第五章酶化學(xué)第一節(jié)

概述一、酶的研究簡(jiǎn)史1.祖先的智慧：約公元前21世紀(jì)夏禹時(shí)代，人們就會(huì)釀酒，制醋，發(fā)面；公元前12世紀(jì)周代能制作飴糖和醬；2000多年前，春秋戰(zhàn)國(guó)時(shí)期已知用曲治療消化不良等等。期間未見(jiàn)細(xì)菌等微生物的個(gè)體;僅憑實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)利用微生物的有益活動(dòng)。2.1897年，德國(guó)人布赫納（E.Buchner）從磨碎的酵母中分離出一種酵素，開(kāi)創(chuàng)了酶的研究。闡明發(fā)酵是酶作用的化學(xué)本質(zhì)，并獲1911年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。3.1926年，美國(guó)化學(xué)家J.Sumner（薩姆納）從刀豆提取脲酶并獲結(jié)晶，證明了其化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)。1949年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。4.1982年美國(guó)科學(xué)家切赫（T.R.Cech）和奧爾特曼（S.Altman）發(fā)現(xiàn)了具有催化功能的RNA_核酶（ribozyme）,1989年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1986年，舒爾茨（Schultz）和勒納（Lerner）研制成功抗體酶(abzyme)。5.90年代ATP合成酶的分子機(jī)制闡明，近年的各種工具酶運(yùn)用等（一）酶作為一般催化劑的特點(diǎn)二、酶催化作用的特點(diǎn)1.都能降低反應(yīng)能閾2.只能催化化學(xué)熱力學(xué)允許進(jìn)行的反應(yīng)，對(duì)可逆化學(xué)反應(yīng)可以縮短平衡達(dá)到的時(shí)間，但不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)。3.反應(yīng)前后不發(fā)生質(zhì)與量的變化。（二）酶區(qū)別于一般催化劑的特點(diǎn)1.酶的催化效率極高—高效性2.酶的催化作用具有高度專一性2H2O22H2O+O21mol過(guò)氧化氫酶5×106molH2O2/秒1mol離子鐵6×10-4molH2O2/秒高效性、專一性、溫和性、可調(diào)節(jié)性等通常要高出非生物催化劑催化活性的106~1013倍。酶對(duì)其作用的底物和催化的反應(yīng)類型具有嚴(yán)格的選擇性。1）絕對(duì)專一性酶的專一性分類：1）絕對(duì)專一性2）相對(duì)專一性3）立體異構(gòu)專一性

a、鍵的專一性：（如：酯酶）酯酶2）相對(duì)專一性鍵的專一性成鍵一側(cè)基團(tuán)專一性b、成鍵一側(cè)基團(tuán)專一性：如：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A、B等胰蛋白酶3）立體異構(gòu)專一性b、幾何異構(gòu)專一性：如：琥珀酸脫氫酶a、旋光異構(gòu)專一性：如：L-乳酸脫氫酶FADH2FAD琥珀酸脫氫酶c、識(shí)別對(duì)稱分子中的兩個(gè)等同基團(tuán)的一個(gè)：如：甘油激酶、順烏頭酸酶等3.酶易失活，要求反應(yīng)條件溫和（1）酶分子合成水平上的調(diào)節(jié)—酶量調(diào)節(jié)

a、誘導(dǎo)或阻遏酶的合成

b、調(diào)節(jié)酶的降解（2）對(duì)酶分子催化活性進(jìn)行調(diào)節(jié)—酶活調(diào)節(jié)

a、變構(gòu)調(diào)節(jié)

b、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)（3）其他的如酶原的激活，同工酶調(diào)節(jié)等4.酶的活性受到調(diào)節(jié)和控制5.酶的催化活性與輔酶、輔基及金屬離子密切相關(guān)三、酶的化學(xué)本質(zhì)及其組成（一）酶的化學(xué)本質(zhì)1、酶是兩性電解質(zhì)2、能引起蛋白質(zhì)變性的理化因素也能使酶喪失活性3、酶也具有膠體蛋白的性質(zhì)4、許多酶受蛋白水解酶作用而失活。5、酶的酸水解產(chǎn)物是氨基酸6、許多酶的氨基酸序列已被測(cè)定其中1969年牛胰核糖核酸酶被人工合成。因此，可以確認(rèn)酶是蛋白質(zhì)。大多數(shù)酶是蛋白質(zhì),其實(shí)驗(yàn)證據(jù)包括：其他成分的酶：酶的概念：酶是生物催化劑。由活細(xì)胞產(chǎn)生的具有高效催化能力和催化專一性的蛋白質(zhì)、核酸或其復(fù)合體。核酶（ribozyme）

：具有催化活性的天然RNA。近年還有DNA分子具有催化活性報(bào)道。脲酶：專一性水解尿素。第一個(gè)被分離提取的酶，并證明其化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)?？贵w酶：是用化學(xué)反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)類似物作免疫原產(chǎn)生的催化性抗體，是一種具有催化能力的蛋白質(zhì)，其本質(zhì)上是免疫球蛋白。（二）酶分子的組成1、單成分酶：只有酶蛋白一種成分（水解酶類）2、雙成分酶：即結(jié)合蛋白酶。全酶=酶蛋白+輔助因子輔助因子金屬離子小分子有機(jī)物輔酶輔基酶蛋白與輔因子單獨(dú)存在均無(wú)催化活力根據(jù)化學(xué)組成可將酶分為單成分酶和雙成分酶酶蛋白決定酶催化專一性，輔酶或輔基決定反應(yīng)的性質(zhì)。思考：酶催化反應(yīng)中，決定酶促反應(yīng)專一性的是（）（a）酶蛋白（b）輔酶（c）底物（d）金屬離子輔酶與輔基、激活劑與輔助因子的區(qū)別2、激活劑與輔助因子的區(qū)別1、輔酶與輔基輔基：與酶蛋白結(jié)合緊密，透析等方法不能去掉。廣義輔酶：狹義輔酶：輔酶與酶蛋白結(jié)合疏松，透析等方法易丟失。酶的輔助因子激活劑與調(diào)節(jié)中心結(jié)合，通過(guò)改變酶活中心構(gòu)象影響酶活力。輔助因子構(gòu)成酶活中心，缺失，酶失去催化活性思考：激活劑和輔酶沒(méi)有本質(zhì)上的區(qū)別，它們的存在與否只是和酶活力大小有關(guān)，對(duì)嗎？1、單體酶:三級(jí)結(jié)構(gòu)是其最高結(jié)構(gòu)形式2、寡聚酶：四級(jí)結(jié)構(gòu)是其最高結(jié)構(gòu)形式3、多酶體系、多酶復(fù)合體連續(xù)反應(yīng)：E2E3E4E1ABCDE多酶體系：催化連續(xù)反應(yīng)的多個(gè)酶稱為多酶體系。多酶體系中，有的是單獨(dú)行使功能，有的是形成多酶復(fù)合體。多酶復(fù)合體：由幾個(gè)酶通過(guò)非共價(jià)鍵彼此嵌合而成的復(fù)合物。一般由2~6個(gè)功能相關(guān)的酶組成。一旦復(fù)合體解體，各個(gè)獨(dú)立的酶分子則無(wú)所作為。如：丙酮酸脫氫酶復(fù)合體脂肪酸合成酶復(fù)合體（三）酶分子的空間結(jié)構(gòu)是其行使功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)四、酶的命名與分類習(xí)慣名：乳酸脫氫酶（一）酶的命名慣用名系統(tǒng)名系統(tǒng)名：L-乳酸：NAD+氧化還原酶（二）酶的分類及作用方式1.氧化還原酶類催化電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶2.轉(zhuǎn)移酶類催化分子間基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶,

激酶為磷酸基轉(zhuǎn)移酶3.水解酶類催化水解反應(yīng)的酶4.裂解酶類催化非水解地除去底物分子中的基團(tuán)及其逆反應(yīng)的酶5.異構(gòu)酶類催化分子內(nèi)的基團(tuán)轉(zhuǎn)移形成異構(gòu)體反應(yīng)的酶6.合成酶類催化ATP水解偶聯(lián)的縮合反應(yīng)的酶如：乳酸脫氫酶的編號(hào)五、酶的活性中心和必需基團(tuán)1、概念：指酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象中，結(jié)合底物并催化底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的空間小區(qū)域。包括結(jié)合部位和催化部位。2、有關(guān)酶活中心說(shuō)明幾點(diǎn)：（1）三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象是維持活性中心所必需的。即酶活中心是一個(gè)三維實(shí)體。酶活中心位于酶分子表面的一個(gè)疏水裂隙內(nèi)。（2）活性部位在酶分子中只占相當(dāng)小的部分。（幾個(gè)氨基酸殘基/100多個(gè)氨基酸。）（3）構(gòu)成酶活中心的必需基團(tuán)，主要是某些氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)，這些側(cè)鏈基團(tuán)在一級(jí)結(jié)構(gòu)中可能相距甚遠(yuǎn)，甚至不在一條肽鏈上。但在高級(jí)結(jié)構(gòu)中相距很近。（6）對(duì)于結(jié)合酶，輔酶、輔基往往參與酶活中心的組成。（4）在酶活中心中出現(xiàn)頻率最高的側(cè)鏈基團(tuán)：

-OH,-SH,咪唑基，羧基、酚羥基等（5）酶活性部位具有柔性或可運(yùn)動(dòng)性，通過(guò)空間構(gòu)象變化與底物相適應(yīng)。_誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)

所以，行使功能時(shí)，酶的空間結(jié)構(gòu)可變。第二節(jié)酶催化作用的機(jī)制一、酶與底物的結(jié)合——中間復(fù)合物學(xué)說(shuō)該學(xué)說(shuō)認(rèn)為，在酶促反應(yīng)中，酶（E）總是先和底物（S）結(jié)合生成不穩(wěn)定的中間復(fù)合物（ES），再分解成產(chǎn)物（P），并釋放出酶（E）?！虚g復(fù)合物學(xué)說(shuō)能較好的解釋酶為什么能降低反應(yīng)的活化能。１.鎖鑰學(xué)說(shuō)：酶的“絕對(duì)專一性學(xué)說(shuō)”２.酶的誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō):酶的活性部位具有一定的柔性，底物與酶相遇時(shí)，可誘導(dǎo)酶蛋白的構(gòu)象發(fā)生相應(yīng)的變化（結(jié)構(gòu)域的運(yùn)動(dòng)），使活性部位上有關(guān)的各個(gè)基團(tuán)達(dá)到正確的排列和定向，因而使酶和底物契合而結(jié)合成中間復(fù)合物，并引起底物發(fā)生反應(yīng)。

實(shí)際上，底物與酶結(jié)合是一種相互作用的過(guò)程，底物可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)必需基團(tuán)也可使底物敏感鍵發(fā)生變化，更好“契合”。3.“三點(diǎn)附著”模型：該模型認(rèn)為底物與酶活中心的結(jié)合有三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，只有當(dāng)這三個(gè)位點(diǎn)都匹配的時(shí)候，酶才會(huì)催化相應(yīng)的反應(yīng)。關(guān)于酶的專一性的假說(shuō)思考：酶的誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)是指（）（a）底物誘導(dǎo)改變酶的構(gòu)象，酶亦誘導(dǎo)底物敏感鍵的改變（b）酶的絕對(duì)專一性（c）酶誘導(dǎo)改變底物的構(gòu)象（d）底物誘導(dǎo)改變酶的構(gòu)象二、酶作用高效率機(jī)制（一）底物與酶的鄰近、定向效應(yīng)

鄰近效應(yīng)是指酶與底物結(jié)合形成中間復(fù)合物以后，使底物和底物之間（如雙分子反應(yīng)），酶的催化基團(tuán)與底物之間結(jié)合于同一分子，而使有效濃度得以極大升高，從而使反應(yīng)速度大大增加的一種效應(yīng)。

定向效應(yīng)是指反應(yīng)物的反應(yīng)基團(tuán)之間和酶的催化基團(tuán)與底物的反應(yīng)基團(tuán)之間的正確取位產(chǎn)生的效應(yīng)。（二）酶使底物分子的敏感鍵產(chǎn)生張力或變形，有利于形成酶-底物復(fù)合物

底物與酶的結(jié)合，不僅誘導(dǎo)酶分子發(fā)生構(gòu)象變化，同樣底物分子也會(huì)發(fā)生扭曲變形，使底物分子的敏感鍵產(chǎn)生“電子張力”（電子的重新分配），甚至“形變”，使某些鍵的鍵能減弱，從而促進(jìn)新鍵形成。（三）酸堿催化

酶活性部位上的某些基團(tuán)可以做為良好的質(zhì)子供體或受體對(duì)底物進(jìn)行酸堿催化。（一般酸堿催化或廣義酸堿催化）

蛋白質(zhì)中起酸、堿催化的功能基團(tuán):

氨基、羧基、咪唑基、巰基、酚羥基。His的咪唑基最活躍。咪唑基pK約為6.0,在生理pH條件下,一半以酸存在,一半以堿存在,既可作為質(zhì)子供體,又作為質(zhì)子受體,參與酸堿催化。His在蛋白質(zhì)組成中的重要性：（1）對(duì)外來(lái)酸堿的緩沖作用（如：血紅蛋白）；（2）酶蛋白中的酸堿催化作用。（組氨酸在酶活中心出現(xiàn)頻率很高，推測(cè)組氨酸很可能在進(jìn)化過(guò)程中被選擇作為酶分子中的催化結(jié)構(gòu)而存在下來(lái)的。）（四）共價(jià)催化作用：E+S[ES]E+P

共價(jià)催化又稱親核或親電子催化。酶可以和底物生成不穩(wěn)定的共價(jià)中間物，降低活化能，這種共價(jià)中間物進(jìn)一步生成產(chǎn)物要比非催化反應(yīng)容易得多。Ser-OH—CH2—S··：H—CH2—O··：HCys-SH—CH2—C=CHHNNCH：His-咪唑基親核基團(tuán)親電子基團(tuán)底物中典型的親電中心包括：磷?；；腔ㄎ澹┙饘匐x子催化（六）活性部位的微環(huán)境效應(yīng)金屬離子作為酶的輔助因子起作用的方式：1.與酶蛋白緊密結(jié)合穩(wěn)定酶的天然構(gòu)象，親電催化2.與酶結(jié)合較弱，作為激活劑存在。3.通過(guò)價(jià)態(tài)的可逆變化，參與氧化還原反應(yīng)。酶的活性部位是一個(gè)疏水的微環(huán)境。有利于催化基團(tuán)與底物分子的敏感鍵發(fā)生作用。三、催化反應(yīng)機(jī)制實(shí)例—絲氨酸蛋白酶家族該家族成員包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶等。（1）它們結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制很相似：都有一個(gè)在酶催化中起關(guān)鍵作用的Ser殘基；活性部位都有Asp、His和Ser，總是簇聚在一起，有著相同的催化機(jī)制。（2）但對(duì)底物有不同的專一性，由其結(jié)合部位結(jié)構(gòu)不同造成。底物結(jié)合部位-Arg、LysPhe、Tyr、Trp小的中性氨基酸底物結(jié)合部位-由疏水氨基酸環(huán)繞形成的口袋。底物結(jié)合部位-小口袋兩側(cè)有較大氨基酸：Val、Thr。（1）不同的專一性：胰蛋白酶裂解Arg、Lys羧基形成的肽鍵；胰凝乳蛋白酶裂解Phe、Tyr、Trp羧基形成的肽鍵；彈性蛋白酶裂解小的中性氨基酸羧基形成的肽鍵（2）酶底物結(jié)合部位的不同：胰蛋白酶口袋中，有一個(gè)負(fù)電荷Asp189在底部，結(jié)合正電荷Arg、Lys殘基；胰凝乳蛋白酶的底物結(jié)合部位-由疏水氨基酸環(huán)繞形成口袋，可容納一個(gè)芳香殘基；彈性蛋白酶口袋淺，開(kāi)口處具有大的Thr、Val殘基阻礙，僅小的氨基酸殘基能夠進(jìn)入它的口袋。..H+絲氨酸蛋白酶的催化三聯(lián)體（胰凝乳蛋白酶）活性中心組成：Ser195、His57、Asp102親核攻擊時(shí)…胰凝乳蛋白酶的活性中心及作用機(jī)理1、活性中心組成：Ser195、His57、Asp1022、胰凝乳蛋白酶對(duì)多肽底物的水解第一階段：水解反應(yīng)的?；A段第二階段：水解反應(yīng)的脫?；A段其中Ser195是底物結(jié)合部位、His57是活性中心的催化部位，Asp102穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)中His57的正電荷形式。胰凝乳蛋白酶水解反應(yīng)過(guò)程肽鏈底物酰基化階段脫?；A段E-SerE-SerR-NH2E-Ser底物結(jié)合到酶活中心Ser-OH上例題：1.胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶作為生物催化劑，有哪些相似之處？有哪些不同之處？3.試解釋為什么胰凝乳蛋白酶不能像胰蛋白酶那樣自我激活？2.將胰凝乳蛋白酶的Ser195突變?yōu)锳la,則活性降低106倍，突變His57為Ala,則活性同樣降低106倍。因此，若同時(shí)突變Ser195和His57為Ala，其活性應(yīng)降低1012倍，這種推斷正確嗎？不正確。胰凝乳蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，構(gòu)成活性中心的電荷中繼網(wǎng)有三個(gè)氨基酸，它們是Ser，His和Asp，組成催化三聯(lián)體，三聯(lián)體的任何一個(gè)氨基酸突變，其活性都會(huì)降到最小，與幾個(gè)氨基酸突變沒(méi)有關(guān)系。要點(diǎn)：胰凝乳蛋白酶裂解Phe、Tyr、Trp等疏水氨基酸的羧基形成的肽鍵，這些氨基酸隱藏在球狀蛋白質(zhì)（如胰凝乳蛋白酶原自身）的內(nèi)部，難以被胰凝乳蛋白酶識(shí)別，所以不會(huì)自我激活。而胰蛋白酶專一斷裂Arg、Lys羧基形成的肽鍵，而這些氨基酸在生理pH下帶正電荷，一般位于球狀蛋白質(zhì)（如胰蛋白酶原自身）的表面，故容易被胰蛋白酶識(shí)別，水解而激活。（絲氨酸蛋白酶）（見(jiàn)第28張幻燈片）第三節(jié)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是的研究各種理化因素對(duì)酶促反應(yīng)速度影響的科學(xué)。底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響酶濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響激活劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響一、酶的反應(yīng)速度及初速度1、酶促反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線[P-t進(jìn)程曲線]產(chǎn)物生成量時(shí)間t2、酶促反應(yīng)初速度酶促反應(yīng)開(kāi)始的一段時(shí)間內(nèi)，產(chǎn)物的生成量隨反應(yīng)時(shí)間而直線增加，這時(shí)的反應(yīng)速度認(rèn)定為酶促反應(yīng)的初速度。或規(guī)定反應(yīng)體系中底物濃度減少量不超過(guò)5%時(shí)的反應(yīng)速度為初速度。3、影響反應(yīng)速度下降的主要原因（1）底物濃度降低，產(chǎn)物濃度增加，逆反應(yīng)加速（2）產(chǎn)物對(duì)酶的抑制作用（3）隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)液的溫度、pH對(duì)酶活性的影響二、底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響1903年法國(guó)Henri（恒瑞）用蔗糖酶水解蔗糖做實(shí)驗(yàn)，研究底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系1、酶濃度固定，pH，溫度等在最適條件下，不同底物濃度〔S〕與酶反應(yīng)速度V之間的關(guān)系曲線：v=k[Et]v=k[s]蔗糖+H2O

葡萄糖+果糖蔗糖水解酶零級(jí)反應(yīng)：表示了反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度無(wú)關(guān)。一級(jí)反應(yīng)：

相當(dāng)于Y=aX+b型直線方程；2、中間產(chǎn)物（中間絡(luò)合物）學(xué)說(shuō)E+S

〔ES〕E+PK1K2K3Henri（恒瑞）等人提出了酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為：當(dāng)酶催化某一化學(xué)反應(yīng)時(shí)，酶首先和底物可逆結(jié)合生成中間復(fù)合物（ES），這是一個(gè)快速的可逆過(guò)程，然后ES復(fù)合物慢速分解生成產(chǎn)物（P），并釋放出酶。由于第二步反應(yīng)較慢而限制了整個(gè)反應(yīng)速度，故ES的濃度決定整個(gè)反應(yīng)速度。3、根據(jù)中間產(chǎn)物（中間絡(luò)合物）學(xué)說(shuō)

推導(dǎo)出米氏方程式的基本形式V=Vmax〔S〕Km+〔S〕(1)一級(jí)反應(yīng)：當(dāng)[S]<<Km，則v=Vmax[S]/Km,此時(shí)若酶的總濃度不變,則v與[S]成正比。(2)零級(jí)反應(yīng)：當(dāng)[S]>>Km，則v=Vm,反應(yīng)速率與

反應(yīng)物濃度無(wú)關(guān)（3）混合級(jí)反應(yīng)：4、米氏方程的意義關(guān)于Km[S]反應(yīng)速度Km的含義:當(dāng)反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)所需要的底物濃度。單位常用mol/L表示。有關(guān)Km的幾點(diǎn)說(shuō)明（1）Km是酶的特征性常數(shù)。Km的大小只與酶本身的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無(wú)關(guān)。Km作為常數(shù)只是對(duì)一定的底物、pH、溫度和離子強(qiáng)度等條件而言。（2）根據(jù)Km可以判斷酶的天然底物。同一個(gè)酶有幾種底物就有幾個(gè)Km值，其中，Km值最小的底物一般稱為該酶的最適底物如己糖激酶，對(duì)底物葡萄糖和果糖的Km分別為1.5x10-4,1.5x10-3,則該酶的最適底物是--------。E+S〔ES〕E+PK1K2K3Km=K2+K3

（ES的分解速度常數(shù)）K1（ES的合成速度常數(shù)）底物常數(shù)Ks=K2K1

Km大表示酶和底物的親和力弱，Km小時(shí)，則表示酶和底物的親和力強(qiáng)。所以，Km最小的底物是酶的最適底物（即天然底物）。（3）Km可以近似地表示酶與底物親合力的大?。?）利用米氏方程式，已知Km時(shí)，可以計(jì)算在某一底物濃度下，其反應(yīng)速率相當(dāng)于最大反應(yīng)速率的百分?jǐn)?shù)。例如：當(dāng)[S]=3Km時(shí)，其初速度相當(dāng)于最大反應(yīng)速度的百分?jǐn)?shù)是——。V=

Vmax[S]

(Km+[S])=Vmax·3Km(Km+3Km)=0.75Vmax代入米氏方程例如：已知某酶的Km，問(wèn)要使其催化的反應(yīng)速度達(dá)到最大速度90%時(shí)，需要的底物濃度。代入米氏方程v=

Vmax[S]

(Km+[S])90%Vmax=

Vmax[S]

(Km+[S])〔S〕=9Km（5）利用米氏方程式，已知Km時(shí)，可以判斷使酶促反應(yīng)速度達(dá)到預(yù)定值時(shí)所需底物濃度。（6）可以幫助推斷某一代謝反應(yīng)的方向和途徑1.大致判斷可逆反應(yīng)的正逆反應(yīng)速度（要結(jié)合底物濃度）13.判斷同一種底物可被幾種酶作用時(shí)，究竟走哪條途徑？如底物丙酮酸：乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸脫羧酶催化其反應(yīng)對(duì)應(yīng)的Km值為1.7x10-5、1.3x10-3、1.0x10-3mol/L。當(dāng)丙酮酸濃度較低時(shí)，優(yōu)先走乳酸脫氫酶催化的反應(yīng)。例如：ABCD連續(xù)反應(yīng)中，每步反應(yīng)的酶對(duì)應(yīng)底物A、B、C的Km分別為10-2、10-3、10-4mol/L,而細(xì)胞內(nèi)A、B、C的濃度均接近10-4mol/L，則可推知限速反應(yīng)是AB的一步。232.判斷連續(xù)反應(yīng)中限速步驟谷氨酸+NAD+

α-酮戊二酸+NADH+H+谷氨酸脫氫酶Km:2.5x10-5

mol/L

1.8x10-5mol/L

關(guān)于Vmax酶對(duì)特定底物的Vmax是一個(gè)常數(shù)。5、雙倒數(shù)作圖法求解Km和Vmax三、酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響V〔E〕[S]足夠大，最適反應(yīng)條件，反應(yīng)系統(tǒng)中不含有抑制酶活性的物質(zhì)時(shí)：v=K[E]

V-[E]不正常關(guān)系曲線：1.正常曲線2.含有酶的抑制劑3.含有激活劑（斜率變大）4.底物不足5.不可逆抑制劑三、pH對(duì)酶促作用的影響1、pH-酶活性曲線（大部分酶為鐘形曲線）2、最適pH:3、pH對(duì)酶作用影響的機(jī)制（1）過(guò)酸、過(guò)堿使酶本身變性失活（2）pH能影響酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離（3）pH能影響維持酶分子空間結(jié)構(gòu)的有關(guān)基團(tuán)的解離(4)pH能影響底物的解離狀態(tài)測(cè)酶活時(shí)，必須加入緩沖溶液，在最適pH下測(cè)定。在酶的提取精制過(guò)程中，或者酶制劑使用過(guò)程中，只要在酶的酸堿穩(wěn)定范圍內(nèi)操作即可。4、酶的酸堿穩(wěn)定范圍五、溫度對(duì)酶促作用的影響1、溫度-酶活曲線2、最適溫度動(dòng)物來(lái)源：35-400C植物來(lái)源：40-500C微生物：差別較大，如：TaqDNA聚合酶最適溫度高達(dá)700C3、酶的低溫保藏4、酶的穩(wěn)定溫度范圍

六、激活劑對(duì)酶作用的影響2.小分子有機(jī)物：有一些以巰基為活性基團(tuán)的酶需要加入抗壞血酸、半胱氨酸或谷胱甘肽等還原劑，維持-SH酶的活性。

酶的激活劑：凡是能夠提高酶活力的物質(zhì)1.無(wú)機(jī)離子：

許多酶的激活劑是一些金屬離子或其他無(wú)機(jī)離子。特點(diǎn)：（1）選擇性（2）拮抗性（3）替代性（4）濃度的影響3.具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子物質(zhì)注意：課本P157,EDTA可視為酶的激活劑。準(zhǔn)確嗎？七、抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響區(qū)分幾個(gè)概念：1、失活作用：凡可使酶蛋白變性而引起酶活力喪失的作用稱為失活作用。2、抑制作用：由于酶的必需基團(tuán)化學(xué)性質(zhì)的改變，（酶未變性）而引起酶活力的降低或喪失而稱為抑制作用。3、抑制劑：引起抑制作用的物質(zhì)稱為抑制劑4、變性劑：引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱為變性劑變性劑對(duì)酶的變性作用無(wú)選擇性，而一種抑制劑只能使一種酶或一類酶產(chǎn)生抑制作用，因此抑制劑對(duì)酶的抑制作用是有選擇性的。

不可逆抑制作用抑制作用的類型

競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用可逆抑制作用非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用（一）不可逆抑制作用因不可逆抑制劑通過(guò)共價(jià)鍵使酶分子受到不同程度的化學(xué)修飾。故又稱酶的修飾抑制。含義：抑制劑通常以共價(jià)鍵與酶蛋白的必需基團(tuán)結(jié)合使酶活性降低或喪失。喪失活性的酶不能用透析或超濾等方法除去抑制劑而恢復(fù)酶活力。不可逆抑制劑分類：1.基團(tuán)特異性抑制劑：不同的抑制劑與其特異性的酶必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶失活。如（1）有機(jī)磷化合物（2）烷化劑（3）砷化合物等2.底物類似物抑制劑：結(jié)構(gòu)與底物相似，而且有反應(yīng)基團(tuán)可以與酶分子的必需基團(tuán)反應(yīng)，使酶活力受到不可逆抑制。3.過(guò)渡態(tài)類似物抑制劑：與過(guò)渡態(tài)中間物相似，與活性中心結(jié)合，從而導(dǎo)致底物無(wú)法進(jìn)入使酶活性不可逆抑制。（相比于底物類似物---是更有效的競(jìng)爭(zhēng)性抑制）4.自殺性抑制劑：此類抑制劑與酶結(jié)合，而且酶又能催化其潛伏的反應(yīng)基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)后激活的潛伏基團(tuán)又反過(guò)來(lái)不可逆的抑制酶活性。這種抑制劑稱為酶的自殺性底物。（1）有機(jī)磷農(nóng)藥：抑制某些蛋白酶及酯酶活力，與酶分子活性部位的Ser-OH共價(jià)結(jié)合，從而使酶失活。解毒劑：解磷定乙酰膽堿乙酸+膽堿膽堿酯酶

積累后引起神經(jīng)過(guò)度興奮，肌肉過(guò)分收縮等（2）有機(jī)汞和有機(jī)砷化合物：這類化合物與酶分子中半胱氨酸的-SH作用，抑制含巰基的酶。酶的Cys殘基對(duì)氯汞苯甲酸酶被不可逆修飾解毒劑：二巰基異丙醇、半胱氨酸、或還原性谷胱甘肽。路易斯毒氣（3）其它不可逆抑制劑重金屬：使酶蛋白變性失活。一般使用螯合劑如EDTA、半胱氨酸等除去有害的重金屬，恢復(fù)酶活力。氰化物、硫化物、CO：與酶中金屬離子形成較為穩(wěn)定的絡(luò)合物，使酶活性受到抑制。如細(xì)胞色素氧化酶中的Fe2+青霉素：與糖肽轉(zhuǎn)肽酶活性部位的絲氨酸羥基共價(jià)結(jié)合，使酶失活。抑制肽聚糖的合成。烷化試劑：如碘乙酸，作用于巰基、羧基、咪唑基等，使酶失活。（二）可逆性抑制作用含義：抑制劑通常以非共價(jià)鍵與酶蛋白的必需基團(tuán)結(jié)合使酶活性降低或喪失。喪失活性的酶可用透析或超濾、分子篩過(guò)濾等方法除去抑制劑而恢復(fù)酶活力。（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用主要指抑制劑和底物結(jié)構(gòu)相似，競(jìng)爭(zhēng)與酶結(jié)合部位，當(dāng)抑制劑與酶結(jié)合后，就妨礙了底物與酶的結(jié)合，減少了酶的作用機(jī)會(huì)，因而降低了酶的活力。分類：競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反競(jìng)爭(zhēng)性抑制另有一類抑制劑，結(jié)合在非活性中心部位，引起酶構(gòu)象變化，可影響酶活中心與底物的結(jié)合，即底物與酶的親和力降低。競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用動(dòng)力學(xué)可表示如下：KiK1K3K2競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用——米氏方程競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用特點(diǎn)酶促反應(yīng)速度下降Km變大。Vmax不變。思考：如果加入足夠量的底物，即使有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的存在，酶催化的最大反應(yīng)速度是可以達(dá)到的。對(duì)嗎？競(jìng)爭(zhēng)性抑制抑制程度取決于底物與抑制劑的相對(duì)濃度，這種抑制可通過(guò)增加底物濃度而解除。競(jìng)爭(zhēng)性抑制兩個(gè)最典型例子：1.丙二酸對(duì)琥珀酸脫氫酶的抑制2.磺胺類藥物（對(duì)氨基苯磺酸）：是對(duì)氨基苯甲酸的結(jié)構(gòu)類似物，可與對(duì)氨苯甲酸競(jìng)爭(zhēng)二氫葉酸合成酶，妨礙二氫葉酸的形成；二氫葉酸在二氫葉酸還原酶的作用下，又生成四氫葉酸，即輔酶F，它能傳遞一碳基團(tuán)參與嘌呤、嘧啶核苷酸合成，最終影響細(xì)菌核蛋白的合成，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。Michaelis-Menten（米-門氏作圖）圖〔S〕Lineweaver-Burk（利-伯二氏）作圖法

——雙倒數(shù)作圖法底物濃度（1/[S]）（2）非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制作用含義：抑制劑和底物結(jié)構(gòu)不相似，可同時(shí)結(jié)合在酶的不同部位，抑制劑與酶的結(jié)合是可逆的?？梢杂孟率奖硎荆篕iKi

KmKmE+P非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用——米氏方程非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用特點(diǎn)酶促反應(yīng)速度下降Km不變Vmax降低例如：亮氨酸是精氨酸酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用

Michaelis-Menten圖（米-門氏作圖）〔S〕Lineweaver-Burk的作圖法（利-伯二氏）

——雙倒數(shù)作圖法

底物濃度(1/[S])（3）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用抑制劑只與酶-底物復(fù)合物[ES]結(jié)合成無(wú)活性的三元復(fù)合物[ESI]KmKiˊ反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用——米氏方程反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用特點(diǎn)使酶促反應(yīng)速度下降Km變小Vmax降低反競(jìng)爭(zhēng)性抑制常見(jiàn)于多底物反應(yīng)中，而在單底物反應(yīng)中比較少見(jiàn)。例如：L-Phe、L-精氨酸對(duì)堿性磷酸酶的作用是反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用

Michaelis-Menten圖（米-門氏作圖）Lineweaver-Burk的作圖法（利-伯二氏）

——雙倒數(shù)作圖法思考：具有反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的抑制劑只與酶-底物復(fù)合物結(jié)合而不與游離的酶結(jié)合，這種抑制使Km和Vm都變小，但Vmax/Km不變。對(duì)嗎？可逆抑制作用與不可逆抑制作用的鑒別一、用透析、超濾或凝膠過(guò)濾法，看能否除去抑制劑來(lái)區(qū)別二、采用動(dòng)力學(xué)的方法來(lái)鑒別1、在測(cè)定酶活力系統(tǒng)中：

〔S〕足夠大，[I]定量。（1）不加抑制劑時(shí)，初速度對(duì)酶濃度作圖得到一條通過(guò)原點(diǎn)的直線.圖1；（２）若加入不可逆抑制劑時(shí)，抑制劑使一定量的酶失活，只有加入的酶量大于不可逆抑制劑的量時(shí)，才表現(xiàn)出酶活力。不可逆抑制劑的作用相當(dāng)于把原點(diǎn)向右移動(dòng)。圖2；（３）若加入可逆抑制劑時(shí)，得到一條通過(guò)原點(diǎn)，但斜率低于曲線1的直線，圖3。2、在測(cè)定酶活力系統(tǒng)中,〔S〕足夠大，改變抑制劑濃度，每一個(gè)抑制劑濃度都作一條初速度和酶濃度關(guān)系曲線，則：（1）不可逆抑制劑：可以得到一組不通過(guò)原點(diǎn)的平行線；隨著不可逆抑制劑濃度增加，直線右移。（2）可逆抑制劑：得到一組通過(guò)原點(diǎn)但斜率不同的直線。隨著可逆抑制劑濃度增加，直線斜率下降。無(wú)I第四節(jié)酶活力的測(cè)定和分離純化（一）酶活力、酶單位、比活力1、酶活力：酶加速其所催化的化學(xué)反應(yīng)速度的能力。酶活力表示酶量的多少。酶活力大小的表示常用酶活單位數(shù)來(lái)表示：對(duì)于酶粉劑：U/g對(duì)于液體酶制劑：U/mL測(cè)定酶的活力本質(zhì)上就是測(cè)定酶促反應(yīng)進(jìn)行的速度。一、酶活力的測(cè)定2、酶活單位——即表示酶量多少的單位

酶單位是人為規(guī)定的一個(gè)對(duì)酶進(jìn)行定量描述的基本度量單位，其含義是在一定反應(yīng)條件下，單位時(shí)間內(nèi)完成一個(gè)規(guī)定的反應(yīng)量所需的酶量。國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定:1個(gè)酶活力國(guó)際單位（IU）是指酶在最適條件下，每分鐘催化1.0μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量，即：1IU=1.0μmol/min國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)規(guī)定:1個(gè)酶活力國(guó)際單位（Kat）是指酶在最適條件下，每秒鐘催化1.0

mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量，1Kat=1.0mol/s1Kat

=6x107IU習(xí)慣沿用單位：如：α-淀粉酶：α-淀粉糊精麥芽糖、葡萄糖規(guī)定：每小時(shí)分解1gα-淀粉需要的酶量為一個(gè)酶活單位或每小時(shí)分解1ml2%可溶性淀粉溶液為無(wú)色糊精的酶量為一個(gè)酶活單位。糖化酶:規(guī)定每小時(shí)轉(zhuǎn)化可溶性淀粉產(chǎn)生1mg還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量為一個(gè)酶活單位.對(duì)于蛋白酶：規(guī)定每分鐘分解底物酪蛋白產(chǎn)生1微克酪氨酸所需的酶量為一個(gè)酶活單位。３、酶的比活力

在酶的提純過(guò)程中，隨著酶逐步被純化，去掉雜蛋白，其比活力也在逐步增加。（1）廣義比活力（比活性）：是指單位酶制劑中的酶活單位數(shù)。酶粉劑：U/g液體酶制劑：U/ml正確理解酶制劑：酶蛋白+雜蛋白+其他雜質(zhì)（2）狹義比活力：即每mg蛋白質(zhì)中所含的U數(shù)，這是表示酶純度的概念（3）恒比活力：隨著去雜蛋白，酶的比活性不再增加。（二）酶活力測(cè)定的方法常規(guī)測(cè)定酶活力的操作程序（化學(xué)分析法）：１、酶液的恰當(dāng)稀釋４、根據(jù)酶活單位的定義和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算酶活力。３、測(cè)定反應(yīng)量（底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量）２、最適條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)（注意控制反應(yīng)時(shí)間）（底物過(guò)量，溫度,pH最適，初速度等）測(cè)酶活時(shí)，[S]過(guò)量。酶濃度越高，完成規(guī)定反應(yīng)量所需時(shí)間越短，應(yīng)根據(jù)需要調(diào)整酶濃度。例題1：因?yàn)橐?guī)定每小時(shí)分解1gα-淀粉需要的酶量為一個(gè)酶活單位。所以1mL酶液的活力：60/5×0.25g=3g,即3U/mL。換算成1克酶制劑的酶活力：3U/mL×1000mL÷1g=3000U/g有1g淀粉酶制劑，用水溶解成1000mL,從中取出1mL測(cè)定淀粉酶活力，測(cè)知每5min分解0.25g淀粉。計(jì)算每克酶制劑所含的淀粉酶活力。淀粉酶活力單位的定義：在最適條件下每小時(shí)分解1g淀粉的酶量稱為1個(gè)活力單位（U）。例題2：稱取25mg蛋白酶粉配制成25mL酶溶液，從中取出0.1mL酶液，以酪蛋白為底物，用Folin-酚比色法測(cè)定酶活力，得知每小時(shí)產(chǎn)生1500μg酪氨酸。另取2mL酶液，用凱氏定氮法測(cè)得蛋白氮為0.2mg。若以每分鐘產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量為1U計(jì)算，根據(jù)以上數(shù)據(jù)，求出：（1）1mL酶液中所含的蛋白質(zhì)量及活力。（2）比活力。（3）1g酶制劑的總蛋白含量及總活力。對(duì)于蛋白酶，規(guī)定每分鐘分解底物酪蛋白產(chǎn)生1微克酪氨酸所需的酶量為一個(gè)酶單位。0.1mL酶溶液的活力：1500μg/60min