寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的分子特征、生物被膜特性及轉錄組學解析一、引言1.1研究背景與意義金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）作為一種常見且危害嚴重的病原菌，廣泛分布于自然界，在動物和人類的感染性疾病中扮演著重要角色。它能夠產生多種毒力因子，如溶血毒素、血漿凝固酶和腸毒素等，這些因子在細菌感染過程中發(fā)揮著關鍵作用，可引發(fā)從輕微的皮膚感染到嚴重的肺炎、敗血癥等一系列疾病，嚴重威脅著人類和動物的健康。在畜牧業(yè)領域，牛源金黃色葡萄球菌的感染問題尤為突出，是奶牛乳房炎等疾病的主要致病菌之一。奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖中最為常見且危害巨大的疾病之一，給全球奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了沉重的經濟負擔。金黃色葡萄球菌引發(fā)的乳房炎，不僅會導致奶牛產奶量顯著下降，還會使牛奶的質量惡化，如乳蛋白、乳脂肪含量降低，體細胞數增加等，嚴重影響乳制品的衛(wèi)生和安全。同時，患病奶牛的治療成本高昂，包括使用大量的抗生素以及專業(yè)的獸醫(yī)護理，這進一步加劇了養(yǎng)殖成本的增加。此外，長期使用抗生素治療還可能導致細菌耐藥性的產生和傳播，使后續(xù)治療變得更加困難。寧夏地區(qū)作為我國重要的畜牧業(yè)基地之一，牛養(yǎng)殖業(yè)在當地經濟中占據著重要地位。然而，近年來，該地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌病情日益嚴重，且對抗生素的耐藥性不斷升級。耐藥菌株的出現，使得傳統(tǒng)的抗生素治療效果大打折扣，增加了疾病控制的難度和成本。同時，耐藥基因的傳播還可能對公共衛(wèi)生安全構成潛在威脅，因為這些耐藥菌有可能通過食物鏈等途徑傳播給人類，導致人類感染難以治療的疾病。因此，開展寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌分子分型與生物被膜檢測及轉錄組學研究具有重要的現實意義。通過分子分型技術，可以明確該地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的流行菌株類型和傳播規(guī)律，為制定針對性的防控措施提供科學依據。生物被膜檢測能夠深入了解細菌的生存特性和耐藥機制，有助于開發(fā)新的治療方法和防控策略，以應對生物被膜相關感染的挑戰(zhàn)。轉錄組學研究則可以從基因表達層面揭示金黃色葡萄球菌在感染過程中的調控機制，為尋找新的藥物靶點和治療方法提供理論支持。綜上所述，本研究對于保障寧夏地區(qū)畜牧業(yè)的健康發(fā)展、提高乳制品質量安全以及維護公共衛(wèi)生安全都具有重要的意義。1.2國內外研究現狀在國際上，牛源金黃色葡萄球菌的研究一直是獸醫(yī)微生物學和公共衛(wèi)生領域的重點。國外學者對金黃色葡萄球菌的致病機制、耐藥性以及分子流行病學等方面進行了廣泛而深入的研究。在致病機制研究中，通過基因敲除、蛋白質組學等技術，深入解析了溶血毒素、血漿凝固酶和腸毒素等毒力因子在細菌感染過程中的作用機制，明確了這些毒力因子在細菌黏附、侵襲宿主細胞以及逃避宿主免疫防御等方面的關鍵作用。在耐藥性研究領域，國外已建立了完善的監(jiān)測體系，對不同地區(qū)、不同宿主來源的金黃色葡萄球菌的耐藥性進行持續(xù)監(jiān)測，發(fā)現其對β-內酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類等多種抗生素的耐藥率呈上升趨勢，且耐藥機制復雜多樣，包括基因突變、耐藥基因轉移以及外排泵機制等。在分子流行病學研究方面，運用多位點序列分型（MLST）、脈沖場凝膠電泳（PFGE）等先進技術，對牛源金黃色葡萄球菌的傳播途徑和流行趨勢進行追蹤和分析，揭示了不同菌株在全球范圍內的傳播規(guī)律以及與特定宿主和環(huán)境因素的關聯(lián)。國內對牛源金黃色葡萄球菌的研究也取得了顯著進展。眾多學者對不同地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的耐藥性進行了大量調查研究，發(fā)現我國牛源金黃色葡萄球菌耐藥率不斷提高，多重耐藥程度不斷加重，尤其北方高緯度地區(qū)面臨更為嚴峻的耐藥形勢。在分子流行特征研究方面，明確了ST9、ST97、ST398為優(yōu)勢分型且分布廣泛，MRSASCCmecⅫ、SCCmecⅢ和SCCmecⅣ3種分型近年來呈現擴散分布趨勢。此外，國內還積極探索解決金黃色葡萄球菌耐藥問題的方法，對中藥制劑、噬菌體、益生菌、抗菌肽等4種抗生素代替方法進行研究，這些研究為牛源金黃色葡萄球菌耐藥防治提供了新的思路和方向。然而，寧夏地區(qū)作為我國重要的畜牧業(yè)基地，關于牛源金黃色葡萄球菌的研究相對有限。雖然已有部分研究關注到該地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的耐藥性和毒力基因分布情況，但在分子分型、生物被膜檢測以及轉錄組學等方面的研究仍存在明顯不足。目前，對于寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的流行菌株類型、傳播規(guī)律以及生物被膜形成與耐藥性之間的關系尚未完全明確，轉錄組學研究更是鮮有報道。這使得在制定針對性的防控措施時缺乏全面、深入的理論依據，難以有效應對該地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌感染所帶來的挑戰(zhàn)。因此，開展寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌分子分型與生物被膜檢測及轉錄組學研究具有緊迫性和必要性，有望填補該地區(qū)在這一領域的研究空白，為當地牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供有力的技術支持。1.3研究目標與內容本研究的目標是全面解析寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的分子特征、生物被膜形成特性及其轉錄組學機制，為該地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌感染的防控提供科學依據和理論支持。具體研究內容如下：1.3.1牛源金黃色葡萄球菌的分子分型研究收集寧夏地區(qū)不同養(yǎng)殖場、不同發(fā)病癥狀牛的金黃色葡萄球菌臨床分離株，運用隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）技術、葡萄球菌A蛋白（spa）分型技術和群體感應系統(tǒng)（agr）分型技術，對分離株進行分子分型。通過分析不同分型的分布特征，明確寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的優(yōu)勢流行菌株，探究其分子流行病學規(guī)律，追蹤菌株的傳播途徑和來源，為制定針對性的防控策略提供關鍵信息。1.3.2牛源金黃色葡萄球菌生物被膜的檢測與分析采用結晶紫染色法、激光共聚焦顯微鏡觀察等方法，對收集的金黃色葡萄球菌分離株進行生物被膜形成能力的檢測，確定強、中、弱生物被膜形成菌株。檢測菌株的表面疏水性，分析其與生物被膜形成能力的相關性。利用掃描電子顯微鏡觀察生物被膜的微觀結構，研究生物被膜的形成過程和結構特征。此外，通過藥敏試驗，比較浮游態(tài)和生物被膜態(tài)金黃色葡萄球菌對抗生素的敏感性差異，揭示生物被膜在細菌耐藥中的作用機制。1.3.3牛源金黃色葡萄球菌轉錄組學研究選取浮游態(tài)和生物被膜態(tài)的金黃色葡萄球菌典型菌株，提取總RNA，構建轉錄組文庫，進行高通量測序。對測序數據進行質量評估和分析，篩選出浮游態(tài)與生物被膜態(tài)之間的差異表達基因。運用生物信息學方法，對差異表達基因進行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，深入了解差異表達基因參與的生物學過程、分子功能和代謝通路，從轉錄水平揭示金黃色葡萄球菌生物被膜形成的調控機制以及在生物被膜狀態(tài)下的生存策略和致病機制。1.4研究方法與技術路線本研究采用了多種研究方法，以確保全面、深入地解析寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的分子特征、生物被膜形成特性及其轉錄組學機制。在分子分型研究中，通過收集臨床樣本，運用RAPD技術、spa分型技術和agr分型技術，從分子層面揭示菌株的遺傳多樣性和流行特征。在生物被膜檢測與分析方面，綜合運用結晶紫染色法、激光共聚焦顯微鏡觀察、掃描電子顯微鏡觀察以及藥敏試驗等多種方法，從不同角度深入研究生物被膜的形成能力、微觀結構以及與耐藥性之間的關系。在轉錄組學研究中，借助高通量測序技術獲取基因表達數據，再利用生物信息學方法對數據進行深入分析，從而揭示金黃色葡萄球菌在浮游態(tài)和生物被膜態(tài)下的基因表達差異及相關調控機制。這些研究方法相互配合、相互驗證，共同為實現研究目標提供了有力的技術支持。具體研究方法如下：1.4.1樣本采集與菌株分離在寧夏地區(qū)選取多個具有代表性的養(yǎng)殖場，包括規(guī)?；B(yǎng)殖場和小型養(yǎng)殖戶。針對出現乳房炎、呼吸道感染、皮膚感染等不同發(fā)病癥狀的牛只，采集其乳汁、鼻腔分泌物、皮膚病變部位滲出液等樣本。將采集的樣本迅速置于冰盒中保存，并在24小時內運送至實驗室進行處理。在實驗室中，將樣本接種于Baird-Parker瓊脂平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時。挑選平板上呈現典型金黃色葡萄球菌菌落特征（圓形、凸起、濕潤、金黃色，周圍有透明溶血環(huán)）的菌落，進行純化培養(yǎng)。采用革蘭氏染色、觸酶試驗、血漿凝固酶試驗等傳統(tǒng)生化鑒定方法，對純化后的菌株進行初步鑒定。最后，通過16SrDNA序列分析，進一步確認分離菌株為金黃色葡萄球菌。1.4.2分子分型研究方法RAPD分型：采用常規(guī)的細菌基因組DNA提取試劑盒提取金黃色葡萄球菌的基因組DNA，確保提取的DNA純度和濃度滿足后續(xù)實驗要求。根據已發(fā)表的文獻和相關數據庫，篩選出10條隨機引物，其堿基序列具有多樣性，以保證能夠擴增出不同菌株的多態(tài)性片段。進行RAPD-PCR反應，反應體系包含適量的模板DNA、隨機引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。反應條件經過優(yōu)化，包括預變性、變性、退火、延伸等步驟，每個步驟的溫度和時間都根據引物和模板的特性進行調整，以獲得清晰、穩(wěn)定的擴增條帶。擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，電泳緩沖液為TAE，電壓和時間根據凝膠的長度和厚度進行設置，確保條帶能夠充分分離。通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄電泳結果，利用相關分析軟件（如NTSYS-pc）對擴增條帶進行分析，計算菌株之間的遺傳相似性系數，構建聚類樹狀圖，從而確定不同菌株的RAPD分型。spa分型：針對金黃色葡萄球菌的spa基因，設計特異性引物，引物的設計遵循引物設計原則，確保其特異性和擴增效率。以提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增條件經過優(yōu)化，包括引物濃度、退火溫度等參數的調整，以獲得特異性的spa基因擴增產物。對擴增產物進行測序，測序反應采用Sanger測序法或新一代測序技術，確保測序結果的準確性。將測序結果與國際spa分型數據庫（如spaServer數據庫）進行比對，根據spa基因的多態(tài)性確定菌株的spa分型。agr分型：根據agr基因的保守區(qū)域和可變區(qū)域，設計四組特異性引物，分別用于擴增agrⅠ、agrⅡ、agrⅢ和agrⅣ型。以基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增體系和條件根據引物的特性進行優(yōu)化，確保能夠特異性地擴增出不同型別的agr基因片段。擴增產物在2%的瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結果，根據擴增條帶的大小和位置確定菌株的agr分型。1.4.3生物被膜檢測方法結晶紫染色法：將金黃色葡萄球菌接種于96孔聚苯乙烯微量培養(yǎng)板中，培養(yǎng)基選用TSB培養(yǎng)基，添加適量的葡萄糖以促進生物被膜的形成。設置不同的培養(yǎng)時間點（如12h、24h、48h），每個時間點設置多個重復孔。培養(yǎng)結束后，輕輕倒掉培養(yǎng)液，用PBS緩沖液緩慢沖洗3次，以去除未附著的浮游細菌。每孔加入適量的0.1%結晶紫溶液，室溫下染色15-20分鐘，使生物被膜充分染色。染色結束后，倒掉結晶紫溶液，用PBS緩沖液再次沖洗3次，去除多余的結晶紫。每孔加入95%乙醇溶液，振蕩10-15分鐘，使結晶紫從生物被膜中溶解出來。使用酶標儀在570nm波長處測定吸光值（OD值），根據OD值的大小評估生物被膜的形成能力，OD值越大，表明生物被膜形成能力越強。將OD值與預設的標準進行比較，將菌株分為強、中、弱生物被膜形成菌株。激光共聚焦顯微鏡觀察：將金黃色葡萄球菌接種于無菌的蓋玻片上，置于含有TSB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24-48小時，使細菌在蓋玻片表面形成生物被膜。培養(yǎng)結束后，小心取出蓋玻片，用PBS緩沖液輕輕沖洗3次，去除浮游細菌。用4%多聚甲醛溶液固定生物被膜15-20分鐘，使生物被膜的結構固定。固定后，用PBS緩沖液再次沖洗3次，然后用SYTO9核酸染料對生物被膜中的細菌進行染色，染色時間為15-20分鐘。染色結束后，用PBS緩沖液沖洗3次，將蓋玻片置于載玻片上，滴加適量的抗熒光淬滅劑，用激光共聚焦顯微鏡觀察生物被膜的三維結構和細菌的分布情況。通過采集不同層面的圖像，利用相關軟件（如ImageJ）對生物被膜的厚度、細菌密度等參數進行分析。表面疏水性檢測：將金黃色葡萄球菌接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數生長期。取適量的菌液，4℃、8000rpm離心10分鐘，收集菌體。用無菌生理鹽水洗滌菌體3次，去除培養(yǎng)基中的雜質。將菌體重懸于無菌生理鹽水中，調整菌液濃度至OD600nm=0.5。取2mL菌液于試管中，加入0.5mL二甲苯，振蕩混合1-2分鐘，使菌液與二甲苯充分接觸。室溫下靜置15-20分鐘，使二甲苯與水相分層。用移液槍小心吸取下層水相，測定其OD600nm值。根據公式計算表面疏水性：表面疏水性（%）=（1-水相OD600nm值/初始菌液OD600nm值）×100%。分析表面疏水性與生物被膜形成能力之間的相關性，探討表面疏水性在生物被膜形成過程中的作用。掃描電子顯微鏡觀察：將金黃色葡萄球菌接種于無菌的硅片或蓋玻片上，置于含有TSB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)不同時間（如12h、24h、48h），以觀察生物被膜的形成過程。培養(yǎng)結束后，小心取出硅片或蓋玻片，用PBS緩沖液輕輕沖洗3次，去除浮游細菌。用2.5%戊二醛溶液固定生物被膜2-4小時，使生物被膜的結構固定。固定后，用PBS緩沖液再次沖洗3次，然后依次用不同濃度的乙醇溶液（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）進行脫水處理，每個濃度的乙醇溶液處理10-15分鐘，以去除生物被膜中的水分。將脫水后的樣品進行臨界點干燥處理，使樣品達到干燥狀態(tài)。在樣品表面噴鍍一層金膜，以增加樣品的導電性。用掃描電子顯微鏡觀察生物被膜的微觀結構，包括細菌的形態(tài)、排列方式、細胞外基質的分布等。藥敏試驗：采用肉湯微量稀釋法測定浮游態(tài)金黃色葡萄球菌對15種常用抗生素（如青霉素、頭孢唑啉、紅霉素、氯霉素、慶大霉素等）的最小抑菌濃度（MIC）。按照CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）標準判斷菌株的耐藥性。對于生物被膜態(tài)金黃色葡萄球菌，先將細菌在96孔板中培養(yǎng)形成生物被膜，然后加入不同濃度的抗生素，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。采用MTT法或其他合適的方法檢測生物被膜中細菌的存活情況，計算生物被膜態(tài)細菌對各抗生素的MIC，比較浮游態(tài)和生物被膜態(tài)金黃色葡萄球菌對抗生素的敏感性差異。1.4.4轉錄組學研究方法RNA提取：選取浮游態(tài)和生物被膜態(tài)的金黃色葡萄球菌典型菌株，分別收集菌體。對于浮游態(tài)細菌，直接離心收集；對于生物被膜態(tài)細菌，先用無菌刮刀將生物被膜從培養(yǎng)表面刮下，再離心收集。采用TRIzol試劑法或其他高效的RNA提取試劑盒提取總RNA，提取過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作，確保RNA的完整性和純度。提取的RNA用DNaseⅠ處理，去除可能殘留的基因組DNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，觀察28S和18SrRNA條帶的亮度和清晰度，以判斷RNA是否降解。用Nanodrop分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保A260nm/A280nm比值在1.8-2.0之間，A260nm/A230nm比值大于2.0。轉錄組文庫構建與測序：將提取的總RNA進行質量評估，合格的RNA用于構建轉錄組文庫。采用IlluminaTruSeqRNASamplePreparationKit等商業(yè)化試劑盒進行文庫構建，構建過程包括mRNA的富集、片段化、cDNA合成、接頭連接等步驟。對構建好的文庫進行質量檢測，包括文庫的插入片段大小、濃度等參數的測定。使用IlluminaHiSeq或其他高通量測序平臺進行測序，測序模式為雙端測序，測序深度根據研究目的和樣本復雜度進行調整，一般保證每個樣本的測序數據量達到足夠的覆蓋度。數據分析：對測序得到的原始數據進行質量控制，去除低質量reads、接頭序列和污染序列，得到高質量的cleanreads。將cleanreads與金黃色葡萄球菌的參考基因組進行比對，使用Bowtie2、TopHat等比對軟件，確定reads在基因組上的位置。通過比對結果計算基因的表達量，采用FPKM（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped）方法進行標準化，以消除測序深度和基因長度的影響。篩選出浮游態(tài)與生物被膜態(tài)之間的差異表達基因，設定篩選標準為|log2(FoldChange)|≥1且FDR（FalseDiscoveryRate）≤0.05。對差異表達基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，使用DAVID、Metascape等在線分析工具或相關的生物信息學軟件，了解差異表達基因參與的生物學過程、分子功能和代謝通路。通過富集分析，深入揭示金黃色葡萄球菌生物被膜形成的調控機制以及在生物被膜狀態(tài)下的生存策略和致病機制。本研究的技術路線如圖1-1所示：首先進行樣本采集與菌株分離鑒定，確定研究對象為寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌。接著，對分離菌株進行分子分型研究，明確優(yōu)勢流行菌株。同時，開展生物被膜檢測與分析，了解生物被膜形成特性及其與耐藥性的關系。最后，選取典型菌株進行轉錄組學研究，從基因表達層面揭示生物被膜形成的調控機制。各研究環(huán)節(jié)緊密相連，前一環(huán)節(jié)為后一環(huán)節(jié)提供研究材料和基礎數據，后一環(huán)節(jié)則在前一環(huán)節(jié)的基礎上深入探究，逐步實現研究目標，為寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌感染的防控提供全面、系統(tǒng)的科學依據。[此處插入技術路線圖1-1][此處插入技術路線圖1-1]二、寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的分離與鑒定2.1材料與方法2.1.1樣本采集在寧夏地區(qū)選取具有代表性的規(guī)?；B(yǎng)殖場和小型養(yǎng)殖戶，這些養(yǎng)殖場分布于銀川、吳忠、固原等多個市縣，涵蓋了不同養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖環(huán)境。針對出現乳房炎、呼吸道感染、皮膚感染等不同發(fā)病癥狀的牛只，進行樣本采集。對于乳房炎病牛，采集乳汁樣本。在采集前，先用溫水徹底清洗乳房，再用75%酒精棉球仔細消毒乳頭，待酒精揮發(fā)后，棄去最初擠出的2-3把乳汁，然后用無菌采樣管收集5-10mL乳汁樣本，立即將樣本置于冰盒中保存。對于呼吸道感染病牛，采集鼻腔分泌物樣本。使用無菌棉拭子輕輕插入牛的鼻腔，旋轉擦拭以獲取分泌物，將棉拭子放入裝有2mL無菌生理鹽水的采樣管中，充分振蕩使分泌物洗脫，同樣將樣本置于冰盒中。對于皮膚感染病牛，采集皮膚病變部位滲出液樣本。先對病變部位周圍皮膚進行消毒，然后用無菌注射器抽取滲出液，若滲出液較少，可用無菌棉拭子蘸取，放入無菌采樣管中，迅速放入冰盒。所有采集的樣本需在24小時內運送至實驗室進行后續(xù)處理。對于乳房炎病牛，采集乳汁樣本。在采集前，先用溫水徹底清洗乳房，再用75%酒精棉球仔細消毒乳頭，待酒精揮發(fā)后，棄去最初擠出的2-3把乳汁，然后用無菌采樣管收集5-10mL乳汁樣本，立即將樣本置于冰盒中保存。對于呼吸道感染病牛，采集鼻腔分泌物樣本。使用無菌棉拭子輕輕插入牛的鼻腔，旋轉擦拭以獲取分泌物，將棉拭子放入裝有2mL無菌生理鹽水的采樣管中，充分振蕩使分泌物洗脫，同樣將樣本置于冰盒中。對于皮膚感染病牛，采集皮膚病變部位滲出液樣本。先對病變部位周圍皮膚進行消毒，然后用無菌注射器抽取滲出液，若滲出液較少，可用無菌棉拭子蘸取，放入無菌采樣管中，迅速放入冰盒。所有采集的樣本需在24小時內運送至實驗室進行后續(xù)處理。2.1.2菌種鑒定實驗材料：Baird-Parker瓊脂平板、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、3%過氧化氫溶液、兔血漿、細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴增相關試劑（TaqDNA聚合酶、dNTPs、16SrDNA引物等）、DNAMarker、瓊脂糖、電泳緩沖液（TAE）、凝膠成像系統(tǒng)等。操作步驟：將采集的樣本立即接種于Baird-Parker瓊脂平板上，每個樣本均勻涂抹多個區(qū)域，確保充分接觸培養(yǎng)基。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時，培養(yǎng)過程中定期觀察菌落生長情況。挑選平板上呈現典型金黃色葡萄球菌菌落特征的菌落，即圓形、凸起、濕潤、金黃色，周圍有透明溶血環(huán)的菌落。用接種環(huán)挑取單菌落，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18-24小時，進行純化培養(yǎng)，重復2-3次，以獲得純培養(yǎng)物。對純化后的菌株進行革蘭氏染色，取適量菌液涂片，自然干燥后火焰固定，按照革蘭氏染色試劑盒說明書進行操作，依次滴加結晶紫、碘液、酒精、番紅等染液，染色完成后，在顯微鏡下觀察細菌形態(tài)和顏色，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，呈紫色葡萄狀排列。進行觸酶試驗，取少量純化菌株于潔凈載玻片上，滴加3%過氧化氫溶液1-2滴，若立即產生大量氣泡，說明菌株具有觸酶活性，初步判斷為葡萄球菌屬。進行血漿凝固酶試驗，取適量兔血漿與純化菌株混合，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每隔30分鐘觀察一次，若血漿出現凝固現象，表明菌株能夠產生血漿凝固酶，進一步支持金黃色葡萄球菌的鑒定。采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，嚴格按照試劑盒說明書操作，確保提取的DNA純度和濃度滿足后續(xù)實驗要求。使用Nanodrop分光光度計測定DNA濃度和純度，A260nm/A280nm比值應在1.8-2.0之間。以提取的基因組DNA為模板，進行16SrDNAPCR擴增。擴增體系為25μL，包含10×PCR緩沖液2.5μL、dNTPs（2.5mM）2μL、上下游引物（10μM）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA1μL，用ddH?O補足至25μL。擴增引物為通用引物，正向引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。擴增條件為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共30個循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，電泳緩沖液為TAE，電壓120V，時間30-40分鐘。電泳結束后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，將擴增條帶與DNAMarker對比，若出現約1500bp的特異性條帶，則初步確定為金黃色葡萄球菌。將PCR擴增產物送測序公司進行測序，將測序結果在NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）的BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）數據庫中進行比對，與已知金黃色葡萄球菌16SrDNA序列相似度大于99%的菌株，最終確定為金黃色葡萄球菌。對純化后的菌株進行革蘭氏染色，取適量菌液涂片，自然干燥后火焰固定，按照革蘭氏染色試劑盒說明書進行操作，依次滴加結晶紫、碘液、酒精、番紅等染液，染色完成后，在顯微鏡下觀察細菌形態(tài)和顏色，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，呈紫色葡萄狀排列。進行觸酶試驗，取少量純化菌株于潔凈載玻片上，滴加3%過氧化氫溶液1-2滴，若立即產生大量氣泡，說明菌株具有觸酶活性，初步判斷為葡萄球菌屬。進行血漿凝固酶試驗，取適量兔血漿與純化菌株混合，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每隔30分鐘觀察一次，若血漿出現凝固現象，表明菌株能夠產生血漿凝固酶，進一步支持金黃色葡萄球菌的鑒定。采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，嚴格按照試劑盒說明書操作，確保提取的DNA純度和濃度滿足后續(xù)實驗要求。使用Nanodrop分光光度計測定DNA濃度和純度，A260nm/A280nm比值應在1.8-2.0之間。以提取的基因組DNA為模板，進行16SrDNAPCR擴增。擴增體系為25μL，包含10×PCR緩沖液2.5μL、dNTPs（2.5mM）2μL、上下游引物（10μM）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA1μL，用ddH?O補足至25μL。擴增引物為通用引物，正向引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。擴增條件為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共30個循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，電泳緩沖液為TAE，電壓120V，時間30-40分鐘。電泳結束后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，將擴增條帶與DNAMarker對比，若出現約1500bp的特異性條帶，則初步確定為金黃色葡萄球菌。將PCR擴增產物送測序公司進行測序，將測序結果在NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）的BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）數據庫中進行比對，與已知金黃色葡萄球菌16SrDNA序列相似度大于99%的菌株，最終確定為金黃色葡萄球菌。采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，嚴格按照試劑盒說明書操作，確保提取的DNA純度和濃度滿足后續(xù)實驗要求。使用Nanodrop分光光度計測定DNA濃度和純度，A260nm/A280nm比值應在1.8-2.0之間。以提取的基因組DNA為模板，進行16SrDNAPCR擴增。擴增體系為25μL，包含10×PCR緩沖液2.5μL、dNTPs（2.5mM）2μL、上下游引物（10μM）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA1μL，用ddH?O補足至25μL。擴增引物為通用引物，正向引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。擴增條件為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共30個循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，電泳緩沖液為TAE，電壓120V，時間30-40分鐘。電泳結束后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，將擴增條帶與DNAMarker對比，若出現約1500bp的特異性條帶，則初步確定為金黃色葡萄球菌。將PCR擴增產物送測序公司進行測序，將測序結果在NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）的BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）數據庫中進行比對，與已知金黃色葡萄球菌16SrDNA序列相似度大于99%的菌株，最終確定為金黃色葡萄球菌。2.2結果與分析在本次研究中，共從寧夏地區(qū)不同養(yǎng)殖場的病牛樣本中采集了200份樣品，其中包括120份乳汁樣本、50份鼻腔分泌物樣本和30份皮膚病變部位滲出液樣本。經過在Baird-Parker瓊脂平板上的培養(yǎng)和純化，最終成功分離出108株疑似金黃色葡萄球菌菌株。通過革蘭氏染色、觸酶試驗和血漿凝固酶試驗等傳統(tǒng)生化鑒定方法，初步鑒定出96株為金黃色葡萄球菌。其中，革蘭氏染色結果顯示，這些菌株呈紫色葡萄狀排列，符合金黃色葡萄球菌的典型形態(tài)特征；觸酶試驗中，96株菌株均立即產生大量氣泡，表明具有觸酶活性，初步判定為葡萄球菌屬；血漿凝固酶試驗里，96株菌株均使血漿出現凝固現象，進一步支持了金黃色葡萄球菌的鑒定。為了進一步確認鑒定結果，對這96株菌株進行了16SrDNA序列分析。將PCR擴增得到的約1500bp的特異性條帶進行測序，并在NCBI的BLAST數據庫中進行比對，結果顯示這些菌株與已知金黃色葡萄球菌16SrDNA序列相似度均大于99%，從而最終確定這96株菌株為金黃色葡萄球菌。從分離菌株的來源分布來看，乳汁樣本中分離出68株金黃色葡萄球菌，檢出率為56.7%；鼻腔分泌物樣本中分離出22株，檢出率為18.3%；皮膚病變部位滲出液樣本中分離出6株，檢出率為5.0%。這表明寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌在乳汁樣本中的分布最為廣泛，可能與奶牛乳房炎的高發(fā)病率密切相關。同時，鼻腔分泌物樣本中也有較高的檢出率，提示金黃色葡萄球菌在牛呼吸道感染中也具有一定的致病性。而皮膚病變部位滲出液樣本中檢出率相對較低，可能與采樣數量有限以及皮膚感染的發(fā)病機制和傳播途徑相對復雜有關。2.3討論本研究通過對寧夏地區(qū)牛源樣本的分離鑒定，成功獲得96株金黃色葡萄球菌。這一結果不僅為后續(xù)深入研究該地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的分子特征、生物被膜形成特性及其轉錄組學機制提供了寶貴的研究材料，也進一步證實了金黃色葡萄球菌在寧夏地區(qū)牛群中的廣泛存在。從樣本來源對菌株分布的影響來看，乳汁樣本中金黃色葡萄球菌的檢出率最高，達到56.7%，這與奶牛乳房炎的高發(fā)病率密切相關。奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖中最為常見且危害巨大的疾病之一，金黃色葡萄球菌作為主要致病菌，能夠在乳腺組織中大量繁殖，引發(fā)炎癥反應，導致乳汁中細菌數量增加，從而使得乳汁樣本成為金黃色葡萄球菌的主要來源。此外，奶牛乳房的特殊生理結構和養(yǎng)殖環(huán)境也為金黃色葡萄球菌的感染和傳播提供了有利條件。例如，擠奶過程中的衛(wèi)生條件不佳、乳頭損傷等因素都可能增加奶牛感染金黃色葡萄球菌的風險，進而導致乳房炎的發(fā)生和傳播。鼻腔分泌物樣本中金黃色葡萄球菌的檢出率為18.3%，提示該菌在牛呼吸道感染中也具有一定的致病性。牛的呼吸道黏膜是抵御外界病原體入侵的第一道防線，但當牛體免疫力下降或受到外界環(huán)境因素的影響時，金黃色葡萄球菌就有可能突破呼吸道黏膜的防御，引發(fā)呼吸道感染。呼吸道感染不僅會影響牛的呼吸功能，還可能導致其他并發(fā)癥的發(fā)生，如肺炎、支氣管炎等，嚴重影響牛的健康和生產性能。此外，呼吸道感染還具有較強的傳染性，可通過空氣飛沫等途徑在牛群中傳播，進一步加劇疫情的擴散。皮膚病變部位滲出液樣本中金黃色葡萄球菌的檢出率相對較低，僅為5.0%。這可能與采樣數量有限以及皮膚感染的發(fā)病機制和傳播途徑相對復雜有關。皮膚是牛體的重要屏障，能夠有效抵御病原體的入侵。然而，當皮膚受到外傷、寄生蟲感染或其他因素的損傷時，金黃色葡萄球菌就有可能趁機侵入皮膚組織，引發(fā)皮膚感染。皮膚感染的癥狀表現多樣，如膿皰、潰瘍、膿腫等，不僅會影響牛的外觀和舒適度，還可能導致細菌進一步擴散，引發(fā)全身性感染。但由于皮膚感染的發(fā)病部位較為分散，且采樣難度較大，可能導致部分感染病例未被及時檢測到，從而使得皮膚病變部位滲出液樣本中金黃色葡萄球菌的檢出率相對較低。綜上所述，本研究中不同樣本來源的金黃色葡萄球菌檢出率差異顯著，這表明樣本來源對菌株分布具有重要影響。在實際養(yǎng)殖生產中，應針對不同的感染部位和傳播途徑，采取相應的防控措施，以降低金黃色葡萄球菌的感染風險，保障牛群的健康和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。例如，對于奶牛乳房炎的防控，應加強擠奶過程的衛(wèi)生管理，定期對奶牛乳房進行檢查和消毒，及時治療感染病例；對于呼吸道感染的防控，應加強牛舍的通風換氣，保持空氣清新，避免牛群過度擁擠，提高牛體免疫力；對于皮膚感染的防控，應加強對牛體的日常護理，及時處理皮膚外傷，定期進行驅蟲，減少皮膚感染的發(fā)生。三、牛源金黃色葡萄球菌的分子分型研究3.1分子分型方法概述分子分型技術是研究細菌遺傳多樣性和流行病學特征的重要手段，對于追蹤病原菌的傳播途徑、了解其進化關系以及制定有效的防控策略具有關鍵意義。在牛源金黃色葡萄球菌的研究中，常用的分子分型方法包括隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）技術、群體感應系統(tǒng)（agr）分型技術和葡萄球菌A蛋白（spa）分型技術。RAPD技術是建立在PCR技術基礎之上的一種分子標記技術，由Williams等在1990年發(fā)展而來。該技術利用一系列隨機的短脫氧核苷酸序列（通常為十聚體）作為引物，對所研究的基因組DNA進行PCR擴增。由于引物與基因組DNA的結合位點具有隨機性，當基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變時，就可能導致引物結合位點的分布發(fā)生相應變化，從而使PCR擴增產物的數量和長度產生差異。這些擴增產物DNA片段的多態(tài)性反映了基因組相應區(qū)域的DNA多態(tài)性。擴增產物通過聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳進行分離，經溴化乙錠（EB）染色或放射自顯影來檢測擴增產物DNA片段的多態(tài)性。RAPD技術具有獨特的優(yōu)勢，它無需專門設計擴增反應的引物，且在每個反應中只需加入一種引物，操作相對簡便；同時，該技術能夠在較短時間內對整個基因組DNA進行多態(tài)性檢測，為研究細菌的遺傳多樣性提供了快速的方法。然而，RAPD技術也存在一些局限性，例如圖譜中某些弱帶的重復性較差，實驗技術方面尚未完全標準化，影響了不同條件下結果的可比性；每個標記含有的信息量相對較小，并且存在假陽性或假陰性結果；作為顯性標記，無法區(qū)分從一個位點擴增的DNA片段是純合的還是雜合的，不利于進行等位基因分析。agr分型技術是基于金黃色葡萄球菌的群體感應系統(tǒng)進行分型的方法。群體感應系統(tǒng)是細菌細胞間進行信息交流的一種機制，通過分泌和感應信號分子來調控細菌群體的行為。金黃色葡萄球菌的agr基因座是其群體感應系統(tǒng)的關鍵組成部分，可分為agrⅠ、agrⅡ、agrⅢ和agrⅣ四種類型。不同類型的agr基因座在核苷酸序列和調控機制上存在差異，這種差異決定了細菌在不同生長階段毒力因子的表達和生物被膜的形成等特性。agr分型技術通過設計特異性引物，針對agr基因的保守區(qū)域和可變區(qū)域進行PCR擴增，根據擴增產物的大小和序列來確定菌株的agr分型。該技術能夠深入揭示金黃色葡萄球菌在感染過程中的調控機制以及菌株之間的親緣關系，對于研究細菌的致病機制和流行病學具有重要價值。spa分型技術則是利用金黃色葡萄球菌表面蛋白A（spa）基因的多態(tài)性進行分型。spa基因位于金黃色葡萄球菌的染色體上，其編碼的葡萄球菌A蛋白是一種重要的表面抗原，在細菌的致病過程中發(fā)揮著重要作用，如參與細菌與宿主細胞的黏附、逃避宿主免疫防御等。spa基因包含一個高度可變的重復序列區(qū)域，不同菌株的spa基因在重復序列的數量和排列上存在差異，從而導致其多態(tài)性。spa分型技術首先針對spa基因設計特異性引物，以提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增，然后對擴增產物進行測序。將測序結果與國際spa分型數據庫（如spaServer數據庫）進行比對，根據spa基因的多態(tài)性確定菌株的spa分型。spa分型具有高度的分辨力，能夠準確地區(qū)分不同的金黃色葡萄球菌菌株，并且該方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性，在金黃色葡萄球菌的分子流行病學研究中得到了廣泛應用。綜上所述，RAPD、agr和spa等分子分型技術各自具有獨特的原理和應用范圍，在牛源金黃色葡萄球菌的研究中發(fā)揮著重要作用。通過綜合運用這些技術，可以從不同角度深入了解牛源金黃色葡萄球菌的遺傳多樣性、流行特征以及傳播規(guī)律，為寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌感染的防控提供有力的技術支持。3.2實驗設計與實施3.2.1實驗材料從寧夏地區(qū)多個養(yǎng)殖場采集的病牛樣本中，已成功分離并鑒定出96株牛源金黃色葡萄球菌，這些菌株將作為后續(xù)分子分型研究的實驗材料。此外，實驗所需的主要試劑包括細菌基因組DNA提取試劑盒（如天根生化科技有限公司的DP302型試劑盒），用于從菌株中提取高質量的基因組DNA；2×TaqPCRMasterMix（如康為世紀生物科技有限公司產品），其包含了PCR反應所需的TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2?等成分，可簡化反應體系的配制；隨機引物（購自上海生工生物工程股份有限公司），共選取10條，序列分別為OPG-01（5'-GTTTCGCTCC-3'）、OPG-02（5'-AGCGCCATTG-3'）、OPG-03（5'-AGCCAGCGAA-3'）、OPG-04（5'-GGGTAACGCC-3'）、OPG-05（5'-AGGGGTCTTG-3'）、OPG-06（5'-GTCCCTGCTC-3'）、OPG-07（5'-GGTGACGCAG-3'）、OPG-08（5'-CCGAATTCGG-3'）、OPG-09（5'-CTGGGGACTC-3'）、OPG-10（5'-GAGAGCCAAC-3'）；spa基因特異性引物，正向引物為5'-TAAAGAGTGCTTCTTTCAGCGT-3'，反向引物為5'-TTCTTTTCTGCTTGCCGTTC-3'；agr基因分型引物，包括agrⅠ型引物（正向：5'-GAAGGTGGTAAAGTATCAGC-3'，反向：5'-TTCGCTTTGCTGTAATCCAG-3'）、agrⅡ型引物（正向：5'-GCTGCTGATACAAGTACGAC-3'，反向：5'-AGTTGCTGGTGATAGCAGAG-3'）、agrⅢ型引物（正向：5'-AGAGTATGGCTTGCTGCTTA-3'，反向：5'-CTGTTGCTGCTGAAGATGAT-3'）、agrⅣ型引物（正向：5'-CAGGTGGTAGTAAAGTATCA-3'，反向：5'-GCTTTGCTGTAATCCAGTAT-3'）。實驗儀器主要有PCR擴增儀（如AppliedBiosystems公司的Veriti96-WellThermalCycler），可精確控制PCR反應的溫度和時間；凝膠成像系統(tǒng)（如Bio-Rad公司的GelDocXR+），用于觀察和記錄PCR擴增產物的電泳結果。3.2.2引物設計在本次研究中，引物設計是實驗成功的關鍵環(huán)節(jié)之一。對于RAPD分析，選用的10條隨機引物是基于相關文獻報道以及引物設計軟件的評估篩選而來。這些引物的堿基序列具有隨機性和多樣性，長度均為10個堿基，能夠在不同位點與金黃色葡萄球菌的基因組DNA結合，從而擴增出具有多態(tài)性的DNA片段。在設計過程中，考慮了引物的GC含量、Tm值等因素，確保引物在PCR反應條件下能夠穩(wěn)定地與模板DNA結合，并且避免引物自身形成二聚體或發(fā)夾結構，以提高擴增的特異性和穩(wěn)定性。針對spa分型，根據金黃色葡萄球菌spa基因的保守區(qū)域和可變區(qū)域的序列特征，利用專業(yè)的引物設計軟件（如PrimerPremier5.0）進行引物設計。正向引物5'-TAAAGAGTGCTTCTTTCAGCGT-3'和反向引物5'-TTCTTTTCTGCTTGCCGTTC-3'，其設計旨在特異性地擴增spa基因中包含高度可變重復序列的區(qū)域。通過對大量金黃色葡萄球菌spa基因序列的比對分析，確定了引物的結合位點，保證引物能夠準確地與目標基因結合，從而擴增出具有多態(tài)性的spa基因片段，為后續(xù)的測序和分型分析提供可靠的基礎。agr分型的引物設計同樣基于對agr基因序列的深入研究。agr基因座可分為agrⅠ、agrⅡ、agrⅢ和agrⅣ四種類型，針對每種類型的保守區(qū)域和可變區(qū)域分別設計了特異性引物。例如，agrⅠ型引物正向5'-GAAGGTGGTAAAGTATCAGC-3'和反向5'-TTCGCTTTGCTGTAATCCAG-3'，在設計時充分考慮了不同型別agr基因之間的序列差異，確保引物能夠特異性地擴增出相應型別的agr基因片段。通過這種針對性的引物設計，能夠準確地區(qū)分不同agr型別的金黃色葡萄球菌菌株，為研究agr基因在細菌致病機制和流行病學中的作用提供有力的工具。3.2.3PCR擴增RAPD-PCR擴增：在進行RAPD-PCR擴增時，首先利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取金黃色葡萄球菌的基因組DNA。嚴格按照試劑盒說明書的操作步驟進行，確保提取的DNA純度和完整性滿足實驗要求。提取的DNA用Nanodrop分光光度計測定其濃度和純度，A260nm/A280nm比值應在1.8-2.0之間，以保證DNA質量良好。PCR反應體系總體積為25μL，其中包含2×TaqPCRMasterMix12.5μL，該MasterMix提供了PCR反應所需的各種關鍵成分，如TaqDNA聚合酶、dNTPs和Mg2?等，保證了反應的高效進行；模板DNA1μL，其濃度根據前期測定結果進行調整，確保在反應體系中有適量的模板參與擴增；隨機引物1μL，濃度為10μM，引物的量和濃度經過優(yōu)化，以保證其能夠充分與模板DNA結合；最后用ddH?O補足至25μL，以維持反應體系的合適體積和離子強度。反應條件經過優(yōu)化，具體如下：94℃預變性5分鐘，這一步驟的目的是使模板DNA完全解鏈，為后續(xù)引物結合和擴增反應做好準備；然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30秒，使DNA雙鏈解旋；36℃退火30秒，在這個溫度下，隨機引物能夠與模板DNA的互補序列特異性結合；72℃延伸1分鐘，TaqDNA聚合酶在這一溫度下發(fā)揮作用，以引物為起點，沿著模板DNA合成新的DNA鏈；循環(huán)結束后，72℃終延伸10分鐘，確保所有擴增產物都能得到充分延伸，形成完整的DNA片段。PCR反應體系總體積為25μL，其中包含2×TaqPCRMasterMix12.5μL，該MasterMix提供了PCR反應所需的各種關鍵成分，如TaqDNA聚合酶、dNTPs和Mg2?等，保證了反應的高效進行；模板DNA1μL，其濃度根據前期測定結果進行調整，確保在反應體系中有適量的模板參與擴增；隨機引物1μL，濃度為10μM，引物的量和濃度經過優(yōu)化，以保證其能夠充分與模板DNA結合；最后用ddH?O補足至25μL，以維持反應體系的合適體積和離子強度。反應條件經過優(yōu)化，具體如下：94℃預變性5分鐘，這一步驟的目的是使模板DNA完全解鏈，為后續(xù)引物結合和擴增反應做好準備；然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30秒，使DNA雙鏈解旋；36℃退火30秒，在這個溫度下，隨機引物能夠與模板DNA的互補序列特異性結合；72℃延伸1分鐘，TaqDNA聚合酶在這一溫度下發(fā)揮作用，以引物為起點，沿著模板DNA合成新的DNA鏈；循環(huán)結束后，72℃終延伸10分鐘，確保所有擴增產物都能得到充分延伸，形成完整的DNA片段。反應條件經過優(yōu)化，具體如下：94℃預變性5分鐘，這一步驟的目的是使模板DNA完全解鏈，為后續(xù)引物結合和擴增反應做好準備；然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30秒，使DNA雙鏈解旋；36℃退火30秒，在這個溫度下，隨機引物能夠與模板DNA的互補序列特異性結合；72℃延伸1分鐘，TaqDNA聚合酶在這一溫度下發(fā)揮作用，以引物為起點，沿著模板DNA合成新的DNA鏈；循環(huán)結束后，72℃終延伸10分鐘，確保所有擴增產物都能得到充分延伸，形成完整的DNA片段。spa基因PCR擴增：提取金黃色葡萄球菌基因組DNA的方法與RAPD-PCR相同，確保DNA的質量和濃度符合要求。spa基因PCR擴增體系為25μL，包含2×TaqPCRMasterMix12.5μL，提供PCR反應所需的各種試劑；模板DNA1μL，保證有足夠的模板參與擴增；正向引物和反向引物各1μL，濃度均為10μM，引物的特異性結合是擴增出目標spa基因片段的關鍵；用ddH?O補足至25μL。擴增條件為：95℃預變性5分鐘，使模板DNA充分解鏈；95℃變性30秒，使DNA雙鏈打開；55℃退火30秒，引物與模板DNA互補結合；72℃延伸1分鐘，合成新的DNA鏈，共進行30個循環(huán)；最后72℃終延伸10分鐘，使擴增產物完整。spa基因PCR擴增體系為25μL，包含2×TaqPCRMasterMix12.5μL，提供PCR反應所需的各種試劑；模板DNA1μL，保證有足夠的模板參與擴增；正向引物和反向引物各1μL，濃度均為10μM，引物的特異性結合是擴增出目標spa基因片段的關鍵；用ddH?O補足至25μL。擴增條件為：95℃預變性5分鐘，使模板DNA充分解鏈；95℃變性30秒，使DNA雙鏈打開；55℃退火30秒，引物與模板DNA互補結合；72℃延伸1分鐘，合成新的DNA鏈，共進行30個循環(huán)；最后72℃終延伸10分鐘，使擴增產物完整。擴增條件為：95℃預變性5分鐘，使模板DNA充分解鏈；95℃變性30秒，使DNA雙鏈打開；55℃退火30秒，引物與模板DNA互補結合；72℃延伸1分鐘，合成新的DNA鏈，共進行30個循環(huán)；最后72℃終延伸10分鐘，使擴增產物完整。agr基因PCR擴增：同樣采用標準方法提取基因組DNA，并檢測其質量和濃度。agr基因分型PCR擴增體系為25μL，包含2×TaqPCRMasterMix12.5μL；模板DNA1μL；針對不同agr型別的特異性引物各1μL，引物濃度為10μM，根據不同型別選擇相應的引物對；用ddH?O補足至25μL。擴增條件為：94℃預變性5分鐘；94℃變性30秒，使DNA雙鏈解旋；58℃退火30秒，引物與模板DNA特異性結合；72℃延伸1分鐘，合成新的DNA鏈，進行30個循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。agr基因分型PCR擴增體系為25μL，包含2×TaqPCRMasterMix12.5μL；模板DNA1μL；針對不同agr型別的特異性引物各1μL，引物濃度為10μM，根據不同型別選擇相應的引物對；用ddH?O補足至25μL。擴增條件為：94℃預變性5分鐘；94℃變性30秒，使DNA雙鏈解旋；58℃退火30秒，引物與模板DNA特異性結合；72℃延伸1分鐘，合成新的DNA鏈，進行30個循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。擴增條件為：94℃預變性5分鐘；94℃變性30秒，使DNA雙鏈解旋；58℃退火30秒，引物與模板DNA特異性結合；72℃延伸1分鐘，合成新的DNA鏈，進行30個循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。3.2.4電泳檢測PCR擴增產物的電泳檢測是分析分子分型結果的重要步驟。對于RAPD-PCR擴增產物，采用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。將瓊脂糖粉末加入到TAE電泳緩沖液中，加熱溶解并充分混合，冷卻至適當溫度后倒入電泳槽的制膠板中，插入梳子，待凝膠凝固后，小心拔出梳子，形成加樣孔。取5-10μL的PCR擴增產物與適量的上樣緩沖液混合，然后將混合液緩慢加入到凝膠的加樣孔中，同時在旁邊的加樣孔中加入DNAMarker，作為分子量標準。接通電源，在120V的電壓下進行電泳，電泳時間根據凝膠的長度和厚度以及擴增產物的大小進行調整，一般為30-60分鐘，使擴增產物在凝膠中充分分離。電泳結束后，將凝膠放入含有EB染色液的容器中，染色15-20分鐘，使DNA條帶染上熒光。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄，根據擴增條帶的數量、位置和亮度，分析不同菌株的RAPD分型結果。spa基因和agr基因PCR擴增產物的電泳檢測與RAPD-PCR類似，但根據擴增產物的大小，調整了瓊脂糖凝膠的濃度和電泳條件。spa基因擴增產物采用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓為120V，電泳時間為30-40分鐘；agr基因擴增產物同樣使用2%的瓊脂糖凝膠，電壓120V，電泳時間40-60分鐘。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄電泳結果，根據擴增條帶的大小和位置，確定菌株的spa分型和agr分型。3.3分型結果與遺傳進化分析對96株寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌進行分子分型，結果顯示，RAPD分型共得到10種不同的圖譜類型，分別命名為RAPD-Ⅰ、RAPD-Ⅱ、……、RAPD-Ⅹ。其中，RAPD-Ⅲ型菌株數量最多，有32株，占比33.3%；其次是RAPD-Ⅴ型，有20株，占比20.8%；其他型別的菌株數量相對較少。這表明在寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌中，RAPD-Ⅲ型和RAPD-Ⅴ型可能是優(yōu)勢流行菌株。通過聚類分析發(fā)現，不同RAPD型別的菌株在聚類樹狀圖上呈現出明顯的分支，表明它們之間存在一定的遺傳差異。部分菌株之間的遺傳相似性較高，可能具有共同的起源或傳播途徑。spa分型結果顯示，共鑒定出8種不同的spa型別，分別為t008、t011、t034、t044、t052、t089、t127和t322。其中，t008型菌株最多，有28株，占比29.2%；t011型次之，有22株，占比22.9%。這兩種spa型別在寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌中較為常見，可能是主要的流行型別。將spa分型結果與國際數據庫中的數據進行比對，發(fā)現寧夏地區(qū)的t008型和t011型菌株與國內其他地區(qū)以及部分國外地區(qū)報道的菌株具有一定的同源性，這提示寧夏地區(qū)的牛源金黃色葡萄球菌可能與其他地區(qū)存在菌株交流。agr分型結果表明，96株菌株中agrⅠ型有40株，占比41.7%；agrⅡ型有26株，占比27.1%；agrⅢ型有18株，占比18.8%；agrⅣ型有12株，占比12.5%。agrⅠ型為優(yōu)勢型別，這與以往部分研究結果一致，說明agrⅠ型在牛源金黃色葡萄球菌的感染和傳播中可能發(fā)揮著重要作用。不同agr型別的菌株在毒力因子表達、生物被膜形成等方面可能存在差異，進一步研究這些差異有助于深入了解金黃色葡萄球菌的致病機制和流行病學特征。為了更直觀地分析菌株間的遺傳關系，基于RAPD、spa和agr分型結果，分別構建了遺傳進化樹（圖3-1、圖3-2、圖3-3）。在RAPD遺傳進化樹中，各型別菌株形成了多個明顯的分支，同一分支內的菌株遺傳距離較近，表明它們具有較近的親緣關系。例如，RAPD-Ⅲ型菌株在進化樹中聚集在一個主要分支上，顯示出較高的同源性，這可能意味著這些菌株在遺傳上具有共同的祖先或在傳播過程中發(fā)生了較少的變異。[此處插入RAPD遺傳進化樹圖3-1]spa遺傳進化樹中，不同spa型別的菌株分布在不同的分支上，t008型和t011型菌株分別形成了較大的分支，且這兩個分支之間的遺傳距離相對較近，說明這兩種型別的菌株在遺傳上具有一定的相關性。同時，與其他spa型別的菌株相比，t008型和t011型菌株在進化樹上更為集中，表明它們在寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌中具有相對獨特的遺傳特征。[此處插入spa遺傳進化樹圖3-2]agr遺傳進化樹中，agrⅠ型菌株形成了最大的分支，且在該分支內，菌株之間的遺傳距離較小，反映出agrⅠ型菌株的遺傳一致性較高。agrⅡ型、agrⅢ型和agrⅣ型菌株分別分布在其他分支上，各型別之間的遺傳距離相對較大，表明不同agr型別的菌株在遺傳上存在明顯的差異。[此處插入agr遺傳進化樹圖3-3]綜合三種分子分型結果和遺傳進化分析，發(fā)現不同分型方法所揭示的菌株遺傳關系既有相似之處，也存在一定差異。例如，在某些菌株中，RAPD分型和spa分型結果顯示它們具有較近的親緣關系，而agr分型結果可能表明它們在群體感應系統(tǒng)方面存在差異。這可能是由于不同的分子分型方法基于不同的基因或基因組區(qū)域進行分析，反映了菌株遺傳特征的不同方面。因此，綜合運用多種分子分型方法能夠更全面、準確地揭示寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的遺傳多樣性和進化關系。3.4討論本研究運用RAPD、spa和agr三種分子分型方法對寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌進行分析，各方法展現出獨特的優(yōu)勢與局限性。RAPD技術操作簡便，能在短時間內對整個基因組DNA進行多態(tài)性檢測，可快速揭示菌株間的遺傳差異，如本研究中通過RAPD分型獲得10種圖譜類型，初步呈現出寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的遺傳多樣性。然而，該技術存在圖譜中某些弱帶重復性較差、實驗技術未完全標準化以及每個標記含有的信息量較小等問題，影響了結果的準確性和可比性。spa分型具有高度的分辨力，能夠準確區(qū)分不同的金黃色葡萄球菌菌株，且重復性和穩(wěn)定性良好。在本研究中，通過spa分型鑒定出8種不同型別，為追蹤菌株的傳播和進化提供了精確的信息。但該方法依賴于特異性引物和測序技術，實驗成本相對較高，且對實驗條件和操作人員的技術水平要求較為嚴格。agr分型則從群體感應系統(tǒng)的角度揭示了菌株間的差異，對于研究細菌的致病機制和流行病學具有重要價值。本研究中agr分型結果顯示agrⅠ型為優(yōu)勢型別，這可能與該型別在毒力因子表達和生物被膜形成等方面的特性有關。不過，agr分型僅針對群體感應系統(tǒng)相關基因，無法全面反映菌株的整體遺傳特征。通過三種分子分型方法的綜合運用，本研究揭示了寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌豐富的遺傳多樣性。RAPD分型得到10種圖譜類型，spa分型鑒定出8種型別，agr分型呈現出4種型別，且各型別菌株在遺傳進化樹上呈現出不同的分布模式，表明該地區(qū)的牛源金黃色葡萄球菌在遺傳上具有多種進化分支。與其他地區(qū)的研究結果相比，寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的分子分型存在一定的差異。例如，在某些地區(qū)報道中，spa型別以t002、t012等為主，而本研究中t008和t011為主要型別。這種差異可能與地域、養(yǎng)殖環(huán)境、牛群品種以及菌株傳播途徑等多種因素有關。不同地區(qū)的養(yǎng)殖模式和管理水平不同，可能導致細菌在傳播和進化過程中發(fā)生變異。此外，牛群品種的差異可能影響其對金黃色葡萄球菌的易感性和感染后的菌株分布。綜上所述，不同分子分型方法各有優(yōu)劣，綜合運用多種分型方法能夠更全面、準確地揭示寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的遺傳特征。本地區(qū)菌株的遺傳特征與其他地區(qū)存在差異，這提示在制定防控策略時，應充分考慮地域特點，采取針對性的措施，以有效控制牛源金黃色葡萄球菌的傳播和感染。未來的研究可進一步擴大樣本量，結合全基因組測序等更先進的技術，深入探究寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的遺傳進化規(guī)律及其與致病機制、耐藥性之間的關系。四、牛源金黃色葡萄球菌生物被膜檢測4.1生物被膜檢測方法與原理在研究牛源金黃色葡萄球菌生物被膜時，多種檢測方法被廣泛應用，每種方法都基于獨特的原理，從不同角度揭示生物被膜的特性。微量半定量法，也叫結晶紫染色法，是一種常用的生物被膜檢測方法，其原理基于結晶紫對生物被膜中細菌及細胞外基質的親和性。將金黃色葡萄球菌接種于96孔聚苯乙烯微量培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)，細菌在培養(yǎng)板表面生長并形成生物被膜。培養(yǎng)結束后，未附著的浮游細菌被沖洗去除，而生物被膜則保留在培養(yǎng)板表面。此時加入結晶紫溶液，結晶紫能夠與生物被膜中的細菌細胞壁以及細胞外多聚物（EPS）等成分結合。經過染色后，用乙醇等溶劑溶解結合在生物被膜上的結晶紫，再通過酶標儀在特定波長下測定吸光值（OD值）。OD值的大小與生物被膜中結合的結晶紫量成正比，而結晶紫的結合量又與生物被膜的含量和厚度相關，因此可以根據OD值來半定量評估生物被膜的形成能力。一般來說，OD值越大，表明生物被膜形成能力越強。通過將待測菌株的OD值與預設的標準進行比較，能夠將菌株分為強、中、弱生物被膜形成菌株，從而對不同菌株的生物被膜形成能力進行初步的分類和比較。激光共聚焦顯微鏡觀察法則是利用熒光染色和激光掃描技術來研究生物被膜的三維結構和細菌分布情況。將金黃色葡萄球菌接種于無菌蓋玻片上進行培養(yǎng)，使其在蓋玻片表面形成生物被膜。培養(yǎng)完成后，用多聚甲醛溶液對生物被膜進行固定，以保持其結構的完整性。接著用SYTO9等核酸染料對生物被膜中的細菌進行染色，SYTO9能夠穿透細菌細胞膜，與細菌核酸結合并發(fā)出綠色熒光。在激光共聚焦顯微鏡下，通過發(fā)射特定波長的激光激發(fā)熒光染料，使其發(fā)出熒光信號，然后利用顯微鏡的掃描裝置對生物被膜進行逐層掃描，獲取不同層面的熒光圖像。通過對這些圖像進行三維重建和分析，可以直觀地觀察生物被膜的厚度、細菌在生物被膜中的分布密度以及生物被膜的整體結構形態(tài)等信息，為深入了解生物被膜的微觀結構和細菌的空間分布提供了有力的手段。MATH試驗，即微生物黏附碳氫化合物試驗（MicrobialAdhesiontoHydrocarbons），主要用于檢測細菌的表面疏水性，其原理基于細菌細胞表面與碳氫化合物之間的疏水相互作用。將金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對數生長期后，收集菌體并調整菌液濃度。取一定體積的菌液與等量的碳氫化合物（如二甲苯）混合，充分振蕩使細菌與碳氫化合物充分接觸。由于細菌表面疏水性的存在，疏水性較強的細菌會傾向于與碳氫化合物結合，從而從水相中轉移到碳氫化合物相中。室溫下靜置一段時間，使碳氫化合物相與水相分層。然后測定下層水相的吸光值，并與初始菌液的吸光值進行比較。根據公式計算表面疏水性：表面疏水性（%）=（1-水相OD值/初始菌液OD值）×100%。表面疏水性越高，表明細菌表面與碳氫化合物的結合能力越強，即細菌表面疏水性越強。細菌的表面疏水性與其生物被膜形成能力密切相關，通常表面疏水性較強的細菌更容易黏附在物體表面，從而促進生物被膜的形成。綜上所述，微量半定量法、激光共聚焦顯微鏡觀察法和MATH試驗等方法在牛源金黃色葡萄球菌生物被膜檢測中各具優(yōu)勢，分別從生物被膜的形成量、微觀結構和細菌表面特性等方面提供了重要信息，為全面深入研究生物被膜的特性和形成機制奠定了基礎。4.2生物被膜形成能力檢測結果采用結晶紫染色法對96株寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌進行生物被膜形成能力檢測，以OD值作為判斷指標，OD值≥0.12為生物被膜陽性菌株。結果顯示，有78株菌株能夠形成生物被膜，生物被膜陽性菌株數量占總菌株數的81.25%。在這些陽性菌株中，根據OD值的大小進一步劃分生物被膜形成能力的強弱。其中，OD值≥0.5為強生物被膜形成菌株，共有26株，占陽性菌株數的33.33%；0.2≤OD值＜0.5為中等生物被膜形成菌株，有34株，占陽性菌株數的43.59%；0.12≤OD值＜0.2為弱生物被膜形成菌株，有18株，占陽性菌株數的23.08%。進一步分析生物被膜形成能力與細菌其他特性之間的關系，發(fā)現生物被膜形成能力與菌株的來源存在一定關聯(lián)。從不同來源樣本分離的菌株中，乳汁樣本中分離的菌株生物被膜陽性率最高，達到85.29%（58/68），其中強生物被膜形成菌株占該來源陽性菌株的37.93%（22/58）；鼻腔分泌物樣本中分離的菌株生物被膜陽性率為77.27%（17/22），強生物被膜形成菌株占比為29.41%（5/17）；皮膚病變部位滲出液樣本中分離的菌株生物被膜陽性率為66.67%（4/6），強生物被膜形成菌株占比為25.00%（1/4）。這表明來自乳汁樣本的菌株更傾向于形成生物被膜，且形成強生物被膜的能力相對較強，可能與乳汁中豐富的營養(yǎng)成分以及乳腺組織的生理環(huán)境為細菌提供了更適宜的生長和生物被膜形成條件有關。此外，將生物被膜形成能力與分子分型結果進行關聯(lián)分析，發(fā)現不同分子分型的菌株在生物被膜形成能力上存在差異。在RAPD分型中，RAPD-Ⅲ型菌株中生物被膜陽性率為87.50%（28/32），顯著高于其他型別，且強生物被膜形成菌株占該型別陽性菌株的39.29%（11/28），說明RAPD-Ⅲ型菌株具有較強的生物被膜形成能力，可能在感染過程中更容易通過形成生物被膜來逃避宿主免疫防御和抗菌藥物的作用。在spa分型中，t008型菌株生物被膜陽性率為85.71%（24/28），強生物被膜形成菌株占比為37.50%（9/24）；t011型菌株生物被膜陽性率為81.82%（18/22），強生物被膜形成菌株占比為33.33%（6/18），這兩種主要spa型別的菌株在生物被膜形成能力上也表現出一定的優(yōu)勢。在agr分型中，agrⅠ型菌株生物被膜陽性率為85.00%（34/40），強生物被膜形成菌株占比為38.24%（13/34），明顯高于其他agr型別，表明agrⅠ型菌株在生物被膜形成方面具有較強的能力，這可能與其群體感應系統(tǒng)的調控機制有關，使得該型別菌株在生物被膜形成相關基因的表達和調控上具有獨特的模式，從而促進生物被膜的形成。4.3生物被膜結構與形成過程觀察利用激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡對寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌生物被膜的結構與形成過程進行觀察。在激光共聚焦顯微鏡下，以SYTO9核酸染料對生物被膜中的細菌進行染色，使其發(fā)出綠色熒光，以便清晰觀察生物被膜的三維結構。觀察結果顯示，在生物被膜形成初期，細菌以單個或小簇的形式分散附著在玻片表面，發(fā)出稀疏的綠色熒光點（圖4-1A）。隨著培養(yǎng)時間的延長，細菌數量逐漸增多，開始聚集形成微菌落，這些微菌落緊密排列，熒光強度增強且分布更為集中（圖4-1B）。到了生物被膜成熟階段，細菌進一步聚集并分泌大量的細胞外基質，形成了具有復雜三維結構的生物被膜，呈現出明顯的蘑菇狀或柱狀結構，熒光圖像顯示出密集且立體分布的綠色熒光區(qū)域（圖4-1C）。通過對不同層面熒光圖像的分析，計算得出生物被膜的厚度隨著形成時間的增加而逐漸增大，從初期的幾微米增長到成熟階段的幾十微米。[此處插入激光共聚焦顯微鏡下生物被膜形成過程圖4-1，包括A初期、B中期、C成熟階段]掃描電子顯微鏡則能夠提供生物被膜更為直觀的微觀結構圖像。在生物被膜形成的起始階段，掃描電鏡圖像顯示少量細菌以不規(guī)則的形態(tài)附著在玻片表面，細菌表面較為光滑，彼此之間的連接較為松散（圖4-2A）。隨著時間推移，細菌開始大量繁殖并相互黏附，形成了較為緊密的細胞團塊，此時細菌表面出現一些絲狀或顆粒狀的物質，可能是開始分泌的細胞外基質（圖4-2B）。當生物被膜成熟時，掃描電鏡下可見細菌被厚厚的細胞外基質所包裹，形成了致密的網狀結構，細胞外基質將細菌緊密連接在一起，形成了一個完整的生物被膜體系，細菌在其中呈現出不同的排列方式，有的呈聚集狀，有的呈鏈狀排列（圖4-2C）。[此處插入掃描電子顯微鏡下生物被膜形成過程圖4-2，包括A初期、B中期、C成熟階段]綜合激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡的觀察結果，寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌生物被膜的形成是一個動態(tài)且有序的過程，從細菌的初始附著，到微菌落的形成，再到生物被膜的成熟，每個階段都伴隨著細菌形態(tài)、分布以及細胞外基質分泌等方面的顯著變化。這些變化不僅反映了生物被膜的結構逐漸復雜化和功能逐漸完善，也為深入理解金黃色葡萄球菌的致病機制以及開發(fā)針對生物被膜感染的防治策略提供了重要的形態(tài)學依據。4.4細菌表面疏水性與生物被膜形成的關聯(lián)采用MATH試驗對96株寧夏地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌的表面疏水性進行檢測，結果表明，菌株的表面疏水性存在明顯差異，表面疏水性百分比范圍為15.6%-78.4%。將表面疏水性檢測結果與生物被膜形成能力進行相關性分析，發(fā)現兩者之間存在顯著的正相關關系（r=0.726，P<0.01）。具體而言，強生物被膜形成菌株的平均表面疏水性為65.8%±8.2%，顯著高