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團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CVMAXXXXX—XXXX

非洲豬瘟病毒一體化分子檢測(cè)方法

Automaticintelligentmoleculardetectionmethod

forAfricanswinefevervirus

征求意見稿

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布

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非洲豬瘟病毒一體化分子檢測(cè)方法

1范圍

本文件規(guī)定了非洲豬瘟病毒一體化分子檢測(cè)方法的技術(shù)原理、試劑與耗材、儀器設(shè)備、操作方法和

結(jié)果判定。

本文件適用于豬唾液、血清或血漿、拭子（包括口鼻拭子、血拭子、肛拭子）、組織研磨液、種豬

精液中非洲豬瘟病毒核酸的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

SN/T1193基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1MAOPA技術(shù)

MAOPA（MagneticbeadsmediatedAll-in-OnePolymeraseAmplification）技術(shù)，即磁珠介導(dǎo)的一體

化聚合酶擴(kuò)增技術(shù)，實(shí)現(xiàn)磁珠貫穿核酸檢測(cè)的全流程，減少了樣品核酸隨著吸附、洗滌、洗脫直至擴(kuò)增

逐級(jí)發(fā)生的損耗，具備較強(qiáng)的兼容性，可為各類核酸檢測(cè)方法的一體化提供技術(shù)平臺(tái)。

3.2Unigen系統(tǒng)

Unigen系統(tǒng)是基于MAOPA技術(shù)開發(fā)的智能軟件、搭配精密硬件的全封閉智能分析系統(tǒng)，采用微流

控卡槽式芯片技術(shù)將核酸提取與分子擴(kuò)增整合在一體化全封閉反應(yīng)裝置中。

4符號(hào)和縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件。

ASFV：非洲豬瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus）

DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAcid）

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）

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5原理

本方法針對(duì)非洲豬瘟病毒P72基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，并根據(jù)隨機(jī)DNA序列設(shè)計(jì)了內(nèi)標(biāo)引

物和探針，同時(shí)將核酸提取與熒光PCR擴(kuò)增通過(guò)微流控卡槽式芯片技術(shù)整合為一體，病原核酸可隨著磁

珠全部進(jìn)入反應(yīng)體系，實(shí)現(xiàn)基于MAOPA技術(shù)的一體化分子檢測(cè)。其中檢測(cè)卡盒為本試劑盒重要組分之

一，在一體化卡盒的不同腔體位置依次裝填各檢測(cè)試劑密封后制備而成。其特征在于：通過(guò)在一個(gè)密閉

卡盒內(nèi)設(shè)置多個(gè)分離腔體，相鄰分離腔體之間使用柱塞阻斷，分離腔體內(nèi)分別放置有裂解液、洗滌液和

反應(yīng)液；檢測(cè)樣品時(shí)，推動(dòng)各個(gè)柱塞，使柱塞的柱塞孔對(duì)準(zhǔn)分離腔體，進(jìn)而導(dǎo)通各個(gè)分離腔體，利用電

磁控制方式，控制隨待測(cè)樣品一同加入的磁珠，依次經(jīng)過(guò)各個(gè)分離腔體，完成樣品核酸的吸附、洗滌、

洗脫和反應(yīng)，最后從外部對(duì)反應(yīng)液中基因擴(kuò)增引起的熒光信號(hào)變化進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)。與傳統(tǒng)的熒光PCR

方法比較，非洲豬瘟病毒一體化分子檢測(cè)方法操作更加便捷，特異性、敏感性、重復(fù)性好，降低污染風(fēng)

險(xiǎn)，為非洲豬瘟病毒的感染早期的精準(zhǔn)檢測(cè)及環(huán)境監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支撐。

6試劑和耗材

6.1試劑

6.1.1除特別說(shuō)明以外，本文件所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水符合GB/T6682中二級(jí)水的要求。

6.1.2洗滌液Ⅰ，按照附錄A中A.1配制。

6.1.3洗滌液Ⅱ，按照附錄A中A.2配制。

6.1.4裂解液，按照附錄A中A.3配制。

6.1.5磁珠，按照附錄A中A.4配制。

6.1.6針對(duì)非洲豬瘟病毒P72基因序列設(shè)計(jì)的特異性引物和探針，并根據(jù)隨機(jī)DNA序列設(shè)計(jì)的內(nèi)標(biāo)

引物和探針。P72基因序列和內(nèi)標(biāo)基因序列見附錄B，引物和探針序列見表1。

表1引物和探針序列

名稱序列

ASFV檢測(cè)上游引物5’-GCCTTATGTTCCAGTAGGGT-3’

ASFV檢測(cè)下游引物5’-AGTCTCCGTACTGGGGAATAC-3’

ASFV檢測(cè)探針5’-（FAM）AGGTGGGGGTACCCGTATGC（BHQ1）-3’

內(nèi)標(biāo)上游引物5’-GGGATATACTACCTAAGGTTA-3’

內(nèi)標(biāo)下游引物5’-TGGTCGATTTACTAGAATTG-3’

內(nèi)標(biāo)探針5’-（ROX）CCTATTCAACGTATCGACATGGCTTAC（BHQ1）-3’

6.1.7非洲豬瘟病毒陽(yáng)性對(duì)照樣品：培養(yǎng)的滅活病毒，由指定單位提供；或?yàn)楹蠵72基因的重組大

腸桿菌菌液。

6.1.8非洲豬瘟病毒陰性對(duì)照樣品：可采用健康豬的組織材料。

6.1.9內(nèi)標(biāo)樣品：含有人工內(nèi)標(biāo)基因的重組大腸桿菌菌液。

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6.1.10其它商品化試劑：石蠟、硅油、熒光PCR預(yù)混液（2×）等。

6.1.11無(wú)菌去離子水，符合GB/T6682要求。

6.2耗材

6.2.1一體化檢測(cè)卡盒。

6.2.2離心管（1.5mL，無(wú)核酸酶）。

6.2.3微量移液器吸頭（10μL、200μL、1000μL，無(wú)核酸酶）。

7儀器設(shè)備

7.1二級(jí)生物安全柜。

7.2Unigen?全封閉智能分析系統(tǒng)

7.3微量可調(diào)移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同規(guī)格）。

7.4組織勻漿器。

7.5臺(tái)式高速離心機(jī)。

8樣品采集、處理和儲(chǔ)存

8.1生物安全措施

樣品采集及運(yùn)輸?shù)纳锇踩胧┌础禢Y/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范》的規(guī)

定執(zhí)行；樣品處理的生物安全措施按《GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》的規(guī)定執(zhí)行；基因檢測(cè)實(shí)

驗(yàn)室按《SN/T1193基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求》的規(guī)定執(zhí)行。

8.2樣品采集及運(yùn)輸

樣品采集及運(yùn)輸按照NY/T541的規(guī)定執(zhí)行。采集豬全血、血清、口鼻拭子等液體樣品，脾臟、扁桃

體、淋巴結(jié)、腎臟、骨髓、肌肉等組織樣品，飼料、污水等周邊環(huán)境樣品用于檢測(cè)，樣品應(yīng)在冷藏條件下

盡快運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，避免反復(fù)凍融。采樣時(shí)應(yīng)穿戴個(gè)人生物安全防護(hù)裝備，結(jié)束后嚴(yán)格按NY/T541的規(guī)定

實(shí)施現(xiàn)場(chǎng)消毒和廢棄物處理。

8.3樣品處理

應(yīng)在Ⅱ級(jí)生物安全柜中處理檢測(cè)前樣品。樣品處理方法如下：

8.3.1唾液樣品：5000r/min離心2min，吸取200μL上清上樣。

8.3.2拭子（包括口鼻拭子、血拭子、肛拭子）樣品：5000r/min離心2min，吸取上清待檢。

8.3.3組織研磨液樣品：5000r/min離心5min，吸取上清待檢。

8.3.4種豬精液樣品：反復(fù)凍融3次，5000r/min離心2min，吸取上清待檢。

8.3.5血清或血漿樣品：無(wú)需處理，可直接吸取待檢。

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8.4樣品存放

采集或處理好的樣品在2℃～8℃保存應(yīng)不超過(guò)24小時(shí)；若需長(zhǎng)期保存，須放置?70℃以下保存，并

應(yīng)避免反復(fù)凍融。

9操作步驟

9.1擴(kuò)增反應(yīng)液的配制

將40μmol/LASFV檢測(cè)上游和下游引物各0.5μL，20μmol/L探針0.4μL，與40μmol/L內(nèi)標(biāo)上游、下游

引物各0.4μL、20μmol/L探針0.3μL，熒光PCR預(yù)混液（2×）20μL，無(wú)菌去離子水17.5μL混合均勻。

9.2檢測(cè)卡盒的裝填

將40μL擴(kuò)增反應(yīng)液、0.058g石蠟（加熱溶解后裝填）、0.51g硅油、各140μL洗滌液Ⅱ、洗滌液Ⅰ和1.2mL

裂解液依次灌裝至一體化空卡盒對(duì)應(yīng)位置，完成檢測(cè)卡盒的裝填，如附錄A.5中圖1所示。

9.3一體化分子檢測(cè)

9.3.1加樣

打開檢測(cè)卡盒頂蓋，分別向各卡盒中加入20μL內(nèi)標(biāo)樣品、10μL磁珠（需提前混勻）及200μL-600μL

待測(cè)樣品，蓋緊卡盒頂蓋，水平搖晃，使檢測(cè)卡盒內(nèi)液體充分混勻，轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)，每次檢測(cè)設(shè)陰、陽(yáng)

性對(duì)照。

9.3.2測(cè)定

打開Unigen?全封閉智能分析系統(tǒng)翻蓋，按提示將檢測(cè)卡盒插入儀器相應(yīng)的檢測(cè)通道，按緊。提取

部分運(yùn)行參數(shù)為：裂解35℃8分鐘；擴(kuò)增部分運(yùn)行參數(shù)為：預(yù)變性95°C5分鐘；變性95°C15秒、退火延

伸58°C30秒，共45個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，于每一循環(huán)退火結(jié)束時(shí)收集FAM和ROX熒光信號(hào)。

10結(jié)果判定

10.1試驗(yàn)成立條件

陽(yáng)性對(duì)照顯示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，同時(shí)FAM通道Ct值≤30并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且內(nèi)標(biāo)ROX通道

Ct值≤30并呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線；陰性對(duì)照顯示檢測(cè)結(jié)果為陰性，同時(shí)FAM通道無(wú)Ct值且無(wú)典型的擴(kuò)

增曲線，且內(nèi)標(biāo)ROX通道Ct值≤30并呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，則判為試驗(yàn)成立。

10.2結(jié)果判定

10.2.1陽(yáng)性

待檢樣品FAM通道Ct值＜36并呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，ROX通道Ct值≤30并呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

10.2.2陰性

待檢樣品FAM通道無(wú)Ct值且無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，ROX通道Ct值≤30并呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

10.2.3復(fù)檢

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待檢樣品FAM通道36≤Ct值≤45并呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，ROX通道Ct值≤30并呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲

線，判為疑似；對(duì)疑似樣品按原條件進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果FAM通道Ct值≤45并呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，ROX

通道Ct值≤30并呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，則判為陽(yáng)性；否則判為陰性。

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附錄A（規(guī)范性附錄）

溶液配制及檢測(cè)卡盒裝填

A.1洗滌液Ⅰ

稱取15.138g三羥甲基氨基甲烷、100g聚乙二醇，加滅菌純化水定容至1L，混合均勻，0.22μm濾膜

過(guò)濾除菌。

A.2洗滌液Ⅱ

稱取6.055g三羥甲基氨基甲烷、15g氯化鉀、300mL無(wú)水乙醇，加滅菌純化水定容至1L，混合均勻，

0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。

A.3裂解液

稱取486.59g異硫氰酸胍、26.8g無(wú)水乙酸鈉、60mLTritonX-100、2mL乙酸，加滅菌純化水定容至

1L，混合均勻，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。

A.4磁珠

用商品化HEPES緩沖液（1mol/L）將商品化磁珠進(jìn)行10倍稀釋，混合均勻。

A.5檢測(cè)卡盒裝填

圖1檢測(cè)卡盒裝填示意圖

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附錄B（資料性附錄）

P72基因序列和內(nèi)標(biāo)序列

B.1P72基因序列

5'-ATGGCATCAGGAGGAGCTTTTTGTCTTATTGCTAACGATGGGAAGGCCGACAAGATTATATT

GGCCCAAGACTTGCTGAATAGCAGGATCTCTAACATTAAAAATGTGAACAAAAGTTATGGGAAAC

CCGATCCCGAACCCACTTTGAGTCAAATCGAAGAAACACATTTGGTGCATTTTAATGCGCATTTTA

AGCCTTATGTTCCAGTAGGGTTTGAATACAATAAAGTACGCCCGCATACGGGTACCCCCACCTTGG

GAAACAAGCTTACCTTTGGTATTCCCCAGTACGGAGACTTTTTCCATGATATGGTGGGCCATCATAT

ATTGGGTGCATGTCATTCATCCTGGCAGGATGCTCCGATTCAGGGCACGTCCCAGATGGGGGCCCA

TGGGCAGCTTCAAACGTTTCCTCGCAACGGATATGACTGGGACAACCAAACACCCTTAGAGGGCG

CCGTTTACACGCTTGTAGATCCTTTTGGAAGACCCATTGTACCCGGCACAAAGAATGCGTACCGAA

ACTTGGTTTACTACTGCGAATACCCCGGAGAACGACTTTATGAAAACGTAAGATTCGATGTAAATG

GAAATTCCCTAGACGAATATAGTTCGGATGTCACAACGCTTGTGCGCAAATTTTGCATCCCAGGGG

ATAAAATGACTGGATATAAGCACTTGGTTGGCCAGGAGGTATCGGTGGAGGGAACCAGTGGCCCT

CTCCTATGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGCAAACCTATTCTTACCGATGAAAATG

ATACGCAGCGAACGTGTAGCCATACCAACCCGAAATTTCTTTCACAGCATTTTCCCGAGAACTCTC

ACAATATCCAAACAGCAGGTAAACAAGATATTACTCCTATCACGGACGCAACGTATCTGGACATAA

GACGTAATGTTCATTACAGCTGTAATGGACCTCAAACCCCTAAATACTATCAGCCCCCTCTTGCGCT

CTGGATTAAGTTGCGCTTTTGGTTTAATGAGAACGTGAACCTTGCTATTCCCTCAGTATCCATTCCC

TTCGGCGAGCGCTTTATCACCATAAAGCTTGCATCGCAAAAGGATTTGGTGAATGAATTTCCTGGA

CTTTTTGTACGCCAGTCACGTTTTATAGCTGGACGCCCCAGTAGACGCAATATACGCTTTAAACCAT

GGTTTATCCCAGGAGTCATTAATGAAATCTCGCTCACGAATAATGAACTTTACATCAATAACCTGTT

TGTAACCCCTGAAATACACAACCTTTTTGTAAAACGCGTTCGCTTTTCGCTGATACGTGTCCATAAA

ACGCAGGTGACCCACACCAACAATAACCACCACGATGAAAAACTAATGTCTGCTCTTAAATGGCC

CATTGAATATATGTTTATAGGATTAAAACCTACCTGGAACATCTCCGATCAAAATCCTCATCAACACC

GAGATTGGCACAAGTTCGGACATGTTGTTAACGCCATTATGCAGCCCACTCACCACGCAGAGATAA

GCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCTTCCAGACGCATGTTCATCTATATCTGATATTAGCCCCGTTACG

TATCCGATCACATACCTATTATTAAAAACATTTCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAAT

TTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACCCCCGA

TGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCA

TATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTGGGACACGGATTACGTGGGGTCTATCACT

ACGGCTGATCTTGTGGTATCGGCATCTGCTATTAACTTTCTTCTTCTTCAGAACGGTTCAGCTGTGC

TGCGTTACAGTACCTAA-3'

注1：序列來(lái)自GenBank中公布的非洲豬瘟病毒HLJ株（登錄號(hào)MK333180.1）。

注2：ASFV檢測(cè)上游引物序列（5’-GCCTTATGTTCCAGTAGGGT-3’）位于195至214bp，ASFV檢測(cè)

下游引物序列（5’-AGTCTCCGTACTGGGGAATAC-3’）位于278至298bp，ASFV檢測(cè)探針（5’（-FAM）

AGGTGGGGGTAC