多色組合原則

BD生物科學(xué)

鮑梅艷Maggie_百年BD全球足跡BD是由Becton和Dickinson于1897年在紐約創(chuàng)立的，總部設(shè)在新澤西州。經(jīng)過一百多年的發(fā)展，BD已成為世界上最大的開發(fā)、生產(chǎn)和銷售醫(yī)療設(shè)備、醫(yī)療系統(tǒng)和試劑的醫(yī)療技術(shù)公司之一，目前經(jīng)營超過產(chǎn)品10000余種。BD致力于提高全世界人類的健康水平，并以其領(lǐng)先的技術(shù)、卓越的產(chǎn)品質(zhì)量和誠實(shí)可信的服務(wù)贏得了全球用戶及合作伙伴的廣泛贊譽(yù)。BD在世界50多個(gè)國家和地區(qū)設(shè)有分支辦事機(jī)構(gòu)、研究發(fā)展中心和制造工廠，業(yè)務(wù)遍及世界六大洲，全球雇員約29,000人。百年BD持續(xù)創(chuàng)新1897公司成立

1906第一家美國注射器針頭工廠

1924第一支胰島素專用注射器

1942第一支青霉素專用注射器

1949第一支真空采血管 1952第一次生產(chǎn)使用一次性醫(yī)療器械 1954第一支可棄式小兒麻痹癥疫苗注射器 1962第一個(gè)開始大批量生產(chǎn)注射器和針頭 1968第一組全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng) 1973第一臺流式細(xì)胞儀 1988第一支安全型注射器

1991第一支自毀式疫苗注射器

1993第一支密閉式留置針

BDBiosciences-PharmingenBDBiosciences-PharmingenFoundedinJune1987LocatedinSanDiego,CASuppliesreagentsforImmunology,CellBiology,CytokineBiologyandMolecularBiologyAcquiredbyBDin1997AllBDPharmingen?reagentsareRUOonlyandnotGMP(onlyforSanJoseplant)Review多色補(bǔ)償調(diào)節(jié)多色配色原則多色工具及新染料pensation

多色補(bǔ)償調(diào)節(jié)熒光染色對照的設(shè)置1陰性對照空白對照自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細(xì)胞熒光分子經(jīng)光照發(fā)出的熒光。自發(fā)熒光信號為噪聲信號。一般說來，細(xì)胞成分中能產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子（核黃素、細(xì)胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)，如腫瘤細(xì)胞、粒細(xì)胞等；樣本死細(xì)胞比例越高自發(fā)熒光越強(qiáng)實(shí)驗(yàn)樣本特異熒光，即抗體F(ab’)2段與細(xì)胞抗原特異結(jié)合上的熒光染料受光照發(fā)出的熒光非特異熒光，即抗體Fc段與細(xì)胞表面的Fc受體非特異結(jié)合上的熒光染料受光照發(fā)出的熒光自發(fā)熒光＋特異熒光＋非特異熒光同型對照（自發(fā)熒光＋非特異熒光）合適？同型對照同型對照（IsotypeControl）：與實(shí)驗(yàn)染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型（即Fc段相同，F(xiàn)(ab’)2段不同）與染色的單克隆抗體①相同種屬來源②相同免疫球蛋白及亞型③相同熒光素標(biāo)記④相同劑量和濃度⑤但由未免疫動(dòng)物血清純化而來用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面的Fc受體而產(chǎn)生的背景染色例如，標(biāo)記FITC的單克隆抗體為小鼠IgG1亞類抗體，標(biāo)記PE的單克隆抗體為小鼠IgG2a亞類抗體，同型對照應(yīng)用相同濃度和劑量的未免疫小鼠血清的純化IgG1（γ1）和IgG2a（γ2a），并分別標(biāo)記FITC和PEFluorescenceSpectrumViewerspectraloverlap如何解決？熒光染色對照的設(shè)置補(bǔ)償對照（雙色或多色分析中，熒光素發(fā)生光譜重疊時(shí)）熒光補(bǔ)償pensation）是指在流式細(xì)胞多色分析中，糾正熒光素發(fā)生光譜重疊（spectraloverlap）的過程，即從一個(gè)被檢測的熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號已染色樣本？真雙陽？假雙陽？熒光染色對照的設(shè)置補(bǔ)償對照（雙色或多色分析中，熒光素發(fā)射光譜重疊時(shí)）熒光補(bǔ)償pensation）使用單種熒光素標(biāo)記的單克隆抗體和其余熒光素對應(yīng)的同型對照抗體分別進(jìn)行染色

※幾色分析需要制備幾個(gè)補(bǔ)償對照管分析類型管功能加入的抗體雙色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PE2pensation1A-FITCγ2a-PE3pensation2γ1-FITCB-PE4Sample1,2……A-FITCB-PENo.AntibodyIsotypeMouseanti-human未免疫M(jìn)ouse血清純化而來1A-FITC（γ1）γ1-FITC2B-PE（γ2a）γ2a-PERelativeIntensity650nm700nm500nm550nm600nmWavelength

(nm)Detector-%SignalFITCpensationFL1530/30FL2585/42FITCpensation24.8%oftheSignalSensedinFL2650nm700nm500nm550nm600nmRelativeIntensityWavelength

(nm)Figure

CFL1530/30FL2585/42650nm700nm500nm600nmRelativeIntensityWavelength

(nm)550nmPEpensationFL3650andHigherFL1530/30FL2585/42OptimalpensationpensationExamplesUndepensationOvepensationNotenoughsubtractedToomuchsubtractedB、多色組合原則按照機(jī)器設(shè)置染料的亮度與抗原表達(dá)相匹配同種細(xì)胞的Marker染料重疊最小化盡量避免偶聯(lián)染料的使用帶來假陽性如果可能，用紅激光做自發(fā)熒光高的樣本。染料選擇-按照機(jī)器設(shè)置6-color8-colorAdditionalFITCorAlexa488FITCorAlexa488FITCorAlexa488PEPEPEPE-CF594orPE-TexasRedorPE-Alexa610/594PE-CF594orPE-TexasRedorPE-Alexa610/594PerCP/PE-Cy5/PerCP-Cy5.5PerCP/PE-Cy5/PerCP-Cy5.5PerCP/PerCP-Cy5.5/PE-Cy5/PE-Cy5.5PE-Cy7PE-Cy7PE-Cy7APCorAlexa647APCorAlexa647APCorAlexa647APC-Cy5.5/Alexa680orAlexa700APC-Cy5.5/Alexa680orAlexa700APC-H7/APC-Cy7APC-H7/APC-Cy7APC-H7/APC-Cy7BV421HorizonV450/V500PacificOrange,Q-dots120熒光染料的強(qiáng)度CD5CD8染料選擇2表達(dá)強(qiáng)弱-

AntigenDensity染料選擇2Example高表達(dá)的抗體可用不太亮的染料，低/弱表達(dá)的Marker用亮的染料Example:CD8“bright”PacificBlueCD7“l(fā)essbright”PECD8=90Kmolecules/cellCD7=20Kmolecules/cell熒光染料光譜重疊最小化spectraviewer3光譜重疊會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)丟失CD45-FITCDimCD4-PECD45FITC漏到PE，CD4PE弱信號分不開CD45-PerCPDimCD4-PECD45PerCP不漏到PE，弱CD4可以分開Upensatedpensateddataspreadduetospillover1）采用多激光激發(fā)減少重疊同一細(xì)胞的抗原,用不同激光激發(fā)減少重疊Example:CD3“bright”APC-Cy7CD7“l(fā)essbright”PEBothantigensexpressedonsamecell,lowspilloverofCD3intoCD7andviceversa.CD3=124Kmolecules/cellCD7=20Kmolecules/cell2）避免雙激發(fā)熒光染料熒光染料可被不止1laser激發(fā)，導(dǎo)致光譜重疊干擾，影響結(jié)果.AmCyan可被Violet（405nm)和Blue（488nm)(FITCdetector).PE-Cy5可漏到APCdetector.WithoutCD45AmCyan:WithCD45AmCyan:CD19FITCOnlyanissuewhenthetwomarkers(CD45andCD19)areco-expressedonthesamecellpopulation.0hours2hours22.5hoursPECD8CD3PE-Cy5PE-Cy7樣本曝光時(shí)間PerCP避免同一細(xì)胞使用偶聯(lián)染料4由于tandem-dye降解會(huì)產(chǎn)生假陽性A.FalsepositivesinAPCchannelreducedinabsenceofAPC-Cy7FalsepositivesinPEchannelremainCD8APC-Cy7+cellsCD4PE-Cy7+cellsB.WithCD8APC-Cy7andCD4PE-Cy7WithoutCD8APC-Cy7避免同一細(xì)胞使用偶聯(lián)染料避免染料和其衍生物（tandem-dye）在同一細(xì)胞上標(biāo)記，或者選用更穩(wěn)定的tandem-dye4BDHorizonTMV500CD45BDTMAPC-cy7CD14FITCCD8PerCP-CyTM5.5CD4BDHorizonTMV450CD3APCCD19PE-Cy?7CD56PECD80FluorochromeAntigenBDHorizonTMV500CD45BDTMAPC-cy7CD14FITCCD8PerCP-CyTM5.5CD4BDHorizonTMV450CD3APCCD19PE-Cy?7CD56PECD80FluorochromeAntigen不同細(xì)胞不同細(xì)胞NewTandemsAreMoreStableAPC-H7toreplaceAPC-Cy7:parisonofSampleStability(inBDStabilizingFixativeatRT)0501001502002500124682448Hoursoflightexposure%SpilloverCD4APC-H7CD8APC-H7CD4APC-Cy7CD8APC-Cy7自發(fā)熒光多的選擇用紅激光激發(fā)的染料BDHorizonTMV500CD45BDTMAPC-H7CD14FITCCD8PerCP-CyTM5.5CD4BDHorizonTMV450CD3APCCD19PE-Cy?7CD56PECD80FluorochromeAntigenPerfect!5多色組合原則1、按照機(jī)器設(shè)置：激光器（488nm？633nm？）/通道（濾光片530/30?585/42?）2、染料的亮度與抗原表達(dá)相匹配：強(qiáng)弱搭配3、同種細(xì)胞的Marker染料重疊最小化：不同激光器激發(fā)/避免雙激發(fā)染料4、盡量避免偶聯(lián)染料的使用帶來假陽性：不同細(xì)胞5、自發(fā)熒光高的樣本：紅激光激發(fā)C、多色應(yīng)用工具及新染料35

BrilliantViolet?421

BrilliantViolet?421ExMax:407nmEmMax:421nmand448nm用標(biāo)準(zhǔn)的HorizonV450filter:450/50nmBrilliantViolet?421

：極亮極亮：更好的細(xì)胞分群亮的染料使細(xì)胞分群更明顯陽性率增加

PerCP-Cy5.5CD279PEBrilliantViolet?42120%26%31%CD18444%79%溢漏更少BV421V450V500穩(wěn)定：StabilityinPFAfixativesSamplePrepTestingCriteriaStabilityResultsFixcells&storeinStainBuffer

@4CinthedarkAbilitytoresolvepositive&negativepopulations≥96hoursStainIndexdoesnotchangemorethan25%ofTime072hoursFixcells&storeinFixative@4CinthedarkAbilitytoresolvepositive&negativepopulations≥96hoursStainIndexdoesnotchangemorethan25%ofTime048hours(1%PFA)24hours(4%PFA)BV421特點(diǎn)總結(jié)極亮溢漏更少穩(wěn)定應(yīng)用：MulticolorBV421是多色組合的理想選擇尤其是弱表達(dá)/低表達(dá)Panels（FACSVerse）很亮的10色組合BrilliantViolet?605PolymerbasedtandemdyedevelopedbySirgenBV421+Cy3.5=BV605ExMax:407nmEmMax:602nmpatiblewithstandardfilter:610/20nmshouldalsoworkinrmendedfiltersfor:QDot605:605/20,eFluor605NC:610/4055Optimal3rdColorfortheVioletLaserAdditionalBrightDyeBrightnessissimilartoPE57LowspilloverintoadjacentchannelsSpilloverdataintoPE-CF594channeldetectedwithabluelaserand610/20filter.謝謝BDImag磁珠分選BDIMag磁珠分離系統(tǒng)步驟1向細(xì)胞懸液中加入抗體標(biāo)記的磁珠2磁珠通過特異性抗體與帶有相應(yīng)抗原的細(xì)胞結(jié)合3置于磁場中，與磁珠連接的細(xì)胞被磁場吸附4吸去上清，帶有抗原的細(xì)胞留在試管里，其他細(xì)胞在吸出的上清中正選法:去除上清，將試管移出磁場，分析被磁珠捕獲的細(xì)胞，即為目的細(xì)胞負(fù)選法:分析上清，目的細(xì)胞在上清液中其他磁珠分選系統(tǒng)目前的2種磁性細(xì)胞分離系統(tǒng)：

Smallparticles(≈50nm)－MACSLargeparticles(1200~4500nm)－others磁珠分離系統(tǒng)的重要指標(biāo)：Purity&Recovery大磁珠小磁珠優(yōu)點(diǎn)：技術(shù)簡單，分離可在試管中完成速度快，得率較高便宜優(yōu)點(diǎn)：對細(xì)胞，不影響分離細(xì)胞的后續(xù)培養(yǎng)可直接上流式檢測，不影響散射光缺點(diǎn)：影響細(xì)胞生物活性及功能,影響后續(xù)培養(yǎng)純度低不能直接上流式，F(xiàn)CM噴嘴

缺點(diǎn)：需要很強(qiáng)的磁場來分離細(xì)胞必須用一次性分離柱，不能在普通試管進(jìn)行速度慢，耗時(shí)長，昂貴大小磁珠分離的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)勢：技術(shù)簡單，分離在試管中完成純度高，