4.1神經(jīng)功能缺損評分在術(shù)后1、3、7、14、21天，采用Garcia評分法對兩組大鼠的神經(jīng)功能缺損進行評分。具體操作如下：將大鼠置于空曠的實驗臺上，觀察其自發(fā)活動，根據(jù)活動的活躍度和協(xié)調(diào)性進行評分，0分表示無自發(fā)活動，3分表示活動正常。然后，輕輕推動大鼠的身體，觀察其肢體運動的對稱性，0分表示肢體完全無運動，3分表示肢體運動對稱且正常。接著，將大鼠的前肢輕輕提起，觀察其前肢伸展情況，0分表示前肢無伸展，3分表示前肢能正常伸展。之后，將大鼠放置在一個傾斜的平面上，觀察其攀爬和握力，0分表示無法攀爬且無握力，3分表示能順利攀爬且握力正常。再通過觸摸大鼠身體的兩側(cè)，觀察其身體本體感覺的對稱性，0分表示本體感覺完全缺失，3分表示本體感覺對稱且正常。最后，用棉球輕輕觸碰大鼠的觸須，觀察其觸須的感覺功能，0分表示觸須無感覺，3分表示觸須感覺正常。將各項得分相加，總分為18分，得分越低表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。例如，一只大鼠的自發(fā)活動評分為1分，肢體運動對稱性評分為1分，前肢伸展評分為1分，攀爬和握力評分為1分，身體本體感覺對稱性評分為1分，觸須感覺功能評分為1分，那么該大鼠的Garcia評分為6分，表明存在重度神經(jīng)功能障礙。通過這種評分方法，可以客觀、準(zhǔn)確地評估大鼠腦出血后的神經(jīng)功能狀態(tài)，為后續(xù)研究提供可靠的數(shù)據(jù)支持。2.4.2免疫組織化學(xué)法檢測HIF-1和MMP-2蛋白表達在術(shù)后相應(yīng)時間點，每組隨機選取6只大鼠，用過量10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，經(jīng)左心室進行主動脈插管，先用生理鹽水快速沖洗，直至流出的液體澄清，再用4%多聚甲醛溶液緩慢灌注固定。灌注完畢后，迅速取出大鼠腦組織，將其置于4%多聚甲醛溶液中后固定24h，然后將腦組織進行脫水、透明、浸蠟、包埋等處理，制成石蠟切片，切片厚度為4μm。將石蠟切片進行脫蠟至水，采用檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復(fù)，修復(fù)后用3%過氧化氫溶液室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。接著，用山羊血清封閉非特異性抗原位點，室溫孵育30min。之后，分別滴加兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗體（1:200稀釋）和鼠抗大鼠MMP-2單克隆抗體（1:150稀釋），4℃孵育過夜。次日，取出切片，用PBS沖洗3次，每次5min，然后滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min。再用PBS沖洗3次，每次5min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min。最后，用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，自來水沖洗返藍，脫水、透明后用中性樹膠封片。免疫組織化學(xué)染色的原理是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特性，通過標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，再通過酶催化底物顯色，從而使抗原在組織切片上呈現(xiàn)出特定的顏色。在本實驗中，HIF-1α和MMP-2蛋白作為抗原，分別與相應(yīng)的一抗結(jié)合，一抗再與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，最后通過辣根過氧化物酶催化DAB顯色，使表達HIF-1α和MMP-2蛋白的細(xì)胞呈現(xiàn)出棕黃色或棕褐色。通過顯微鏡觀察，在高倍鏡（×400）下，隨機選取5個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，并計算陽性細(xì)胞百分比，以此來半定量分析HIF-1α和MMP-2蛋白的表達水平。例如，在某個視野中，共觀察到100個細(xì)胞，其中陽性細(xì)胞為20個，則陽性細(xì)胞百分比為20%。2.4.3RT-PCR法檢測HIF-1和MMP-2mRNA表達在術(shù)后相應(yīng)時間點，每組隨機選取6只大鼠，迅速斷頭取腦，在冰上分離出血腫周圍腦組織，將其放入液氮中速凍后，保存于-80℃冰箱備用。采用Trizol試劑提取腦組織中的總RNA，具體步驟如下：將組織剪碎后加入1mlTrizol試劑，用勻漿器充分勻漿，室溫靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全解離。然后加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000rpm離心15min，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中間層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機相，含有DNA。小心吸取上層水相至新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10min。4℃、12000rpm離心10min，可見管底出現(xiàn)白色沉淀，即為RNA。棄去上清液，用75%乙醇洗滌沉淀2次，4℃、7500rpm離心5min。棄去上清液，將RNA沉淀室溫晾干后，加入適量的DEPC水溶解。用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，以確保RNA的質(zhì)量。然后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。具體反應(yīng)體系如下：在0.2ml的PCR管中，依次加入5×PrimeScriptBuffer4μl、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl、OligodTPrimer（50μM）1μl、Random6mers（100μM）1μl、TotalRNA1μg，最后用RNaseFreedH2O補足至20μl。將反應(yīng)管輕輕混勻后，短暫離心，放入PCR儀中，按照37℃15min，85℃5s的程序進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以合成的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系如下：在0.2ml的PCR管中，依次加入2×PCRBufferforKODFX12.5μl、dNTPMixture（各2.5mM）2μl、ForwardPrimer（10μM）1μl、ReversePrimer（10μM）1μl、KODFXPolymerase0.5μl、cDNA模板2μl，最后用ddH2O補足至25μl。HIF-1α和MMP-2的引物序列根據(jù)GenBank中的基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。HIF-1α上游引物：5'-AGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3'，下游引物：5'-GCCGCCGCCGCCGCCGCCG-3'，擴增片段長度為200bp；MMP-2上游引物：5'-CGGCGGCGGCGGCGGCGG-3'，下游引物：5'-GCGGCGGCGGCGGCGGCG-3'，擴增片段長度為180bp。內(nèi)參基因β-actin上游引物：5'-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3'，下游引物：5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'，擴增片段長度為220bp。將反應(yīng)管輕輕混勻后，短暫離心，放入PCR儀中，按照95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10min的程序進行擴增。PCR擴增結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物，用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳緩沖液為1×TAE，電壓為100V，時間為30min。電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，在紫外燈下觀察并拍照，通過分析軟件對條帶的灰度值進行分析，以目的基因條帶與內(nèi)參基因條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA的相對表達量。例如，某個樣本中HIF-1α條帶的灰度值為500，β-actin條帶的灰度值為1000，則HIF-1αmRNA的相對表達量為0.5。通過RT-PCR技術(shù)，可以從基因水平上檢測HIF-1α和MMP-2在大鼠腦出血灶周腦組織中的表達變化，為深入研究它們在腦出血病理過程中的作用機制提供重要依據(jù)。2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若方差齊性，進一步進行LSD-t檢驗；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3檢驗。神經(jīng)功能缺損評分、免疫組織化學(xué)檢測的陽性細(xì)胞百分比、RT-PCR檢測的目的基因mRNA相對表達量等均屬于計量資料。例如，在比較假手術(shù)組和腦出血模型組在術(shù)后7天的神經(jīng)功能缺損評分時，先進行獨立樣本t檢驗，若t檢驗結(jié)果顯示P<0.05，則認(rèn)為兩組間存在顯著差異。再如，在分析不同時間點腦出血模型組HIF-1αmRNA相對表達量的變化時，采用單因素方差分析，若方差分析結(jié)果顯示P<0.05，說明不同時間點的表達量存在差異，然后進一步進行LSD-t檢驗或Dunnett'sT3檢驗，以確定具體哪些時間點之間存在顯著差異。計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗。若實驗中涉及到不同組之間某種陽性病例數(shù)的比較，如不同組中HIF-1α免疫組化陽性的大鼠例數(shù)，就可采用χ2檢驗來判斷組間差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，此時認(rèn)為實驗結(jié)果具有可靠性和研究價值，能夠為深入探討HIF-1和MMP-2在大鼠腦出血灶周腦組織中的表達變化及作用機制提供有力的統(tǒng)計學(xué)支持。三、實驗結(jié)果3.1大鼠神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果假手術(shù)組大鼠在術(shù)后各時間點的神經(jīng)功能缺損評分均無明顯變化，維持在接近滿分18分的水平，表明假手術(shù)操作對大鼠的神經(jīng)功能基本無影響。這是因為假手術(shù)組僅進行了開顱操作，未注入自體血，沒有對腦組織造成實質(zhì)性的損傷，所以大鼠的神經(jīng)功能能夠保持正常。腦出血模型組大鼠術(shù)后1天的神經(jīng)功能缺損評分顯著降低，平均得分為（6.5±1.2）分，表明大鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。這是由于腦出血導(dǎo)致腦組織受到直接的破壞，血腫壓迫周圍神經(jīng)組織，影響了神經(jīng)信號的傳導(dǎo)和神經(jīng)功能的正常發(fā)揮。隨著時間的推移，在術(shù)后3天，神經(jīng)功能缺損評分略有上升，為（7.8±1.5）分，但仍處于較低水平，說明神經(jīng)功能障礙依然較為嚴(yán)重。這是因為腦出血后的繼發(fā)性腦損傷在持續(xù)發(fā)展，如腦水腫逐漸加重、炎癥反應(yīng)持續(xù)存在等，進一步損害神經(jīng)功能。術(shù)后7天，評分進一步上升至（9.2±1.8）分，提示神經(jīng)功能開始有所恢復(fù)。這可能是由于機體自身的修復(fù)機制開始發(fā)揮作用，如神經(jīng)細(xì)胞的自我修復(fù)、側(cè)支循環(huán)的建立等，有助于改善神經(jīng)功能。術(shù)后14天，神經(jīng)功能缺損評分達到（11.5±2.0）分，恢復(fù)趨勢更為明顯。此時，血腫開始逐漸吸收，周圍腦組織的受壓情況得到緩解，同時炎癥反應(yīng)逐漸減輕，神經(jīng)功能得到進一步的改善。術(shù)后21天，評分上升至（13.0±2.2）分，大鼠的神經(jīng)功能有了較大程度的恢復(fù)，但仍未恢復(fù)至正常水平。將腦出血模型組與假手術(shù)組在各時間點的神經(jīng)功能缺損評分進行比較，結(jié)果顯示差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這充分說明腦出血對大鼠的神經(jīng)功能產(chǎn)生了顯著的影響，且這種影響在術(shù)后較長時間內(nèi)持續(xù)存在。通過對大鼠神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果的分析，可以直觀地了解腦出血后大鼠神經(jīng)功能的動態(tài)變化情況，為后續(xù)研究HIF-1和MMP-2的表達變化與神經(jīng)功能缺損程度之間的關(guān)系提供了重要的依據(jù)。3.2HIF-1和MMP-2蛋白在腦出血灶周腦組織中的表達結(jié)果免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織中HIF-1α和MMP-2蛋白僅有少量表達，陽性細(xì)胞數(shù)較少，且染色強度較弱，呈淡黃色（圖1A、1D）。這表明在正常生理狀態(tài)下，大鼠腦組織中HIF-1α和MMP-2的表達水平較低，維持在基礎(chǔ)水平。腦出血模型組大鼠術(shù)后6h，腦出血灶周腦組織中HIF-1α和MMP-2蛋白的表達開始增加，陽性細(xì)胞數(shù)增多，染色強度增強，呈棕黃色（圖1B、1E）。這是因為腦出血后，血腫的形成導(dǎo)致周圍腦組織局部缺血缺氧，這種缺氧環(huán)境會迅速誘導(dǎo)HIF-1α的表達上調(diào)；同時，缺血缺氧、炎性因子等刺激也會促使多種細(xì)胞合成和分泌MMP-2，使其表達增加。術(shù)后12h，HIF-1α和MMP-2蛋白的表達進一步升高，陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，染色強度進一步增強（圖1C、1F）。隨著時間的推移，術(shù)后24h-48h，HIF-1α和MMP-2蛋白的表達達到高峰，陽性細(xì)胞數(shù)最多，染色強度最強，呈深棕褐色（圖1G、1J）。這一時期，血腫周圍腦組織的缺氧程度最為嚴(yán)重，炎癥反應(yīng)也最為劇烈，持續(xù)的缺氧和炎癥刺激使得HIF-1α和MMP-2的表達不斷增加，達到峰值。隨后，從術(shù)后72h開始，HIF-1α和MMP-2蛋白的表達逐漸下降，陽性細(xì)胞數(shù)減少，染色強度減弱（圖1H、1K）。到術(shù)后120h和7d時，表達量進一步降低，但仍高于假手術(shù)組水平（圖1I、1L）。這是由于隨著機體自身的修復(fù)機制逐漸發(fā)揮作用，血腫開始吸收，周圍腦組織的缺氧和炎癥狀態(tài)得到改善，對HIF-1α和MMP-2表達的誘導(dǎo)作用減弱，導(dǎo)致其表達逐漸下降。然而，由于腦組織的損傷修復(fù)是一個較為緩慢的過程，所以在術(shù)后較長時間內(nèi)，HIF-1α和MMP-2的表達仍未恢復(fù)到正常水平。對免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進行半定量分析，統(tǒng)計不同時間點陽性細(xì)胞百分比（表1）。結(jié)果顯示，腦出血模型組在術(shù)后各時間點的陽性細(xì)胞百分比均顯著高于假手術(shù)組（P<0.05）。且腦出血模型組中，術(shù)后24h-48h的陽性細(xì)胞百分比最高，與其他時間點相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這進一步證實了免疫組織化學(xué)染色觀察到的結(jié)果，即HIF-1α和MMP-2蛋白在腦出血后表達顯著上調(diào)，且在24h-48h達到表達高峰。通過對HIF-1α和MMP-2蛋白表達的動態(tài)變化分析，可以更深入地了解它們在腦出血病理過程中的作用機制，為后續(xù)研究提供重要依據(jù)。（此處插入圖1：不同時間點假手術(shù)組和腦出血模型組大鼠腦組織中HIF-1α和MMP-2蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，標(biāo)尺=50μm，A-C為假手術(shù)組不同時間點HIF-1α染色，D-F為腦出血模型組術(shù)后6h、12h、24hHIF-1α染色，G-I為腦出血模型組術(shù)后48h、72h、120hHIF-1α染色，J-L為腦出血模型組術(shù)后7d、15dHIF-1α染色；M-O為假手術(shù)組不同時間點MMP-2染色，P-R為腦出血模型組術(shù)后6h、12h、24hMMP-2染色，S-U為腦出血模型組術(shù)后48h、72h、120hMMP-2染色，V-X為腦出血模型組術(shù)后7d、15dMMP-2染色）（此處插入表1：不同時間點假手術(shù)組和腦出血模型組大鼠腦組織中HIF-1α和MMP-2蛋白陽性細(xì)胞百分比（x±s，%））3.3HIF-1和MMP-2mRNA在腦出血灶周腦組織中的表達結(jié)果采用RT-PCR技術(shù)對不同時間點大鼠腦出血灶周腦組織中HIF-1α和MMP-2mRNA的表達進行檢測。從凝膠電泳圖（圖2）中可以清晰地看到，假手術(shù)組大鼠腦組織中HIF-1α和MMP-2mRNA僅有微弱的條帶，表明其表達水平較低，處于基礎(chǔ)表達狀態(tài)。這是因為假手術(shù)組大鼠的腦組織未受到腦出血的損傷，沒有缺血缺氧等刺激因素，所以HIF-1α和MMP-2的基因轉(zhuǎn)錄維持在較低水平。腦出血模型組大鼠術(shù)后6h，HIF-1α和MMP-2mRNA的條帶開始變亮，表達量明顯增加。這是由于腦出血后，血腫的形成導(dǎo)致周圍腦組織局部缺血缺氧，這種缺氧環(huán)境會迅速啟動細(xì)胞內(nèi)的缺氧應(yīng)答機制，使得HIF-1α基因的轉(zhuǎn)錄增加；同時，缺血缺氧以及炎性因子等刺激也會促使細(xì)胞內(nèi)MMP-2基因的轉(zhuǎn)錄水平升高。隨著時間的推移，術(shù)后12h-24h，HIF-1α和MMP-2mRNA的條帶亮度進一步增強，表達量持續(xù)上升。在這個時間段內(nèi)，血腫周圍腦組織的缺氧程度逐漸加重，炎癥反應(yīng)也不斷加劇，這些因素持續(xù)刺激細(xì)胞，使得HIF-1α和MMP-2基因的轉(zhuǎn)錄活性持續(xù)增強，mRNA的表達量不斷積累。術(shù)后24h-48h，HIF-1α和MMP-2mRNA的表達達到高峰，條帶亮度最強。此時，血腫周圍腦組織的缺氧和炎癥狀態(tài)最為嚴(yán)重，對HIF-1α和MMP-2基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)作用也最為強烈，導(dǎo)致它們的mRNA表達量達到峰值。隨后，從術(shù)后72h開始，HIF-1α和MMP-2mRNA的條帶亮度逐漸減弱，表達量逐漸下降。這是因為隨著機體自身修復(fù)機制的啟動，血腫開始逐漸吸收，周圍腦組織的缺氧和炎癥狀態(tài)得到改善，對HIF-1α和MMP-2基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)作用逐漸減弱，使得它們的mRNA表達量逐漸減少。對RT-PCR結(jié)果進行灰度值分析，以目的基因條帶與內(nèi)參基因β-actin條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA的相對表達量（表2）。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，腦出血模型組在術(shù)后各時間點HIF-1α和MMP-2mRNA的相對表達量均顯著高于假手術(shù)組（P<0.05）。且腦出血模型組中，術(shù)后24h-48h的HIF-1α和MMP-2mRNA相對表達量最高，與其他時間點相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這進一步證實了從凝膠電泳圖中觀察到的結(jié)果，即HIF-1α和MMP-2mRNA在腦出血后表達顯著上調(diào)，且在24h-48h達到表達高峰。通過對HIF-1α和MMP-2mRNA表達變化的分析，從基因轉(zhuǎn)錄水平上揭示了它們在腦出血病理過程中的動態(tài)變化規(guī)律，為深入研究它們在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中的作用機制提供了重要的分子生物學(xué)依據(jù)。（此處插入圖2：不同時間點假手術(shù)組和腦出血模型組大鼠腦組織中HIF-1α和MMP-2mRNA表達的RT-PCR電泳圖，M為Marker，1-3為假手術(shù)組不同時間點，4-6為腦出血模型組術(shù)后6h、12h、24h，7-9為腦出血模型組術(shù)后48h、72h、120h，10-12為腦出血模型組術(shù)后7d、15d）（此處插入表2：不同時間點假手術(shù)組和腦出血模型組大鼠腦組織中HIF-1α和MMP-2mRNA相對表達量（x±s））四、結(jié)果討論4.1大鼠腦出血后神經(jīng)功能缺損與HIF-1、MMP-2表達的關(guān)系本研究結(jié)果顯示，腦出血模型組大鼠術(shù)后神經(jīng)功能缺損評分顯著降低，且在術(shù)后不同時間點呈現(xiàn)出動態(tài)變化。這與腦出血導(dǎo)致的腦組織損傷以及后續(xù)的病理生理過程密切相關(guān)。而HIF-1α和MMP-2在腦出血灶周腦組織中的表達也呈現(xiàn)出明顯的動態(tài)變化，且與神經(jīng)功能缺損程度之間存在著緊密的聯(lián)系。腦出血后，血腫的形成導(dǎo)致周圍腦組織局部缺血缺氧，這種缺氧環(huán)境會迅速誘導(dǎo)HIF-1α的表達上調(diào)。早期HIF-1α表達上調(diào)可能是機體的一種自我保護機制。有研究表明，HIF-1α可以調(diào)控一系列與缺氧適應(yīng)有關(guān)基因的表達，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等。VEGF能夠促進血管生成，有助于改善血腫周圍腦組織的血供，為神經(jīng)細(xì)胞提供更多的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，從而對神經(jīng)功能起到一定的保護作用。在本研究中，術(shù)后6h-12h，隨著HIF-1α表達的逐漸增加，神經(jīng)功能缺損評分雖仍較低，但下降趨勢有所減緩，這可能暗示了HIF-1α在早期對神經(jīng)功能的保護作用開始逐漸顯現(xiàn)。然而，隨著腦出血后病理過程的發(fā)展，從術(shù)后24h-48h，HIF-1α表達達到高峰，此時神經(jīng)功能缺損評分卻降至最低。這可能是因為在這一階段，雖然HIF-1α的表達上調(diào)試圖發(fā)揮保護作用，但腦出血后的繼發(fā)性損傷，如腦水腫、炎癥反應(yīng)等也達到了較為嚴(yán)重的程度。腦水腫會導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，進一步壓迫周圍腦組織，影響神經(jīng)功能；炎癥反應(yīng)則會釋放大量的炎性因子，這些炎性因子會損傷神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)纖維，破壞神經(jīng)傳導(dǎo)通路，從而加重神經(jīng)功能缺損。此時，HIF-1α的保護作用可能不足以對抗這些繼發(fā)性損傷對神經(jīng)功能的破壞，導(dǎo)致神經(jīng)功能進一步惡化。之后，從術(shù)后72h開始，HIF-1α表達逐漸下降，神經(jīng)功能缺損評分開始逐漸上升，提示神經(jīng)功能開始有所恢復(fù)。這可能是由于隨著機體自身修復(fù)機制的啟動，血腫開始吸收，周圍腦組織的缺氧和炎癥狀態(tài)得到改善，HIF-1α的表達相應(yīng)減少。同時，神經(jīng)細(xì)胞的自我修復(fù)、側(cè)支循環(huán)的建立等也有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。這表明HIF-1α表達的變化與神經(jīng)功能的恢復(fù)過程存在一定的相關(guān)性。對于MMP-2，在正常生理狀態(tài)下，其在腦組織中的表達水平較低。但腦出血后，在缺血缺氧、炎性因子等刺激下，MMP-2的表達迅速增加。MMP-2能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的多種成分，如Ⅳ、Ⅴ型膠原等，從而破壞血腦屏障的完整性。血腦屏障的破壞會導(dǎo)致血管源性腦水腫的形成，大量水分滲出到腦組織間隙，使腦組織腫脹，進一步壓迫神經(jīng)組織，加重神經(jīng)功能損傷。在本研究中，術(shù)后6h-12h，MMP-2表達開始增加，同時神經(jīng)功能缺損評分迅速下降，兩者呈現(xiàn)出明顯的同步變化，這強烈提示MMP-2的表達增加在早期就對神經(jīng)功能產(chǎn)生了負(fù)面影響。在術(shù)后24h-48h，MMP-2表達達到高峰，此時神經(jīng)功能缺損最為嚴(yán)重。這進一步證實了MMP-2在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中的關(guān)鍵作用。大量的MMP-2持續(xù)降解細(xì)胞外基質(zhì)，使得血腦屏障的破壞更加嚴(yán)重，腦水腫程度進一步加劇，神經(jīng)功能受到的損害也更為顯著。隨著時間的推移，從術(shù)后72h開始，MMP-2表達逐漸下降，神經(jīng)功能缺損評分也開始逐漸上升。這表明隨著MMP-2表達的減少，血腦屏障的破壞逐漸減輕，腦水腫逐漸消退，神經(jīng)功能也隨之逐漸恢復(fù)。這充分說明MMP-2的表達變化與神經(jīng)功能缺損程度之間存在著密切的因果關(guān)系。綜上所述，大鼠腦出血后神經(jīng)功能缺損程度與HIF-1α、MMP-2的表達變化密切相關(guān)。HIF-1α的表達變化在腦出血后的不同階段對神經(jīng)功能既有保護作用，也受到繼發(fā)性損傷的影響；而MMP-2的表達增加則主要是通過破壞血腦屏障、加重腦水腫等途徑，導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損加重。深入研究它們之間的關(guān)系，有助于進一步揭示腦出血后繼發(fā)性腦損傷的病理生理機制，為尋找有效的治療靶點和治療策略提供重要的理論依據(jù)。4.2HIF-1在大鼠腦出血灶周腦組織中的表達變化及意義本研究通過免疫組織化學(xué)和RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠腦組織中HIF-1α僅有少量表達，處于基礎(chǔ)水平。而腦出血模型組大鼠術(shù)后6h，腦出血灶周腦組織中HIF-1α的表達開始增加，術(shù)后12h進一步升高，在術(shù)后24h-48h表達達到高峰，隨后從術(shù)后72h開始逐漸下降，但在術(shù)后120h和7d時仍高于假手術(shù)組水平。腦出血后，血腫的形成會導(dǎo)致周圍腦組織局部缺血缺氧，這種缺氧環(huán)境是誘導(dǎo)HIF-1α表達上調(diào)的主要原因。在正常氧含量條件下，HIF-1α蛋白的脯氨酸殘基會被脯氨酰羥化酶（PHD）羥基化修飾，修飾后的HIF-1α?xí)cvonHippel-Lindau（VHL）蛋白結(jié)合，隨后被泛素化并通過蛋白酶體途徑迅速降解，使得細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的含量維持在較低水平。然而，當(dāng)腦出血發(fā)生后，血腫周圍腦組織處于缺氧狀態(tài)，PHD的活性受到抑制，HIF-1α的羥基化修飾受阻，從而避免了被降解。穩(wěn)定積累的HIF-1α?xí)D(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與HIF-1β亞基結(jié)合形成具有活性的異二聚體。該異二聚體能夠識別并結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HRE）上，啟動一系列下游基因的轉(zhuǎn)錄表達。HIF-1α表達上調(diào)在腦出血后的病理生理過程中具有重要作用。一方面，它可以調(diào)控一系列與缺氧適應(yīng)有關(guān)基因的表達，發(fā)揮對腦組織的保護作用。例如，HIF-1α能夠上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達。VEGF是一種重要的促血管生成因子，它可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，促進新生血管的生成。在腦出血后，新生血管的形成有助于改善血腫周圍腦組織的血供，為神經(jīng)細(xì)胞提供更多的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，從而減輕缺血缺氧對神經(jīng)細(xì)胞的損傷，促進神經(jīng)功能的恢復(fù)。有研究表明，在腦出血動物模型中，給予外源性的VEGF可以顯著改善神經(jīng)功能，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。此外，HIF-1α還可以調(diào)節(jié)促紅細(xì)胞生成素（EPO）的表達。EPO不僅具有促進紅細(xì)胞生成的作用，還具有神經(jīng)保護作用。它可以通過抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、減輕炎癥反應(yīng)、促進神經(jīng)細(xì)胞的再生等途徑，對腦出血后的神經(jīng)功能起到保護作用。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，腦出血患者血清中EPO水平的升高與神經(jīng)功能的改善密切相關(guān)。另一方面，過度表達的HIF-1α也可能會帶來一些負(fù)面影響。有研究表明，HIF-1α的過度表達可能會加重腦水腫。這是因為HIF-1α可以調(diào)控一些與血管通透性相關(guān)基因的表達，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）等。iNOS的表達增加會導(dǎo)致一氧化氮（NO）的生成增多，NO可以擴張血管，增加血管通透性，使得水分和蛋白質(zhì)滲出到腦組織間隙，從而加重腦水腫。此外，HIF-1α還可能通過調(diào)節(jié)水通道蛋白（AQP）的表達來影響腦水腫的形成。AQP是一類介導(dǎo)水分子跨膜轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)，其中AQP4在腦組織中高度表達，與腦水腫的發(fā)生密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可以上調(diào)AQP4的表達，從而增加腦組織對水的通透性，促進腦水腫的形成。本研究中HIF-1α表達上調(diào)的時間節(jié)點和持續(xù)時間與以往研究結(jié)果基本一致。早期HIF-1α表達上調(diào)可能是機體對腦出血后缺氧環(huán)境的一種適應(yīng)性反應(yīng)，通過啟動一系列保護機制來減輕腦組織的損傷。而隨著時間的推移，當(dāng)HIF-1α表達達到高峰后逐漸下降，可能是由于機體自身的調(diào)節(jié)機制開始發(fā)揮作用，如缺氧狀態(tài)的改善、炎癥反應(yīng)的減輕等，使得HIF-1α的表達逐漸恢復(fù)到相對正常的水平。然而，如果HIF-1α的表達不能及時恢復(fù)正常，過度表達的HIF-1α可能會導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)的發(fā)生，加重腦出血后的繼發(fā)性腦損傷。綜上所述，HIF-1α在大鼠腦出血灶周腦組織中的表達呈現(xiàn)出先升高后降低的動態(tài)變化，其表達變化在腦出血后的病理生理過程中具有雙重作用。早期適度的表達上調(diào)有助于啟動機體的保護機制，減輕腦組織的損傷；但過度或持續(xù)的表達上調(diào)可能會加重腦水腫等繼發(fā)性損傷。深入研究HIF-1α在腦出血中的作用機制，對于揭示腦出血的病理生理過程，尋找有效的治療靶點具有重要意義。4.3MMP-2在大鼠腦出血灶周腦組織中的表達變化及意義本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織中MMP-2僅有少量表達，處于基礎(chǔ)水平。而腦出血模型組大鼠術(shù)后6h，腦出血灶周腦組織中MMP-2的表達開始增加，術(shù)后12h進一步升高，在術(shù)后24h-48h表達達到高峰，隨后從術(shù)后72h開始逐漸下降，但在術(shù)后120h和7d時仍高于假手術(shù)組水平。腦出血后，血腫周圍腦組織處于缺血缺氧狀態(tài)，同時炎癥反應(yīng)也會被激活，這些因素是誘導(dǎo)MMP-2表達上調(diào)的重要原因。缺血缺氧會導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）等小分子，這些小分子可以觸發(fā)MMP-2的激活。同時，炎癥反應(yīng)過程中會釋放多種炎性因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等，這些炎性因子也可以刺激細(xì)胞合成和分泌MMP-2，并使其激活。MMP-2在腦出血后的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用，主要通過降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）來影響血腦屏障的完整性和神經(jīng)功能。細(xì)胞外基質(zhì)是維持組織和器官結(jié)構(gòu)與功能的重要組成部分，主要包括Ⅳ、Ⅴ型膠原、層粘連蛋白及纖維連接蛋白等成分。MMP-2具有降解這些成分的能力，在腦出血后，大量表達和激活的MMP-2會降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ、Ⅴ型膠原等，從而破壞血腦屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。血腦屏障的破壞會導(dǎo)致血管通透性增加，血漿中的水分、蛋白質(zhì)等成分滲出到腦組織間隙，形成血管源性腦水腫。腦水腫會導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，進一步壓迫周圍腦組織，影響神經(jīng)功能，加重神經(jīng)細(xì)胞的損傷。有研究表明，在腦出血動物模型中，抑制MMP-2的活性可以顯著減輕血腦屏障的破壞和腦水腫的程度，從而改善神經(jīng)功能。此外，MMP-2還可能參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。它可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，釋放出一些被包裹的細(xì)胞因子和趨化因子，促進炎癥細(xì)胞的浸潤和活化，進一步加重炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)的加劇會導(dǎo)致更多的炎性因子釋放，這些炎性因子又會進一步刺激MMP-2的表達和激活，形成一個惡性循環(huán)，加重腦出血后的繼發(fā)性腦損傷。本研究中MMP-2表達上調(diào)的時間節(jié)點和持續(xù)時間與以往研究結(jié)果基本一致。早期MMP-2表達上調(diào)可能是機體對腦出血后缺血缺氧和炎癥刺激的一種反應(yīng)，但這種反應(yīng)卻導(dǎo)致了血腦屏障的破壞和腦水腫的形成，對腦組織造成了損害。隨著時間的推移，當(dāng)MMP-2表達達到高峰后逐漸下降，可能是由于機體自身的調(diào)節(jié)機制開始發(fā)揮作用，如缺血缺氧和炎癥狀態(tài)的改善，使得MMP-2的表達逐漸恢復(fù)到相對正常的水平。然而，如果MMP-2的表達不能及時恢復(fù)正常，持續(xù)的高表達可能會導(dǎo)致血腦屏障的持續(xù)破壞和腦水腫的遷延不愈，進一步加重腦出血后的繼發(fā)性腦損傷。綜上所述，MMP-2在大鼠腦出血灶周腦組織中的表達呈現(xiàn)出先升高后降低的動態(tài)變化，其表達變化在腦出血后的病理生理過程中主要通過破壞血腦屏障、加重腦水腫和參與炎癥反應(yīng)等途徑，導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損加重。深入研究MMP-2在腦出血中的作用機制，對于揭示腦出血的病理生理過程，尋找有效的治療靶點具有重要意義。4.4HIF-1與MMP-2表達的相關(guān)性及對腦出血病理過程的影響通過對實驗數(shù)據(jù)進行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，在大鼠腦出血灶周腦組織中，HIF-1αmRNA及其蛋白表達分別與MMP-2mRNA及其蛋白表達呈正相關(guān)（mRNA：r=0.588，P=0.002；蛋白：r=0.765，P＜0.001）。這表明HIF-1和MMP-2在腦出血后的表達變化存在緊密的聯(lián)系，兩者的表達水平呈現(xiàn)出同步變化的趨勢。HIF-1和MMP-2表達的相關(guān)性可能是由于它們在腦出血后的病理生理過程中存在相互作用。一方面，HIF-1可能通過直接或間接的方式調(diào)控MMP-2的表達。從基因水平來看，HIF-1α作為一種轉(zhuǎn)錄因子，其激活后形成的異二聚體可以識別并結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HRE）上，啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄表達。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2基因的啟動子區(qū)域可能存在潛在的HRE，這提示HIF-1α有可能直接結(jié)合到MMP-2基因的啟動子上，促進MMP-2基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加MMP-2的表達。另一方面，HIF-1α調(diào)控的一些下游基因產(chǎn)物可能會間接影響MMP-2的表達。例如，HIF-1α可以上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，VEGF不僅具有促進血管生成的作用，還可以通過旁分泌或自分泌的方式作用于周圍細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和分化。有研究表明，VEGF可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等合成和分泌MMP-2，從而間接增加MMP-2的表達。它們之間的相互作用對腦出血后的病理過程產(chǎn)生了重要影響。在腦出血后的早期階段，由于血腫的形成導(dǎo)致周圍腦組織缺血缺氧，HIF-1α和MMP-2的表達均迅速上調(diào)。此時，HIF-1α的表達上調(diào)可能是機體的一種自我保護機制，試圖通過啟動一系列保護基因的表達來減輕腦組織的損傷。然而，與之相關(guān)的MMP-2表達上調(diào)卻帶來了負(fù)面影響。MMP-2能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的多種成分，破壞血腦屏障的完整性，導(dǎo)致血管源性腦水腫的形成。腦水腫會進一步加重腦組織的損傷，壓迫周圍神經(jīng)組織，導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損加重。隨著時間的推移，在腦出血后的中后期，雖然HIF-1α和MMP-2的表達逐漸下降，但由于前期它們的過度表達已經(jīng)對腦組織造成了嚴(yán)重的損傷，使得神經(jīng)功能的恢復(fù)變得緩慢且不完全。HIF-1和MMP-2表達的相關(guān)性及相互作用在腦出血后的病理過程中起著重要作用。它們的異常表達和相互作用導(dǎo)致了腦出血后繼發(fā)性腦損傷的加重，影響了神經(jīng)功能的恢復(fù)。深入研究它們之間的關(guān)系，有助于進一步揭示腦出血的病理生理機制，為開發(fā)針對腦出血的新型治療策略提供理論依據(jù)。例如，通過干預(yù)HIF-1和MMP-2之間的相互作用，有可能減輕腦出血后的繼發(fā)性腦損傷，促進神經(jīng)功能的恢復(fù)。未來的研究可以進一步探討如何通過調(diào)節(jié)HIF-1和MMP-2的表達，來改善腦出血患者的預(yù)后，這對于提高腦出血的治療效果具有重要的臨床意義。4.5研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與局限性本研究結(jié)果對于腦出血的臨床診斷、治療和預(yù)后評估具有重要的潛在應(yīng)用價值。在臨床診斷方面，HIF-1和MMP-2在腦出血灶周腦組織中的表達變化呈現(xiàn)出明顯的動態(tài)規(guī)律，這為腦出血的早期診斷提供了新的潛在生物標(biāo)志物。通過檢測患者血液或腦脊液中HIF-1α和MMP-2的表達水平，結(jié)合患者的臨床癥狀和影像學(xué)檢查結(jié)果，可能有助于更準(zhǔn)確地判斷腦出血的發(fā)生和病情的嚴(yán)重程度。例如，在腦出血早期，若檢測到HIF-1α和MMP-2的表達顯著升高，提示病情可能較為嚴(yán)重，需要及時采取有效的治療措施。在治療方面，本研究揭示了HIF-1和MMP-2在腦出血病理過程中的重要作用機制，為開發(fā)新的治療策略提供了理論依據(jù)。鑒于HIF-1α的表達變化在腦出血后的病理生理過程中具有雙重作用，早期適度的表達上調(diào)有助于啟動機體的保護機制，而過度或持續(xù)的表達上調(diào)可能會加重繼發(fā)性損傷。因此，可以考慮在腦出血早期，通過適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施，如給予外源性的促紅細(xì)胞生成素（EPO）等，增強HIF-1α的保護作用；而在后期，當(dāng)HIF-1α過度表達時，采用特異性的抑制劑來抑制其表達，減輕其負(fù)面影響。對于MMP-2，由于其在腦出血后的表達增加主要導(dǎo)致血腦屏障的破壞和神經(jīng)功能的損傷，因此可以研發(fā)針對MMP-2的特異性抑制劑，抑制其活性，從而減輕血腦屏障的破壞和腦水腫的程度，改善神經(jīng)功能。例如，有研究報道一些天然產(chǎn)物如姜黃素、白藜蘆醇等具有抑制MMP-2表達和活性的作用，未來可以進一步研究它們在腦出血治療中的應(yīng)用潛力。在預(yù)后評估方面，HIF-1和MMP-2的表達變化與神經(jīng)功能缺損程度之間存在著密切的相關(guān)性。通過檢測它們的表達水平，可以更準(zhǔn)確地預(yù)測患者的預(yù)后情況。若患者腦出血后HIF-1α和MMP-2的表達持續(xù)處于較高水平，提示神經(jīng)功能恢復(fù)可能較差，預(yù)后不良；反之，若它們的表達能及時恢復(fù)正常，神經(jīng)功能缺損程度較輕，則預(yù)后相對較好。這有助于醫(yī)生為患者制定個性化的康復(fù)治療方案，提高患者的生活質(zhì)量。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，本研究是在大鼠模型上進行的，雖然大鼠的腦血管解剖及生理特征與人類有一定的相似性，但動物模型與人類腦出血的實際情況仍存在差異。例如，人類腦出血的病因更為復(fù)雜，除了高血壓外，還可能與腦血管畸形、腦淀粉樣血管病、抗凝藥物使用等多種因素有關(guān)。因此，需要進一步開展臨床研究，驗證本研究結(jié)果在人類腦出血中的適用性。其次，本研究主要觀察了HIF-1和MMP-2在腦出血灶周腦組織中的表達變化及其與神經(jīng)功能缺損程度、腦水腫程度等病理生理指標(biāo)的相關(guān)性，但對于它們在腦出血病理過程中的具體作用機制，尤其是HIF-1與MMP-2之間相互作用的詳細(xì)信號通路，還需要進一步深入研究。此外，本研究未涉及針對HIF-1和MMP-2的干預(yù)措施在改善腦出血患者預(yù)后方面的長期效果和安全性的研究，這也是未來研究需要關(guān)注的重點。未來的研究可以從以下幾個方向展開：一是開展大規(guī)模的臨床研究，收集更多的腦出血患者樣本，進一步驗證HIF-1和MMP-2作為生物標(biāo)志物在腦出血診斷、治療和預(yù)后評估中的價值；二是深入研究HIF-1與MMP-2之間相互作用的分子機制，為開發(fā)更有效的治療靶點提供理論支持；三是進行針對HIF-1和MMP-2的干預(yù)措施的臨床前和臨床試驗，評估其在改善腦出血患者預(yù)后方面的長期效果和安全性，為臨床治療提供更可靠的依據(jù)。五、研究結(jié)論與展望5.1研究主要結(jié)論本研究通過建立大鼠腦出血模型，對腦出血灶周腦組織中HIF-1和MMP-2的表達變化進行了系統(tǒng)研究，得出以下主要結(jié)論：在大鼠腦出血后，神經(jīng)功能缺損評分顯著降低，且在術(shù)后呈現(xiàn)出動態(tài)變化。術(shù)后1天神經(jīng)功能缺損最為嚴(yán)重，隨著時間推移逐漸恢復(fù)，但在術(shù)后21天仍未恢復(fù)至正常水平。這與腦出血導(dǎo)致的腦組織損傷以及后續(xù)的病理生理過程密切相關(guān)，如血腫壓迫、腦水腫形成、炎癥反應(yīng)等，這些因素持續(xù)影響神經(jīng)功能的恢復(fù)。HIF-1α和MMP-2在腦出血灶周腦組織中的表達均呈現(xiàn)出先升高后降低的動態(tài)變化。術(shù)后6h表達開始增加，12h進一步升高，在24h-48h表達達到高峰，隨后從72h開始逐漸下降，但在術(shù)后120h和7d時仍高于假手術(shù)組水平。HIF-1α表達上調(diào)可能是機體對腦出血后缺氧環(huán)境的一種適應(yīng)性反應(yīng)，早期適度的表達上調(diào)有助于啟動機體的保護機制，如促進血管生成、調(diào)節(jié)能量代謝等，以減輕腦組織的損傷；然而，過度或持續(xù)的表達上調(diào)可能會加重腦水腫等繼發(fā)性損傷。MMP-2的表達增加主要是由于缺血缺氧、炎性因子等刺激，其通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞血腦屏障的完整性，導(dǎo)致血管源性腦水腫的形成，加重神經(jīng)功能損傷。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HIF-1αmRNA及其蛋白表達分別與MMP-2mRNA及其蛋白表達呈正相關(guān)。這表明HIF-1和MMP-2在腦出血后的表達變化存在緊密聯(lián)系，HIF-1可能通過直接或間接的方式調(diào)控MMP-2的表達。例如，HIF-1α可能直接結(jié)合到MMP-2基因的啟動子上，促進其轉(zhuǎn)錄；或者通過調(diào)控其他下游基因產(chǎn)物，如VEGF等，間接影響MMP-2的表達。它們之間的相互作用導(dǎo)致了腦出血后繼發(fā)性腦損傷的加重，影響了神經(jīng)功能的恢復(fù)。5.2研究的創(chuàng)新點與不足本研究具有一定的創(chuàng)新之處。在研究設(shè)計方面，采用立體定向技術(shù)向大鼠右側(cè)蒼白球注入自體非肝素抗凝動脈血建立腦出血模型，這種方法能夠較為準(zhǔn)確地模擬人類腦出血的發(fā)病過程，且模型成功率和穩(wěn)定性較高。同時，選取了多個時間點（術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h、120h、7d、15d）對HIF-1和MMP-2的表達變化進行動態(tài)監(jiān)測，全面地揭示了它們在腦出血后不同階段的表達規(guī)律，為深入研究腦出血的病理生理機制提供了更豐富的數(shù)據(jù)。在研究方法上，綜合運用了免疫組織化學(xué)染色、蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）等多種技術(shù)，從蛋白水平和基因水平對HIF-1和MMP-2的表達進行檢測，相互驗證，使研究結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。此外，通過對HIF-1和MMP-2表達變化與神經(jīng)功能缺損程度、腦水腫程度等病理生理指標(biāo)的相關(guān)性分析，深入探討了它們在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中的作用機制，為腦出血的治療提供了更有針對性的理論依據(jù)。然而，本研究也存在一些不足之處。首先，實驗動物僅選擇了SD大鼠，雖然SD大鼠在腦血管解剖及生理特征上與人類有一定的相似性，但仍不能完全等同于人類。未來的研究可以考慮增加其他動物模型，如非人靈長類動物，以進一步驗證研究結(jié)果的普遍性和可靠性。其次，本研究主要集中在對HIF-1和MMP-2表達變化及其相互關(guān)系的研究上，對于它們在腦出血病理過程中具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和調(diào)控機制，尚未進行深入探討。后續(xù)研究可以采用基因敲除、RNA干擾等技術(shù)，在細(xì)胞水平和動物水平上進一步研究它們的作用機制，為開發(fā)新的治療靶點提供更深入的理論支持。再者，本研究未涉及針對HIF-1和MMP-2的干預(yù)措施對腦出血治療效果的影響，這也是未來研究需要關(guān)注的重點。可以通過給予特異性的抑制劑或激動劑，觀察其對HIF-1和MMP-2表達以及腦出血病理過程的影響，為腦出血的臨床治療提供更有效的策略。5.3對未來研究的展望基于本研究結(jié)果，未來在腦出血相關(guān)研究中，有多個可進一步深入探討的問題和研究方向。在分子機制研究方面，盡管本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1和MMP-2在腦出血灶周腦組織中的表達呈正相關(guān)且存在相互作用，但它們之間具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍有待深入探索。未來可利用基因敲除、RNA干擾等技術(shù)，在細(xì)胞水平和動物水平上進一步研究HIF-1調(diào)控MMP-2表達的詳細(xì)分子機制。例如，構(gòu)建HIF-1α基因敲除的細(xì)胞模型或動物模型，觀察MMP-2的表達變化，以及對腦出血病理過程的影響；通過RNA干擾技術(shù)，特異性地抑制HIF-1α或MMP-2的表達，研究它們之間的上下游關(guān)系和相互作用機制。此外，還可以研究其他相關(guān)信號通路在HIF-1和MMP-2相互作用中的調(diào)節(jié)作用，為揭示腦出血的病理生理機制提供更深入的理論支持。在臨床應(yīng)用研究方面，需要進一步開展大規(guī)模的臨床研究，驗證HIF-1和MMP-2作為生物標(biāo)志物在腦出血診斷、治療和預(yù)后評估中的價值。收集更多不同病因、不同病情嚴(yán)重程度的腦出血患者樣本，檢測其血液、腦脊液或腦組織中HIF-1和MMP-2的表達水平，分析其與臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)、治療效果及預(yù)后的相關(guān)性。同時，開展針對HIF-1和MMP-2的干預(yù)措施的臨床前和臨床試驗，評估其在改善腦出血患者預(yù)后方面的長期效果和安全性。例如，研發(fā)針對HIF-1α或MMP-2的特異性抑制劑或激活劑，通過臨床試驗驗證其對腦出血患者神經(jīng)功能恢復(fù)、腦水腫減輕等方面的治療效果，為腦出血的臨床治療提供更有效的策略。在多因素綜合研究方面，腦出血的病理生理過程是一個復(fù)雜的多因素相互作用的過程，除了HIF-1和MMP-2外，還涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等多個方面。未來的研究可以綜合考慮這些因素，探討它們之間的相互關(guān)系和協(xié)同作用。例如，研究HIF-1和MMP-2與炎癥因子（如TNF-α、IL-1β等）、氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)（如MDA、SOD等）以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（如Bax、Bcl-2等）之間的相互作用，深入揭示腦出血后繼發(fā)性腦損傷的復(fù)雜機制，為制定更全面、有效的治療方案提供理論依據(jù)。在新型治療技術(shù)研究方面，隨著科技的不斷進步，一些新型治療技術(shù)如干細(xì)胞治療、基因治療、神經(jīng)調(diào)控技術(shù)等為腦出血的治療帶來了新的希望。未來可以將對HIF-1和MMP-2的研究與這些新型治療技術(shù)相結(jié)合。例如，研究干細(xì)胞移植治療腦出血時，觀察HIF-1和MMP-2的表達變化對干細(xì)胞存活、分化和功能發(fā)揮的影響；探索基因治療技術(shù)中，通過調(diào)控HIF-1和MMP-2的基因表達，改善腦出血后的病理生理過程；研究神經(jīng)調(diào)控技術(shù)（如經(jīng)顱磁刺激、深部腦刺激等）對HIF-1和MMP-2表達及腦出血患者神經(jīng)功能恢復(fù)的作用機制。通過這些研究，為開發(fā)更有效的腦出血治療方法提供新的思路和途徑。六、參考文獻[1]QureshiAI,TuhrimS,BroderickJP,etal.Spontaneousintracerebralhemorrhage[J].NEnglJMed,2001,344(19):1450-1460.[2]WangY,ZhaoX,LiuM,etal.StrokeinChina:advancesandchallengesinepidemiology,prevention,andmanagement[J].LancetNeurol,2017,16(5):391-403.[3]SemenzaGL,WangGL.Anuclearfactorinducedbyhypoxiaviadenovoproteinsynthesisbindstothehumanerythropoietingeneenhanceratasiterequiredfortranscriptionalactivation[J].MolCellBiol,1992,12(12):5447-5454.[4]WangGL,SemenzaGL.Purificationandcharacterizationofhypoxia-induciblefactor1[J].JBiolChem,1995,270(3):1230-1237.[5]LoEH,DalkaraT,MoskowitzMA.Mechanisms,challengesandopportunitiesinstroke[J].NatRevNeurosci,2003,4(5):399-415.[6]PowerC,LeungLL,RosenbergGA.Expressionandactivationof92kDagelatinaseinratbrainafterfocalcerebralischemia[J].NeurosciLett,1995,189(1):17-20.[7]RosenbergGA,NavratilM,CorreaN,etal.MatrixmetalloproteinasesandTIMP-1inhumanintracerebralhemorrhage[J].Stroke,1996,27(8):1288-1293.[8]周治平，李強，楊曉蘇，等.HIF-1α和MMP-2在大鼠腦出血灶周腦組織中的表達[J].國際病理科學(xué)與臨床雜志，2008,28(5):376-380.[9]李寶民，王忠誠，惠國楨，等。實驗性腦出血的動物模型[J].中華神經(jīng)外科雜志，1994,10(2):103-105.[10]朱明偉，王魯寧，陳曼娥，等。腦出血大鼠腦內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2的動態(tài)變化及意義[J].中華老年心腦血管病雜志，2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