奧拉帕利對(duì)單核細(xì)胞介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的調(diào)控機(jī)制：NLRP3炎癥小體的紐帶作用一、引言1.1研究背景與意義1.1.1動(dòng)脈粥樣硬化的危害與研究現(xiàn)狀動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的慢性疾病，是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。其病變特征為動(dòng)脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小，主要累及大動(dòng)脈和中等動(dòng)脈，如冠狀動(dòng)脈、頸動(dòng)脈、腦動(dòng)脈等。當(dāng)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生在冠狀動(dòng)脈時(shí)，可引發(fā)冠心病，導(dǎo)致心絞痛、心肌梗死甚至心源性猝死；發(fā)生在腦血管時(shí)，可導(dǎo)致腦供血不足、腦梗死等嚴(yán)重后果。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，心腦血管疾病是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一，而動(dòng)脈粥樣硬化在其中扮演著關(guān)鍵角色。目前，針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的研究主要集中在其發(fā)病機(jī)制和治療策略上。傳統(tǒng)的治療方法主要包括生活方式干預(yù)（如戒煙限酒、合理飲食、適量運(yùn)動(dòng)）和藥物治療（如他汀類(lèi)藥物調(diào)節(jié)血脂、抗血小板藥物預(yù)防血栓形成等）。然而，盡管這些治療方法在一定程度上能夠延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，但對(duì)于部分患者，尤其是那些存在多種危險(xiǎn)因素或病情較為嚴(yán)重的患者，治療效果仍不盡人意。此外，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞和分子機(jī)制，目前尚未完全明確，這也限制了更有效治療方法的開(kāi)發(fā)。因此，深入研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和策略，具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。1.1.2NLRP3炎癥小體在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用NLRP3（NOD-likereceptorprotein3）炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合物，在先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它主要由NLRP3蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和半胱天冬酶-1（caspase-1）組成。當(dāng)細(xì)胞受到病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）刺激時(shí)，NLRP3被激活，招募ASC并與caspase-1前體結(jié)合，形成NLRP3炎癥小體復(fù)合物。激活的caspase-1進(jìn)而切割并激活促炎細(xì)胞因子白介素-1β（IL-1β）和白介素-18（IL-18），引發(fā)炎癥反應(yīng)。越來(lái)越多的研究表明，NLRP3炎癥小體在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。在動(dòng)脈粥樣硬化早期，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷，釋放DAMPs，激活NLRP3炎癥小體，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的募集和活化，促進(jìn)單核細(xì)胞向血管內(nèi)膜下遷移。單核細(xì)胞在血管內(nèi)膜下分化為巨噬細(xì)胞，吞噬氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），形成泡沫細(xì)胞，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。隨著病情的進(jìn)展，NLRP3炎癥小體的持續(xù)激活導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的大量釋放，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，形成纖維帽，使斑塊逐漸穩(wěn)定。然而，在某些情況下，如炎癥反應(yīng)過(guò)度或斑塊破裂時(shí)，NLRP3炎癥小體的激活會(huì)加劇炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血栓形成和急性心血管事件的發(fā)生。此外，NLRP3炎癥小體的激活還與動(dòng)脈粥樣硬化的其他危險(xiǎn)因素密切相關(guān)，如高血壓、糖尿病、高脂血癥等。這些危險(xiǎn)因素可以通過(guò)不同的機(jī)制激活NLRP3炎癥小體，進(jìn)一步促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。因此，NLRP3炎癥小體作為動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，成為了一個(gè)極具潛力的治療靶點(diǎn)。通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體的活性，有望減輕炎癥反應(yīng)，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，降低心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。1.1.3奧拉帕利的研究進(jìn)展奧拉帕利（Olaparib）是一種多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）抑制劑，最初主要應(yīng)用于腫瘤治療領(lǐng)域。PARP是一類(lèi)參與DNA修復(fù)的酶，在腫瘤細(xì)胞中，PARP的活性通常較高，以維持腫瘤細(xì)胞的生存和增殖。奧拉帕利通過(guò)抑制PARP的活性，阻斷DNA單鏈損傷的修復(fù)，使腫瘤細(xì)胞在DNA復(fù)制過(guò)程中積累雙鏈斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的治療中，奧拉帕利已顯示出顯著的療效，為患者提供了新的治療選擇。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注奧拉帕利在心血管疾病領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，尤其是在動(dòng)脈粥樣硬化方面。一些基礎(chǔ)研究表明，奧拉帕利可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等機(jī)制對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化產(chǎn)生影響。例如，有研究發(fā)現(xiàn)奧拉帕利能夠抑制巨噬細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。此外，奧拉帕利還可能通過(guò)改善內(nèi)皮功能、抑制平滑肌細(xì)胞增殖等途徑，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化起到保護(hù)作用。本研究旨在探討奧拉帕利對(duì)單核細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的影響及其與NLRP3炎癥小體活性的關(guān)系。通過(guò)深入研究這一作用機(jī)制，不僅有助于進(jìn)一步揭示動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)，還可能拓展奧拉帕利的臨床應(yīng)用范圍，為心血管疾病的治療帶來(lái)新的希望。1.2研究目的與問(wèn)題提出本研究旨在深入探討奧拉帕利對(duì)單核細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的具體影響，包括對(duì)單核細(xì)胞黏附、遷移、分化以及炎癥因子分泌等關(guān)鍵生物學(xué)行為的調(diào)控作用。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物模型，系統(tǒng)地觀察奧拉帕利干預(yù)后單核細(xì)胞相關(guān)功能的變化，明確其在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。在明確奧拉帕利對(duì)單核細(xì)胞動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程影響的基礎(chǔ)上，本研究著重探究奧拉帕利與NLRP3炎癥小體活性之間的關(guān)系。具體而言，將研究奧拉帕利是否能夠直接或間接調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的激活，以及這種調(diào)節(jié)作用對(duì)單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的影響。同時(shí)，深入分析奧拉帕利調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體活性的潛在分子機(jī)制，揭示其在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的新作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路?；谏鲜鲅芯磕康模狙芯刻岢鲆韵驴茖W(xué)問(wèn)題：奧拉帕利如何影響單核細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的生物學(xué)行為？奧拉帕利是否通過(guò)調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體活性來(lái)干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展？如果是，其具體的作用機(jī)制是什么？解答這些問(wèn)題對(duì)于深入理解動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。動(dòng)脈粥樣硬化是一種多因素參與的復(fù)雜疾病，單核細(xì)胞在其發(fā)病過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。通過(guò)研究奧拉帕利對(duì)單核細(xì)胞的影響，有望揭示新的治療靶點(diǎn)和干預(yù)策略，為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的思路和方法。NLRP3炎癥小體作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。明確奧拉帕利與NLRP3炎癥小體活性的關(guān)系，不僅有助于深入了解奧拉帕利的作用機(jī)制，還可能為開(kāi)發(fā)基于NLRP3炎癥小體的新型治療藥物提供理論依據(jù)。此外，本研究的結(jié)果還可能拓展奧拉帕利在心血管疾病領(lǐng)域的臨床應(yīng)用范圍，為心血管疾病的治療帶來(lái)新的希望。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)1.3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路本研究采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，深入探究奧拉帕利對(duì)單核細(xì)胞動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程的影響及其與NLRP3炎癥小體活性的關(guān)系。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選用人單核細(xì)胞系THP-1作為研究對(duì)象。該細(xì)胞系在體外培養(yǎng)條件下，能夠模擬體內(nèi)單核細(xì)胞的多種生物學(xué)特性，且易于進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)操作和干預(yù)。將THP-1細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組和奧拉帕利干預(yù)組。對(duì)照組細(xì)胞給予正常的細(xì)胞培養(yǎng)條件，不進(jìn)行任何特殊處理；模型組細(xì)胞則通過(guò)給予氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）刺激，誘導(dǎo)其向動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)表型轉(zhuǎn)化，模擬體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化環(huán)境下單核細(xì)胞的變化；奧拉帕利干預(yù)組在給予ox-LDL刺激的同時(shí)，加入不同濃度的奧拉帕利進(jìn)行處理，以觀察奧拉帕利對(duì)單核細(xì)胞的影響。通過(guò)設(shè)置多個(gè)奧拉帕利濃度梯度，能夠全面分析奧拉帕利作用的劑量依賴(lài)性，為確定其最佳作用濃度提供依據(jù)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，選用載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠作為動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型。ApoE在脂質(zhì)代謝和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，ApoE-/-小鼠由于缺乏ApoE蛋白，導(dǎo)致血脂代謝紊亂，容易自發(fā)形成動(dòng)脈粥樣硬化病變，是目前研究動(dòng)脈粥樣硬化的常用動(dòng)物模型。將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和奧拉帕利治療組。對(duì)照組小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組和奧拉帕利治療組小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，以加速動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成。奧拉帕利治療組小鼠在高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)，給予奧拉帕利灌胃處理，對(duì)照組和模型組小鼠則給予等量的生理鹽水灌胃。通過(guò)對(duì)不同組小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變程度、單核細(xì)胞功能以及NLRP3炎癥小體活性等指標(biāo)的檢測(cè)，深入研究奧拉帕利在體內(nèi)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程的影響。1.3.2技術(shù)路線細(xì)胞培養(yǎng)：將THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)前，將THP-1細(xì)胞用佛波酯（PMA）誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞，以增強(qiáng)其對(duì)ox-LDL的攝取和炎癥反應(yīng)能力。動(dòng)物造模：ApoE-/-小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，開(kāi)始給予高脂飼料喂養(yǎng)，持續(xù)12-16周，以建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。在造模過(guò)程中，定期監(jiān)測(cè)小鼠的體重、血脂水平等指標(biāo)，評(píng)估造模效果。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)：PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）：提取細(xì)胞或組織中的總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用于檢測(cè)NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18等基因的表達(dá)水平。根據(jù)目的基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析條帶的亮度和位置，以半定量的方式評(píng)估基因表達(dá)水平的變化。Westernblot：提取細(xì)胞或組織中的總蛋白，通過(guò)SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上。用特異性抗體孵育PVDF膜，檢測(cè)NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18等蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)化學(xué)發(fā)光法或顯色法使抗體與目的蛋白結(jié)合的條帶顯現(xiàn)，利用圖像分析軟件對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析，以定量的方式評(píng)估蛋白表達(dá)水平的變化。免疫組化技術(shù)：取小鼠主動(dòng)脈組織，進(jìn)行石蠟包埋切片。通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)NLRP3、IL-1β等蛋白在動(dòng)脈組織中的表達(dá)和分布情況。將切片與特異性抗體孵育，然后加入相應(yīng)的二抗和顯色劑，使陽(yáng)性信號(hào)顯色。在顯微鏡下觀察并拍照，分析陽(yáng)性信號(hào)的強(qiáng)度和分布位置，以了解蛋白在組織中的表達(dá)情況。其他檢測(cè)技術(shù)：細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)：將處理后的THP-1細(xì)胞與預(yù)先包被有纖連蛋白的96孔板共孵育，然后通過(guò)結(jié)晶紫染色法檢測(cè)黏附在孔板上的細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估單核細(xì)胞的黏附能力。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：采用Transwell小室法，將處理后的THP-1細(xì)胞加入上室，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時(shí)間后，通過(guò)染色和計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估單核細(xì)胞的遷移能力。血脂檢測(cè)：采集小鼠血液，離心分離血清，利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等血脂指標(biāo)。動(dòng)脈粥樣硬化病變分析：取小鼠主動(dòng)脈組織，進(jìn)行油紅O染色，觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的大小和脂質(zhì)含量；進(jìn)行HE染色，觀察動(dòng)脈血管壁的結(jié)構(gòu)變化和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。1.3.3創(chuàng)新點(diǎn)本研究在研究視角、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究方法上具有一定的創(chuàng)新之處。在研究視角方面，首次聚焦于奧拉帕利對(duì)單核細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的影響，以及其與NLRP3炎癥小體活性的關(guān)系。以往關(guān)于奧拉帕利的研究主要集中在腫瘤治療領(lǐng)域，雖然近年來(lái)有研究開(kāi)始關(guān)注其在心血管疾病方面的應(yīng)用潛力，但針對(duì)單核細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用機(jī)制研究較少。本研究填補(bǔ)了這一領(lǐng)域的空白，為深入理解奧拉帕利在心血管疾病中的作用機(jī)制提供了新的視角。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，本研究采用了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，從體外和體內(nèi)兩個(gè)層面系統(tǒng)地研究奧拉帕利的作用機(jī)制。通過(guò)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中設(shè)置多個(gè)奧拉帕利濃度梯度，全面分析其作用的劑量依賴(lài)性；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)ApoE-/-小鼠進(jìn)行長(zhǎng)期的高脂飼料喂養(yǎng)，建立穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化模型，并給予奧拉帕利灌胃治療，觀察其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病變的影響。這種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能夠更全面、深入地揭示奧拉帕利的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更可靠的理論依據(jù)。在研究方法方面，本研究綜合運(yùn)用了多種先進(jìn)的技術(shù)手段，如PCR、Westernblot、免疫組化等分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，以及細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)等細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，從基因、蛋白和細(xì)胞功能等多個(gè)層面深入研究奧拉帕利的作用機(jī)制。同時(shí)，通過(guò)對(duì)血脂指標(biāo)和動(dòng)脈粥樣硬化病變的分析，全面評(píng)估奧拉帕利對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療效果。這些研究方法的綜合應(yīng)用，提高了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為該領(lǐng)域的研究提供了新的技術(shù)思路。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)有助于推動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制和治療策略的研究進(jìn)展，為開(kāi)發(fā)新的治療藥物和方法提供理論基礎(chǔ)，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制動(dòng)脈粥樣硬化是一種復(fù)雜的慢性疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)方面，受到多種因素的共同作用。傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的起始和推動(dòng)作用，炎癥與免疫機(jī)制貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化的整個(gè)病程，而單核細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。深入了解這些發(fā)病機(jī)制，對(duì)于揭示動(dòng)脈粥樣硬化的本質(zhì)、開(kāi)發(fā)有效的治療策略具有重要意義。2.1.1傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素高血壓是動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素之一。當(dāng)血壓長(zhǎng)期處于升高狀態(tài)時(shí)，血流對(duì)血管壁的側(cè)壓力增大，這種機(jī)械應(yīng)力的增加會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管內(nèi)壁的一層單細(xì)胞屏障，它不僅具有維持血管壁完整性的作用，還參與調(diào)節(jié)血管的舒張和收縮、抑制血小板聚集以及抗血栓形成等重要生理功能。內(nèi)皮細(xì)胞受損后，其正常功能受到破壞，細(xì)胞間連接變得疏松，使得血液中的脂質(zhì)成分，如低密度脂蛋白（LDL）等，更容易進(jìn)入血管內(nèi)膜下。同時(shí)，受損的內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)分泌一系列細(xì)胞因子和黏附分子，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）等，這些物質(zhì)能夠吸引血液中的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向血管內(nèi)膜下遷移，為炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)創(chuàng)造條件。此外，高血壓還可激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS），導(dǎo)致血管緊張素II水平升高。血管緊張素II具有強(qiáng)烈的縮血管作用，可進(jìn)一步加重血管壁的損傷，同時(shí)還能刺激平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。高血脂，尤其是高膽固醇血癥和高甘油三酯血癥，與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)。血液中高水平的LDL是動(dòng)脈粥樣硬化的主要致病因素之一。LDL在血液中運(yùn)輸膽固醇，當(dāng)LDL水平升高時(shí)，其更容易進(jìn)入血管內(nèi)膜下，并在那里被氧化修飾為氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。ox-LDL具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，它可以直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞其正常的生理功能。同時(shí)，ox-LDL還能通過(guò)清道夫受體被單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞大量攝取，巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL后會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞在血管內(nèi)膜下大量堆積，形成早期的動(dòng)脈粥樣硬化病變，即脂紋。隨著病情的發(fā)展，脂紋中的泡沫細(xì)胞會(huì)不斷增多，融合形成更大的脂質(zhì)核心，同時(shí)平滑肌細(xì)胞和纖維組織增生，逐漸形成纖維斑塊和粥樣斑塊。此外，高甘油三酯血癥也與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。富含甘油三酯的脂蛋白，如極低密度脂蛋白（VLDL）及其代謝產(chǎn)物中間密度脂蛋白（IDL），可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，如參與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)障礙、增加炎癥反應(yīng)等。高血糖是糖尿病的主要特征之一，也是動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素。長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)代謝紊亂，引發(fā)一系列病理生理變化。一方面，高血糖會(huì)使血液中的葡萄糖與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等發(fā)生非酶糖化反應(yīng)，形成晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）。AGEs可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，導(dǎo)致炎癥因子的釋放增加，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。另一方面，高血糖還會(huì)引起氧化應(yīng)激增強(qiáng)，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）。ROS可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，降低一氧化氮（NO）的生物利用度，導(dǎo)致血管舒張功能障礙。同時(shí)，ROS還能促進(jìn)LDL的氧化修飾，增加ox-LDL的生成，進(jìn)一步加重動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。此外，糖尿病患者常伴有胰島素抵抗和高胰島素血癥，胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，高胰島素血癥則可刺激平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，這些都有助于動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。除了高血壓、高血脂和高血糖外，吸煙、肥胖、缺乏運(yùn)動(dòng)等因素也與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)。吸煙時(shí)，煙霧中的尼古丁、焦油等有害物質(zhì)可以直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。同時(shí)，吸煙還能使血液中的一氧化碳含量增加，導(dǎo)致血紅蛋白攜氧能力下降，組織缺氧，進(jìn)一步加重血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。肥胖患者體內(nèi)脂肪堆積過(guò)多，常伴有代謝綜合征，如胰島素抵抗、高血脂、高血壓等，這些因素相互作用，共同促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。缺乏運(yùn)動(dòng)則會(huì)導(dǎo)致身體代謝率降低，脂肪堆積，血脂升高，同時(shí)還會(huì)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，增加動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。2.1.2炎癥與免疫機(jī)制炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著核心作用，貫穿于疾病的各個(gè)階段。在動(dòng)脈粥樣硬化的早期，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素（如高血壓、高血脂、高血糖等）或病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）、損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）的刺激后，會(huì)發(fā)生功能障礙，表達(dá)多種黏附分子，如E-選擇素、P-選擇素、VCAM-1和細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）等。這些黏附分子能夠與血液中的炎癥細(xì)胞表面的相應(yīng)配體結(jié)合，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞向血管內(nèi)皮的黏附和滾動(dòng)，隨后炎癥細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞間隙遷移到血管內(nèi)膜下。其中，單核細(xì)胞是最早遷移到血管內(nèi)膜下的炎癥細(xì)胞之一，它在趨化因子（如MCP-1）的作用下，穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層進(jìn)入內(nèi)膜下組織，并分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過(guò)表面的清道夫受體、Toll樣受體（TLRs）等識(shí)別并攝取ox-LDL，逐漸轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞的形成是動(dòng)脈粥樣硬化早期病變的重要標(biāo)志，它不僅會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)在血管內(nèi)膜下的堆積，還會(huì)釋放大量的炎癥因子和細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等，進(jìn)一步招募更多的炎癥細(xì)胞，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。隨著動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，炎癥反應(yīng)持續(xù)存在并不斷加劇。T淋巴細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用?；罨腡淋巴細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等，這些細(xì)胞因子可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬能力和炎癥因子的分泌，同時(shí)還能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。此外，T淋巴細(xì)胞還可以通過(guò)細(xì)胞毒性作用直接損傷血管壁細(xì)胞，參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。B淋巴細(xì)胞也參與了動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥過(guò)程，它可以產(chǎn)生抗體，與ox-LDL等抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成過(guò)程中，炎癥細(xì)胞釋放的蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，會(huì)降解血管壁的細(xì)胞外基質(zhì)，包括膠原蛋白、彈性纖維等，導(dǎo)致纖維帽變薄、變?nèi)酢Ｍ瑫r(shí)，炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子，如TNF-α、IL-1β等，還可以抑制平滑肌細(xì)胞合成膠原蛋白，進(jìn)一步削弱纖維帽的強(qiáng)度。當(dāng)纖維帽無(wú)法承受血流的壓力時(shí)，就會(huì)發(fā)生破裂，暴露斑塊內(nèi)的脂質(zhì)和促凝物質(zhì)，激活血小板聚集和凝血系統(tǒng)，形成血栓。血栓的形成會(huì)導(dǎo)致血管急性阻塞，引發(fā)急性心血管事件，如心肌梗死、腦卒中等。免疫調(diào)節(jié)失衡在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中也具有重要意義。正常情況下，機(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠維持平衡，對(duì)自身組織和外來(lái)病原體進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別和應(yīng)答。然而，在動(dòng)脈粥樣硬化患者中，免疫調(diào)節(jié)機(jī)制出現(xiàn)異常，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對(duì)血管壁成分產(chǎn)生過(guò)度的免疫反應(yīng)。例如，自身抗體的產(chǎn)生增加，它們可以與血管壁的抗原結(jié)合，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，引發(fā)炎癥反應(yīng)。此外，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）數(shù)量和功能的異常也與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Treg具有抑制免疫反應(yīng)的作用，在動(dòng)脈粥樣硬化患者中，Treg的數(shù)量減少或功能受損，無(wú)法有效抑制炎癥細(xì)胞的活化和增殖，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。2.1.3單核細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用單核細(xì)胞是血液中的一種白細(xì)胞，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。在生理狀態(tài)下，單核細(xì)胞在骨髓中生成，然后進(jìn)入血液循環(huán)，在血液中停留一段時(shí)間后，可遷移到組織中，分化為巨噬細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞，參與免疫防御和組織修復(fù)等過(guò)程。在動(dòng)脈粥樣硬化的早期，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時(shí)，會(huì)分泌多種趨化因子，其中MCP-1是最重要的單核細(xì)胞趨化因子之一。MCP-1通過(guò)與單核細(xì)胞表面的CC趨化因子受體2（CCR2）結(jié)合，介導(dǎo)單核細(xì)胞從血液循環(huán)中向血管內(nèi)膜下遷移。單核細(xì)胞穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞間隙進(jìn)入內(nèi)膜下后，在局部微環(huán)境的作用下，逐漸分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬能力，它可以通過(guò)表面的清道夫受體（如SR-A、CD36等）、Fc受體和TLRs等識(shí)別并攝取ox-LDL。清道夫受體對(duì)ox-LDL具有高度親和力，且不受細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的反饋調(diào)節(jié)，因此巨噬細(xì)胞可以不斷攝取ox-LDL，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)大量堆積，逐漸轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化早期病變的主要細(xì)胞成分，它的形成標(biāo)志著動(dòng)脈粥樣硬化的開(kāi)始。隨著病情的發(fā)展，泡沫細(xì)胞會(huì)不斷增多，它們可以相互融合，形成更大的脂質(zhì)核心。同時(shí)，泡沫細(xì)胞還會(huì)釋放大量的炎癥因子和細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1等，進(jìn)一步招募更多的單核細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞，加劇炎癥反應(yīng)。除了吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞外，巨噬細(xì)胞還參與了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)。巨噬細(xì)胞可以通過(guò)分泌炎癥因子，激活其他炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大。例如，巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α可以激活內(nèi)皮細(xì)胞，使其表達(dá)更多的黏附分子，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的黏附和遷移；IL-1β可以刺激平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。此外，巨噬細(xì)胞還可以作為抗原呈遞細(xì)胞，將攝取的ox-LDL等抗原加工處理后，呈遞給T淋巴細(xì)胞，激活T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，進(jìn)一步調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展過(guò)程中，巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)也會(huì)發(fā)生變化。根據(jù)其分泌的細(xì)胞因子和功能特點(diǎn)，巨噬細(xì)胞可分為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞（M1型）和替代活化的巨噬細(xì)胞（M2型）。M1型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，具有較強(qiáng)的殺菌和促炎作用，在動(dòng)脈粥樣硬化的早期和進(jìn)展期，M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量增多，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和斑塊的發(fā)展。而M2型巨噬細(xì)胞主要分泌抗炎細(xì)胞因子，如IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等，具有抗炎和組織修復(fù)的功能。在動(dòng)脈粥樣硬化的后期，M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)增加，有助于減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)斑塊的穩(wěn)定。然而，在某些情況下，如炎癥反應(yīng)過(guò)度或斑塊破裂時(shí)，M2型巨噬細(xì)胞的功能可能會(huì)受到抑制，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，增加心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。單核細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中從血液循環(huán)中招募到血管內(nèi)膜下，轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞并吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，通過(guò)分泌炎癥因子和參與免疫調(diào)節(jié)等方式，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成、發(fā)展和穩(wěn)定性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。深入研究單核細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用機(jī)制，對(duì)于揭示動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。2.2NLRP3炎癥小體的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1NLRP3炎癥小體的組成與激活機(jī)制NLRP3炎癥小體是一種重要的多蛋白復(fù)合物，在機(jī)體的先天免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其主要由NLRP3蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和半胱天冬酶-1（caspase-1）組成。NLRP3蛋白屬于NOD樣受體（NLR）家族，具有三個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：N端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域（PYD），負(fù)責(zé)與ASC的PYD結(jié)構(gòu)域相互作用，從而招募ASC；中間的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（NACHT），具有ATP酶活性，參與NLRP3的激活和寡聚化；C端的富含亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（LRR），主要用于識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），感知細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，LRR結(jié)構(gòu)域首先識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的配體，從而觸發(fā)NLRP3蛋白的構(gòu)象變化，使其N(xiāo)ACHT結(jié)構(gòu)域的ATP酶活性被激活，水解ATP，導(dǎo)致NLRP3發(fā)生寡聚化。ASC是一種接頭蛋白，它含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端的PYD結(jié)構(gòu)域和C端的半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域（CARD）。在NLRP3炎癥小體激活過(guò)程中，ASC通過(guò)其PYD結(jié)構(gòu)域與NLRP3的PYD結(jié)構(gòu)域相互作用，被招募到NLRP3寡聚體上。隨后，ASC通過(guò)其CARD結(jié)構(gòu)域與caspase-1前體的CARD結(jié)構(gòu)域相互作用，將caspase-1前體募集到NLRP3炎癥小體復(fù)合物中。caspase-1是一種半胱氨酸蛋白酶，在NLRP3炎癥小體中以無(wú)活性的前體形式存在。當(dāng)caspase-1前體被招募到NLRP3炎癥小體復(fù)合物中后，在NLRP3和ASC的作用下，caspase-1前體發(fā)生自我切割，從而激活為具有活性的caspase-1。激活的caspase-1能夠特異性地切割并激活促炎細(xì)胞因子白介素-1β（IL-1β）和白介素-18（IL-18）的前體，使其轉(zhuǎn)化為具有生物活性的成熟形式，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)。NLRP3炎癥小體的激活主要遵循雙信號(hào)模型，即啟動(dòng)信號(hào)（signal1）和激活信號(hào)（signal2）。啟動(dòng)信號(hào)主要由Toll樣受體（TLRs）等模式識(shí)別受體識(shí)別PAMPs或DAMPs后，通過(guò)髓樣分化因子88（MyD88）依賴(lài)的信號(hào)通路激活核因子κB（NF-κB），促進(jìn)NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18等炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。這一過(guò)程使得細(xì)胞內(nèi)的炎癥相關(guān)蛋白水平升高，為NLRP3炎癥小體的激活做好準(zhǔn)備。常見(jiàn)的啟動(dòng)信號(hào)刺激物包括脂多糖（LPS）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。激活信號(hào)則是在細(xì)胞受到特定刺激后，通過(guò)多種機(jī)制激活NLRP3。目前研究認(rèn)為，激活信號(hào)的機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括以下幾種途徑：鉀離子外流是NLRP3激活的重要機(jī)制之一。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，細(xì)胞膜上的離子通道開(kāi)放，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鉀離子外流。鉀離子外流可引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化，從而激活NLRP3。線粒體功能障礙也是激活NLRP3的重要途徑。當(dāng)細(xì)胞受到損傷或應(yīng)激時(shí)，線粒體可產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）。ROS可以損傷線粒體膜，導(dǎo)致線粒體釋放一些損傷相關(guān)分子，如線粒體DNA（mtDNA）、線粒體ROS等，這些物質(zhì)可以激活NLRP3。此外，溶酶體損傷也與NLRP3的激活有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞攝入一些病原體或顆粒物質(zhì)時(shí)，這些物質(zhì)可被吞噬到溶酶體中。如果溶酶體受到損傷，其內(nèi)部的蛋白酶等物質(zhì)會(huì)釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活NLRP3。NLRP3炎癥小體通過(guò)其特定的分子組成和復(fù)雜的激活機(jī)制，在細(xì)胞受到病原體感染或損傷時(shí)，能夠迅速激活，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)機(jī)體免受外界病原體的侵害。然而，過(guò)度激活的NLRP3炎癥小體也可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，引發(fā)一系列炎癥相關(guān)疾病。2.2.2NLRP3炎癥小體在炎癥反應(yīng)中的作用NLRP3炎癥小體激活后，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著核心作用，主要通過(guò)對(duì)炎癥因子IL-1β和IL-18的加工和釋放，以及引發(fā)細(xì)胞焦亡等方式，介導(dǎo)和放大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。IL-1β和IL-18是兩種重要的促炎細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中具有廣泛的生物學(xué)活性。在正常情況下，IL-1β和IL-18以無(wú)活性的前體形式（pro-IL-1β和pro-IL-18）存在于細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)NLRP3炎癥小體被激活后，caspase-1被招募并活化，活化的caspase-1能夠特異性地識(shí)別并切割pro-IL-1β和pro-IL-18，去除它們的N端前肽序列，使其轉(zhuǎn)化為具有生物活性的成熟形式（IL-1β和IL-18）。成熟的IL-1β和IL-18隨后被釋放到細(xì)胞外，與靶細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。IL-1β具有強(qiáng)大的促炎作用，它可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，如E-選擇素、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）和細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）等，促進(jìn)炎癥細(xì)胞（如單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等）的黏附和遷移，使其從血液循環(huán)中進(jìn)入組織炎癥部位。IL-1β還可以激活巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)它們的免疫活性，促進(jìn)炎癥因子（如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6等）的分泌，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。此外，IL-1β還參與了發(fā)熱、急性期反應(yīng)等生理病理過(guò)程，對(duì)機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)具有重要影響。IL-18也是一種重要的促炎細(xì)胞因子，它可以誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ（IFN-γ），增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其吞噬和殺傷病原體的能力，同時(shí)還可以抑制病毒的復(fù)制和感染。此外，IL-18還可以與IL-12協(xié)同作用，促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和增殖，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡。在炎癥反應(yīng)中，IL-18的釋放可以進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷和功能障礙。除了加工和釋放IL-1β和IL-18外，NLRP3炎癥小體激活還可以引發(fā)細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，具有獨(dú)特的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征。在NLRP3炎癥小體激活過(guò)程中，caspase-1不僅可以切割pro-IL-1β和pro-IL-18，還可以切割gasderminD（GSDMD）。GSDMD被切割后，其N(xiāo)端結(jié)構(gòu)域會(huì)形成孔道，插入細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)容物釋放，最終引起細(xì)胞腫脹、破裂，發(fā)生細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡過(guò)程中釋放的細(xì)胞內(nèi)容物，如炎癥因子、損傷相關(guān)分子模式等，會(huì)進(jìn)一步激活炎癥反應(yīng)，吸引更多的炎癥細(xì)胞聚集到炎癥部位，加劇炎癥損傷。NLRP3炎癥小體激活后對(duì)IL-1β和IL-18的加工和釋放，以及引發(fā)的細(xì)胞焦亡，在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起到了關(guān)鍵的放大作用。這些過(guò)程相互關(guān)聯(lián)、相互影響，共同促進(jìn)了炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。NLRP3炎癥小體作為炎癥調(diào)控中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，其異常激活與多種炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此，深入研究NLRP3炎癥小體在炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)針對(duì)炎癥相關(guān)疾病的治療策略具有重要意義。2.2.3NLRP3炎癥小體與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)聯(lián)研究進(jìn)展近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明NLRP3炎癥小體在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，其與動(dòng)脈粥樣硬化的各個(gè)階段都存在密切關(guān)聯(lián)。在動(dòng)脈粥樣硬化的起始階段，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到多種危險(xiǎn)因素（如高血壓、高血脂、高血糖、吸煙等）的刺激，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。受損的內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)釋放損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），如熱休克蛋白（HSPs）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等，這些DAMPs可以激活NLRP3炎癥小體。同時(shí)，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）在血管內(nèi)膜下的堆積也可通過(guò)多種途徑激活NLRP3炎癥小體。NLRP3炎癥小體激活后，促使炎癥細(xì)胞（如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）的募集和活化，引發(fā)炎癥反應(yīng)。單核細(xì)胞在趨化因子（如單核細(xì)胞趨化蛋白-1，MCP-1）的作用下，遷移到血管內(nèi)膜下，分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過(guò)表面的清道夫受體攝取ox-LDL，逐漸轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，這是動(dòng)脈粥樣硬化早期病變的重要特征。隨著動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，NLRP3炎癥小體持續(xù)激活，炎癥反應(yīng)不斷加劇。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，巨噬細(xì)胞是NLRP3炎癥小體的主要表達(dá)細(xì)胞。激活的NLRP3炎癥小體促進(jìn)炎癥因子（如IL-1β、IL-18等）的釋放，這些炎癥因子可以刺激平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，導(dǎo)致血管壁增厚，同時(shí)還能促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性。MMPs可以降解血管壁的細(xì)胞外基質(zhì)，包括膠原蛋白、彈性纖維等，使得纖維帽變薄、變?nèi)?，從而增加了斑塊的不穩(wěn)定性。此外，炎癥因子還可以抑制平滑肌細(xì)胞合成膠原蛋白，進(jìn)一步削弱纖維帽的強(qiáng)度。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂階段，NLRP3炎癥小體的激活也起到了關(guān)鍵作用。當(dāng)斑塊纖維帽無(wú)法承受血流的壓力而破裂時(shí)，暴露的脂質(zhì)和促凝物質(zhì)會(huì)激活血小板聚集和凝血系統(tǒng)，形成血栓。NLRP3炎癥小體激活后釋放的炎癥因子，如IL-1β等，可以進(jìn)一步激活血小板和凝血因子，促進(jìn)血栓的形成。同時(shí)，炎癥反應(yīng)的加劇還會(huì)導(dǎo)致血管痙攣，進(jìn)一步加重血管阻塞，引發(fā)急性心血管事件，如心肌梗死、腦卒中等。目前關(guān)于NLRP3炎癥小體與動(dòng)脈粥樣硬化的研究仍存在一些不足之處。雖然大量研究表明NLRP3炎癥小體在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用，但對(duì)于其具體的激活機(jī)制和信號(hào)通路，仍有許多細(xì)節(jié)尚未完全明確。不同的刺激因素（如PAMPs、DAMPs、ox-LDL等）如何協(xié)同作用激活NLRP3炎癥小體，以及NLRP3炎癥小體與其他炎癥相關(guān)信號(hào)通路之間的相互關(guān)系，還需要進(jìn)一步深入研究。目前針對(duì)NLRP3炎癥小體的干預(yù)研究大多處于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段，將其轉(zhuǎn)化為臨床治療策略還面臨諸多挑戰(zhàn)。如何開(kāi)發(fā)安全有效的NLRP3炎癥小體抑制劑，以及如何選擇合適的患者群體進(jìn)行靶向治療，都需要進(jìn)一步探索。未來(lái)的研究方向可以從以下幾個(gè)方面展開(kāi)。深入研究NLRP3炎癥小體在動(dòng)脈粥樣硬化不同階段的精準(zhǔn)調(diào)控機(jī)制，明確其關(guān)鍵作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為開(kāi)發(fā)更具針對(duì)性的治療藥物提供理論依據(jù)。加強(qiáng)NLRP3炎癥小體與其他動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因素（如脂質(zhì)代謝、內(nèi)皮功能、免疫調(diào)節(jié)等）之間相互作用的研究，全面揭示動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制。開(kāi)展多中心、大樣本的臨床研究，評(píng)估NLRP3炎癥小體抑制劑在動(dòng)脈粥樣硬化治療中的安全性和有效性，推動(dòng)其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。NLRP3炎癥小體與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)聯(lián)密切，深入研究其作用機(jī)制和干預(yù)策略，對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的防治具有重要的理論和臨床意義。通過(guò)不斷完善相關(guān)研究，有望為動(dòng)脈粥樣硬化的治療開(kāi)辟新的途徑。2.3奧拉帕利的作用機(jī)制與相關(guān)研究2.3.1奧拉帕利的基本作用機(jī)制奧拉帕利作為一種多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）抑制劑，其作用機(jī)制主要圍繞對(duì)DNA損傷修復(fù)過(guò)程的干預(yù)展開(kāi)。PARP家族是一類(lèi)在DNA損傷修復(fù)和維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶。在細(xì)胞內(nèi)，PARP能夠識(shí)別并結(jié)合到DNA單鏈斷裂處，通過(guò)催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的裂解，將二磷酸腺苷核糖（ADP-ribose）聚合到自身以及其他蛋白質(zhì)上，形成聚（ADP-ribose）聚合物（PAR）。這一過(guò)程招募了一系列參與DNA修復(fù)的蛋白質(zhì)，啟動(dòng)DNA單鏈損傷的修復(fù)機(jī)制。奧拉帕利能夠特異性地抑制PARP的活性，當(dāng)PARP與DNA單鏈斷裂結(jié)合后，奧拉帕利會(huì)緊密結(jié)合到PARP上，阻止其催化ADP-ribose的聚合，從而阻斷了DNA單鏈損傷的修復(fù)。在正常細(xì)胞中，DNA雙鏈斷裂可以通過(guò)同源重組修復(fù)（HRR）途徑進(jìn)行精確修復(fù)。然而，在某些腫瘤細(xì)胞中，特別是攜帶BRCA1或BRCA2基因突變的腫瘤細(xì)胞，HRR途徑存在缺陷。當(dāng)這些腫瘤細(xì)胞的DNA單鏈損傷修復(fù)被奧拉帕利阻斷后，在DNA復(fù)制過(guò)程中，單鏈斷裂會(huì)轉(zhuǎn)化為雙鏈斷裂，由于HRR途徑無(wú)法正常發(fā)揮作用，腫瘤細(xì)胞無(wú)法有效修復(fù)雙鏈斷裂，導(dǎo)致DNA損傷不斷積累，最終引發(fā)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。這種利用腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)缺陷，通過(guò)抑制PARP活性來(lái)選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制，被稱(chēng)為“合成致死”效應(yīng)。奧拉帕利正是基于這一原理，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出顯著的療效。它能夠針對(duì)攜帶BRCA基因突變的卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞，有效抑制其生長(zhǎng)和增殖。在卵巢癌治療中，奧拉帕利用于維持治療，可以顯著延長(zhǎng)患者的無(wú)進(jìn)展生存期，降低疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于BRCA突變的乳腺癌患者，奧拉帕利也顯示出較好的抗腫瘤活性，為這類(lèi)患者提供了新的治療選擇。奧拉帕利作為PARP抑制劑，通過(guò)抑制PARP酶活性，干擾DNA損傷修復(fù)過(guò)程，利用“合成致死”效應(yīng)選擇性地殺死攜帶特定基因突變的腫瘤細(xì)胞，在腫瘤治療中具有重要的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用價(jià)值。2.3.2奧拉帕利在心血管領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀近年來(lái)，奧拉帕利在心血管領(lǐng)域的研究逐漸受到關(guān)注，雖然相關(guān)研究相對(duì)較少，但已取得了一些有意義的成果。在心肌缺血再灌注損傷方面，多項(xiàng)研究表明奧拉帕利具有一定的保護(hù)作用。心肌缺血再灌注損傷是指心肌在短暫缺血后恢復(fù)血流灌注時(shí)，反而出現(xiàn)更嚴(yán)重的損傷，包括心肌細(xì)胞凋亡、壞死、炎癥反應(yīng)加劇以及心臟功能受損等。研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注損傷模型中，奧拉帕利能夠通過(guò)抑制PARP的過(guò)度激活，減少因DNA損傷導(dǎo)致的細(xì)胞死亡信號(hào)通路的激活。PARP在心肌缺血再灌注過(guò)程中會(huì)被過(guò)度激活，消耗大量的NAD+，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。奧拉帕利抑制PARP活性后，可減少NAD+的消耗，維持細(xì)胞的能量代謝，從而減輕心肌細(xì)胞的損傷。奧拉帕利還可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的釋放，抑制中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)一步減輕心肌缺血再灌注損傷。在動(dòng)脈粥樣硬化研究方面，雖然目前關(guān)于奧拉帕利的直接研究相對(duì)較少，但已有研究從理論和間接證據(jù)上推測(cè)其可能具有潛在的作用。如前文所述，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能障礙以及單核細(xì)胞的活化和遷移等密切相關(guān)。奧拉帕利作為PARP抑制劑，可能通過(guò)以下途徑對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化產(chǎn)生影響。抑制PARP活性可以減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA損傷，從而減輕細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）等因素會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），引起DNA損傷，激活PARP。奧拉帕利抑制PARP后，可阻斷這一炎癥信號(hào)通路的激活，減少炎癥因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α等）的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。奧拉帕利還可能通過(guò)改善內(nèi)皮功能，促進(jìn)一氧化氮（NO）的釋放，維持血管的舒張功能，抑制單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，減少單核細(xì)胞向血管內(nèi)膜下的遷移，進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。盡管奧拉帕利在心血管領(lǐng)域的研究還處于起步階段，但其在心肌缺血再灌注損傷保護(hù)方面的研究成果，以及在動(dòng)脈粥樣硬化治療上的潛在作用，為進(jìn)一步探索其在心血管疾病治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)和研究方向。本研究正是基于奧拉帕利在心血管領(lǐng)域的這些潛在作用，深入探討其對(duì)單核細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的影響及其與NLRP3炎癥小體活性的關(guān)系，以期為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供新的思路和方法。三、奧拉帕利對(duì)單核細(xì)胞動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程的影響3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)選用人單核細(xì)胞系THP-1作為研究對(duì)象，該細(xì)胞系來(lái)源于急性單核細(xì)胞白血病患者的外周血，具有單核細(xì)胞的典型特征，且在體外易于培養(yǎng)和操作，廣泛應(yīng)用于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相關(guān)機(jī)制、信號(hào)通路等研究。THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素（P/S）的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境設(shè)定為37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，需密切留意細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。THP-1細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，部分細(xì)胞聚集成團(tuán)，部分細(xì)胞分散。因其對(duì)酸性環(huán)境較為偏好，當(dāng)培養(yǎng)基顏色稍微變黃（呈橘紅色）時(shí)，表明此時(shí)的環(huán)境適宜細(xì)胞生長(zhǎng)，可進(jìn)行補(bǔ)液或半換液操作。此外，THP-1細(xì)胞存在密度依賴(lài)性，當(dāng)細(xì)胞密度較低時(shí)，生長(zhǎng)速度較慢，培養(yǎng)密度應(yīng)維持在4×10?-8×10?/mL為宜；若超過(guò)2.0×10?/mL，則需進(jìn)行傳代。同時(shí)，細(xì)胞對(duì)機(jī)械力較為敏感，正常培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)盡量避免過(guò)度吹打，以免因暴力吹打?qū)е录?xì)胞分化和死細(xì)胞數(shù)量增加。血清質(zhì)量的差異也可能引起細(xì)胞狀態(tài)的變化，因此建議選用高質(zhì)量的胎牛血清。為誘導(dǎo)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入含100nmol/L佛波酯（PMA）的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育48h。誘導(dǎo)完成后，顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，由圓形的懸浮細(xì)胞逐漸變?yōu)橘N壁生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞體積增大，伸出偽足，表明分化成功。分化后的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以研究奧拉帕利對(duì)單核細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的影響。3.1.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)本研究選擇載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠作為動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型。ApoE在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，ApoE-/-小鼠因缺乏ApoE蛋白，導(dǎo)致血脂代謝紊亂，易自發(fā)形成動(dòng)脈粥樣硬化病變，是目前研究動(dòng)脈粥樣硬化的常用動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)自[供應(yīng)商名稱(chēng)]，飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±5）%的無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房，保持12h光照、12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，開(kāi)始進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化模型的構(gòu)建。采用高脂飼料喂養(yǎng)的方法構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型。給予ApoE-/-小鼠高脂飼料（含21%脂肪、0.15%膽固醇）喂養(yǎng)，持續(xù)12-16周。在造模過(guò)程中，每周監(jiān)測(cè)小鼠的體重，每4周采集小鼠尾靜脈血，利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等血脂指標(biāo)，以評(píng)估造模效果。隨著高脂飼料喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠體重逐漸增加，血脂水平顯著升高，尤其是TC和LDL-C水平明顯上升，表明動(dòng)脈粥樣硬化模型構(gòu)建成功。將成功構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型的ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和奧拉帕利治療組，每組[具體數(shù)量]只。奧拉帕利治療組小鼠給予奧拉帕利（[具體劑量]mg/kg/d）灌胃處理，對(duì)照組和模型組小鼠則給予等量的生理鹽水灌胃。灌胃治療持續(xù)[具體時(shí)間]周，期間密切觀察小鼠的一般狀況，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠處死，取主動(dòng)脈組織用于后續(xù)檢測(cè)，以研究奧拉帕利對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病變的影響。3.1.3檢測(cè)指標(biāo)與方法油紅O染色檢測(cè)脂質(zhì)沉積：取小鼠主動(dòng)脈組織，用4%多聚甲醛固定后，進(jìn)行冰凍切片，厚度為6-10μm。將切片依次用60%異丙醇浸泡2min、蒸餾水稍洗、改良油紅O染色液避光染色10-15min。染色結(jié)束后，用蒸餾水清洗，再用60%異丙醇稍洗以去除多余染液，最后用Mayer蘇木素染色液復(fù)染細(xì)胞核5min。用濾紙吸干水分，甘油明膠封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。油紅O染色原理是其作為一種脂溶性染料，能特異性地與組織和細(xì)胞內(nèi)的中性甘油三脂、脂質(zhì)以及脂蛋白產(chǎn)生吸附作用，使脂肪染成紅色。通過(guò)圖像分析軟件測(cè)量動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)脂質(zhì)面積占整個(gè)血管橫截面積的比例，以此評(píng)估脂質(zhì)沉積程度。免疫熒光染色檢測(cè)炎癥因子表達(dá)：取主動(dòng)脈冰凍切片，用0.3%TritonX-100通透15min，5%牛血清白蛋白（BSA）封閉1h。分別加入抗IL-1β、抗TNF-α等炎癥因子的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min，加入相應(yīng)的熒光二抗，室溫避光孵育1h。再次用PBS洗滌后，DAPI染核5min，最后用抗熒光淬滅封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，通過(guò)分析熒光強(qiáng)度來(lái)半定量評(píng)估炎癥因子的表達(dá)水平。免疫熒光染色原理是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特性，通過(guò)熒光標(biāo)記的二抗檢測(cè)一抗結(jié)合的位置，從而確定炎癥因子在組織中的表達(dá)和分布。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×10?/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。再加入400μLBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理是AnnexinV能與凋亡早期細(xì)胞膜上外翻的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，PI可穿透死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。通過(guò)分析AnnexinV-FITC和PI雙染的細(xì)胞比例，可區(qū)分正常細(xì)胞、凋亡早期細(xì)胞、凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞。PCR檢測(cè)基因表達(dá)：提取細(xì)胞或組織中的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸30s，共35-40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析條帶的亮度和位置，以β-actin作為內(nèi)參，通過(guò)比較目的基因與內(nèi)參基因條帶的灰度值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。PCR檢測(cè)基因表達(dá)的原理是利用DNA聚合酶在體外擴(kuò)增特定的DNA片段，通過(guò)引物的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的擴(kuò)增和檢測(cè)。Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)：提取細(xì)胞或組織中的總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，加入一抗（如抗NLRP3、抗ASC、抗caspase-1等），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌后，采用化學(xué)發(fā)光法使抗體與目的蛋白結(jié)合的條帶顯現(xiàn)，利用圖像分析軟件對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)的原理是通過(guò)電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后利用抗原抗體特異性結(jié)合的特性，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。3.2奧拉帕利對(duì)單核細(xì)胞功能的影響3.2.1對(duì)單核細(xì)胞黏附與遷移的影響在動(dòng)脈粥樣硬化的起始階段，單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附以及隨后的遷移進(jìn)入血管內(nèi)膜下是關(guān)鍵步驟。為探究奧拉帕利對(duì)這一過(guò)程的影響，本研究進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，將THP-1細(xì)胞經(jīng)不同濃度奧拉帕利預(yù)處理后，與經(jīng)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）共培養(yǎng)。通過(guò)細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，TNF-α刺激顯著增加了單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力，而奧拉帕利預(yù)處理能夠劑量依賴(lài)性地抑制這種黏附增加。當(dāng)奧拉帕利濃度為10μmol/L時(shí)，單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附率較TNF-α刺激組降低了約30%（P<0.05）；當(dāng)奧拉帕利濃度提高到20μmol/L時(shí)，黏附率進(jìn)一步降低至約40%（P<0.01）。這表明奧拉帕利能夠有效抑制單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，減少炎癥細(xì)胞向血管內(nèi)膜下的募集。為進(jìn)一步研究奧拉帕利對(duì)單核細(xì)胞遷移能力的影響，采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。將THP-1細(xì)胞置于Transwell小室的上室，下室加入含有單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）的培養(yǎng)基作為趨化因子。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MCP-1刺激顯著促進(jìn)了單核細(xì)胞的遷移，而奧拉帕利預(yù)處理能夠明顯抑制單核細(xì)胞的遷移能力。在奧拉帕利濃度為10μmol/L時(shí)，遷移到下室的單核細(xì)胞數(shù)量較MCP-1刺激組減少了約35%（P<0.05）；當(dāng)奧拉帕利濃度為20μmol/L時(shí)，遷移細(xì)胞數(shù)量減少了約50%（P<0.01）。這表明奧拉帕利能夠抑制單核細(xì)胞在趨化因子作用下的遷移，減少單核細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)膜下的數(shù)量。單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和遷移是動(dòng)脈粥樣硬化早期的重要事件。在生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞保持完整，單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附較弱。然而，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時(shí)，如受到氧化應(yīng)激、炎癥因子等刺激，內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)表達(dá)多種黏附分子，如E-選擇素、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）和細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）等。這些黏附分子能夠與單核細(xì)胞表面的相應(yīng)配體結(jié)合，介導(dǎo)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。隨后，在趨化因子（如MCP-1）的作用下，單核細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞間隙遷移到血管內(nèi)膜下，分化為巨噬細(xì)胞，吞噬氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），形成泡沫細(xì)胞，啟動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。奧拉帕利抑制單核細(xì)胞黏附和遷移的作用機(jī)制可能與多種因素有關(guān)。奧拉帕利作為PARP抑制劑，可能通過(guò)抑制PARP的活性，減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA損傷，從而減輕內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，降低黏附分子的表達(dá)。研究表明，PARP的激活與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，PARP會(huì)被激活，導(dǎo)致NAD+的大量消耗，進(jìn)而影響細(xì)胞的能量代謝和功能。奧拉帕利抑制PARP活性后，可減少NAD+的消耗，維持細(xì)胞的正常功能，減輕內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥損傷，降低黏附分子的表達(dá)，從而抑制單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。奧拉帕利還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，影響單核細(xì)胞的遷移能力。MCP-1與單核細(xì)胞表面的CC趨化因子受體2（CCR2）結(jié)合后，會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)通路，如PI3K-Akt、MAPK等，促進(jìn)單核細(xì)胞的遷移。奧拉帕利可能通過(guò)抑制這些信號(hào)通路的激活，從而抑制單核細(xì)胞的遷移。奧拉帕利能夠顯著抑制單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附以及在趨化因子作用下的遷移能力，這對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的早期防治具有重要意義。通過(guò)減少單核細(xì)胞向血管內(nèi)膜下的募集，奧拉帕利有望降低動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供新的策略。3.2.2對(duì)單核細(xì)胞吞噬功能的影響單核細(xì)胞吞噬氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）并轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為研究奧拉帕利對(duì)單核細(xì)胞吞噬功能的影響，本研究采用熒光標(biāo)記的ox-LDL（DiI-ox-LDL）孵育經(jīng)奧拉帕利預(yù)處理的THP-1細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)DiI-ox-LDL的攝取情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ox-LDL刺激顯著增加了THP-1細(xì)胞對(duì)DiI-ox-LDL的攝取，而奧拉帕利預(yù)處理能夠劑量依賴(lài)性地抑制這種攝取增加。當(dāng)奧拉帕利濃度為10μmol/L時(shí)，THP-1細(xì)胞對(duì)DiI-ox-LDL的平均熒光強(qiáng)度較ox-LDL刺激組降低了約25%（P<0.05）；當(dāng)奧拉帕利濃度提高到20μmol/L時(shí)，平均熒光強(qiáng)度進(jìn)一步降低至約40%（P<0.01）。這表明奧拉帕利能夠有效抑制單核細(xì)胞對(duì)ox-LDL的吞噬，減少泡沫細(xì)胞的形成。在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中，ox-LDL在血管內(nèi)膜下堆積，被單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞識(shí)別并攝取。巨噬細(xì)胞表面存在多種清道夫受體，如SR-A、CD36等，它們能夠特異性地結(jié)合ox-LDL，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞對(duì)ox-LDL的攝取。巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL后，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)逐漸堆積，形成泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞的形成不僅導(dǎo)致脂質(zhì)在血管內(nèi)膜下的大量沉積，還會(huì)釋放一系列炎癥因子和細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等，進(jìn)一步招募炎癥細(xì)胞，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。奧拉帕利抑制單核細(xì)胞吞噬ox-LDL的作用機(jī)制可能與以下因素有關(guān)。奧拉帕利可能通過(guò)調(diào)節(jié)清道夫受體的表達(dá)來(lái)影響單核細(xì)胞對(duì)ox-LDL的攝取。研究表明，PARP的激活與清道夫受體的表達(dá)密切相關(guān)，當(dāng)PARP被激活時(shí)，可促進(jìn)清道夫受體基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。奧拉帕利抑制PARP活性后，可能會(huì)抑制清道夫受體的表達(dá)，從而減少單核細(xì)胞對(duì)ox-LDL的攝取。奧拉帕利還可能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝途徑來(lái)抑制泡沫細(xì)胞的形成。單核細(xì)胞攝取ox-LDL后，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝會(huì)發(fā)生改變，如脂肪酸合成增加、膽固醇外流減少等。奧拉帕利可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些脂質(zhì)代謝途徑，促進(jìn)膽固醇的外流，減少脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的堆積，從而抑制泡沫細(xì)胞的形成。奧拉帕利能夠顯著抑制單核細(xì)胞對(duì)ox-LDL的吞噬功能，減少泡沫細(xì)胞的形成。這一作用有助于減輕動(dòng)脈粥樣硬化早期的脂質(zhì)沉積和炎癥反應(yīng)，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程。奧拉帕利在動(dòng)脈粥樣硬化防治中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，其作用機(jī)制的深入研究將為開(kāi)發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)。3.2.3對(duì)單核細(xì)胞極化的影響單核細(xì)胞在不同的微環(huán)境刺激下可極化為M1型和M2型巨噬細(xì)胞，它們?cè)趧?dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮著截然不同的作用。M1型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，具有較強(qiáng)的促炎和殺菌作用，在動(dòng)脈粥樣硬化的早期和進(jìn)展期，M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量增多，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和斑塊的發(fā)展。而M2型巨噬細(xì)胞主要分泌抗炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等，具有抗炎和組織修復(fù)的功能。在動(dòng)脈粥樣硬化的后期，M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)增加，有助于減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)斑塊的穩(wěn)定。為研究奧拉帕利對(duì)單核細(xì)胞極化的影響，本研究將THP-1細(xì)胞經(jīng)奧拉帕利預(yù)處理后，用脂多糖（LPS）和干擾素-γ（IFN-γ）誘導(dǎo)其向M1型極化，用白細(xì)胞介素-4（IL-4）誘導(dǎo)其向M2型極化。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)M1型和M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS+IFN-γ刺激顯著上調(diào)了M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（如iNOS、TNF-α、IL-1β）的表達(dá)，而奧拉帕利預(yù)處理能夠劑量依賴(lài)性地抑制這些標(biāo)志物的上調(diào)。當(dāng)奧拉帕利濃度為10μmol/L時(shí)，iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)水平較LPS+IFN-γ刺激組分別降低了約30%、25%、20%（P<0.05）；當(dāng)奧拉帕利濃度提高到20μmol/L時(shí)，表達(dá)水平進(jìn)一步降低至約50%、40%、35%（P<0.01）。相反，IL-4刺激顯著上調(diào)了M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（如Arg-1、IL-10、TGF-β）的表達(dá)，奧拉帕利預(yù)處理能夠增強(qiáng)這種上調(diào)作用。在奧拉帕利濃度為10μmol/L時(shí)，Arg-1、IL-10、TGF-β的mRNA表達(dá)水平較IL-4刺激組分別提高了約20%、15%、10%（P<0.05）；當(dāng)奧拉帕利濃度為20μmol/L時(shí)，表達(dá)水平進(jìn)一步提高至約35%、30%、25%（P<0.01）。為進(jìn)一步驗(yàn)證奧拉帕利對(duì)單核細(xì)胞極化的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M1型和M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果與qPCR結(jié)果一致，奧拉帕利能夠抑制單核細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞的極化，促進(jìn)其向M2型巨噬細(xì)胞的極化。奧拉帕利調(diào)節(jié)單核細(xì)胞極化的作用機(jī)制可能與多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。在單核細(xì)胞向M1型極化過(guò)程中，LPS和IFN-γ通過(guò)激活Toll樣受體（TLRs）和JAK-STAT信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和M1型極化。奧拉帕利可能通過(guò)抑制PARP的活性，減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA損傷，從而抑制TLRs和JAK-STAT信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制M1型極化。在單核細(xì)胞向M2型極化過(guò)程中，IL-4通過(guò)激活STAT6信號(hào)通路，促進(jìn)M2型相關(guān)基因的表達(dá)。奧拉帕利可能通過(guò)調(diào)節(jié)STAT6信號(hào)通路的活性，增強(qiáng)M2型極化。奧拉帕利能夠調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的極化方向，抑制其向促炎的M1型巨噬細(xì)胞極化，促進(jìn)其向抗炎的M2型巨噬細(xì)胞極化。這種調(diào)節(jié)作用有助于減輕動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)斑塊的穩(wěn)定，為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探討奧拉帕利調(diào)節(jié)單核細(xì)胞極化的具體分子機(jī)制，以及其在體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化模型中的作用效果，為其臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。3.3奧拉帕利對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成與發(fā)展的影響3.3.1斑塊面積與形態(tài)分析為深入探究奧拉帕利對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成與發(fā)展的影響，本研究采用載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠作為動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型。將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和奧拉帕利治療組，對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組和奧拉帕利治療組給予高脂飼料喂養(yǎng)以誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化病變形成，奧拉帕利治療組在此基礎(chǔ)上給予奧拉帕利灌胃處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取小鼠主動(dòng)脈組織進(jìn)行油紅O染色，以觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。油紅O是一種脂溶性染料，能特異性地與組織和細(xì)胞內(nèi)的中性甘油三脂、脂質(zhì)以及脂蛋白產(chǎn)生吸附作用，使脂肪染成紅色。通過(guò)圖像分析軟件測(cè)量動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)脂質(zhì)面積占整個(gè)血管橫截面積的比例，以此評(píng)估斑塊面積大小。結(jié)果顯示，模型組小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積顯著大于對(duì)照組，表明高脂飼料喂養(yǎng)成功誘導(dǎo)了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。而奧拉帕利治療組小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積明顯小于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明奧拉帕利能夠有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，減少脂質(zhì)在血管壁的沉積。對(duì)主動(dòng)脈組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察斑塊形態(tài)學(xué)特征。HE染色是組織學(xué)中最常用的染色方法之一，蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)脂質(zhì)核心較大，纖維帽較薄，且可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而奧拉帕利治療組小鼠斑塊內(nèi)脂質(zhì)核心相對(duì)較小，纖維帽增厚，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕。這表明奧拉帕利不僅能夠減少斑塊面積，還能改善斑塊的形態(tài)學(xué)特征，使斑塊更加穩(wěn)定。為進(jìn)一步分析奧拉帕利對(duì)斑塊形態(tài)的影響，采用Masson染色觀察血管壁膠原纖維的分布情況。Masson染色主要用于顯示組織中纖維的分布，膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。結(jié)果顯示，模型組小鼠血管壁膠原纖維含量減少，排列紊亂，而奧拉帕利治療組小鼠血管壁膠原纖維含量增加，排列較為整齊。這表明奧拉帕利能夠促進(jìn)血管壁膠原纖維的合成和沉積，增強(qiáng)纖維帽的強(qiáng)度，從而穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。3.3.2斑塊穩(wěn)定性相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類(lèi)鋅離子依賴(lài)的內(nèi)肽酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成、發(fā)展和破裂過(guò)程中發(fā)揮重要作用。為研究奧拉帕利對(duì)斑塊穩(wěn)定性相關(guān)指標(biāo)的影響，本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)主動(dòng)脈組織中MMP-2和MMP-9的表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)法是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。結(jié)果顯示，模型組小鼠主動(dòng)脈組織中MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，而奧拉帕利治療組小鼠MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明奧拉帕利能夠抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性。為檢測(cè)MMPs的活性，采用明膠酶譜法。明膠酶譜法是一種能夠特異性檢測(cè)MMP-2和MMP-9活性的方法，其原理是利用MMPs能夠降解明膠的特性，在含有明膠的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，MMPs在凝膠中遷移并降解明膠，形成透明的條帶，通過(guò)掃描條帶的灰度值可以半定量分析MMPs的活性。結(jié)果顯示，模型組小鼠主動(dòng)脈組織中MMP-2和MMP-9的活性明顯高于對(duì)照組，而奧拉帕利治療組小鼠MMP-2和MMP-9的活性顯著低于模型組。這進(jìn)一步證實(shí)了奧拉帕利能夠抑制MMPs的活性，穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)是影響動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的重要因素之一。本研究采用免疫熒光染色法檢測(cè)主動(dòng)脈組織中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68的表達(dá)情況，以評(píng)估炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度。免疫熒光染色是利用熒光素標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞中的抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)，從而對(duì)抗原進(jìn)行定位和定量分析。結(jié)果顯示，模型組小鼠主動(dòng)脈組織中CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組，表明模型組小鼠斑塊內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度較高。而奧拉帕利治療組小鼠CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著少于模型組，表明奧拉帕利能夠減少炎癥細(xì)胞向斑塊內(nèi)的浸潤(rùn)，減輕炎癥反應(yīng)，從而穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。3.3.3血管功能評(píng)估血管張力測(cè)定是評(píng)估動(dòng)脈血管功能的常用方法之一，它能夠反映血管的收縮和舒張能力。本研究采用離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)，取小鼠胸主動(dòng)脈，制備血管環(huán)，將其置于含Krebs-Henseleit液的浴槽中，通過(guò)張力換能器記錄血管環(huán)的張力變化。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，先給予去氧腎上腺素（PE）使血管環(huán)收縮至穩(wěn)定狀態(tài)，然后加入乙酰膽堿（ACh）觀察血管環(huán)的舒張反應(yīng)，以評(píng)估血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能。結(jié)果顯示，模型組小鼠血管環(huán)對(duì)ACh的舒張反應(yīng)明顯減弱，表明動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠血管內(nèi)皮功能受損。而奧拉帕利治療組小鼠血管環(huán)對(duì)ACh的舒張反應(yīng)顯著增強(qiáng)，與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明奧拉帕利能夠改善動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的血管內(nèi)皮功能，增強(qiáng)血管的舒張能力。為進(jìn)一步評(píng)估血管的收縮功能，在給予PE使血管環(huán)收縮后，加入硝普鈉（SNP）觀察血管環(huán)的舒張反應(yīng)。SNP是一種非內(nèi)皮依賴(lài)性的血管舒張劑，它能夠直接作用于血管平滑肌細(xì)胞，使其舒張。結(jié)果顯示，模型組小鼠血管環(huán)對(duì)SNP的舒張反應(yīng)也有所減弱，但與奧拉帕利治療組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明奧拉帕利主要通過(guò)改善血管內(nèi)皮功能來(lái)調(diào)節(jié)血管的舒張和收縮功能，對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的直接作用較小。一氧化氮（NO）是一種重要的血管舒張因子，它由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，能夠調(diào)節(jié)血管張力和抑制血小板聚集。為探討奧拉帕利改善血管功能的機(jī)制，本研究采用硝酸還原酶法檢測(cè)小鼠血清中NO的含量。硝酸還原酶法是利用硝酸還原酶將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，通過(guò)檢測(cè)亞硝酸鹽的含量來(lái)間接反映NO的水平。結(jié)果顯示，模型組小鼠血清中NO含量顯著低于對(duì)照組，而奧拉帕利治療組小鼠血清中NO含量明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明奧拉帕利能夠增加血清中NO的含量，促進(jìn)血管舒張，改善動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的血管功能。內(nèi)皮素-1（ET-1）是一種強(qiáng)烈的血管收縮因子，它由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，與血管收縮和高血壓等心血管疾病密切相關(guān)。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)小鼠血清中ET-1的含量。ELISA是一種常用的免疫分析技術(shù)，它利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)酶標(biāo)記的抗體檢測(cè)樣品中的抗原含量。結(jié)果顯示，模型組小鼠血清中ET-1含量顯著高于對(duì)照組，而奧拉帕利治療組小鼠血清中ET-1含量明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0