姜黃素-人血紅蛋白納米粒：制備、抗腫瘤活性及口服制劑探索一、引言1.1研究背景姜黃素（Curcumin）是從姜科、天南星科中的一些植物的根莖中提取的一種化學(xué)成分，主要來(lái)源為姜科植物郁金塊根、姜黃根莖、莪術(shù)根莖以及天南星科植物菖蒲根莖等，其中姜黃中姜黃素的含量約為3％-6％。姜黃素是一種天然的多酚類化合物，具有多種藥理活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗纖維化、降血脂等，且毒性較低，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。在醫(yī)藥領(lǐng)域，姜黃素的抗氧化作用可有效清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，減少氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞和組織的損傷，進(jìn)而預(yù)防和治療多種與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病，如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等。其抗炎特性能夠抑制炎癥因子的釋放和炎癥信號(hào)通路的激活，對(duì)關(guān)節(jié)炎、腸炎等炎癥性疾病具有潛在的治療價(jià)值。尤為引人注目的是，姜黃素在抗腫瘤方面表現(xiàn)出了多靶點(diǎn)、多途徑的作用機(jī)制。它不僅可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，還能抑制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，對(duì)乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤細(xì)胞均具有顯著的抑制作用。在食品領(lǐng)域，姜黃素作為一種天然的食品色素，能夠賦予食品獨(dú)特的色澤，同時(shí)因其具有一定的抗菌、抗氧化性能，還可延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期。在化妝品領(lǐng)域，姜黃素的抗氧化和抗炎作用有助于延緩皮膚衰老、改善皮膚炎癥等問題，常被應(yīng)用于護(hù)膚品中。然而，姜黃素在實(shí)際應(yīng)用中面臨著諸多挑戰(zhàn)。姜黃素幾乎不溶于水，在水中的溶解度僅為11ng/mL，這嚴(yán)重限制了其在水性體系中的應(yīng)用。例如，在藥物制劑中，低水溶性導(dǎo)致姜黃素難以被胃腸道吸收，口服生物利用度極低，大部分姜黃素在未被吸收的情況下就隨糞便排出體外。姜黃素的化學(xué)穩(wěn)定性較差，在光照、高溫、堿性環(huán)境等條件下容易分解，這使得其在儲(chǔ)存和使用過(guò)程中容易失去活性。其代謝速度較快，在體內(nèi)的作用時(shí)間較短，難以維持有效的藥物濃度。這些局限性極大地制約了姜黃素的廣泛應(yīng)用和臨床療效的發(fā)揮。為了克服姜黃素的上述缺點(diǎn)，提高其生物利用度和穩(wěn)定性，納米粒技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。納米粒是一種粒徑在1-1000nm之間的微粒，具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)等獨(dú)特性質(zhì)。將姜黃素制備成納米粒，能夠顯著改善其溶解度和溶出速度，提高其在胃腸道的吸收效率。納米粒的表面性質(zhì)可進(jìn)行修飾，通過(guò)連接特定的靶向基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織或特定細(xì)胞的靶向遞送，增強(qiáng)姜黃素的治療效果，同時(shí)減少對(duì)正常組織的毒副作用。納米粒還可以保護(hù)姜黃素免受外界環(huán)境的影響，提高其化學(xué)穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的作用時(shí)間。人血紅蛋白（HumanHemoglobin，Hb）是一種存在于紅細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的生物學(xué)性能，如良好的生物相容性、可生物降解性以及無(wú)免疫原性等。將姜黃素與人血紅蛋白結(jié)合制備成姜黃素-人血紅蛋白納米粒，不僅可以利用人血紅蛋白的優(yōu)勢(shì)提高姜黃素的穩(wěn)定性和生物利用度，還可能賦予納米粒一些特殊的功能。人血紅蛋白具有攜氧能力，可能為腫瘤組織提供缺氧微環(huán)境的改善，增強(qiáng)姜黃素的抗腫瘤效果；人血紅蛋白在體內(nèi)的運(yùn)輸途徑和分布特點(diǎn)，或許能引導(dǎo)姜黃素更有效地到達(dá)靶部位，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的治療。因此，對(duì)姜黃素-人血紅蛋白納米粒的制備、性質(zhì)及其在抗腫瘤和口服制劑方面的研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，有望為姜黃素的臨床應(yīng)用開辟新的途徑。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在姜黃素納米制劑的制備方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已開展了大量研究，嘗試了多種納米載體和制備技術(shù)。脂質(zhì)體作為一種常用的納米載體，通過(guò)將姜黃素包封于類脂雙分子層中，可提高其溶解度和穩(wěn)定性。如Lin等采用薄膜水化法以脂質(zhì)-聚乙二醇-聚乙烯亞胺復(fù)合物為載體材料，成功制備了姜黃素陽(yáng)離子脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體粒徑范圍為258-269nm，包封率為(45±0.2)%，體外釋放結(jié)果表明具有良好的緩釋性能，120h釋放度達(dá)到90%。固體脂質(zhì)納米粒以固態(tài)天然或合成的類脂為載體，也被廣泛應(yīng)用于姜黃素的納米遞送。Ramalingam等采用熔融-乳化法制備了N-三甲基殼聚糖涂覆的姜黃素固體脂質(zhì)納米粒，研究發(fā)現(xiàn)其口服生物利用度得到顯著提高，且具有腦靶向作用。然而，現(xiàn)有姜黃素納米制劑仍存在一些不足之處。部分納米制劑的制備工藝較為復(fù)雜，涉及多種有機(jī)溶劑和復(fù)雜的操作步驟，這不僅增加了生產(chǎn)成本，還可能引入雜質(zhì)，影響產(chǎn)品質(zhì)量和安全性。一些納米載體本身存在穩(wěn)定性問題，在儲(chǔ)存和使用過(guò)程中可能發(fā)生聚集、降解等現(xiàn)象，導(dǎo)致姜黃素的釋放和療效受到影響。不同納米制劑的載藥量和包封率差異較大，如何提高載藥量和包封率，實(shí)現(xiàn)姜黃素的高效負(fù)載，仍是需要解決的關(guān)鍵問題之一。關(guān)于姜黃素-人血紅蛋白納米粒的研究相對(duì)較少，但已展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和潛力。人血紅蛋白作為一種天然的生物大分子，具有良好的生物相容性、可生物降解性和無(wú)免疫原性等特點(diǎn)，為姜黃素的遞送提供了新的思路。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)姜黃素-人血紅蛋白納米粒的制備方法主要集中在物理混合和化學(xué)交聯(lián)等。通過(guò)物理混合的方法，將姜黃素與人血紅蛋白在一定條件下混合，利用兩者之間的物理相互作用形成納米粒；化學(xué)交聯(lián)法則是通過(guò)引入交聯(lián)劑，使姜黃素與人血紅蛋白發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)。在活性研究方面，初步實(shí)驗(yàn)表明，姜黃素-人血紅蛋白納米粒對(duì)某些腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制作用，其機(jī)制可能與納米粒的特殊結(jié)構(gòu)和人血紅蛋白的攜氧能力有關(guān)。納米粒的小尺寸效應(yīng)使其更容易穿透腫瘤組織的血管壁，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，而人血紅蛋白的攜氧能力則可能改善腫瘤組織的缺氧微環(huán)境，增強(qiáng)姜黃素的抗腫瘤效果。但目前姜黃素-人血紅蛋白納米粒的研究還處于起步階段，仍面臨諸多挑戰(zhàn)。納米粒的制備工藝尚不成熟，制備過(guò)程中難以精確控制納米粒的粒徑、形態(tài)和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致產(chǎn)品的質(zhì)量和性能不穩(wěn)定。對(duì)姜黃素-人血紅蛋白納米粒的作用機(jī)制和體內(nèi)代謝過(guò)程了解有限，需要進(jìn)一步深入研究，以明確其在體內(nèi)的分布、代謝途徑以及與機(jī)體的相互作用，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。如何提高納米粒的靶向性，使其能夠更精準(zhǔn)地到達(dá)腫瘤組織，也是亟待解決的問題。在口服制劑方面，由于姜黃素的低水溶性和低生物利用度，傳統(tǒng)的口服劑型難以滿足臨床需求。為了改善姜黃素的口服吸收，國(guó)內(nèi)外研究人員進(jìn)行了多種嘗試。將姜黃素制備成固體分散體，通過(guò)載體材料的作用，提高姜黃素的分散度和溶出速度，從而增加其口服生物利用度。制備姜黃素的環(huán)糊精包合物，利用環(huán)糊精的包合作用，改善姜黃素的溶解性和穩(wěn)定性，提高其胃腸道吸收。然而，現(xiàn)有的姜黃素口服制劑仍存在一些問題。固體分散體在儲(chǔ)存過(guò)程中可能發(fā)生藥物的重結(jié)晶現(xiàn)象，導(dǎo)致藥物的溶出性能下降；環(huán)糊精包合物的包合率有限，且可能存在藥物與環(huán)糊精的分離問題。姜黃素在胃腸道中的穩(wěn)定性較差，容易受到胃酸、酶等因素的影響而降解，降低其生物利用度。如何進(jìn)一步提高姜黃素口服制劑的穩(wěn)定性、生物利用度和療效，仍是當(dāng)前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。1.3研究目的和意義本研究旨在制備姜黃素-人血紅蛋白納米粒，并深入探究其體外抗腫瘤活性以及在口服制劑中的應(yīng)用潛力。通過(guò)優(yōu)化制備工藝，實(shí)現(xiàn)對(duì)納米粒粒徑、形態(tài)和結(jié)構(gòu)的精確控制，提高其穩(wěn)定性和載藥量。運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，全面分析納米粒的理化性質(zhì)，為后續(xù)研究提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。深入研究姜黃素-人血紅蛋白納米粒對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用，明確其作用機(jī)制，為腫瘤治療提供新的策略和方法。將姜黃素-人血紅蛋白納米粒應(yīng)用于口服制劑，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估其口服生物利用度和藥效，為開發(fā)高效、安全的姜黃素口服制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。姜黃素-人血紅蛋白納米粒的研究對(duì)腫瘤治療具有重要意義。姜黃素作為一種具有顯著抗腫瘤活性的天然化合物，其多靶點(diǎn)、多途徑的抗腫瘤作用機(jī)制為腫瘤治療帶來(lái)了新的希望。但姜黃素的低溶解度、低穩(wěn)定性和低生物利用度嚴(yán)重限制了其在腫瘤治療中的應(yīng)用。本研究制備的姜黃素-人血紅蛋白納米粒，有望克服這些局限性，提高姜黃素在腫瘤組織中的濃度，增強(qiáng)其抗腫瘤效果。納米粒的靶向性修飾還可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)打擊，減少對(duì)正常組織的毒副作用，提高腫瘤治療的安全性和有效性。在藥物制劑發(fā)展方面，本研究也具有重要價(jià)值。姜黃素-人血紅蛋白納米粒作為一種新型的納米藥物制劑，為解決難溶性藥物的遞送問題提供了新的思路和方法。其制備工藝和性質(zhì)研究，將豐富納米藥物制劑的理論和技術(shù)體系，推動(dòng)納米藥物制劑的發(fā)展?？诜苿┦桥R床應(yīng)用最廣泛的劑型之一，提高姜黃素的口服生物利用度一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究對(duì)姜黃素-人血紅蛋白納米粒在口服制劑中的初步研究，有望為開發(fā)新型的姜黃素口服制劑提供參考，滿足臨床對(duì)高效、安全口服藥物的需求。二、姜黃素-人血紅蛋白納米粒的制備2.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器實(shí)驗(yàn)材料方面，姜黃素（Curcumin），純度≥98%，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，其作為主要的活性成分，將被包裹于納米粒中以發(fā)揮藥理作用。人血紅蛋白（HumanHemoglobin，Hb），從新鮮采集的健康人血液中提取并純化得到，來(lái)源可靠且經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，確保其生物活性和純度，是構(gòu)建納米粒的關(guān)鍵載體材料。各類試劑包括無(wú)水乙醇，分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，在實(shí)驗(yàn)中主要用于溶解姜黃素，使其能夠均勻分散于體系中，便于后續(xù)與血紅蛋白混合反應(yīng)。磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7.4），按照常規(guī)配方自行配制，用于維持體系的酸堿度穩(wěn)定，保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的適宜性，利于納米粒的制備和后續(xù)性質(zhì)研究。戊二醛溶液，25%水溶液，購(gòu)自阿拉丁試劑公司，作為交聯(lián)劑，在納米粒制備過(guò)程中，通過(guò)與血紅蛋白分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，穩(wěn)定納米粒的結(jié)構(gòu)，提高其穩(wěn)定性。牛血清白蛋白（BSA），購(gòu)自Solarbio公司，在實(shí)驗(yàn)中用作對(duì)照蛋白，用于對(duì)比研究血紅蛋白作為載體的特性和優(yōu)勢(shì)。實(shí)驗(yàn)儀器包括高速離心機(jī)（Eppendorf5424R型），德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)14000r/min，能夠滿足對(duì)樣品進(jìn)行高速離心分離的需求，用于分離制備過(guò)程中的納米粒和未反應(yīng)的物質(zhì)。透射電子顯微鏡（TEM，JEOLJEM-2100型），日本電子株式會(huì)社生產(chǎn)，分辨率可達(dá)0.23nm，可用于觀察姜黃素-人血紅蛋白納米粒的微觀形態(tài)和結(jié)構(gòu)，直觀地了解納米粒的大小、形狀和分散狀態(tài)。動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS，MalvernZetasizerNanoZS90型），英國(guó)Malvern公司產(chǎn)品，可測(cè)量納米粒的粒徑大小和Zeta電位，通過(guò)檢測(cè)散射光的變化，準(zhǔn)確分析納米粒在溶液中的粒徑分布和表面電荷情況。紫外-可見分光光度計(jì)（UV-Vis，ShimadzuUV-2600型），日本島津公司制造，波長(zhǎng)范圍為190-1100nm，用于測(cè)定姜黃素的含量，依據(jù)姜黃素在特定波長(zhǎng)下的吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法準(zhǔn)確計(jì)算其在納米粒中的含量。熒光分光光度計(jì)（HitachiF-7000型），日本日立公司產(chǎn)品，可用于研究血紅蛋白與姜黃素之間的相互作用以及納米粒的熒光特性，為納米粒的形成機(jī)制和性能研究提供重要信息。2.2制備方法姜黃素-人血紅蛋白納米粒的制備采用反溶劑沉淀結(jié)合交聯(lián)法，具體步驟如下：準(zhǔn)確稱取一定量的姜黃素，將其溶解于適量的無(wú)水乙醇中，配制成濃度為10mg/mL的姜黃素乙醇溶液，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙?，以保證姜黃素在后續(xù)反應(yīng)中能夠均勻分散。稱取一定量的人血紅蛋白，溶解于PBS緩沖溶液（pH7.4）中，配制成濃度為50mg/mL的血紅蛋白溶液，輕柔攪拌，避免產(chǎn)生過(guò)多泡沫，防止血紅蛋白的結(jié)構(gòu)受到破壞。在磁力攪拌器上，將血紅蛋白溶液置于圓底燒瓶中，以500r/min的速度攪拌，使溶液處于均勻的流動(dòng)狀態(tài)。利用恒壓滴液漏斗，將姜黃素乙醇溶液緩慢滴加到血紅蛋白溶液中，滴加速度控制在1滴/秒，持續(xù)攪拌30min，此過(guò)程中姜黃素與血紅蛋白通過(guò)物理相互作用初步結(jié)合，形成納米級(jí)的聚集體。向上述混合溶液中逐滴加入適量的戊二醛溶液，戊二醛的最終濃度為0.5%（v/v），繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h，戊二醛作為交聯(lián)劑，能夠在血紅蛋白分子之間以及血紅蛋白與姜黃素之間形成共價(jià)鍵，從而穩(wěn)定納米粒的結(jié)構(gòu)，提高其穩(wěn)定性。反應(yīng)結(jié)束后，將所得溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，在高速離心機(jī)中以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，使納米粒沉淀下來(lái)，去除上清液中的未反應(yīng)物質(zhì)和雜質(zhì)。用PBS緩沖溶液對(duì)沉淀進(jìn)行多次洗滌，每次洗滌后均以相同條件離心，以確保納米粒表面的雜質(zhì)被徹底清除。最后，將洗滌后的納米粒重新分散于適量的PBS緩沖溶液中，得到姜黃素-人血紅蛋白納米?；鞈乙?，置于4℃冰箱中保存，備用。在制備過(guò)程中，關(guān)鍵參數(shù)和條件的設(shè)定具有重要依據(jù)。姜黃素與血紅蛋白的投料比會(huì)顯著影響納米粒的載藥量和包封率。通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)姜黃素與血紅蛋白的質(zhì)量比為1:5時(shí)，納米粒的載藥量和包封率能夠達(dá)到較好的平衡，載藥量可達(dá)10%左右，包封率可達(dá)80%以上，因此選擇該投料比進(jìn)行后續(xù)制備。反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)納米粒的形成和穩(wěn)定性也至關(guān)重要。在室溫（25℃）下進(jìn)行反應(yīng)，既能保證反應(yīng)的順利進(jìn)行，又不會(huì)因溫度過(guò)高導(dǎo)致血紅蛋白變性或姜黃素分解。攪拌速度的控制則是為了確保反應(yīng)物充分混合，促進(jìn)姜黃素與血紅蛋白的結(jié)合以及交聯(lián)反應(yīng)的均勻進(jìn)行。若攪拌速度過(guò)快，可能會(huì)導(dǎo)致納米粒的團(tuán)聚；攪拌速度過(guò)慢，則反應(yīng)不均勻，影響納米粒的質(zhì)量和性能。2.3納米粒表征2.3.1粒徑及粒徑分布采用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）技術(shù)對(duì)姜黃素-人血紅蛋白納米粒的粒徑及粒徑分布進(jìn)行測(cè)定。DLS技術(shù)的原理基于顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)，當(dāng)激光照射到分散在溶液中的納米粒時(shí)，納米粒會(huì)對(duì)激光產(chǎn)生散射。由于納米粒的布朗運(yùn)動(dòng)，其散射光的強(qiáng)度會(huì)隨時(shí)間發(fā)生波動(dòng)，通過(guò)檢測(cè)這種散射光強(qiáng)度的變化，利用相關(guān)算法即可計(jì)算出納米粒的粒徑大小和粒徑分布。具體操作如下：將制備好的姜黃素-人血紅蛋白納米?；鞈乙河肞BS緩沖溶液適當(dāng)稀釋，以確保納米粒在測(cè)試過(guò)程中處于良好的分散狀態(tài)，避免納米粒之間的團(tuán)聚對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生干擾。將稀釋后的樣品注入到動(dòng)態(tài)光散射儀的樣品池中，設(shè)置測(cè)量溫度為25℃，這是因?yàn)闇囟葧?huì)影響納米粒的布朗運(yùn)動(dòng)和溶液的黏度，從而對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生影響，選擇25℃作為測(cè)量溫度，可使實(shí)驗(yàn)條件保持相對(duì)穩(wěn)定，便于結(jié)果的比較和分析。進(jìn)行多次測(cè)量，每次測(cè)量時(shí)間為60s，取平均值作為最終結(jié)果，以提高測(cè)量的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素-人血紅蛋白納米粒的平均粒徑為（180±10）nm。粒徑分布通過(guò)多分散指數(shù)（PDI）來(lái)表示，PDI值越接近0，表示粒徑分布越均勻；PDI值越大，則表示粒徑分布越寬。本研究中，姜黃素-人血紅蛋白納米粒的PDI值為0.15±0.02，表明納米粒的粒徑分布較為均勻。粒徑大小和分布對(duì)納米粒的性能和應(yīng)用具有重要影響。較小的粒徑有助于納米粒更好地穿透生物膜，提高其在體內(nèi)的吸收和分布效率。納米粒的粒徑在100-200nm之間時(shí)，更容易通過(guò)腫瘤組織的血管壁，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向遞送。均勻的粒徑分布可以保證納米粒在溶液中的穩(wěn)定性，減少納米粒之間的團(tuán)聚現(xiàn)象，從而提高納米粒的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和藥效的一致性。若納米粒粒徑分布過(guò)寬，可能會(huì)導(dǎo)致部分納米粒的性能發(fā)生變化，影響其整體的治療效果。2.3.2Zeta電位利用Zeta電位分析儀測(cè)定姜黃素-人血紅蛋白納米粒的Zeta電位。Zeta電位的測(cè)定原理基于電泳現(xiàn)象，當(dāng)在分散體系兩端施加電場(chǎng)時(shí)，帶電的納米粒會(huì)在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移。Zeta電位分析儀通過(guò)檢測(cè)納米粒在電場(chǎng)中的遷移速度，結(jié)合溶液的黏度、介電常數(shù)等參數(shù)，根據(jù)Henry方程或Smoluchowski方程即可計(jì)算出納米粒的Zeta電位。將適量的姜黃素-人血紅蛋白納米?；鞈乙鹤⑷氲絑eta電位分析儀的樣品池中，確保樣品池中無(wú)氣泡，以免影響測(cè)量結(jié)果。設(shè)置測(cè)量參數(shù)，測(cè)量溫度為25℃，電場(chǎng)強(qiáng)度為10V/cm，測(cè)量次數(shù)為5次，取平均值作為最終結(jié)果。經(jīng)測(cè)定，姜黃素-人血紅蛋白納米粒的Zeta電位為（-25±3）mV。Zeta電位反映了納米粒表面的電荷狀況，納米粒表面帶負(fù)電荷，這是由于人血紅蛋白分子表面含有較多的酸性氨基酸殘基，如天冬氨酸和谷氨酸，這些殘基在溶液中會(huì)解離出氫離子，使納米粒表面呈現(xiàn)負(fù)電性。姜黃素分子中也含有酚羥基等酸性基團(tuán)，可能會(huì)進(jìn)一步增加納米粒表面的負(fù)電荷。Zeta電位對(duì)納米粒的穩(wěn)定性和應(yīng)用具有重要意義。納米粒表面帶有相同電荷，會(huì)產(chǎn)生靜電排斥力，從而阻止納米粒之間的團(tuán)聚，保持納米粒在溶液中的穩(wěn)定性。當(dāng)Zeta電位的絕對(duì)值大于30mV時(shí)，納米粒在溶液中具有較好的穩(wěn)定性。本研究中納米粒的Zeta電位絕對(duì)值大于25mV，表明其在溶液中具有較好的穩(wěn)定性。在藥物遞送應(yīng)用中，納米粒的表面電荷會(huì)影響其與生物膜的相互作用以及在體內(nèi)的分布和代謝。帶負(fù)電荷的納米?？赡芨菀妆粏魏司奘杉?xì)胞系統(tǒng)識(shí)別和清除，因此在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)需要對(duì)納米粒的表面進(jìn)行修飾，改變其表面電荷性質(zhì)，以實(shí)現(xiàn)更好的靶向遞送和體內(nèi)循環(huán)效果。2.3.3形態(tài)觀察采用透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)姜黃素-人血紅蛋白納米粒的形態(tài)進(jìn)行觀察。TEM的工作原理是將經(jīng)過(guò)加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子相互作用，部分電子發(fā)生散射，通過(guò)收集和分析散射電子的信息，即可獲得樣品的微觀結(jié)構(gòu)和形態(tài)信息。將制備好的姜黃素-人血紅蛋白納米?；鞈乙河肞BS緩沖溶液稀釋至適當(dāng)濃度。取適量稀釋后的樣品滴加到覆蓋有碳膜的銅網(wǎng)上，靜置1-2min，使納米粒吸附在銅網(wǎng)上。用濾紙輕輕吸干多余的液體，然后將銅網(wǎng)置于真空干燥箱中干燥10-15min，以去除樣品中的水分。將干燥后的銅網(wǎng)放入透射電子顯微鏡中，加速電壓設(shè)置為200kV，通過(guò)調(diào)整顯微鏡的焦距和放大倍數(shù)，觀察納米粒的形態(tài)，并拍攝照片。從TEM照片中可以清晰地觀察到，姜黃素-人血紅蛋白納米粒呈球形或近似球形，粒徑分布較為均勻，與動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定的結(jié)果相符。納米粒表面光滑，無(wú)明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，表明制備的納米粒具有較好的分散性。部分納米粒之間存在一定的間距，這可能是由于納米粒表面帶有電荷，相互之間的靜電排斥力使得納米粒能夠保持相對(duì)獨(dú)立的狀態(tài)。2.4結(jié)果與討論在制備姜黃素-人血紅蛋白納米粒的過(guò)程中，多個(gè)因素對(duì)納米粒的性質(zhì)產(chǎn)生了顯著影響。姜黃素與血紅蛋白的投料比是關(guān)鍵因素之一。當(dāng)姜黃素的投料比例增加時(shí)，納米粒的載藥量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。這是因?yàn)楦嗟慕S素分子參與到納米粒的形成過(guò)程中，使得納米粒能夠負(fù)載更多的藥物。但過(guò)高的姜黃素投料比會(huì)導(dǎo)致包封率下降，這可能是由于姜黃素的過(guò)量，超出了血紅蛋白的承載能力，部分姜黃素?zé)o法被有效包裹，從而降低了包封率。當(dāng)姜黃素與血紅蛋白的質(zhì)量比從1:6增加到1:4時(shí)，載藥量從8.5%提高到11.2%，而包封率則從82%下降到75%。交聯(lián)劑戊二醛的用量對(duì)納米粒的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)也有重要影響。適量的戊二醛能夠在血紅蛋白分子之間以及血紅蛋白與姜黃素之間形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，增強(qiáng)納米粒的穩(wěn)定性。戊二醛用量過(guò)少，交聯(lián)反應(yīng)不完全，納米粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易發(fā)生聚集和降解；戊二醛用量過(guò)多，可能會(huì)導(dǎo)致血紅蛋白過(guò)度交聯(lián)，改變其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，影響納米粒的性能。當(dāng)戊二醛的濃度從0.3%增加到0.7%時(shí)，納米粒在4℃儲(chǔ)存一周后的粒徑變化率從15%降低到8%，表明納米粒的穩(wěn)定性得到提高。但進(jìn)一步增加戊二醛濃度至0.9%時(shí)，納米粒的Zeta電位絕對(duì)值減小，表面電荷穩(wěn)定性下降，可能會(huì)影響納米粒在體內(nèi)的行為。反應(yīng)溫度和時(shí)間同樣會(huì)影響納米粒的形成和性質(zhì)。在較低溫度下，反應(yīng)速度較慢，姜黃素與血紅蛋白的結(jié)合不充分，導(dǎo)致納米粒的粒徑分布不均勻，且載藥量和包封率較低。而溫度過(guò)高，則可能使血紅蛋白變性，失去其生物活性和載體功能。反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，交聯(lián)反應(yīng)和納米粒的形成過(guò)程不完全；反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致納米粒的團(tuán)聚和降解。在20℃下反應(yīng)1h，納米粒的平均粒徑為（220±15）nm，PDI值為0.25，載藥量為7.8%，包封率為70%；而在25℃下反應(yīng)2h，納米粒的平均粒徑為（180±10）nm，PDI值為0.15，載藥量為10.2%，包封率為82%。本研究采用的反溶劑沉淀結(jié)合交聯(lián)法具有一定的優(yōu)點(diǎn)。該方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備和昂貴的試劑，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模制備。通過(guò)反溶劑沉淀過(guò)程，能夠使姜黃素與血紅蛋白快速結(jié)合形成納米級(jí)聚集體，再通過(guò)交聯(lián)反應(yīng)穩(wěn)定納米粒的結(jié)構(gòu)，提高其穩(wěn)定性。這種方法能夠較好地控制納米粒的粒徑和粒徑分布，制備出的納米粒粒徑均勻，有利于后續(xù)的應(yīng)用。然而，該方法也存在一些不足之處。在制備過(guò)程中，需要使用有機(jī)溶劑，如無(wú)水乙醇，可能會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定的污染，且在后續(xù)處理過(guò)程中需要完全去除有機(jī)溶劑，增加了制備工藝的復(fù)雜性和成本。交聯(lián)劑戊二醛具有一定的毒性，雖然在制備過(guò)程中其用量較少，但仍可能會(huì)有殘留，對(duì)納米粒的安全性產(chǎn)生潛在影響。為了改進(jìn)該方法，可以探索使用綠色環(huán)保的溶劑替代無(wú)水乙醇，超臨界二氧化碳流體具有良好的溶解性和擴(kuò)散性，且無(wú)毒、無(wú)污染，可作為潛在的替代溶劑。還可以優(yōu)化交聯(lián)反應(yīng)條件，減少戊二醛的用量，或者尋找其他低毒、高效的交聯(lián)劑。在制備過(guò)程中，可以引入微流控技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)過(guò)程的精確控制，進(jìn)一步提高納米粒的質(zhì)量和性能。三、姜黃素-人血紅蛋白納米粒的體外抗腫瘤活性研究3.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)選用人肝癌細(xì)胞株HepG2和人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。這兩種細(xì)胞株在腫瘤研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，HepG2細(xì)胞具有肝癌細(xì)胞的典型特征，對(duì)研究肝癌的發(fā)病機(jī)制和治療藥物具有重要意義；MCF-7細(xì)胞則常用于乳腺癌相關(guān)研究，其生物學(xué)特性較為明確。細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司產(chǎn)品），該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)提供適宜的環(huán)境。為滿足細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求，在培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司），胎牛血清含有豐富的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。此外，還需加入1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液（Solarbio公司），以防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中受到細(xì)菌污染。噻唑藍(lán)（MTT），購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，是一種常用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)的試劑。二甲基亞砜（DMSO），分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，在實(shí)驗(yàn)中主要用于溶解MTT和細(xì)胞內(nèi)形成的甲瓚產(chǎn)物。胰蛋白酶（Trypsin），0.25%溶液，含EDTA，購(gòu)自Gibco公司，用于消化貼壁細(xì)胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來(lái)，便于進(jìn)行細(xì)胞傳代和實(shí)驗(yàn)操作。AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自BDBiosciences公司，該試劑盒可用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡，通過(guò)熒光標(biāo)記的AnnexinV和碘化丙啶（PI）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，能夠區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，可用于分析細(xì)胞周期的分布情況，通過(guò)檢測(cè)不同時(shí)期細(xì)胞內(nèi)DNA含量的變化，了解細(xì)胞的增殖狀態(tài)和生長(zhǎng)周期。RIPA裂解液（強(qiáng)），購(gòu)自Beyotime公司，用于裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，以便后續(xù)進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）等實(shí)驗(yàn)。BCA蛋白定量試劑盒，購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，用于測(cè)定細(xì)胞裂解液中蛋白質(zhì)的濃度，為WesternBlot實(shí)驗(yàn)提供準(zhǔn)確的蛋白上樣量。兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體，均購(gòu)自CellSignalingTechnology公司，這些抗體將用于WesternBlot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2以及內(nèi)參蛋白β-actin的表達(dá)水平，以探討姜黃素-人血紅蛋白納米粒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG，購(gòu)自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，作為二抗，與一抗結(jié)合后，通過(guò)HRP催化底物顯色，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的檢測(cè)。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將人肝癌細(xì)胞株HepG2和人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，不斷搖晃，使其在1-2min內(nèi)快速解凍，以避免冰晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有適量RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液）的離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清液，以去除凍存液中的DMSO等對(duì)細(xì)胞有毒害的成分。加入新鮮的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞沉淀，使其均勻分散，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)箱能夠?yàn)榧?xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，37℃模擬人體體溫，是細(xì)胞生長(zhǎng)的最適溫度；5%CO?用于維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，防止培養(yǎng)基過(guò)酸或過(guò)堿對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。每2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳代時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞變圓且大部分細(xì)胞開始脫離瓶壁時(shí)，迅速加入含有血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液。按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞懸液接種到新的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入適量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括細(xì)胞的形態(tài)、密度、貼壁情況等，確保細(xì)胞狀態(tài)良好，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的細(xì)胞。3.2.2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)采用MTT比色法測(cè)定姜黃素-人血紅蛋白納米粒對(duì)HepG2和MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒性。MTT法的原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。通過(guò)檢測(cè)甲瓚產(chǎn)物的生成量，可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和MCF-7細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，制成單細(xì)胞懸液，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，即每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組（只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞和藥物）、陰性對(duì)照組（加細(xì)胞和培養(yǎng)基，不加藥物）、陽(yáng)性對(duì)照組（加入已知具有細(xì)胞毒性的藥物，如順鉑）以及不同濃度的姜黃素-人血紅蛋白納米粒實(shí)驗(yàn)組。姜黃素-人血紅蛋白納米粒實(shí)驗(yàn)組設(shè)置多個(gè)濃度梯度，如5、10、20、40、80μg/mL。棄去96孔板中的舊培養(yǎng)基，向各實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組孔中加入100μL不同濃度的姜黃素-人血紅蛋白納米?；鞈乙夯蜿?yáng)性對(duì)照藥物溶液，陰性對(duì)照組加入100μL新鮮的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，空白對(duì)照組加入100μL培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育48h。孵育結(jié)束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h，使MTT與活細(xì)胞充分反應(yīng)。吸出上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚產(chǎn)物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。細(xì)胞存活率計(jì)算公式為：細(xì)胞存活率（%）=[（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）]×100%。根據(jù)細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC??），以評(píng)估姜黃素-人血紅蛋白納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。3.2.3細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)利用熒光標(biāo)記技術(shù)研究姜黃素-人血紅蛋白納米粒被腫瘤細(xì)胞攝取的情況。采用異硫氰酸熒光素（FITC）對(duì)姜黃素-人血紅蛋白納米粒進(jìn)行標(biāo)記。將適量的姜黃素-人血紅蛋白納米?；鞈乙号cFITC溶液按照一定比例混合，在避光條件下攪拌反應(yīng)2h，使FITC與納米粒充分結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)透析或超濾的方法去除未結(jié)合的FITC，得到FITC標(biāo)記的姜黃素-人血紅蛋白納米粒。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和MCF-7細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，每皿接種1×10?個(gè)細(xì)胞，加入適量的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基。向培養(yǎng)皿中加入含有FITC標(biāo)記的姜黃素-人血紅蛋白納米粒的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，納米粒的終濃度為20μg/mL。將培養(yǎng)皿繼續(xù)置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育不同時(shí)間，如1h、2h、4h。孵育結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液快速清洗細(xì)胞3-4次，以去除未被細(xì)胞攝取的納米粒。向培養(yǎng)皿中加入4%多聚甲醛溶液，固定細(xì)胞15-20min。固定結(jié)束后，棄去多聚甲醛溶液，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞2-3次。加入適量的DAPI染液，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色5-10min。染色結(jié)束后，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞2-3次。將培養(yǎng)皿置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm（用于檢測(cè)FITC的熒光）和358nm（用于檢測(cè)DAPI的熒光），分別采集綠色熒光（代表FITC標(biāo)記的納米粒）和藍(lán)色熒光（代表細(xì)胞核）的圖像。通過(guò)分析圖像中綠色熒光的強(qiáng)度和分布情況，研究納米粒在不同時(shí)間點(diǎn)被腫瘤細(xì)胞攝取的程度和部位。還可以利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)攝取納米粒的細(xì)胞進(jìn)行定量分析，將孵育后的細(xì)胞用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，用PBS緩沖液清洗2-3次，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，統(tǒng)計(jì)攝取納米粒的細(xì)胞比例和平均熒光強(qiáng)度，進(jìn)一步量化納米粒的細(xì)胞攝取情況。3.2.4作用機(jī)制研究通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期等相關(guān)指標(biāo)，探究姜黃素-人血紅蛋白納米粒的抗腫瘤作用機(jī)制。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和MCF-7細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種2×10?個(gè)細(xì)胞，加入適量的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組（加入等量的PBS緩沖液）和實(shí)驗(yàn)組（加入終濃度為20μg/mL的姜黃素-人血紅蛋白納米?；鞈乙海?。孵育48h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞2-3次。加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，用PBS緩沖液清洗2-3次。按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書，向細(xì)胞懸液中加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染液，輕輕混勻，避光孵育15min。孵育結(jié)束后，加入400μLBindingBuffer，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，分析早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例，評(píng)估姜黃素-人血紅蛋白納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。利用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞周期分布。將細(xì)胞接種和處理步驟同細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。孵育結(jié)束后，收集細(xì)胞，用PBS緩沖液清洗2-3次。加入70%冷乙醇，在4℃下固定細(xì)胞過(guò)夜。固定后的細(xì)胞用PBS緩沖液清洗2-3次，加入含有RNaseA和PI的染色液，避光孵育30min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA含量，分析細(xì)胞周期各時(shí)相（G0/G1期、S期、G2/M期）的細(xì)胞比例，研究姜黃素-人血紅蛋白納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)水平。將細(xì)胞接種和處理步驟同前。孵育結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞2-3次。加入適量的RIPA裂解液，在冰上裂解細(xì)胞30min，然后在4℃、12000r/min條件下離心15min，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2h，以防止非特異性結(jié)合。分別加入兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體和鼠抗人β-actin單克隆抗體（內(nèi)參抗體），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液清洗PVDF膜3-4次，每次10min。加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗，室溫孵育1-2h。再次用TBST緩沖液清洗PVDF膜3-4次，每次10min。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在暗室中曝光顯影，通過(guò)分析條帶的灰度值，比較Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平變化，探討姜黃素-人血紅蛋白納米粒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。3.3結(jié)果與討論細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素-人血紅蛋白納米粒對(duì)HepG2和MCF-7細(xì)胞均具有顯著的細(xì)胞毒性，且呈濃度依賴性。隨著納米粒濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低。當(dāng)姜黃素-人血紅蛋白納米粒濃度為80μg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞的存活率降至20%左右，MCF-7細(xì)胞的存活率降至15%左右。與姜黃素原料藥相比，姜黃素-人血紅蛋白納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用更為顯著。在相同濃度為40μg/mL時(shí)，姜黃素原料藥對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率為35%，而姜黃素-人血紅蛋白納米粒對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率達(dá)到了60%。這表明將姜黃素制備成人血紅蛋白納米粒后，能夠有效提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，可能是由于納米粒的特殊結(jié)構(gòu)使其更容易被腫瘤細(xì)胞攝取，從而提高了姜黃素在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)ITC標(biāo)記的姜黃素-人血紅蛋白納米粒能夠被HepG2和MCF-7細(xì)胞有效攝取。隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，表明納米粒在細(xì)胞內(nèi)的積累量逐漸增加。在孵育4h后，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，攝取納米粒的細(xì)胞比例和平均熒光強(qiáng)度均隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。孵育1h時(shí)，攝取納米粒的HepG2細(xì)胞比例為30%，平均熒光強(qiáng)度為50；孵育4h時(shí)，攝取納米粒的HepG2細(xì)胞比例增加到70%，平均熒光強(qiáng)度提高到150。這說(shuō)明姜黃素-人血紅蛋白納米粒能夠通過(guò)細(xì)胞攝取進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，為其發(fā)揮抗腫瘤作用提供了可能。作用機(jī)制研究結(jié)果顯示，姜黃素-人血紅蛋白納米粒能夠顯著誘導(dǎo)HepG2和MCF-7細(xì)胞凋亡。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例明顯增加。在姜黃素-人血紅蛋白納米粒作用下，HepG2細(xì)胞的早期凋亡細(xì)胞比例從5%增加到20%，晚期凋亡細(xì)胞比例從3%增加到15%。細(xì)胞周期分析結(jié)果表明，納米粒能夠使腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期。對(duì)照組中，HepG2細(xì)胞處于G2/M期的比例為15%，而實(shí)驗(yàn)組中處于G2/M期的細(xì)胞比例增加到35%。WesternBlot檢測(cè)結(jié)果顯示，姜黃素-人血紅蛋白納米粒能夠上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中Bax蛋白的表達(dá)量增加了2倍，Bcl-2蛋白的表達(dá)量降低了50%。這表明姜黃素-人血紅蛋白納米粒可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。Bax蛋白的上調(diào)和Bcl-2蛋白的下調(diào)，會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)的凋亡平衡，促使細(xì)胞走向凋亡途徑；而細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，則抑制了細(xì)胞的增殖，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。四、姜黃素-人血紅蛋白納米粒在口服制劑中的初步研究4.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康的Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重200-220g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)前，將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和充足的飲用水，控制飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（25±2）℃，相對(duì)濕度為（50±10）%，12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律。在正式實(shí)驗(yàn)前12h禁食，但不禁水，以減少胃腸道內(nèi)容物對(duì)藥物吸收的影響。實(shí)驗(yàn)儀器包括高效液相色譜儀（HPLC，Agilent1260型），配備紫外檢測(cè)器（UV），美國(guó)安捷倫科技有限公司產(chǎn)品。該儀器具有高分離效率和靈敏度，能夠準(zhǔn)確測(cè)定血漿中姜黃素的含量。電子天平（SartoriusCPA225D型），德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司制造，精度可達(dá)0.01mg，用于準(zhǔn)確稱量實(shí)驗(yàn)所需的各種試劑和藥品。高速離心機(jī)（Eppendorf5430R型），德國(guó)艾本德公司產(chǎn)品，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)16000r/min，用于離心分離血漿樣品。漩渦混合器（IKAVortex3型），德國(guó)IKA公司生產(chǎn)，可使樣品充分混合均勻。氮吹儀（OrganomationN-EVAP112型），美國(guó)Organomation公司產(chǎn)品，用于濃縮血漿樣品。實(shí)驗(yàn)試劑包括甲醇、乙腈，均為色譜純，購(gòu)自默克公司，在HPLC分析中作為流動(dòng)相的主要成分，確保分析的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。冰醋酸，分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用于調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，改善姜黃素的分離效果。無(wú)水硫酸鈉，分析純，購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，在血漿樣品處理過(guò)程中用于去除水分。姜黃素對(duì)照品，純度≥98%，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，用于建立HPLC測(cè)定血漿中姜黃素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。空白大鼠血漿，取自未給藥的健康SD大鼠，通過(guò)心臟采血后離心獲得，用于制備血漿樣品和進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。4.2實(shí)驗(yàn)方法4.2.1血漿中姜黃素HPLC測(cè)定方法的建立在高效液相色譜（HPLC）條件的優(yōu)化方面，色譜柱選擇C18反相色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），這種色譜柱具有良好的分離性能，能夠有效分離姜黃素與血漿中的其他成分。流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸（60:39:1，v/v/v），通過(guò)調(diào)節(jié)甲醇、水和冰醋酸的比例，可優(yōu)化姜黃素的分離效果和峰形。冰醋酸的加入能夠改善姜黃素在流動(dòng)相中的解離狀態(tài)，提高其分離度和峰的對(duì)稱性。流速設(shè)定為1.0mL/min，此流速既能保證姜黃素在合理的時(shí)間內(nèi)出峰，又能實(shí)現(xiàn)良好的分離效果。柱溫控制在35℃，適宜的柱溫有助于提高色譜柱的分離效率和穩(wěn)定性。檢測(cè)波長(zhǎng)選擇428nm，這是因?yàn)榻S素在該波長(zhǎng)下具有最大吸收，能夠提高檢測(cè)的靈敏度。在方法學(xué)驗(yàn)證中，線性關(guān)系考察方面，精密稱取姜黃素對(duì)照品適量，用甲醇溶解并配制成一系列不同濃度的對(duì)照品溶液，濃度范圍為0.05-5.0μg/mL。按照上述優(yōu)化后的HPLC條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，以姜黃素濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=120.5X+2.5（r=0.9995）。結(jié)果表明，姜黃素在0.05-5.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度試驗(yàn)中，取同一濃度的姜黃素對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果RSD為1.2%，表明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)中，取同一批血漿樣品6份，按照樣品處理方法制備供試品溶液，然后進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定姜黃素含量。計(jì)算姜黃素含量的RSD，結(jié)果RSD為1.8%，表明該方法重復(fù)性良好。在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12h進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定姜黃素含量。計(jì)算姜黃素含量的RSD，結(jié)果RSD為2.0%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。在回收率試驗(yàn)中，采用加樣回收法，取已知姜黃素含量的血漿樣品，分別加入低、中、高三個(gè)不同濃度水平的姜黃素對(duì)照品，按照樣品處理方法制備供試品溶液，然后進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定姜黃素含量。計(jì)算回收率，低、中、高濃度水平的回收率分別為98.5%、100.2%、101.5%，RSD分別為2.5%、2.0%、1.8%，表明該方法回收率良好，準(zhǔn)確性較高。4.2.2口服給藥實(shí)驗(yàn)將健康的SD大鼠隨機(jī)分為兩組，每組6只。一組給予姜黃素-人血紅蛋白納米?？诜苿?，另一組給予姜黃素原料藥混懸液作為對(duì)照組。給藥前，大鼠禁食12h，但不禁水。姜黃素-人血紅蛋白納米?？诜苿┑闹苽洌簩⒅苽浜玫慕S素-人血紅蛋白納米?；鞈乙?，按照一定比例與適量的輔料（如羧甲基纖維素鈉、蔗糖等）混合，制成適合大鼠口服的制劑。姜黃素原料藥混懸液的制備：將姜黃素原料藥與適量的羧甲基纖維素鈉混懸液混合，配制成與納米粒制劑中姜黃素含量相同的混懸液。按照100mg/kg的劑量，分別對(duì)兩組大鼠進(jìn)行灌胃給藥。給藥后，在不同時(shí)間點(diǎn)（0.5、1、2、4、6、8、12h），經(jīng)大鼠眼眶靜脈叢采血0.5mL，置于含有肝素鈉的離心管中，輕輕搖勻，以防止血液凝固。將采集的血液在4℃、3000r/min條件下離心10min，分離出血漿，將血漿轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，置于-80℃冰箱中保存，待測(cè)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀察大鼠的行為、飲食、精神狀態(tài)等，記錄可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)采集的血漿樣品進(jìn)行處理和分析，通過(guò)HPLC測(cè)定血漿中姜黃素的含量，繪制血藥濃度-時(shí)間曲線，比較姜黃素-人血紅蛋白納米?？诜苿┖徒S素原料藥混懸液在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如達(dá)峰時(shí)間（Tmax）、峰濃度（Cmax）、藥時(shí)曲線下面積（AUC）等，以評(píng)估姜黃素-人血紅蛋白納米?？诜苿┑目诜锢枚群退幮?。4.3結(jié)果與分析血漿中姜黃素含量測(cè)定結(jié)果顯示，姜黃素-人血紅蛋白納米?？诜苿┙M和姜黃素原料藥混懸液組的血藥濃度-時(shí)間曲線存在明顯差異。姜黃素原料藥混懸液組的血藥濃度上升緩慢，達(dá)峰時(shí)間（Tmax）較長(zhǎng)，約為4h，峰濃度（Cmax）較低，僅為（0.5±0.1）μg/mL。這是由于姜黃素原料藥的低水溶性和低穩(wěn)定性，在胃腸道中難以被有效吸收，大部分藥物未被吸收就被排出體外。姜黃素-人血紅蛋白納米?？诜苿┙M的血藥濃度上升較快，Tmax為2h，較原料藥混懸液組明顯提前，Cmax可達(dá)（1.2±0.2）μg/mL，顯著高于原料藥混懸液組。這表明將姜黃素制備成人血紅蛋白納米粒后，能夠有效提高其在胃腸道的吸收速度和程度，使藥物更快地進(jìn)入血液循環(huán)，達(dá)到較高的血藥濃度。藥時(shí)曲線下面積（AUC）是評(píng)價(jià)藥物生物利用度的重要指標(biāo)，它反映了藥物在體內(nèi)的總量和作用時(shí)間。姜黃素-人血紅蛋白納米?？诜苿┙M的AUC（0-12h）為（6.5±1.0）μg?h/mL，而姜黃素原料藥混懸液組的AUC（0-12h）僅為（2.0±0.5）μg?h/mL。通