TheRelationshipbetweenDentalPulpStemCellsandToothInnervationJuly第一章引 牙齒發(fā) 牙齒發(fā)育的起始和階 老鼠牙齒胚胎發(fā) 牙齒神經(jīng)發(fā) 牙齒神經(jīng)支 干細(xì) 牙髓干細(xì) 神經(jīng)干細(xì) 神經(jīng)因子, 干細(xì)胞表面標(biāo) 神經(jīng)表面標(biāo) 巢蛋白(Nestin) 神經(jīng)介 AM1-43 第二章實(shí)驗(yàn)假說，實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，特定?第三章材料與方 實(shí)驗(yàn)流程 免疫熒光染 材 共軛焦顯微 第四 結(jié) 第五章討 AM1-43反應(yīng)陽性的時(shí)間和位 CD146免疫反應(yīng)陽性的時(shí)間和位 第六章結(jié) 第七章未來研究方 圖1-1Budstage(AveryandChiego 圖1-2Capstage(AveryandChiego 圖1-3Bellstage(AveryandChiego 圖1- 老鼠齒列示意 圖1-5牙齒神經(jīng)發(fā)育過程 圖3-1實(shí)驗(yàn)流程 圖3-2ICR 圖3-3ICRmouse解剖下 圖4-1Nestin、CD146、GAP-43、Nerve的P4和P8比較 圖4-2P4 圖4-3P4 圖4-4P4Nestin 圖4-5P8 圖4-6P8 圖4-7P8 圖4-8P8 圖4-9P8Nestin 圖4-10P4 圖4-11P4 圖4-12P4 圖4-13P4 圖4-14P4CD146 圖4-15P8 圖4-16P8 圖4-17P8 圖4-18P8 圖4-19P8CD146 圖4-20CD146positivecontrol:bloodvesselsinhuman 圖4-21P4GAP- 圖4-22P4GAP- 圖4-23P4GAP- 圖4-24P4GAP- 圖4-25P4GAP-43 圖4-26P8GAP- 圖4-27P8GAP- 圖4-28P8GAP- 圖4-29P8GAP- 圖4-30P8GAP-43 圖4-31GAP-43PositiveControl:humanpulpRaschkow (2)間葉細(xì)胞形成牙乳頭(dentalpapilla)。stage)，帽(capstage)和鐘階段(bellstage)。每個(gè)階段都是根據(jù)上皮釉質(zhì)的形狀定11Budstage(AveryandChiego12Capstage(AveryandChiego13Bellstage(AveryandChiego細(xì)胞分化在鐘形期間變得明顯，可以區(qū)分為內(nèi)釉上皮(internalenamelepithelium)和外釉上皮(externalenamelepithelium)。內(nèi)釉的細(xì)胞上皮，未來將成為成釉細(xì)胞，在頸環(huán)(cervicalloop)附近分化最少，在牙尖分化最多。釉質(zhì)器官的內(nèi)部包括星狀網(wǎng)(stellatereticulum)，緩沖層，連續(xù)的薄層，薄層將產(chǎn)生由牙釉質(zhì)器官中的第四層由中間細(xì)胞(Stratumintermediumcells)組成。這些細(xì)胞odontoblastcells)，這些細(xì)胞是由間葉細(xì)胞分化而來。由于牙本質(zhì)母細(xì)胞伸長并且變成柱狀，它們形成的膠原蛋白基質(zhì)纖維被鑒定為前牙本質(zhì)。24小時(shí)后，化。(AveryandChiego2006)實(shí)驗(yàn)室小鼠（Musmusculus）是牙齒發(fā)育研究中最常見的模型動(dòng)物，具有由diastema分開，且小鼠門牙連續(xù)生長但牙齒沒有更換。圖1- (Peterkova,PeterkaandLesot過復(fù)雜的細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)牙齒器官發(fā)生。牙齒硬組織、牙本(Fraseretal2009TummersandThesleff2009)出芽開始時(shí)，第一個(gè)信號(hào)中心出現(xiàn)在牙基板(Dentalplacode)上；隨后，在從芽可以透過觀察幾種轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)分子的局部表達(dá)。Pitx2是牙齒上皮細(xì)胞及其表達(dá)的最特異標(biāo)記，在牙冠發(fā)育期間，持續(xù)存在于所有上皮細(xì)胞中(Mucchiellietal.1997)在胎膜中的其他轉(zhuǎn)錄因子包括Foxi3(Shirokovaetal2013)，Dlx2，Lef1p63，它們與Pitx2Shh，Bmp2，Bmp4，Bmp7，F(xiàn)gf8，F(xiàn)gf9，Wnt10a，和Wnt10b(DassuleandMcMahon1998)，可能從上皮到間質(zhì)的牙源性潛力有調(diào)解者的作用。小鼠第一顆牙齒的成形是從基板(Dentalplacode)開始，出現(xiàn)在胚胎后第十二天E12小鼠胚胎中局部增厚在門齒和臼齒區(qū)域(BiggsandMikkola2014,JussilaandThesleff2012)。子。然而，與許多其他人類上皮不同，人類牙齒沒有再生能力。此后，第二和第三臼齒（M2和M3）在第一臼齒（M1）后發(fā)育。許多牙板Pitx2Foxi3，以及幾種與信號(hào)通路相關(guān)的Shh，Wnt10，Bmp2和Fgf20稱為早期信號(hào)傳導(dǎo)中心的基板細(xì)胞(Haaraetal.2012,JussilaandThesleff2012,Keranenetal.1999)。這些信號(hào)調(diào)節(jié)了牙芽的基板上皮增殖和向下長。BonemorphogeneticproteinBMP)Fibroblastgrowthfactor(FGF)誘導(dǎo)牙源性間充質(zhì)。組織重組研究顯示，上皮信號(hào)在間質(zhì)中有誘導(dǎo)隨后牙齒形態(tài)產(chǎn)生的能力。BMP和FGF誘導(dǎo)幾信號(hào)的能力(Thesleff2003)。受不同信號(hào)調(diào)節(jié)的基因包括轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)受體，組織之間的通訊(JernvallandThesleff2000,ThesleffandMikkola2002)。下一個(gè)信號(hào)中心，稱為琺瑯結(jié)(Enamelknot)，形成于芽尖，其特征是細(xì)胞從細(xì)胞周期中排出（p21的表達(dá)）以及信號(hào)分子的局部表達(dá)和信號(hào)通路相關(guān)的基因。信號(hào)刺激了生長產(chǎn)生頸環(huán)(Cervicalloop（CLs）)和牙齒的側(cè)翼上皮使牙號(hào)的來源(JussilaandThesleff2012)。來自琺瑯結(jié)的信號(hào)影響兩者上皮細(xì)胞和間SHH信號(hào)需要生長上皮頸環(huán)對(duì)牙釉質(zhì)andThesleff2012)(BalicandThesleff細(xì)胞不再分化為成釉細(xì)胞，相反的，他們形成Hertwig的上皮根鞘\hHertwig's\hepithelialrootsheath（HERS）與外層釉質(zhì)上皮。Hertwig的上皮根鞘（HERS）擴(kuò)Hertwig的上皮根鞘（HERS）有一個(gè)有限的增長潛力，決定了牙根長度。(Nanci導(dǎo)細(xì)胞溝通牙齒間的發(fā)展；他們中的大多數(shù)都屬于轉(zhuǎn)化生長因子Transforming (TGFb)，成纖維細(xì)胞生長因子Fibroblast (FGF)，Hedgehog和Wnt家族。雖然信號(hào)主要調(diào)節(jié)相互作用在外胚層和間質(zhì)之EctodysplasinTumornecrosisfactorTNF)家族中識(shí)別的信號(hào)分子，其受體Edar介導(dǎo)(Edarmediate)牙胚中外胚層區(qū)室(ectodermalcompartments)之間的信號(hào)傳導(dǎo)(JernvallandThesleff2000,ThesleffandMikkola且它們調(diào)節(jié)所有動(dòng)物的器官發(fā)育。這些信號(hào)家族是WNT，骨形態(tài)發(fā)生蛋白Bonemorphogeneticprotein(BMP)，Hedgehog（HH）和成纖維細(xì)胞生長因Fibroblastgrowthfactor(FGF)。此外，需要一種稱為ectodysplasin（EDA）的信以維持運(yùn)作。(Moeetal.2008)同物種中研究感覺神經(jīng)的發(fā)展發(fā)現(xiàn)三叉神經(jīng)神經(jīng)纖維自芽階段(budstage)之后在的牙釉質(zhì)且牙本質(zhì)已生成，這個(gè)時(shí)候神經(jīng)進(jìn)入牙髓中。(Sasanoetal.1995)(Moeetal2008Kettunenetal.2007)性信號(hào)也控制牙齒間質(zhì)中的軸突導(dǎo)航。(Kettunenetal.2007)(MohamedandAtkinson1983)在鐘階段晚期進(jìn)行釉質(zhì)發(fā)生和牙本質(zhì)發(fā)生，第一個(gè)軸突進(jìn)入牙乳頭(KollarandLumsden1979a,Lumsden1982,MohamedandAtkinson1983,Pearson1977,Raschkow叢和軸突末端的形成，前牙本質(zhì)和牙本質(zhì)。通過神經(jīng)生長和分支的牙1980)。牙髓基質(zhì)中的一些軸突與血管相關(guān)(Bernick1959,Byers1980,MohamedandAtkinson1982,Wassermann1939)完成功能性咬合后，牙髓軸突在一段時(shí)間內(nèi)繼續(xù)緩慢增加。(Kettunenetal.2007)當(dāng)牙根開始生長，源自上頸神經(jīng)節(jié)的交感神經(jīng)也出現(xiàn)在牙髓。(LuukkoandKettunen2014)牙齒，有些則是跟機(jī)械感覺刺激有關(guān)。從上頸神經(jīng)節(jié)(superiorcervicalganglion)來的交感神經(jīng)主要伴隨著血管且主要與調(diào)節(jié)血管有關(guān)。(LuukkoandKettunen9覺神經(jīng)支配。(Moeetal15(LuukkoandKettunen過了幾年，并且神經(jīng)成熟相應(yīng)緩慢。(Byers1984,FriedandHildebrand1981a,FriedandHildebrand1981bJohnsenandKarlsson1974)量相似。因此，軸突數(shù)量差異可能是次級(jí)差異(JohnsenandKarlsson1974)。直到乳牙開始吸收，齒內(nèi)軸突的發(fā)育解剖結(jié)構(gòu)在初級(jí)和恒牙中大致相似(JohnsenandKarlsson1977,Mohiuddin1950)。然而，在那時(shí)，原發(fā)性牙髓軸突退化，而永久性牙髓軸突繼續(xù)發(fā)展(NaftelQianandBernanke1994)。當(dāng)神經(jīng)生長到牙本質(zhì)的初和根部水平的牙本質(zhì)(Byers1980,Byers1984,Byers,NeuhausandGehrig1982,TaylorandByers1990)。這種轉(zhuǎn)變?nèi)栽诶^續(xù)，最終導(dǎo)致牙齒老化中牙髓軸突的損失。(Hildebrand,SchallerandParsons1995)Schwartz建議神經(jīng)與干細(xì)胞之間可能存在相關(guān)性，因此在神經(jīng)分支數(shù)之間和牙類的數(shù)量，此篇研究了一個(gè)大樣本-3個(gè)月的胎兒闡明神經(jīng)分配發(fā)生在牙齒發(fā)育較晚期。(Winkler,SchwartzandSwindler1991)神經(jīng)有不同種類，例如:無髓鞘，有髓鞘的感覺神經(jīng)和無髓鞘的交感神經(jīng)素神經(jīng)來自上頸椎神經(jīng)節(jié)(Luukkoetal.1997)。(Luukko1997)纖維神經(jīng)位于牙齒基板或牙齒原基下方。(Johnsen1985)(Luukkoetal.1997)。(Luukko1997)1-4IJ-m直徑范圍內(nèi)（3-10IJ-m(Johnsen1985)。根據(jù)研究指出，芽和帽階段，神經(jīng)纖始，當(dāng)神經(jīng)支配相當(dāng)迅速時(shí)，神經(jīng)才進(jìn)入牙乳頭(Dentalpapilla)(MohamedandAtkinson1983)。SerA(Sema)在第一個(gè)牙齒神經(jīng)纖維到達(dá)前在牙齒間質(zhì)中表達(dá)，kvsnddetn0)期階段開始，在發(fā)育中的牙齒上皮附近不存在神經(jīng)纖維。(Luukkoetal.1997,Pearson1977)異。結(jié)論是，神經(jīng)支配在確定牙齒發(fā)育中不起作用。(KollarandLumsden1979b,Pagella,Jimenez-RojoandMitsiadis2014)有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)支配牙髓的組成由兩相?以百計(jì)的軸突從根尖孔進(jìn)入牙齒，為其提供感覺供應(yīng)。神經(jīng)牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體的供應(yīng)主要由A纖維（δ和β）和C纖維組成，根據(jù)它們的直徑和傳導(dǎo)速度 A纖維主要受寒冷刺激，產(chǎn)生劇烈疼痛，而C纖維的刺激會(huì)產(chǎn)生暗沉的疼痛。因?yàn)樗麄兊奈恢煤团帕校珻纖維引起疼痛。(Abd-ElmeguidandYu2009b,Abd-ElmeguidandYu2009a)（DPSCs途(Leeetal.2014)來自人類脫落的乳牙Stemcellsfromhumanexfoliateddeciduous（SHED）的干細(xì)胞高度增殖，具有神經(jīng)嵴細(xì)胞起源(Neural-crestcellorigin)的克隆(Clone)形成和多能干細(xì)胞(Multipotentstemcell)。此外，與其他間質(zhì)干細(xì)胞Mesenchymalstemcells（MSCS）來源相比，其收集具有微創(chuàng)性。因此，脫落的SHED可能是有潛力的治療理想選擇。在這項(xiàng)研究中，脫落的乳牙干細(xì)胞(SHEDs)69歲的孩童酶分解的乳牙髓建立的。經(jīng)由FACS分析評(píng)MSCs，STRO1，CD146，CD45，CD90，CD106和CD166的特征，但不是造血細(xì)胞和內(nèi)皮標(biāo)記，CD34和CD31。潛力。為了進(jìn)一步評(píng)估體外脫落的乳牙干細(xì)胞Stemcellsfromhumanexfoliateddeciduousteeth（SHED）分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能，使用一種簡單的短時(shí)生長因免疫熒光染色和流式細(xì)胞儀分析表明脫落的乳牙干細(xì)胞Stemcellsfromhumanexfoliateddeciduousteeth（SHED）Nestin和?-tubulin，之后表達(dá)中間神經(jīng)標(biāo)記物。此外，Nestin?-Ⅲtubulin和成熟神經(jīng)標(biāo)志物（polysialicacid-neuralcelladhesionmolecule(PSA-NCAM)，Neuronalnuclei(NeuN)，Tau，Tyrosinehydroxylase(TH)Glialfibrillaryacidicprotein(GFAP)）在治療后的強(qiáng)度和百分比顯著增加。(Nourbakhshetal2011)干細(xì)胞分為三大類：胚胎干細(xì)胞Embryonicstemcells（ESCs，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞Inducedpluripotentstemcells（iPSCs）和成人/Adult/postnatalstemcells（ASCs?，F(xiàn)在評(píng)論性文章將注意力集中在成人/ASC上，這些成人/產(chǎn)后干細(xì)胞ASC已經(jīng)被認(rèn)定存在于許多口腔組織如牙髓、牙周組織韌帶、過去十年中，人的牙髓干細(xì)胞hDPSCs由于其可以分化成幾種細(xì)胞表型，在組織領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。這篇評(píng)論仔細(xì)描述了人的牙髓干細(xì)胞hDPSCs分化為力。(Nutietal.2016)cysts（hPCys源性炎癥性囊性病變，含有間葉干細(xì)胞Mesenchymalstemcells（MSCs，具有的間葉干細(xì)胞MSChPCMSCs和牙髓干細(xì)胞和神經(jīng)干/星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)膠質(zhì)纖維酸性蛋白neuralstem-/astrocyte-specificproteinglialfibrillaryacidicprotein（GFAP）在分化前的基礎(chǔ)狀態(tài)表達(dá)神經(jīng)元特異性蛋白β-III微管蛋白(neuron-specificproteinβ-IIItubulin)。(Marrelli,PaduanoandTatullo2015)力(multi-lineagedifferentiationcapacity)，和人牙髓的克隆效益(clonogenic牙髓干細(xì)胞移植的培養(yǎng)物重新建立基質(zhì)樣細(xì)胞(Stromal-linecells)和重新培養(yǎng)移植到免疫功能低下的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生牙本質(zhì)-牙髓樣組織，證明他們的自我更新能力。牙髓干細(xì)胞也是發(fā)現(xiàn)能夠分化成脂肪細(xì)胞和神經(jīng)樣細(xì)胞(neural-likecells)。12個(gè)單個(gè)菌落衍生的牙髓干細(xì)胞株(single-colony-derivedDPSC有干細(xì)胞之特性，包括自我更新能力和可塑性之分化能力。(Gronthosetal.種子細(xì)胞的分化途徑。(Gage2000)子(neurotrophicfactors)。牙髓干細(xì)胞的再生潛力適合被用來研究其在神經(jīng)疾病(Martensetal.神經(jīng)因子Apicalpapilla的干細(xì)胞和牙髓干細(xì)胞分泌蛋白體分泌大量的Brain-derivedneurotrophicfactorBDNF),neurotrophin-3NT-3glialcell-derivedneurotrophicfactor(GDNF),nervegrowthfactor(NGF)和其他許多因子。(Ratajczaketal.2016)神經(jīng)生長因子（GF）是一個(gè)目標(biāo)衍生的營養(yǎng)因子，支持組織中的交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)支配。雖然它的名字看起來只跟神經(jīng)有關(guān)，GF可能具有更廣泛的生物功能，在廣泛的非神經(jīng)元發(fā)育的早期分化細(xì)胞。GF的-依賴于GF與特定的目標(biāo)細(xì)胞上的膜受體初始結(jié)合tsset.9)，被鑒定為對(duì)牙齒發(fā)育中神經(jīng)軸突向目標(biāo)生長的關(guān)鍵分子訊號(hào)；GF調(diào)節(jié)神經(jīng)反應(yīng)，且與蛀牙和創(chuàng)傷有關(guān)。(endagevsCo0)在更進(jìn)階的發(fā)育階段，神經(jīng)生長因子NGF和TrkA是在具有分泌能力的分化細(xì)胞質(zhì)。相比之下，這些分泌細(xì)胞沒有p75NTR，并被限制在牙齒上皮的增殖細(xì)胞中。NGF和p75NTR在人胚胎牙齒內(nèi)與囓齒動(dòng)物中觀察到的相似但不相同。NGFp75NTRandTrkA在牙本質(zhì)生成過程中的表現(xiàn)形態(tài)顯示出NGF在上皮和間質(zhì)細(xì)胞的分化和增殖、牙齒神經(jīng)纖維的生長和吸引有調(diào)節(jié)的角色，NGF并不只有與牙髓軸突向內(nèi)生長有關(guān)。(MitsiadisandPagella2016Nosratetal另外，據(jù)研究上皮間質(zhì)細(xì)胞藉由NGF對(duì)p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體(p75neurotrophicreceptor)（NGFR）作用，促成牙齒發(fā)育相關(guān)的誘導(dǎo)(Mitsiadisetal.1992Byersetal1982)；NGF也存在于成熟的牙髓組織中，參與創(chuàng)傷后的牙髓炎癥反應(yīng)和修復(fù)(ByersWheelerandBothwell1992)。但是，它在牙生理性牙齒磨損具有p75NGF在牙齒中形成細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的一部分，包括發(fā)展，衰老和創(chuàng)傷(ByersSchattemanandBothwell1990Byersetal1992)，并主要在生理和病理生理?xiàng)l件下神經(jīng)纖維的生長和發(fā)芽發(fā)揮調(diào)節(jié)作用(Byersetal1992,Mitsiadisetal.1992)本質(zhì)細(xì)胞中有NGF和NGFR的免疫反應(yīng)性(Byersetal.1990,Luukkoetal.1996,Mitsiadisetal1992)，顯示成牙本質(zhì)細(xì)胞在初級(jí)牙本質(zhì)發(fā)生和成熟組織中控制牙出前后管狀牙本質(zhì)沉積的形成作用及其前后礦化的控制(LindeandGoldberg1993)。神經(jīng)嵴細(xì)胞的衍生(RuchLesotandBegue-Kirn1995)和形成特殊的細(xì)胞屏胞連接起來(Turner,MarfurtandSattelberg1989)。有研究指出NGFR-IR存在于中央牙髓中的神經(jīng)束和亞成牙本質(zhì)區(qū)(pre-定向神經(jīng)發(fā)育變得明顯。因此，牙本質(zhì)母細(xì)胞層的獨(dú)特性質(zhì)與其特殊NGF的表達(dá)可以提示它們對(duì)牙髓細(xì)胞和神經(jīng)供應(yīng)的控制。(Mahdeeetal.2019)神經(jīng)細(xì)胞凋亡期間，在小鼠中發(fā)生在E13-E18(Davies1988)，神經(jīng)元需要較多的NGF用于存活。隨后的成熟期間，感覺神經(jīng)元對(duì)神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的依賴性較小，但在某些情況下它們需要神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(Davies1997,LewinandBarde1996)NGF和BDNF可能參與外周軸突發(fā)芽和再生的調(diào)節(jié)(Diamondetal.1987,Lindsay1988)。在形成牙髓神經(jīng)支配期間和之后，NGF存在于發(fā)育中的大鼠臼齒牙髓中。(Byersetal.1990,Mitsiadisetal.1992,Naftel,ShamssoolariandThueson1992,Nosratetal.1998,Nosratetal.1997)其他幾項(xiàng)研究也得出結(jié)論，NGF對(duì)于牙髓神經(jīng)發(fā)育至關(guān)重要.(Byerset1990Byersetal1992Mitsiadisetal1993Mitsiadisetal1992Nafteletal1994,Nafteletal.1992,QianandNaftel1996)。(Friedetal.2000)神經(jīng)纖維滲入牙髓被認(rèn)為涉及各種神經(jīng)營養(yǎng)因子(Friedetal.2000)，在這之中，神經(jīng)生長因子(NGF)trkA神經(jīng)生長因子缺乏時(shí)，臼齒和門牙牙髓中會(huì)缺乏感覺神經(jīng)。.(Matsuoetal.2001)蛋白(MUC18)CD146蛋白由MCAM基因編碼。(KuskeandJohnsonMCAM作為層粘連蛋白α4的受體起作用，層粘連蛋白α4MCAM由作為血管壁成分的細(xì)胞高度表達(dá)，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞。(Flanaganetal.2012)已經(jīng)證明CD146出現(xiàn)在健康個(gè)體周圍血中的一小部分T和B淋巴細(xì)胞上。CD146+T細(xì)胞顯示與效應(yīng)記憶細(xì)胞一致的免疫表型，并具有與CD146-T(Elshaletal.2007,Elshaletal.2005)胞是分化程度更高且有更限定分化潛力的分化細(xì)胞(Covasetal.2008)CD146是表現(xiàn)效力的細(xì)胞表面標(biāo)記。辨認(rèn)間質(zhì)干細(xì)胞表面表現(xiàn)效力的抗原相當(dāng)?shù)腃D146量。CD146(MCAM,Mel-CAM,S-Endo-1,A32antigen,andMUC18)在多種細(xì)胞上皆有表現(xiàn)(MSCs,endothelialcells,andmelanomacells)且有參與在heterotypicintercellularadhesion。CD146在快速增殖的間質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)量增加，且有三系分化(trilineagedifferentiation)的能力(Russelletal.2010)巢蛋白(Nestin巢蛋白(Nestin)typeVIIntermediatefilament(Gueretteetal2007)，在胚胎形成期，巢蛋白(Nestin)在遷徙和增殖的細(xì)示有多潛力和再生潛力。(Wieseetal.2004)下，在成人中重新誘導(dǎo)巢蛋白表達(dá)，例如在CNS損傷后和損傷的肌肉組織再生期間形成神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕；雖然Nestin巢蛋白(Nestin)是用來當(dāng)增殖和遷徙細(xì)胞的蛋白(Nestin)，表示在調(diào)中間纖維(intermediatefilament)蛋白的集合與分散時(shí)其有較復(fù)雜的身分；同時(shí)也與其他結(jié)構(gòu)性蛋白參與細(xì)胞的重塑。(MichalczykandZiman2005)(Dahlstrand,CollinsandLendahl1992)源，用于治療周圍神經(jīng)損傷。(Hoffman2007)最近發(fā)現(xiàn)NestinNestin是結(jié)直腸癌組織中增殖內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成標(biāo)志物。(Teranishietal.2007)牙髓含有兩種感覺神經(jīng)纖維：有髓（A纖維）和無髓（C纖維。兩者之間存在一些功能重疊，因?yàn)閮煞N纖維類型都可以是傷害感受器。A纖維包括A-β和A-δ纖維。A-β纖維可能比A-δ纖維稍微敏感，但功能上這些纖維在牙髓90A纖維是A-δ纖維。未發(fā)展髓鞘的A纖維。有髓纖維是最后出現(xiàn)在發(fā)展的人類牙髓中的主要結(jié)構(gòu)。有纖維進(jìn)入前期牙本質(zhì)。(BermanandHargreaves2016)GAP-43是細(xì)胞內(nèi)生長相關(guān)蛋白(Growthassociatedprotein-43)支。GAP-43的染色允許在軸突尖端可辨認(rèn)生長錐。更令人驚訝的是，GAP-43也cell)相關(guān)時(shí)，GAP-43表達(dá)在其前驅(qū)細(xì)胞和非髓鞘成熟細(xì)胞。(K?ktenetal.2014a)許旺細(xì)胞中在年輕成體樣本的成牙本質(zhì)下層subodontoblastlayer內(nèi)S100和GAP43的部分共存。而在年紀(jì)較長的成人樣本中，較少的GAP43標(biāo)記在牙本質(zhì)-經(jīng)，免疫和血管成分之間的關(guān)系。許旺細(xì)胞顯示在牙本質(zhì)處-牙髓界面形成突有關(guān)的多細(xì)胞神經(jīng)免疫界面。許旺細(xì)胞表型被S100，膠質(zhì)原纖維酸性蛋白的表達(dá)識(shí)別（GFAP，髓鞘堿性蛋白（MBP，Sox10，GAP43和p75NTR標(biāo)記。通過成牙本質(zhì)細(xì)胞層，進(jìn)入鄰近前牙本質(zhì)/牙本質(zhì)區(qū)域。雖然GAP43p75NTRRaschkow神經(jīng)叢和牙髓中的神經(jīng)束旺細(xì)胞作為牙本質(zhì)-牙髓界面支持它們與感覺神經(jīng)末梢和免疫系統(tǒng)成分的關(guān)聯(lián)etal.2018)使用針對(duì)S100β的抗體檢測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以檢測(cè)許旺細(xì)胞(schwanncell)和膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）以檢測(cè)衛(wèi)星神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。(SJoseFlavioA-Bopp2017)。Gap43是一種有助于監(jiān)測(cè)神經(jīng)元生長和突觸發(fā)生的標(biāo)記物，也反映了特定神經(jīng)元突觸活動(dòng)的特定模式(Rosskothen-KuhlandIlling2014)。GAP-43（F1，B-50或神經(jīng)調(diào)節(jié)素）GAP-43表達(dá)的同樣對(duì)神經(jīng)突向外生長具有深遠(yuǎn)的影響。GAP-43似乎參與轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)和C的磷酸化在這方面尤為重要，并且與神經(jīng)末梢發(fā)芽和長期增強(qiáng)有關(guān)。(BenowitzandRouttenberg1997)(Aartsetal.1998)AM1-43AM1-43是感覺神經(jīng)的優(yōu)秀標(biāo)記物，可用于進(jìn)一步研究牙齒神經(jīng)支配和探索新的鎮(zhèn)痛藥治療牙齒疼痛(Nishikawa2006)AM1-43可以標(biāo)記感覺神經(jīng)纖維和感覺神經(jīng)元。神經(jīng)細(xì)胞膜的非選擇性陽離子通道的滲透是負(fù)責(zé)標(biāo)記的機(jī)制。TRPV2通道，非TRPV1通道，有助于牙髓中AM1-43的熒光標(biāo)記(Nishikawa2008)。體內(nèi)AM1-43的廣泛組織標(biāo)記模式經(jīng)過簡熒光是明亮且特定的;（2）EDTA脫礦之后仍然觀察到熒光和（3）熒光可以薄切片檢查(Nishikawa2006)。有研究使用AM1-43在囓齒動(dòng)物，周緣乳頭(Circumvallatepapilla（CVP）)及其潛在的小唾液腺，根據(jù)這些形態(tài)學(xué)和免疫組化結(jié)果，我們認(rèn)為神經(jīng)支配和細(xì)胞增殖在CVP中的味蕾定位和舌頭中馮埃伯納腺體(VonEbner’sgland(VEG))的分支形態(tài)發(fā)生中起重要作用(Sohnetal.2011)。也有研究使用AM1-43dye在斑馬魚上研究胞吞作用(endocytosis)dye是藉著胞吐胞吞作用的(Waltersetal.2012)。從許多研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)的發(fā)育生成實(shí)驗(yàn)假說實(shí)驗(yàn)?zāi)康奶囟繕?biāo)研究和觀察小鼠牙胚不同階段（P4，P8ICR小鼠）探討牙髓干細(xì)胞在小鼠牙胚不同階段（P4，P8ICR小鼠P1Wistar大鼠）分31以注射法標(biāo)定神經(jīng)纖維分布研究和觀察小鼠牙胚不同階段（P4，P8ICR小鼠）(3-3)的牙齒神經(jīng)支配，使用AM1-43注射的染劑。AM1-43是感覺神經(jīng)的優(yōu)秀標(biāo)記物，可以標(biāo)記感覺神經(jīng)纖維和感覺神經(jīng)元。體內(nèi)AM1-43明亮且特定的;（2）EDTA脫礦之后仍然觀察到熒光和（3）熒光可以薄切片檢查(Nishikawa2006)。ICRmouse1mgmL的濃度溶解在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）AM1-43（Biotium，Hayward，CA，USA;2μgg體重）PBS。注射后一天，藉由吸入二氧化碳（NembutalAbbot，NorthChicago，IL，USA）麻醉動(dòng)物并斷頭處死。解剖下頜骨(3-4)4％多聚甲醛的PBS49-24小時(shí)。3-2ICR33ICRmouse石蠟切片處理方式95%酒精共換三缸，每缸各一小時(shí)，加起來共三小時(shí)；100%酒精共換三缸，每缸各一小時(shí)，加起來共三小時(shí)；接著二甲苯三3分滿，將檢體切面朝下置于包埋模內(nèi)，并留下包埋盒備用。探討牙髓干細(xì)胞在小鼠牙胚不同階段（P4，P8ICR小鼠,PlWistap大560°C2小時(shí)(塑料玻片架24Tpilogy?350?lTpilogyTM（這將在第一染色皿中的處理時(shí)間之后用熱沖洗700毫7（第二容器.5（PBSTBSIHCPBSTBSIHCTpilogy?。現(xiàn)在必須丟棄最Tpilogy?。第二次（熱沖洗）Tpilogy?可Trlgy?3清洗三次，每次五分1§%Normalgoatserum室溫blocking§.5小時(shí)以減少抗體非特2小時(shí)(此步驟開始均需避光)。1XP&3清洗三次，每次五分鐘。以含熒光保護(hù)劑的封片膠耗材：22×22mm24×40的蓋玻片(厚度No.1.5；0.17mm)、76×26mm的載玻片(silaneorpoly-Llysinecoated)、微量吸管(10μl、200μl、1000μl)、1.5ml微量離心管、15ml離心管、10ml吸管、pippette、鑷子、染缸、保濕暗盒、擦手紙、拭鏡紙、冰桶及離心管架、指甲油、1000ml燒杯、1000ml量筒、試劑(廠牌僅供參考Antibodydiluent:10%Normalgoatserum(100%dilutedwith1XBlockingbuffer：10%Normalgoatserum(100%dilutedwith1XProlongGoldAntifadeReagentParaformaldehydeSolution,4%(w/v)inAqueousPhosphateBuffer(Cis-bio:PrimaryNestin:Abcam,ab61421:20-CD146:Abcam,ab75769GAP43:Abcam,ab52918NGF:Abcam,ab52918SecondaryAlexaFluorAbcam,ab150115Abcam,ab150083ZeissLSM510MetaTheimagesofConfocalMicroscopywereacquiredbyZeissLSM510MetaandanalyzedbyLSMImageBrowsersoftware(CarlZEISS,Jena,Germany)CarlZeiss巢蛋白(Nestin)，CD146的免疫熒光染色陽性反應(yīng)面積是由此軟件藉由分析 AM1-43可以標(biāo)記感覺神經(jīng)纖維和感覺神經(jīng)元。神經(jīng)細(xì)胞膜的非選擇性陽離AM1-43標(biāo)記的神經(jīng)纖維在牙胚外，未進(jìn)入牙髓中。出生后八天在牙胚內(nèi)外都有AM1-43標(biāo)記的神經(jīng)纖維，且已進(jìn)入牙髓中。記，細(xì)胞若有這個(gè)標(biāo)記表示有多潛力和再生潛力(Wieseetal.2004)。0.8%(4-5~4-9)。CD146是表現(xiàn)效力的細(xì)胞表面標(biāo)記。辨認(rèn)間質(zhì)干細(xì)胞表面表現(xiàn)效力的抗原CD146在牙胚中微血天的牙胚中結(jié)果顯示CD146在牙胚中微血管內(nèi)皮細(xì)胞和牙胚外微血管內(nèi)皮細(xì)胞4.1%(4-15~4-20)。細(xì)胞內(nèi)生長相關(guān)蛋白Growthassociatedprotein-43(GAP-43)通過整合質(zhì)膜和細(xì)內(nèi)生長相關(guān)蛋白GAP-43的染色允許在軸突尖端可辨認(rèn)生長錐(nervegrowth(dentalfollicle)周圍是免疫染色反應(yīng)陽性(4-21~4-25)。出生后第八天的牙胚43（GAP-43）在牙胚牙囊(dentalfollicle)周圍，牙胚齒生后第八天高不少(4.64倍)。出生后第四天和生后第八天沒有很明顯的差別。神經(jīng)生長錐(Nervegrowthcone)(由生長相關(guān)蛋白(GAP-43)標(biāo)記)在出生后第四天時(shí)在牙胚牙囊(dentalfollicle)外，在出生后第八天除了牙胚牙囊(dentalfollicle)外也可在牙胚齒頸部和牙胚內(nèi)觀察到。(4-1)CD146Positivecontrol組免疫熒光染色是染人類牙髓中的微血管內(nèi)皮細(xì)胞(4-20)Growthassociatedprotein-43(GAP-43)的Positivecontrol組免疫熒光染色是染的人類牙髓中的Raschkowplexus(4-31)41Nestin、CD146、GAP-43、Nerve的P4和P8第五章AM1-43可以標(biāo)記感覺神經(jīng)纖維和感覺神經(jīng)元。神經(jīng)細(xì)胞膜的非選擇性陽離子通道的滲透是負(fù)責(zé)標(biāo)記的機(jī)制。TRPV2通道，非TRPV1通道，有助于牙髓中AM1-43的熒光標(biāo)記。(Nishikawa2008)在本實(shí)驗(yàn)中的出生后四天牙胚中結(jié)果顯示被AM1-43標(biāo)記的神經(jīng)纖維在牙胚外，未進(jìn)入牙髓中。出生后八天在牙胚內(nèi)外都有AM1-43標(biāo)記的神經(jīng)纖維，感覺神經(jīng)纖維中被強(qiáng)烈標(biāo)記，但在牙髓沒有標(biāo)記。出生第七天大鼠的門牙，AM1-43陽性標(biāo)記的纖維沿著血管進(jìn)入牙髓中，且沿著血管。這個(gè)時(shí)候還沒有神(Nishikawa2007)示有多潛力和再生潛力。(Wieseetal.2004)根據(jù)研究指出，出生后第三天的老鼠，在中間層(stratumintermedium)的細(xì)（CI在胚胎牙齒發(fā)育期，小鼠胚胎的牙齒芽（）中，巢蛋白(t首先在增殖的牙板中央核心中檢測(cè)到免疫反應(yīng)性；后來，巢蛋白在未來的內(nèi)部牙齒上皮。巢蛋白免疫染色也在牙乳頭形成時(shí)的凝聚的外胚層中有免疫反應(yīng)性。在E15，巢蛋白(Nestin)（IDE和內(nèi)牙上皮IDE邊緣處之間。外牙上皮的基底膜也是巢蛋白陽性。反應(yīng)性。這個(gè)階段可以觀察到上皮細(xì)胞有很高的免疫反應(yīng)性產(chǎn)后牙齒發(fā)育期3天，巢蛋白(Nestin)表達(dá)發(fā)現(xiàn)于成釉細(xì)胞，中間層SISI細(xì)胞和成釉細(xì)胞均為巢蛋白免疫反應(yīng)陽性，成釉細(xì)胞主要位于其跟端部位。在發(fā)展裂隙中developingfissures，只有中間層(stratumimermedium)顯示巢蛋白(Nestin)免疫標(biāo)記。1228天，牙本質(zhì)母細(xì)胞在仍沒有萌發(fā)下頜臼齒的細(xì)胞層仍是巢蛋蛋白(Nestin)免疫反應(yīng)陽性。(Terlingetal.1995)Nestin是在多系前驅(qū)細(xì)胞上的一個(gè)特色標(biāo)記，細(xì)胞若有這個(gè)標(biāo)記表示有多潛力和再生潛力。(Wieseetal.2004)Nestin免疫反應(yīng)陽性根據(jù)研究指出，出生后第三天的老鼠，在中間層(stratumintermedium)的細(xì)Nestin。延伸到成（CI裂隙中排列的成牙本質(zhì)細(xì)胞顯示出比牙尖中的成牙本質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)更低的免疫反應(yīng)性。中間層(stratumimermedium)是免疫陽性，而成釉細(xì)胞是陰性。出生后第三天的老鼠，Nestin分布僅位于牙髓的成牙本質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。更高的放大倍數(shù)顯示Nestin在成牙本質(zhì)細(xì)胞及其突起，從牙髓延伸到牙本質(zhì)呈現(xiàn)線CD146免疫反應(yīng)陽性的時(shí)間和位置CD146是表現(xiàn)效力的細(xì)胞表面標(biāo)記。辨認(rèn)間質(zhì)干細(xì)胞表面表現(xiàn)效力的抗原較高的CD146量。CD146(MCAM,Mel-CAM,S-Endo-1,A32antigen,andMUC18)在多種細(xì)胞上皆有表現(xiàn)(MSCs,endothelialcells,andmelanomacells)且有參與在heterotypicintercellularadhesion。CD146在快速增殖的間質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)量增加，且有三系分化(trilineagedifferentiation)的能力(Russelletal.2010)。本實(shí)驗(yàn)中出生后四天和八天的牙胚中結(jié)果顯示CD146在牙胚牙髓中微血管根據(jù)研究指出，CD146是內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的標(biāo)記物(K?ktenetal2014b)。干細(xì)胞標(biāo)記物CD146STRO-1和CD146（也是無血管標(biāo)記物）均沿血液表達(dá)。根據(jù)研STRO-1的細(xì)胞（最著名的間質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物，CD146（內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物）和P75（神經(jīng)嵴干細(xì)胞標(biāo)記物。STRO-1和C