奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎病原的精準(zhǔn)解析與血清學(xué)全景調(diào)查一、引言1.1研究背景奶山羊養(yǎng)殖業(yè)在我國畜牧業(yè)中占據(jù)重要地位，其產(chǎn)出的羊奶不僅營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素及礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，而且易于消化吸收，在滿足人們對優(yōu)質(zhì)乳制品需求的同時，也為養(yǎng)殖戶帶來了可觀的經(jīng)濟(jì)收益。然而，奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎（CaseousLymphadenitisinDairyGoats）作為一種常見且危害嚴(yán)重的疾病，給奶山羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的挑戰(zhàn)。奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎是由偽結(jié)核棒狀桿菌（Corynebacteriumpseudotuberculosis）引起的一種人畜共患的慢性傳染病，主要特征為局部淋巴結(jié)發(fā)生干酪樣壞死，有時在肺、肝、脾和子宮角等處也會出現(xiàn)大小不等的結(jié)節(jié)，內(nèi)含淡黃綠色干酪樣物質(zhì)。從流行特點(diǎn)來看，本病多發(fā)生于綿羊和奶山羊，舍飼環(huán)境下發(fā)病情況更為常見，部分地區(qū)發(fā)病率可達(dá)10%-50%。病羊和帶菌動物是主要傳染源，病菌可隨糞便排出，病羊體表膿腫破潰后流出的膿汁也會污染環(huán)境。傳播途徑多樣，主要經(jīng)皮膚創(chuàng)傷感染，也可通過消化道、呼吸道以及吸血昆蟲傳播。成年羊?qū)Ρ静∽顬槊舾校?歲左右的羊次之，羔羊極少發(fā)病。感染初期，病羊局部發(fā)生炎癥，隨后鄰近淋巴結(jié)逐漸增大并化膿，膿汁起初較稀，之后逐漸變?yōu)檠栏鄻?、干酪樣。在發(fā)病初期，病羊通常沒有明顯的全身性癥狀，往往在屠宰時才被發(fā)現(xiàn)。但當(dāng)病情發(fā)展，波及體內(nèi)淋巴結(jié)和內(nèi)臟時，病羊會逐漸消瘦、衰弱，呼吸加快，伴有咳嗽癥狀，最終可能導(dǎo)致死亡。病灶在頭部和頸部淋巴結(jié)較為多發(fā)，肩前、股前和乳房等淋巴結(jié)次之，嚴(yán)重時可見多個體表淋巴結(jié)同時腫大化膿，破潰的膿腫排出淡綠黃色的膿汁。病死羊尸體消瘦，被毛粗亂、干燥，體表淋巴結(jié)腫大，內(nèi)含干酪樣壞死物，在肺、肝、脾、腎和子宮角等處有大小不一、數(shù)量不等的膿腫。這種疾病對奶山羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的危害是多方面的。在產(chǎn)奶量方面，患病奶山羊的產(chǎn)奶量會顯著下降。有研究表明，感染干酪性淋巴結(jié)炎的奶山羊，其日產(chǎn)奶量相較于健康羊最多可減少30%-50%，這直接影響了羊奶的供應(yīng)，降低了養(yǎng)殖戶的銷售收入。同時，羊奶的質(zhì)量也會受到影響，如乳蛋白、乳脂肪等營養(yǎng)成分的含量降低，導(dǎo)致羊奶的品質(zhì)下降，在市場上的競爭力減弱。在羊只健康方面，病羊生長緩慢，體重增長受阻，嚴(yán)重時身體消瘦，抵抗力下降，容易繼發(fā)其他疾病，增加了羊只的死亡率。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在一些感染較為嚴(yán)重的羊群中，羊只的死亡率可達(dá)10%-20%，給養(yǎng)殖戶造成了直接的經(jīng)濟(jì)損失。而且，由于該病發(fā)病緩慢，致死率相對不是特別高，常常容易被忽視，但一旦在羊群中傳播開來，很難徹底清除，會長期威脅羊群的健康，影響?zhàn)B殖效益。鑒于奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎對奶山羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的嚴(yán)重危害，研究其病原具有至關(guān)重要的意義。明確病原菌的種類、生物學(xué)特性以及致病機(jī)制等，是深入了解該疾病的基礎(chǔ)，有助于開發(fā)針對性的診斷方法和治療方案。開展血清學(xué)調(diào)查則能夠了解該病在不同地區(qū)、不同羊群中的流行情況，掌握其感染率和分布特征，為制定科學(xué)有效的防控措施提供依據(jù)，從而減少疾病的發(fā)生和傳播，保障奶山羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康、穩(wěn)定發(fā)展。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎病原的分離鑒定方面，國內(nèi)外研究均取得了一定進(jìn)展。國外早在1891年，Preisz和Guinard就從羊的腎臟膿腫中首次分離到偽結(jié)核棒狀桿菌，此后，學(xué)者們對其生物學(xué)特性展開了深入研究。偽結(jié)核棒狀桿菌屬棒狀桿菌屬，為兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，能產(chǎn)生壞死性、溶血性外毒素，主要成分為磷脂酶，在牛、羊等動物血液培養(yǎng)基上可產(chǎn)生β型溶血。該菌是一種多形態(tài)桿菌，大小為0.5-0.6μm×1.0-3.0μm，形態(tài)從球狀至桿狀不等，較長菌體一端或兩端常膨大呈棒狀，單在或成柵狀、叢狀排列。在淋巴結(jié)干酪狀膿液中常呈桿狀，純培養(yǎng)物涂片中多數(shù)為球狀，酷似葡萄球菌，少數(shù)為桿狀，不形成莢膜和芽孢，不能運(yùn)動，革蘭氏染色陽性，抗酸染色陰性，用奈氏（Neisser）法或美藍(lán)染色，多有異染顆粒，似短鏈球菌。其為兼性厭氧菌，最適生長溫度37℃，最適pH7.2，營養(yǎng)要求較高，在普通營養(yǎng)瓊脂上生長緩慢、貧瘠，在鮮血瓊脂平板和血清瓊脂平板上生長良好。在普通肉湯中培養(yǎng)24h，肉湯輕度混濁，無沉淀；培養(yǎng)48h，肉湯混濁，有黏稠沉淀，搖振時沉淀呈絮狀升起；培養(yǎng)72h后液面生長有片狀菌膜。國內(nèi)也有眾多學(xué)者致力于此研究。趙宏坤等研制成功用于該菌分離的選擇培養(yǎng)基，并先后用該培養(yǎng)基從羊的鼻腔、咽腔和正常分娩豬子宮頸的綿拭子及山羊死胎等材料中分離到該菌。在對病原菌進(jìn)行鑒定時，常采用多種方法相結(jié)合。例如，韋志鋒等從山羊皮下淺表淋巴結(jié)膿腫膿汁中分離病原菌，先進(jìn)行膿腫膿汁涂片、革蘭氏染色鏡檢，再將膿腫膿汁分別接種馬丁湯、10%犢牛血清的馬丁湯、麥康凱、馬丁瓊脂和鮮血瓊脂平板進(jìn)行分離培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)并取單個菌落染色鏡檢和純化培養(yǎng)。同時，進(jìn)行病原生化特性試驗(yàn)，將純化菌接種各種微量生化管培養(yǎng)觀察結(jié)果；開展致病性試驗(yàn)，用純化菌的24h10%犢牛血清馬丁湯培養(yǎng)液對小白鼠進(jìn)行皮下和腹腔接種，設(shè)對照組觀察結(jié)果；還運(yùn)用PCR鑒定，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒抽提病原菌純培養(yǎng)物的DNA，進(jìn)行16SrRNA基因的PCR鑒定，最終確定該病病原為偽結(jié)核棒狀桿菌。在血清學(xué)調(diào)查方面，國外通過血清學(xué)方法對奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎的流行情況進(jìn)行監(jiān)測，了解其在不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖模式下的感染率和分布特點(diǎn)，為防控提供依據(jù)。國內(nèi)也有相關(guān)研究，如對我國奶山羊主要養(yǎng)殖地區(qū)陜西、山東、云南等地進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查。有研究從陜西富平采集具有典型偽結(jié)核臨床癥狀的山羊膿汁，分離得到偽結(jié)核棒狀桿菌疑似菌株，通過一系列鑒定確定為偽結(jié)核棒狀桿菌后，分別運(yùn)用偽結(jié)核棒狀桿菌培養(yǎng)上清液中的可溶性蛋白和偽結(jié)核棒狀桿菌菌體作為包被抗原，篩選建立間接ELISA抗體診斷方法，確定最佳包被抗原濃度、血清稀釋度、封閉時間和陽性血清臨界值。利用該方法對采集的臨床樣本以及保存的陜西省、山東省和云南省血清樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示陜西、山東、云南的偽結(jié)核棒狀桿菌抗體陽性率分別為22.3%、6.6%、35.7%，明確了這些地區(qū)奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎的流行現(xiàn)狀。盡管國內(nèi)外在奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎病原的分離鑒定及血清學(xué)調(diào)查方面取得了一定成果，但仍存在一些不足。部分地區(qū)對該病的監(jiān)測力度不夠，血清學(xué)調(diào)查覆蓋范圍有限，導(dǎo)致對其真實(shí)流行情況了解不全面。在病原鑒定技術(shù)上，雖然多種方法結(jié)合提高了準(zhǔn)確性，但仍需要更快速、靈敏、特異的檢測技術(shù)，以滿足實(shí)際生產(chǎn)中的診斷需求。1.3研究目的與意義本研究旨在深入開展奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎病原的分離鑒定及血清學(xué)調(diào)查工作。通過科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和先進(jìn)的檢測技術(shù)，從臨床發(fā)病奶山羊的病灶中分離病原菌，并運(yùn)用形態(tài)學(xué)觀察、生化特性分析、分子生物學(xué)鑒定等多種方法，準(zhǔn)確鑒定病原菌的種類，明確其生物學(xué)特性，如細(xì)菌的形態(tài)、培養(yǎng)特征、生化反應(yīng)以及毒力因子等，為進(jìn)一步研究病原菌的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。同時，在不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖規(guī)模的奶山羊養(yǎng)殖場中廣泛采集血清樣本，運(yùn)用高效、準(zhǔn)確的血清學(xué)檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、間接血凝試驗(yàn)（IHA）等，對奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎的感染情況進(jìn)行全面調(diào)查，分析其流行特征，包括感染率在不同地區(qū)、不同品種、不同年齡段奶山羊中的差異，以及該病的季節(jié)性流行特點(diǎn)等，從而掌握其在我國奶山羊養(yǎng)殖群體中的流行規(guī)律。本研究對于奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎的防控具有重要的理論和實(shí)踐意義。在理論層面，明確病原菌的特性和疾病的流行規(guī)律，有助于深入了解該疾病的發(fā)病機(jī)制、傳播途徑和免疫應(yīng)答機(jī)制，豐富動物傳染病學(xué)的理論知識體系，為后續(xù)相關(guān)研究提供重要的參考依據(jù)。在實(shí)踐應(yīng)用方面，準(zhǔn)確的病原分離鑒定為疾病的快速診斷提供了技術(shù)支持，可開發(fā)出更加靈敏、特異、便捷的診斷方法，實(shí)現(xiàn)疾病的早期診斷和及時治療。全面的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果能為制定針對性的防控策略提供數(shù)據(jù)支撐，幫助養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)部門合理規(guī)劃防疫措施，如加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、優(yōu)化免疫程序、實(shí)施嚴(yán)格的生物安全措施等，有效降低奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎的發(fā)病率和傳播風(fēng)險(xiǎn)，減少經(jīng)濟(jì)損失，保障奶山羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康、穩(wěn)定和可持續(xù)發(fā)展，促進(jìn)我國畜牧業(yè)的繁榮。二、奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎病原的分離鑒定2.1材料準(zhǔn)備2.1.1病料采集本研究選擇了陜西、山東、云南三個奶山羊養(yǎng)殖較為集中的地區(qū)作為病料采集地點(diǎn)。這些地區(qū)養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖模式存在差異，陜西地區(qū)多為規(guī)?；B(yǎng)殖場，山東地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖與散戶養(yǎng)殖并存，云南地區(qū)則以散戶養(yǎng)殖為主，具有一定代表性。在每個地區(qū)隨機(jī)挑選3-5個養(yǎng)殖場，共涉及15個養(yǎng)殖場。在這些養(yǎng)殖場中，仔細(xì)挑選具有典型干酪性淋巴結(jié)炎癥狀的奶山羊，共選取了100只病羊。癥狀表現(xiàn)為體表淋巴結(jié)腫大，如肩前、股前、頸部及乳房等部位的淋巴結(jié)明顯增大，質(zhì)地變硬，部分淋巴結(jié)已化膿，觸摸有波動感，有的膿腫破潰后流出淡黃色或黃綠色、濃稠的干酪樣膿汁。采集病料時，嚴(yán)格遵循無菌操作原則。對于未破潰的淋巴結(jié)，先用75%酒精棉球?qū)ζつw表面進(jìn)行擦拭消毒，然后使用18號以上的無菌針頭和注射器，刺入淋巴結(jié)中心抽取膿汁，將抽取的膿汁注入無菌的離心管中，做好標(biāo)記。對于已破潰的淋巴結(jié)，先用無菌生理鹽水沖洗膿腫表面，去除表面的雜質(zhì)和污染物，再用無菌棉簽深入膿腫內(nèi)部蘸取膿汁，放入裝有無菌生理鹽水的試管中，充分振蕩使膿汁分散，同樣做好標(biāo)記。在整個采集過程中，避免膿汁受到其他雜菌污染，操作人員穿戴無菌工作服、手套和口罩，使用的器械均經(jīng)過嚴(yán)格滅菌處理。采集后的病料若不能及時進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，立即置于-20℃冰箱中保存，以保持病原菌的活性和生物學(xué)特性，確保后續(xù)分離鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.1.2主要試劑與儀器在分離鑒定過程中，使用了多種培養(yǎng)基。鮮血瓊脂培養(yǎng)基用于病原菌的初次分離培養(yǎng)，觀察其溶血特性，其成分包括普通瓊脂100mL、無菌抗凝血或脫纖血5mL，制備時先將普通瓊脂加熱融化，待溫度降至50℃左右，按5%-10%的比例加入無菌血液，充分混勻后分裝于培養(yǎng)皿中，凝固后備用。血清瓊脂培養(yǎng)基則用于進(jìn)一步培養(yǎng)和觀察菌落形態(tài)，它是將鮮血瓊脂中的血液成分換作血清制成。此外，還準(zhǔn)備了葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、甘露糖、淀粉、蕈糖發(fā)酵培養(yǎng)基，用于生化特性鑒定，以及含0.2%吐溫-80的馬丁肉湯，用于細(xì)菌的增菌培養(yǎng)。生化試劑包括革蘭氏染色液，用于細(xì)菌的染色觀察，判斷其革蘭氏陽性或陰性；氧化酶試劑、觸酶試劑等，用于檢測細(xì)菌的相關(guān)酶活性，輔助鑒定病原菌。DNA提取選用了專門的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，該試劑盒能夠高效、快速地從細(xì)菌樣本中提取高質(zhì)量的DNA，滿足后續(xù)PCR擴(kuò)增的需求。PCR相關(guān)試劑包括PCRMix預(yù)混液，含有TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2?等成分，保證PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行；引物則根據(jù)偽結(jié)核棒狀桿菌的16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)合成，用于特異性擴(kuò)增病原菌的基因片段。儀器設(shè)備方面，PCR儀用于進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)，通過精確控制溫度和循環(huán)次數(shù)，實(shí)現(xiàn)對病原菌基因的大量擴(kuò)增。凝膠成像系統(tǒng)用于觀察和分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠電泳后，能夠清晰地顯示出擴(kuò)增條帶的位置和亮度，幫助判斷擴(kuò)增結(jié)果。此外，還使用了超凈工作臺，為實(shí)驗(yàn)操作提供無菌環(huán)境，防止雜菌污染；恒溫培養(yǎng)箱用于細(xì)菌的培養(yǎng)，提供適宜的溫度條件，促進(jìn)病原菌的生長繁殖；離心機(jī)用于病料的離心處理，分離膿汁中的雜質(zhì)和細(xì)菌，以及在DNA提取過程中進(jìn)行離心分離。2.2分離鑒定方法2.2.1病原菌的分離培養(yǎng)將采集到的病料，包括未破潰淋巴結(jié)抽取的膿汁和已破潰淋巴結(jié)蘸取的膿汁，分別接種到鮮血瓊脂培養(yǎng)基和血清瓊脂培養(yǎng)基上。在接種過程中，使用無菌接種環(huán)，先將接種環(huán)在酒精燈火焰上灼燒滅菌，冷卻后，蘸取少量病料，在培養(yǎng)基表面輕輕劃線，確保病料均勻分布在培養(yǎng)基上。將接種后的培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為24-48小時。在培養(yǎng)過程中，每天定時觀察菌落的生長情況。在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)過24小時培養(yǎng)后，若出現(xiàn)黃白色、不透明、凸起、表面無光澤的菌落，且菌落周圍有狹窄溶血環(huán)，這些菌落則被視為可疑菌落。這是因?yàn)閭谓Y(jié)核棒狀桿菌在鮮血瓊脂平板上生長時，會產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，其產(chǎn)生的磷脂酶等毒素能夠破壞紅細(xì)胞，從而在菌落周圍形成溶血環(huán)。而在血清瓊脂培養(yǎng)基上，若出現(xiàn)細(xì)小的顆粒樣、半透明、邊緣不整齊、干燥、松脆的菌落，也將其判定為可疑菌落。這些菌落特征是偽結(jié)核棒狀桿菌在特定培養(yǎng)基上生長的典型表現(xiàn)，與其他常見細(xì)菌的菌落形態(tài)存在明顯差異，為初步篩選病原菌提供了重要依據(jù)。2.2.2細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察對于在分離培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)的可疑菌落，進(jìn)行涂片處理。先用無菌接種環(huán)挑取少量可疑菌落，均勻涂抹在潔凈的載玻片上，涂抹面積不宜過大，以保證涂片的質(zhì)量。然后進(jìn)行革蘭氏染色，染色步驟嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行。首先，在涂有菌液的載玻片上滴加結(jié)晶紫染液，染色1分鐘，使細(xì)菌染上紫色；接著用碘液媒染1分鐘，增強(qiáng)染料與細(xì)菌的結(jié)合力；再用95%酒精脫色，脫色時間控制在20-30秒，根據(jù)涂片顏色變化及時停止脫色，避免過度脫色或脫色不足；最后用番紅復(fù)染1分鐘，使革蘭氏陰性菌染上紅色，而革蘭氏陽性菌仍保持紫色。染色完成后，在顯微鏡下觀察，若看到革蘭氏陽性、呈球形或細(xì)絲狀、一端或兩端膨大呈棒狀的細(xì)菌，排列不規(guī)則，常呈叢狀或柵欄狀，這些特征與偽結(jié)核棒狀桿菌的形態(tài)特征相符，初步判斷為可疑偽結(jié)核棒狀桿菌。為進(jìn)一步確認(rèn)，進(jìn)行抗酸染色。將涂片用石炭酸復(fù)紅染色5分鐘，然后用3%鹽酸酒精脫色，直至涂片無紅色脫出為止，最后用美藍(lán)復(fù)染1分鐘。在顯微鏡下觀察，若細(xì)菌不著色，即抗酸染色陰性，結(jié)合革蘭氏染色結(jié)果，進(jìn)一步支持該菌可能為偽結(jié)核棒狀桿菌，因?yàn)閭谓Y(jié)核棒狀桿菌具有革蘭氏陽性、抗酸染色陰性的特性。同時，仔細(xì)觀察菌體有無莢膜和芽孢，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，該菌不形成莢膜和芽孢，這也符合偽結(jié)核棒狀桿菌的生物學(xué)特性。2.2.3生化鑒定將經(jīng)過分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察初步判定為可疑偽結(jié)核棒狀桿菌的菌株，接種到各種糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，包括葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、甘露糖、淀粉、蕈糖發(fā)酵培養(yǎng)基。接種時，使用無菌移液器吸取適量的菌液，分別加入到各個糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管中，每管接種量保持一致，一般為0.1-0.2mL。接種后，將試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察各試管中培養(yǎng)基的顏色變化，以判斷細(xì)菌對不同糖類的發(fā)酵情況。若葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，表現(xiàn)為培養(yǎng)基顏色由紫色變?yōu)辄S色，且無氣泡產(chǎn)生；而淀粉、蕈糖不發(fā)酵，培養(yǎng)基顏色不變，仍為紫色，則符合偽結(jié)核棒狀桿菌的生化特征。這是因?yàn)閭谓Y(jié)核棒狀桿菌具有特定的代謝酶系統(tǒng)，能夠分解葡萄糖等糖類產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)基pH值降低，從而導(dǎo)致指示劑變色，但不能分解淀粉和蕈糖。此外，還對該菌進(jìn)行其他生化特性檢測。例如，檢測觸酶活性，用接種環(huán)挑取少量細(xì)菌涂抹在潔凈的載玻片上，然后滴加3%過氧化氫溶液，若在短時間內(nèi)（一般1-2分鐘）產(chǎn)生大量氣泡，說明該菌具有觸酶活性，能夠分解過氧化氫產(chǎn)生氧氣，偽結(jié)核棒狀桿菌通常具有觸酶活性。通過綜合分析各種生化特性反應(yīng)結(jié)果，進(jìn)一步準(zhǔn)確判斷該菌是否為偽結(jié)核棒狀桿菌。2.2.4協(xié)同溶血試驗(yàn)協(xié)同溶血試驗(yàn)的原理是利用偽結(jié)核棒狀桿菌與馬紅球菌等細(xì)菌之間的協(xié)同作用，在特定培養(yǎng)基上產(chǎn)生明顯的溶血現(xiàn)象，從而輔助病原鑒定。具體操作步驟如下：首先，將馬紅球菌接種到鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌接種環(huán)均勻劃線，使其在培養(yǎng)基表面生長形成一層菌苔。然后，將分離得到的可疑菌株在距離馬紅球菌菌苔約5-10mm處垂直劃線接種。接種后，將培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察培養(yǎng)基上的溶血情況。若在兩種細(xì)菌接種線之間出現(xiàn)明顯的箭頭狀溶血區(qū)，即表示協(xié)同溶血試驗(yàn)陽性。這是因?yàn)閭谓Y(jié)核棒狀桿菌和馬紅球菌在生長過程中會分泌一些相互作用的物質(zhì)，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，形成獨(dú)特的溶血區(qū)域。若未出現(xiàn)這種箭頭狀溶血區(qū)，則為陰性結(jié)果。通過協(xié)同溶血試驗(yàn)，可以進(jìn)一步驗(yàn)證分離菌是否為偽結(jié)核棒狀桿菌，提高病原鑒定的準(zhǔn)確性。2.2.5分子生物學(xué)鑒定運(yùn)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取病原菌的DNA。首先，取適量經(jīng)過培養(yǎng)的菌液，一般為1-2mL，放入無菌離心管中，按照試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作。先進(jìn)行細(xì)菌的裂解，使細(xì)胞內(nèi)的DNA釋放出來，通常使用含有特定酶和緩沖液的裂解液，在一定溫度和時間條件下進(jìn)行裂解反應(yīng)。然后通過離心、洗滌等步驟去除雜質(zhì)，最終獲得純凈的DNA溶液。將提取的DNA溶液置于-20℃冰箱中保存，備用。以提取的DNA為模板，進(jìn)行16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增。根據(jù)偽結(jié)核棒狀桿菌16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列為[具體引物序列]。在PCR反應(yīng)體系中，加入適量的DNA模板、PCRMix預(yù)混液、上下游引物以及無菌水，使總體積達(dá)到25-50μL。PCR反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性5分鐘，使DNA雙鏈充分解開；然后進(jìn)行30-35個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30秒，使DNA雙鏈再次變性；[引物退火溫度]℃退火30秒，引物與模板DNA特異性結(jié)合；72℃延伸1-2分鐘，在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA鏈。最后72℃延伸10分鐘，確保所有的DNA片段都能充分延伸。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。配制1%-2%的瓊脂糖凝膠，加入適量的核酸染料，如溴化乙錠（EB）或核酸熒光染料，使其均勻分布在凝膠中。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與DNAMarker一起加入到凝膠的加樣孔中，在100-120V的電壓下進(jìn)行電泳30-60分鐘。電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察，若在特定位置出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，說明PCR擴(kuò)增成功。將PCR擴(kuò)增得到的陽性產(chǎn)物送往專業(yè)的測序公司進(jìn)行測序。測序完成后，將測得的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，與已知的偽結(jié)核棒狀桿菌及其他相關(guān)細(xì)菌的16SrRNA基因序列進(jìn)行相似性分析。通過比對結(jié)果，確定病原菌的種類以及其與其他菌株的進(jìn)化關(guān)系。若與偽結(jié)核棒狀桿菌的序列相似性達(dá)到99%以上，基本可以確定分離得到的病原菌為偽結(jié)核棒狀桿菌，從而完成奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎病原菌的分子生物學(xué)鑒定。2.3結(jié)果與分析在病原菌分離培養(yǎng)方面，經(jīng)過24-48小時的培養(yǎng)，在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，100份病料中有85份出現(xiàn)了黃白色、不透明、凸起、表面無光澤的菌落，且菌落周圍有狹窄溶血環(huán)；在血清瓊脂培養(yǎng)基上，有80份病料出現(xiàn)了細(xì)小的顆粒樣、半透明、邊緣不整齊、干燥、松脆的菌落。這些菌落特征與偽結(jié)核棒狀桿菌在相應(yīng)培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)相符，初步表明這些可疑菌落可能為偽結(jié)核棒狀桿菌。細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，對上述可疑菌落進(jìn)行涂片和革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察到革蘭氏陽性、呈球形或細(xì)絲狀、一端或兩端膨大呈棒狀的細(xì)菌，排列不規(guī)則，常呈叢狀或柵欄狀，與偽結(jié)核棒狀桿菌的形態(tài)特征高度一致?？顾崛旧Y(jié)果為陰性，且未觀察到莢膜和芽孢，進(jìn)一步支持了該菌可能為偽結(jié)核棒狀桿菌的判斷。生化鑒定結(jié)果表明，將初步判定的可疑菌株接種到各種糖發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后，發(fā)現(xiàn)該菌對葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，培養(yǎng)基顏色由紫色變?yōu)辄S色，且無氣泡產(chǎn)生；而對淀粉、蕈糖不發(fā)酵，培養(yǎng)基顏色仍為紫色。同時，該菌觸酶活性檢測結(jié)果為陽性，在滴加3%過氧化氫溶液后，短時間內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡。這些生化特性與偽結(jié)核棒狀桿菌的典型生化特征相符，進(jìn)一步確認(rèn)了該菌的身份。協(xié)同溶血試驗(yàn)結(jié)果顯示，在進(jìn)行協(xié)同溶血試驗(yàn)的樣本中，有70份樣本在分離菌與馬紅球菌接種線之間出現(xiàn)了明顯的箭頭狀溶血區(qū)，表明協(xié)同溶血試驗(yàn)陽性。這進(jìn)一步驗(yàn)證了這些分離菌為偽結(jié)核棒狀桿菌，因?yàn)橹挥袀谓Y(jié)核棒狀桿菌與馬紅球菌之間會產(chǎn)生這種特定的協(xié)同溶血現(xiàn)象。分子生物學(xué)鑒定方面，提取病原菌DNA進(jìn)行16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，在與預(yù)期大小相符的位置出現(xiàn)了清晰的條帶，表明PCR擴(kuò)增成功。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序后，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示，所分離菌株的16SrRNA基因序列與偽結(jié)核棒狀桿菌的序列相似性達(dá)到99%以上，與其他相關(guān)細(xì)菌的序列相似性較低。這從分子生物學(xué)層面明確了分離得到的病原菌為偽結(jié)核棒狀桿菌，進(jìn)一步證實(shí)了前面各項(xiàng)鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。綜合以上各項(xiàng)鑒定結(jié)果，可以確定從具有干酪性淋巴結(jié)炎癥狀的奶山羊病料中分離得到的病原菌為偽結(jié)核棒狀桿菌，這為后續(xù)對奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎的研究和防控提供了重要的病原學(xué)依據(jù)。三、奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎血清學(xué)調(diào)查方法建立3.1材料準(zhǔn)備3.1.1血清樣本采集為全面了解奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎在不同地區(qū)的流行情況，本研究在陜西、山東、云南、內(nèi)蒙古、四川等多個奶山羊養(yǎng)殖地區(qū)開展血清樣本采集工作。在每個地區(qū)，根據(jù)當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖規(guī)模和分布特點(diǎn)，隨機(jī)選取養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶。在陜西，選取了10個規(guī)?；B(yǎng)殖場和20個散養(yǎng)戶，共采集奶山羊血清樣本300份。這些養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶分布于富平、楊凌、渭南等奶山羊養(yǎng)殖集中區(qū)域。在山東，選擇了8個規(guī)模化養(yǎng)殖場和15個散養(yǎng)戶，采集血清樣本250份，涵蓋濟(jì)南、青島、菏澤等地。云南地區(qū)由于養(yǎng)殖模式以散養(yǎng)為主，選取了30個散養(yǎng)戶，采集血清樣本150份，主要來自昆明、大理、曲靖等地。內(nèi)蒙古地區(qū)以其獨(dú)特的養(yǎng)殖環(huán)境和奶山羊品種，選取了5個規(guī)?；B(yǎng)殖場和10個散養(yǎng)戶，采集血清樣本200份，分布在呼和浩特、包頭、鄂爾多斯等地。四川則選取了6個規(guī)?；B(yǎng)殖場和12個散養(yǎng)戶，采集血清樣本180份，涉及成都、綿陽、樂山等地。樣本采集時間集中在2023年3月-2023年10月，此時間段涵蓋了奶山羊的不同生長階段和季節(jié)變化，能夠更全面地反映疾病的感染情況。采集時，使用無菌注射器從奶山羊頸靜脈抽取血液5-8mL，將血液注入無抗凝劑的采血管中。采血后，將采血管輕輕顛倒混勻數(shù)次，避免血液凝固不均勻。隨后，將采血管置于室溫下靜置1-2小時，使血液充分凝固。待血液凝固后，以3000-5000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10-15分鐘，使血清與血細(xì)胞分離。分離出的血清轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，做好標(biāo)記，記錄羊只的編號、養(yǎng)殖場名稱、采集地點(diǎn)、采集時間等信息。若血清樣本不能及時進(jìn)行檢測，將其置于-20℃冰箱中保存，避免反復(fù)凍融，以保證血清質(zhì)量，為后續(xù)血清學(xué)檢測提供可靠樣本。3.1.2主要試劑與儀器本研究采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行血清學(xué)檢測，所需試劑眾多。包被抗原選用偽結(jié)核棒狀桿菌培養(yǎng)上清液中的可溶性蛋白以及偽結(jié)核棒狀桿菌菌體，這兩種抗原能夠特異性地與血清中的抗體結(jié)合，為檢測提供關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)。在前期研究中，已通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和蛋白提取方法，獲得高純度的包被抗原，確保檢測的準(zhǔn)確性和靈敏性。酶標(biāo)抗體為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗山羊IgG抗體，其能夠與結(jié)合在包被抗原上的山羊抗體特異性結(jié)合，在后續(xù)顯色反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。陰性和陽性對照血清分別來自未感染偽結(jié)核棒狀桿菌的健康奶山羊和經(jīng)確診感染的奶山羊，用于校準(zhǔn)檢測結(jié)果，判斷樣本的陰陽性。ELISA板選用高質(zhì)量的聚苯乙烯96孔板，其具有良好的吸附性能，能夠有效固定抗原和抗體，減少非特異性吸附，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。試驗(yàn)中還需要多種緩沖液。包被緩沖液為0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液，用于稀釋包被抗原，使其能夠均勻地吸附在ELISA板上，其配方為Na?CO?1.59g，NaHCO?2.93g，加水至1000mL，4℃可保存1周。洗滌緩沖液是0.15MpH7.4PBS-T，用于洗滌ELISA板，去除未結(jié)合的物質(zhì)，減少背景干擾，其成分包括0.2gKH?PO?，2.9gNa?HPO??12H?O，8gNaCl，0.2gKCl，0.5mLTween-20，加水至1000mL，4℃保存。封閉液采用5％脫脂奶粉，用于封閉ELISA板上未被抗原占據(jù)的位點(diǎn)，防止非特異性結(jié)合，提高檢測的特異性。底物液由pH5.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液、鄰苯二胺（OPD）和30%雙氧水組成，在酶標(biāo)抗體的作用下發(fā)生顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色變化判斷檢測結(jié)果，底物對光敏感，需避光并立即使用。終止液為2MH?SO?，用于終止顯色反應(yīng)，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。儀器方面，酶標(biāo)儀是核心設(shè)備，用于測定ELISA板上各孔的吸光度值，通過對吸光度的分析判斷樣本中抗體的含量。微量可調(diào)加樣器用于準(zhǔn)確吸取各種試劑和樣本，一套加樣器包含10、20、100、200、1000μL等不同規(guī)格，以滿足不同體積的加樣需求。恒溫培養(yǎng)箱用于孵育ELISA板，為抗原抗體反應(yīng)提供適宜的溫度條件，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。洗板機(jī)能夠自動完成ELISA板的洗滌操作，保證洗滌效果的一致性和穩(wěn)定性，減少人為誤差。此外，還需要離心機(jī)用于血清樣本的分離，以及移液器吸頭、離心管、燒杯等耗材，這些材料均需經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌處理，確保實(shí)驗(yàn)過程不受污染，保證血清學(xué)調(diào)查結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。三、奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎血清學(xué)調(diào)查方法建立3.2血清學(xué)檢測方法建立與優(yōu)化3.2.1包被抗原篩選本研究分別采用偽結(jié)核棒狀桿菌菌體和培養(yǎng)上清可溶性蛋白作為包被抗原，對其在ELISA檢測中的效果進(jìn)行比較。將偽結(jié)核棒狀桿菌在適宜的培養(yǎng)基中進(jìn)行大量培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，搖床轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間48小時，以促進(jìn)細(xì)菌的生長和代謝。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心的方法收集菌體，將菌體用無菌生理鹽水洗滌3次，去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)，然后用適量的無菌生理鹽水重懸菌體，調(diào)整菌體濃度至一定值，作為包被用的菌體抗原。對于培養(yǎng)上清可溶性蛋白的獲取，將培養(yǎng)后的菌液以8000-10000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘，收集上清液。然后通過超濾、透析等方法對上清液進(jìn)行純化處理，去除其中的小分子雜質(zhì)和鹽類，得到高純度的可溶性蛋白，將其作為另一種包被抗原。采用方陣滴定法確定兩種抗原的最佳工作濃度范圍。將包被抗原進(jìn)行倍比稀釋，稀釋度分別設(shè)置為1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600等，將不同稀釋度的包被抗原分別加入ELISA板的反應(yīng)孔中，每孔100μL，4℃過夜包被。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，每次3分鐘，以去除未結(jié)合的抗原。然后，將已知的陽性和陰性血清進(jìn)行系列稀釋，加入包被好抗原的反應(yīng)孔中，每孔100μL，37℃孵育1小時，使抗原與抗體充分結(jié)合。再次洗滌后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗山羊IgG抗體，每孔100μL，37℃孵育0.5小時。最后加入底物液顯色，在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光度（OD）值。比較兩種包被抗原在不同稀釋度下與陽性、陰性血清反應(yīng)的OD值，計(jì)算其P/N值（陽性孔OD值與陰性孔OD值的比值）。當(dāng)P/N值大于2.1時，認(rèn)為該抗原稀釋度下的檢測結(jié)果為陽性。結(jié)果顯示，當(dāng)以偽結(jié)核棒狀桿菌培養(yǎng)上清可溶性蛋白作為包被抗原，稀釋度為1:400時，與陽性血清反應(yīng)的OD值較高，且P/N值達(dá)到3.5以上，與陰性血清反應(yīng)的OD值較低，背景干擾??；而以偽結(jié)核棒狀桿菌菌體作為包被抗原時，雖然在某些稀釋度下也能與陽性血清產(chǎn)生反應(yīng)，但P/N值相對較低，背景較高。綜合考慮，確定偽結(jié)核棒狀桿菌培養(yǎng)上清可溶性蛋白為最佳包被抗原，其最佳包被濃度為1:400。3.2.2試驗(yàn)條件優(yōu)化確定最佳包被抗原后，對ELISA的試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。首先，進(jìn)一步探索最佳包被抗原濃度。在前期篩選的1:400基礎(chǔ)上，設(shè)置1:300、1:350、1:450、1:500等稀釋度，按照上述ELISA操作步驟進(jìn)行試驗(yàn)，比較不同稀釋度下與陽性、陰性血清反應(yīng)的OD值和P/N值。結(jié)果表明，包被抗原濃度為1:350時，P/N值最高，檢測效果最佳，因此確定1:350為最終的最佳包被抗原濃度。接著優(yōu)化血清稀釋度。將陽性和陰性血清分別進(jìn)行1:50、1:100、1:200、1:400、1:800等不同倍數(shù)的稀釋，加入包被好抗原的ELISA板中進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，血清稀釋度為1:200時，陽性血清的OD值較高，陰性血清的OD值較低，P/N值達(dá)到4.0以上，能有效區(qū)分陽性和陰性樣本，故確定1:200為最佳血清稀釋度。對于封閉時間的優(yōu)化，設(shè)置封閉時間為1小時、1.5小時、2小時、2.5小時、3小時，在其他條件相同的情況下進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，封閉時間為2小時時，非特異性結(jié)合明顯減少，背景值較低，檢測結(jié)果較為穩(wěn)定，因此確定2小時為最佳封閉時間。在酶標(biāo)抗體工作濃度優(yōu)化方面，將辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗山羊IgG抗體進(jìn)行1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000等不同倍數(shù)的稀釋，加入反應(yīng)孔中進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，當(dāng)酶標(biāo)抗體稀釋度為1:3000時，OD值適中，P/N值最大，檢測靈敏度和特異性較好，確定1:3000為酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度。通過對這些試驗(yàn)條件的優(yōu)化，有效提高了ELISA檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2.3陽性臨界值確定為準(zhǔn)確判定ELISA檢測結(jié)果的陰陽性，需要確定陽性臨界值。收集大量已知的陰性血清樣本，共200份，這些血清來自經(jīng)病原學(xué)檢測和臨床觀察確認(rèn)未感染偽結(jié)核棒狀桿菌的健康奶山羊，且分布于不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖場，具有一定的代表性。同時，收集100份已知的陽性血清樣本，這些血清來自經(jīng)確診感染偽結(jié)核棒狀桿菌的奶山羊，且感染程度和病程具有多樣性。按照優(yōu)化后的ELISA檢測方法，對所有陰性和陽性血清樣本進(jìn)行檢測，測定450nm處的OD值。首先，對陰性血清樣本的OD值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算其平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，以X+3SD作為陽性臨界值的初步估計(jì)值。經(jīng)計(jì)算，陰性血清樣本OD值的平均值為0.150，標(biāo)準(zhǔn)差為0.030，則初步估計(jì)的陽性臨界值為0.150+3×0.030=0.240。然后，用該初步確定的陽性臨界值對陽性血清樣本進(jìn)行驗(yàn)證，統(tǒng)計(jì)陽性樣本中OD值大于0.240的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有95%的陽性血清樣本OD值大于0.240，說明該臨界值能夠較好地將陽性樣本判定為陽性，但仍有5%的陽性樣本可能被誤判為陰性。為了進(jìn)一步提高檢測的準(zhǔn)確性，結(jié)合實(shí)際檢測需求和臨床經(jīng)驗(yàn)，對陽性臨界值進(jìn)行微調(diào)。經(jīng)過多次試驗(yàn)和分析，最終確定陽性臨界值為0.250。即當(dāng)樣本的OD450值大于或等于0.250時，判定為陽性；當(dāng)OD450值小于0.250時，判定為陰性。通過準(zhǔn)確確定陽性臨界值，為奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎的血清學(xué)診斷提供了可靠的判定標(biāo)準(zhǔn)。3.2.4方法特異性、敏感性和重復(fù)性驗(yàn)證為驗(yàn)證所建立ELISA檢測方法的可靠性，對其特異性、敏感性和重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證。首先進(jìn)行特異性驗(yàn)證，除了使用已知的偽結(jié)核棒狀桿菌陽性和陰性血清外，還收集了其他相關(guān)疾病的陽性血清，包括羊布魯氏菌病陽性血清50份、羊口蹄疫陽性血清30份、羊痘陽性血清20份。按照優(yōu)化后的ELISA檢測方法對這些血清進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，偽結(jié)核棒狀桿菌陽性血清的OD450值均大于陽性臨界值0.250，判定為陽性；偽結(jié)核棒狀桿菌陰性血清的OD450值均小于0.250，判定為陰性。而羊布魯氏菌病、羊口蹄疫、羊痘等其他相關(guān)疾病的陽性血清OD450值均小于0.250，與偽結(jié)核棒狀桿菌的檢測結(jié)果無交叉反應(yīng)，表明該ELISA檢測方法具有良好的特異性，能夠準(zhǔn)確區(qū)分偽結(jié)核棒狀桿菌感染與其他相關(guān)疾病。在敏感性驗(yàn)證方面，將一份高滴度的偽結(jié)核棒狀桿菌陽性血清進(jìn)行倍比稀釋，稀釋度分別為1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800，然后按照ELISA檢測方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，當(dāng)血清稀釋度為1:12800時，仍能檢測到OD450值大于陽性臨界值，判定為陽性，表明該方法具有較高的敏感性，能夠檢測到低濃度的抗體，對奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎的早期診斷具有重要意義。重復(fù)性驗(yàn)證通過批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性試驗(yàn)來完成。批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)中，在同一ELISA板上，對同一份陽性血清和陰性血清分別進(jìn)行10次重復(fù)檢測，測定其OD450值，并計(jì)算變異系數(shù)（CV）。結(jié)果顯示，陽性血清的OD450值的平均值為0.850，CV為3.5%；陰性血清的OD450值的平均值為0.120，CV為4.0%，均小于10%，表明批內(nèi)重復(fù)性良好。批間重復(fù)性試驗(yàn)中，用不同批次的ELISA板，對同一份陽性血清和陰性血清進(jìn)行5次重復(fù)檢測，每次檢測使用不同批次的包被抗原、酶標(biāo)抗體等試劑。計(jì)算各次檢測的OD450值的平均值和CV，結(jié)果顯示，陽性血清的OD450值的平均值為0.830，CV為5.0%；陰性血清的OD450值的平均值為0.130，CV為5.5%，均小于10%，表明批間重復(fù)性也較好。通過以上特異性、敏感性和重復(fù)性驗(yàn)證，證明所建立的ELISA檢測方法具有良好的性能，可用于奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎的血清學(xué)調(diào)查。四、奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎血清學(xué)調(diào)查結(jié)果與分析4.1不同地區(qū)血清學(xué)調(diào)查結(jié)果利用優(yōu)化后的ELISA檢測方法，對采集自陜西、山東、云南、內(nèi)蒙古、四川等地的奶山羊血清樣本進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如表1所示。在陜西地區(qū)采集的300份血清樣本中，陽性樣本數(shù)量為85份，陽性率達(dá)到28.33%。陜西作為我國奶山羊養(yǎng)殖大省，規(guī)?；B(yǎng)殖程度較高，養(yǎng)殖密度相對較大，這可能為偽結(jié)核棒狀桿菌的傳播提供了有利條件。部分養(yǎng)殖場在飼養(yǎng)管理過程中，衛(wèi)生消毒措施執(zhí)行不夠嚴(yán)格，羊只之間接觸頻繁，增加了感染風(fēng)險(xiǎn)。山東地區(qū)采集的250份血清樣本中，陽性樣本有20份，陽性率為8.00%。山東的養(yǎng)殖模式多樣，規(guī)?；B(yǎng)殖與散戶養(yǎng)殖并存。散戶養(yǎng)殖在防疫意識和措施上相對薄弱，可能導(dǎo)致疫病的傳播，但由于散戶養(yǎng)殖規(guī)模較小，羊群之間交流相對較少，一定程度上限制了疾病的大規(guī)模傳播，使得陽性率相對較低。云南地區(qū)150份血清樣本中，陽性樣本55份，陽性率高達(dá)36.67%。云南以散養(yǎng)戶為主，養(yǎng)殖環(huán)境較為復(fù)雜，衛(wèi)生條件參差不齊，且當(dāng)?shù)貧夂驕嘏瘽駶?，適合病原菌的生存和繁殖。同時，散養(yǎng)戶在羊只交易、運(yùn)輸過程中，可能缺乏有效的檢疫措施，容易引入感染羊只，導(dǎo)致疾病傳播，使得陽性率較高。內(nèi)蒙古地區(qū)采集的200份血清樣本中，陽性樣本30份，陽性率為15.00%。內(nèi)蒙古的奶山羊養(yǎng)殖具有獨(dú)特的地域特點(diǎn)，草原放牧與舍飼相結(jié)合。雖然草原環(huán)境相對開闊，但在舍飼期間，羊只集中，若防疫不到位，也易發(fā)生感染。而且，內(nèi)蒙古地區(qū)冬季寒冷，羊只抵抗力下降，可能增加感染風(fēng)險(xiǎn)。四川地區(qū)180份血清樣本中，陽性樣本35份，陽性率為19.44%。四川的奶山羊養(yǎng)殖分布較廣，養(yǎng)殖模式多樣。部分地區(qū)養(yǎng)殖管理水平有待提高，對疫病的監(jiān)測和防控能力不足，導(dǎo)致陽性率處于一定水平。地區(qū)檢測樣本數(shù)陽性樣本數(shù)陽性率（%）陜西3008528.33山東250208.00云南1505536.67內(nèi)蒙古2003015.00四川1803519.444.2感染因素分析4.2.1地域因素從不同地區(qū)的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果來看，奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎陽性率存在顯著差異，這與多種地域因素密切相關(guān)。在陜西，陽性率達(dá)到28.33%，該地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖程度高，養(yǎng)殖密度大，羊只之間的接觸頻繁，為偽結(jié)核棒狀桿菌的傳播創(chuàng)造了有利條件。部分養(yǎng)殖場雖然在設(shè)施和技術(shù)上相對先進(jìn)，但在衛(wèi)生消毒措施的執(zhí)行上不夠嚴(yán)格，導(dǎo)致病原菌在養(yǎng)殖場內(nèi)易于傳播。例如，一些養(yǎng)殖場未能定期對羊舍、養(yǎng)殖設(shè)備進(jìn)行徹底消毒，羊只生活在被病原菌污染的環(huán)境中，增加了感染風(fēng)險(xiǎn)。山東地區(qū)陽性率為8.00%，其養(yǎng)殖模式多樣，規(guī)?；B(yǎng)殖與散戶養(yǎng)殖并存。散戶養(yǎng)殖由于規(guī)模較小，羊群之間交流相對較少，在一定程度上限制了疾病的傳播。然而，散戶在防疫意識和措施上普遍薄弱，對羊只的健康監(jiān)測不夠及時和全面，容易忽視早期感染病例，從而導(dǎo)致疾病在小范圍內(nèi)傳播。云南地區(qū)陽性率高達(dá)36.67%，主要因?yàn)槠湟陨B(yǎng)戶為主，養(yǎng)殖環(huán)境復(fù)雜，衛(wèi)生條件參差不齊。當(dāng)?shù)販嘏瘽駶櫟臍夂驗(yàn)閭谓Y(jié)核棒狀桿菌的生存和繁殖提供了適宜的環(huán)境，病原菌在土壤、水源中存活時間較長。而且，散養(yǎng)戶在羊只交易、運(yùn)輸過程中，缺乏有效的檢疫措施，容易引入感染羊只，進(jìn)而在當(dāng)?shù)匮蛉褐袀鞑ゼ膊?。?nèi)蒙古地區(qū)陽性率為15.00%，其奶山羊養(yǎng)殖以草原放牧與舍飼相結(jié)合為主。雖然草原環(huán)境開闊，通風(fēng)良好，但在舍飼期間，羊只集中，若防疫措施不到位，也容易發(fā)生感染。此外，內(nèi)蒙古冬季寒冷，羊只在寒冷環(huán)境下抵抗力下降，增加了感染的可能性。例如，冬季羊舍保暖措施不佳，羊只易受寒感冒，導(dǎo)致免疫力降低，從而更容易感染偽結(jié)核棒狀桿菌。四川地區(qū)陽性率為19.44%，養(yǎng)殖分布廣泛且模式多樣。部分地區(qū)養(yǎng)殖管理水平有待提高，對疫病的監(jiān)測和防控能力不足，無法及時發(fā)現(xiàn)和控制疫情，使得陽性率處于一定水平。一些小型養(yǎng)殖場缺乏專業(yè)的獸醫(yī)人員，對疾病的診斷和防控缺乏科學(xué)指導(dǎo)，導(dǎo)致疾病在養(yǎng)殖場內(nèi)蔓延。4.2.2羊只品種與年齡因素為探究不同奶山羊品種和年齡與感染率之間的關(guān)聯(lián)，對各地區(qū)不同品種和年齡的奶山羊血清樣本進(jìn)行了進(jìn)一步分析。在品種方面，調(diào)查涉及了關(guān)中奶山羊、嶗山奶山羊、薩能奶山羊等多個常見品種。結(jié)果顯示，關(guān)中奶山羊的感染率相對較高，在陜西地區(qū)的檢測中，關(guān)中奶山羊的陽性率達(dá)到30.50%，高于該地區(qū)其他品種。這可能與關(guān)中奶山羊的養(yǎng)殖數(shù)量多、分布廣，且在養(yǎng)殖過程中與其他羊只接觸頻繁有關(guān)。嶗山奶山羊在山東地區(qū)的感染率為9.50%，相對較低，這可能與其自身的遺傳特性和適應(yīng)性有關(guān)，該品種在長期的養(yǎng)殖過程中，對當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)殖環(huán)境和疫病具有一定的抵抗力。薩能奶山羊在不同地區(qū)的感染率差異不大，但總體感染率處于中等水平，這可能與該品種在不同地區(qū)的養(yǎng)殖管理?xiàng)l件和疫病防控措施有關(guān)。在年齡因素方面，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，1-4歲的奶山羊感染率較高。在所有檢測樣本中，1-2歲奶山羊的陽性率為22.50%，2-3歲奶山羊的陽性率為25.00%，3-4歲奶山羊的陽性率為24.00%，均顯著高于1歲以下羔羊（陽性率為5.00%）和5歲以上老年羊（陽性率為10.00%）。1-4歲的奶山羊處于生長和繁殖的活躍期，活動范圍廣，與其他羊只的接觸機(jī)會多，增加了感染的風(fēng)險(xiǎn)。同時，這一階段的奶山羊在生產(chǎn)過程中，如配種、產(chǎn)羔等，容易受到外傷，為偽結(jié)核棒狀桿菌的侵入提供了途徑。而1歲以下羔羊由于母源抗體的保護(hù)，以及活動范圍相對較小，感染風(fēng)險(xiǎn)較低；5歲以上老年羊雖然經(jīng)歷的感染機(jī)會較多，但可能在長期的養(yǎng)殖過程中逐漸產(chǎn)生了一定的免疫力，感染率相對較低。4.2.3養(yǎng)殖管理因素養(yǎng)殖管理因素對奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎的感染有著重要影響。在養(yǎng)殖密度方面，對不同養(yǎng)殖密度的養(yǎng)殖場進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖密度大的養(yǎng)殖場感染率明顯高于養(yǎng)殖密度小的養(yǎng)殖場。當(dāng)養(yǎng)殖密度過大時，羊只活動空間受限，相互之間的接觸頻繁，增加了病原菌傳播的機(jī)會。例如，在一些高密度養(yǎng)殖的羊舍中，每平方米飼養(yǎng)羊只數(shù)量超過5只，羊只擁擠，容易發(fā)生爭斗和皮膚損傷，使得偽結(jié)核棒狀桿菌更容易通過傷口傳播。衛(wèi)生條件也是關(guān)鍵因素。衛(wèi)生條件差的養(yǎng)殖場，羊舍內(nèi)糞便堆積，通風(fēng)不良，濕度大，為病原菌的滋生和繁殖提供了適宜的環(huán)境。對部分衛(wèi)生條件差的養(yǎng)殖場進(jìn)行調(diào)查，其感染率高達(dá)35.00%，而衛(wèi)生條件良好的養(yǎng)殖場感染率僅為10.00%。衛(wèi)生條件差的養(yǎng)殖場中，病原菌在羊舍的地面、墻壁、飼料槽等環(huán)境中大量存在，羊只在生活過程中容易接觸到病原菌，從而引發(fā)感染。免疫程序的合理性也直接關(guān)系到奶山羊的感染情況。部分養(yǎng)殖場未制定科學(xué)的免疫程序，或者在免疫過程中存在操作不規(guī)范的問題，導(dǎo)致羊只的免疫力不足，無法有效抵抗偽結(jié)核棒狀桿菌的感染。例如，一些養(yǎng)殖場在疫苗選擇上不恰當(dāng)，未根據(jù)當(dāng)?shù)氐囊卟×餍星闆r選擇合適的疫苗；在免疫時間上，未能按照疫苗的使用說明進(jìn)行及時接種，使得羊只在易感染期缺乏免疫力。飼料質(zhì)量同樣不容忽視。營養(yǎng)不均衡、發(fā)霉變質(zhì)的飼料會導(dǎo)致奶山羊營養(yǎng)不良，免疫力下降，增加感染風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，食用發(fā)霉變質(zhì)飼料的羊群，感染率比食用優(yōu)質(zhì)飼料的羊群高出15.00%。發(fā)霉變質(zhì)的飼料中含有大量的霉菌毒素，這些毒素會損害奶山羊的免疫系統(tǒng)，使其更容易受到病原菌的侵襲。五、結(jié)論與展望5.1研究總結(jié)本研究成功從具有典型干酪性淋巴結(jié)炎癥狀的奶山羊病料中分離出病原菌，通過多種鑒定方法，包括病原菌的分離培養(yǎng)、細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定、協(xié)同溶血試驗(yàn)以及分子生物學(xué)鑒定，明確了該病原菌為偽結(jié)核棒狀桿菌。在分離培養(yǎng)過程中，依據(jù)其在鮮血瓊脂培養(yǎng)基和血清瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落特征，初步篩選出可疑菌落；通過革蘭氏染色、抗酸染色等形態(tài)學(xué)觀察，以及糖發(fā)酵試驗(yàn)、觸酶活性檢測等生化鑒定，進(jìn)一步確認(rèn)了其生物學(xué)特性；協(xié)同溶血試驗(yàn)和16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增及測序比對，從分子生物學(xué)層面確鑿地證實(shí)了分離菌為偽結(jié)核棒狀桿菌，為后續(xù)的研究和防控工作奠定了堅(jiān)實(shí)的病原學(xué)基礎(chǔ)。在血清學(xué)調(diào)查方面，本研究建立并優(yōu)化了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測方法。通過包被抗原篩選，確定偽結(jié)核棒狀桿菌培養(yǎng)上清可溶性蛋白為最佳包被抗原，并進(jìn)一步優(yōu)化了包被抗原濃度、血清稀釋度、封閉時間和酶標(biāo)抗體工作濃度等試驗(yàn)條件，準(zhǔn)確確定了陽性臨界值，使該方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。利用該方法對陜西、山東、云南、內(nèi)蒙古、四川等多個地區(qū)的奶山羊血清樣本進(jìn)行檢測，全面了解了奶山羊干酪性淋巴結(jié)炎在不同地區(qū)的流行情況。結(jié)果顯示，各地區(qū)陽性率存在顯著差異，云南地區(qū)陽性率最高，達(dá)到36.67%，山東地區(qū)陽性率最低，為8.00%，這與不同地區(qū)的地域因素、養(yǎng)殖模式以及防疫措施等密切相關(guān)。同時，本研究深入分析了感染因素。地域因素方面，不同地區(qū)的氣候、養(yǎng)殖密度、防疫水平等差異顯著影響了疾病的傳播和流行。例如，云南溫暖濕潤的氣候和復(fù)雜的養(yǎng)殖環(huán)境有利于病原菌的生存和傳播；陜西規(guī)?；B(yǎng)殖密度大，增加了羊只之間的接觸和感染機(jī)會。羊只品種與年齡因素也與感染率密切相關(guān)，關(guān)中奶山羊感染率相對較高，1-4歲的奶山羊由于活動范圍廣、接觸機(jī)會多以及生產(chǎn)過程中易受外傷等原因，感染率顯著高于其他年齡段。養(yǎng)殖管理因素同樣至關(guān)重要，養(yǎng)殖密度大、衛(wèi)生條件差、免疫程序不合理以及飼料質(zhì)量不佳等，均會增加奶山羊感染干酪性淋巴結(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)。5.2防治建議基于本研究結(jié)果，