基因遞送系統(tǒng)：CRISPR臨床挑戰(zhàn)演講人01引言：CRISPR技術(shù)突破與遞送系統(tǒng)的“卡脖子”困境02遞送系統(tǒng)的生物學挑戰(zhàn)：從“體外可控”到“體內(nèi)精準”的鴻溝03監(jiān)管與倫理挑戰(zhàn)：從“技術(shù)可行”到“合規(guī)應用”的跨越04未來突破方向：多學科交叉驅(qū)動的“遞送革命”05結(jié)語：遞送系統(tǒng)是CRISPR臨床化的“核心引擎”目錄基因遞送系統(tǒng)：CRISPR臨床挑戰(zhàn)01引言：CRISPR技術(shù)突破與遞送系統(tǒng)的“卡脖子”困境引言：CRISPR技術(shù)突破與遞送系統(tǒng)的“卡脖子”困境作為基因編輯領(lǐng)域的革命性工具，CRISPR-Cas9系統(tǒng)以靶向精準、操作簡便、成本可控等優(yōu)勢，為遺傳性疾病、惡性腫瘤、感染性疾病的治療帶來了前所未有的希望。從體外基因敲除到動物模型疾病治愈，CRISPR技術(shù)的實驗室研究已取得突破性進展，然而其向臨床轉(zhuǎn)化的道路上，始終橫亙著一道核心壁壘——基因遞送系統(tǒng)。在參與首個CRISPR治療鐮狀細胞貧血的臨床試驗時，我深刻體會到：遞送系統(tǒng)的“最后一公里”直接決定了技術(shù)的成敗。CRISPRcomponents（Cas9蛋白/mRNA、gRNA）作為大分子物質(zhì)，難以穿越細胞膜屏障；而體內(nèi)遞送需面對血液清除、組織靶向、細胞內(nèi)吞、內(nèi)體逃逸、核定位等多重生物學障礙。正如一位領(lǐng)域前輩所言：“CRISPR是‘精準手術(shù)刀’，但遞送系統(tǒng)是‘送達手術(shù)刀的手’——沒有這雙手，再鋒利的刀也無法抵達病灶。”引言：CRISPR技術(shù)突破與遞送系統(tǒng)的“卡脖子”困境當前，全球已有數(shù)十項CRISPR臨床試驗進入臨床I/II期，涵蓋血液病、眼科疾病、肝臟代謝病等領(lǐng)域，但遞送效率不足、脫靶效應、免疫原性等問題仍是制約療效與安全性的關(guān)鍵。本文將從遞送系統(tǒng)的生物學基礎(chǔ)、臨床轉(zhuǎn)化中的技術(shù)瓶頸、監(jiān)管與倫理挑戰(zhàn)及未來突破方向展開系統(tǒng)闡述，以期為行業(yè)者提供全面視角，共同推動CRISPR技術(shù)從“實驗室奇跡”向“臨床現(xiàn)實”的跨越。02遞送系統(tǒng)的生物學挑戰(zhàn)：從“體外可控”到“體內(nèi)精準”的鴻溝遞送系統(tǒng)的生物學挑戰(zhàn)：從“體外可控”到“體內(nèi)精準”的鴻溝基因遞送系統(tǒng)的核心功能是將CRISPRcomponents安全、高效地遞送至靶細胞，并在特定時空發(fā)揮編輯功能。相較于體外實驗的簡化環(huán)境（如培養(yǎng)細胞、固定血清濃度），體內(nèi)遞送需應對復雜的生物微環(huán)境，這一過程涉及多重生物學屏障，每一環(huán)節(jié)的效率損失均可能導致臨床療效的顯著下降。遞送載體的選擇困境：病毒與非病毒的“權(quán)衡之術(shù)”遞送載體是CRISPR遞送系統(tǒng)的核心，目前主要分為病毒載體與非病毒載體兩大類，二者在遞送效率、裝載容量、安全性、免疫原性等方面存在本質(zhì)差異，臨床選擇需基于疾病類型、靶組織特性及治療需求進行“個性化權(quán)衡”。遞送載體的選擇困境：病毒與非病毒的“權(quán)衡之術(shù)”病毒載體：天然遞送效率與安全性的“雙刃劍”病毒載體是臨床研究中最常用的遞送工具，其天然感染能力使其具有較高的細胞遞送效率，其中腺相關(guān)病毒（AAV）、慢病毒（LV）、腺病毒（Ad）等應用最為廣泛。-AAV載體：作為目前CRISPR臨床研究中最主流的載體（占比超70%），AAV具有低免疫原性、長期表達（可整合至宿主基因組或以附加體形式存在）、組織靶向性可通過衣殼工程化改造等優(yōu)勢。例如，AAV6和AAV8對肝臟組織具有天然嗜性，已被用于治療遺傳性酪氨酸血癥I型（NCT03346784）；AAV5對視網(wǎng)膜感光細胞的高靶向性，使其成為Leber先天性黑蒙癥（LCA）治療的理想載體（NCT04567735）。然而，AAV的局限性亦十分突出：包裝容量有限（約4.7kb），難以裝載SpCas9（4.2kb）及調(diào)控元件；預存免疫（人群中約30%-70%存在AAV中和抗體）可導致遞送失敗；長期表達可能引發(fā)免疫應答，如2020年首個CRISPR臨床試驗（治療β-地中海貧血）中，患者接受AAV遞送后出現(xiàn)肝酶升高，可能與AAV衣殼蛋白激活T細胞相關(guān)。遞送載體的選擇困境：病毒與非病毒的“權(quán)衡之術(shù)”病毒載體：天然遞送效率與安全性的“雙刃劍”-慢病毒載體：可整合至宿主基因組，實現(xiàn)長期穩(wěn)定表達，且裝載容量大于AAV（約8kb），適用于需持久編輯的疾病（如HIV感染）。但其插入突變風險可能激活原癌基因或抑癌基因，如早期基因治療中曾發(fā)生MLL基因插入導致的白血病案例；免疫原性較高，易引發(fā)細胞免疫反應，限制其重復使用。-腺病毒載體：裝載容量大（約36kb），轉(zhuǎn)染效率高，但強免疫原性（易引發(fā)強烈炎癥反應）和短暫表達（以游離形式存在，不整合）限制了其在CRISPR長期治療中的應用，目前主要用于體外編輯或體內(nèi)短期干預。遞送載體的選擇困境：病毒與非病毒的“權(quán)衡之術(shù)”非病毒載體：安全性與效率的“兩難抉擇”非病毒載體（如脂質(zhì)納米粒、聚合物、外泌體等）因無免疫原性、可降解、易規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)勢，被視為病毒載體的“替代方案”，但其遞送效率顯著低于病毒載體，是目前臨床轉(zhuǎn)化的主要瓶頸。-脂質(zhì)納米粒（LNP）：通過電離脂質(zhì)、磷脂、膽固醇、PEG化脂質(zhì)等成分自組裝形成，可包裹CRISPRmRNA或sgRNA，實現(xiàn)高效細胞內(nèi)吞。2021年FDA批準的siRNA藥物Patisiran（治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性）即采用LNP遞送，證明其臨床可行性。在CRISPR領(lǐng)域，LNP遞送的Cas9mRNA/sgRNA已在治療轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（ATTR，NCT04601051）和鐮狀細胞貧血（NCT04244656）的臨床試驗中顯示出療效。然而，LNP的組織靶向性有限（主要富集于肝臟、脾臟），難以遞送至腦、肌肉等組織；細胞毒性（高劑量下可引發(fā)肝損傷）和內(nèi)體逃逸效率低（僅約1%-2%的LNP可逃逸內(nèi)體進入細胞質(zhì)）是其核心問題。遞送載體的選擇困境：病毒與非病毒的“權(quán)衡之術(shù)”非病毒載體：安全性與效率的“兩難抉擇”-聚合物載體：如聚乙烯亞胺（PEI）、聚賴氨酸等，可通過正電荷與帶負電的核酸結(jié)合形成復合物，成本低、易修飾。但其生物相容性差（PEI具有明顯細胞毒性）、降解產(chǎn)物可能引發(fā)炎癥反應，且遞送效率受分子量、電荷密度影響大，臨床轉(zhuǎn)化進展緩慢。-外泌體：作為天然納米囊泡，具有低免疫原性、生物相容性高、可穿透血腦屏障等優(yōu)勢，是近年來新興的遞送工具。例如，工程化外泌體遞送CRISPRcomponents可靶向腫瘤細胞，在動物模型中實現(xiàn)抑癌基因編輯（如p53基因修復）。然而，外泌體產(chǎn)量低、分離純化困難，且裝載效率低（目前不足5%），距離臨床應用仍有較大差距。組織靶向性：“精準導航”的生物學難題CRISPR臨床治療的核心是“靶向編輯”，即遞送系統(tǒng)需特異性識別病變細胞，避免對正常組織的脫靶編輯。然而，人體組織微環(huán)境的復雜性（如血腦屏障、腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性）使得“精準導航”成為巨大挑戰(zhàn)。組織靶向性：“精準導航”的生物學難題生理屏障的突破：從血液到靶細胞的“萬里長征”-血腦屏障（BBB）：作為保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要屏障，BBB由內(nèi)皮細胞、緊密連接、外周細胞等構(gòu)成，僅允許小分子（<500Da）被動擴散。CRISPRcomponents（如Cas9蛋白約160kDa）難以通過BBB，目前主要依賴顱內(nèi)注射（如直接遞送至腦脊液，治療脊髓性肌萎縮癥，SMA）或載體修飾（如RVG肽修飾的LNP，靶向BBB上的乙酰膽堿受體）。但顱內(nèi)創(chuàng)傷大、全身遞送效率低，仍是腦部疾病治療的瓶頸。-腫瘤微環(huán)境（TME）：腫瘤血管異常、間質(zhì)壓力高、免疫抑制性等特點，阻礙遞送系統(tǒng)滲透至腫瘤核心。例如，在肝癌治療中，AAV和LNP主要富集于腫瘤周邊正常肝組織，而腫瘤內(nèi)部遞送效率不足30%。近年來，研究者通過修飾載體靶向腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）或腫瘤血管內(nèi)皮細胞（如RGD肽修飾靶向整合素αvβ3），可提高腫瘤遞送效率，但仍需臨床驗證。組織靶向性：“精準導航”的生物學難題細胞特異性識別：從“廣譜感染”到“精準鎖定”即使突破組織屏障，遞送系統(tǒng)仍需識別病變細胞（如肝細胞中的突變基因、T細胞中的PD-1）。病毒載體的靶向性依賴衣殼蛋白與細胞受體的結(jié)合（如AAV2與肝素硫酸蛋白的結(jié)合），但天然受體分布廣泛，導致脫靶感染。非病毒載體的靶向性則需通過表面修飾配體（如抗體、多肽、適配子）實現(xiàn)，例如：-抗體修飾：抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）抗體修飾的LNP可靶向高表達TfR的腦內(nèi)皮細胞，提高中樞遞送效率；-適配子修飾：AS1411適配子（靶向核仁素）可修飾LNP，靶向高表達核仁素的腫瘤細胞（如肺癌、乳腺癌）。然而，靶細胞受體表達的異質(zhì)性（同一病變細胞受體表達量差異大）和脫靶效應（配體可能結(jié)合非靶細胞受體）仍制約靶向精準性。例如，抗TfR抗體可能結(jié)合表達TfR的腸道上皮細胞，引發(fā)胃腸道毒性。組織靶向性：“精準導航”的生物學難題細胞特異性識別：從“廣譜感染”到“精準鎖定”（三）細胞內(nèi)遞送效率：從“進入細胞”到“發(fā)揮功能”的“關(guān)卡重重”即使成功遞送至靶細胞，CRISPRcomponents仍需面臨內(nèi)體逃逸、細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運、核定位等“關(guān)卡”，任一環(huán)節(jié)效率下降均會導致編輯功能喪失。組織靶向性：“精準導航”的生物學難題內(nèi)體逃逸：“細胞吞噬陷阱”的突破遞送系統(tǒng)通過內(nèi)吞作用進入細胞后，被包裹在內(nèi)體中，若無法及時逃逸，將隨內(nèi)體溶酶體降解（溶酶體pH4.5-5.0，含多種水解酶）。目前，內(nèi)體逃逸策略主要包括：-“質(zhì)子海綿效應”：如聚乙烯亞胺（PEI）可緩沖溶酶體中的H+，導致內(nèi)體滲透壓升高、破裂，釋放載體；但PEI細胞毒性大，臨床應用受限。-膜融合/破壞劑：如DOPE（二油酰磷脂酰乙醇胺）可促進LNP與內(nèi)體膜融合，pH敏感聚合物（如聚β-氨基酯）可在酸性環(huán)境下構(gòu)象變化，破壞內(nèi)體膜。然而，逃逸效率普遍較低（病毒載體約10%-20%，非病毒載體<5%），且過度破壞內(nèi)體可能引發(fā)細胞應激死亡。組織靶向性：“精準導航”的生物學難題內(nèi)體逃逸：“細胞吞噬陷阱”的突破2.細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運與核定位：“從細胞質(zhì)到細胞核的最后一躍”Cas9蛋白（或mRNA翻譯的Cas9蛋白）和gRNA需形成核糖核蛋白復合物（RNP）后進入細胞核，發(fā)揮編輯功能。然而，細胞核膜是雙向選擇性屏障，需通過核定位信號（NLS）與核轉(zhuǎn)運蛋白（importin）結(jié)合，才能經(jīng)核孔復合物（NPC，直徑約39nm）進入細胞核。-RNP遞送：相比DNA/mRNA遞送，RNP（預組裝Cas9-gRNA復合物）可避免細胞質(zhì)中Cas9蛋白的持續(xù)表達（降低免疫原性），且編輯起效快（2-4小時），但穩(wěn)定性差（易被胞外核酸酶降解）、核轉(zhuǎn)運效率低（僅約1%的RNP可進入細胞核）。組織靶向性：“精準導航”的生物學難題內(nèi)體逃逸：“細胞吞噬陷阱”的突破-NLS修飾：在Cas9蛋白上添加核定位信號（如SV40大T抗原NLS、PKSNLS）可促進核轉(zhuǎn)運，但過多的NLS可能增加RNP分子量（影響遞送效率）或引發(fā)免疫識別。三、臨床轉(zhuǎn)化中的技術(shù)瓶頸：從“實驗室數(shù)據(jù)”到“患者療效”的落差盡管遞送系統(tǒng)的生物學基礎(chǔ)研究已取得進展，但CRISPR臨床試驗中仍暴露出諸多技術(shù)瓶頸，包括劑量-療效失衡、長期安全性未知、規(guī)模化生產(chǎn)困難等，這些問題的解決直接關(guān)系到技術(shù)能否真正惠及患者。（一）劑量-療效平衡：“高劑量毒性”與“低劑量無效”的臨床困境遞送劑量是CRISPR臨床治療的核心參數(shù)，劑量不足導致編輯效率低下（無法達到治療效果），劑量過高則可能引發(fā)嚴重毒性。然而，“安全有效劑量”的確定需綜合考慮載體類型、靶組織、疾病嚴重程度等多重因素，目前仍缺乏統(tǒng)一標準。組織靶向性：“精準導航”的生物學難題病毒載體的“劑量毒性困境”AAV載體在肝臟遞送中，劑量過高可引發(fā)肝竇阻塞綜合征（SOS）和急性肝損傷。例如，在治療血友病B的AAV-FIX臨床試驗中，患者接受2×101?vg/kg劑量后，出現(xiàn)血小板減少、膽紅素升高等嚴重不良反應，可能與AAV衣殼激活補體系統(tǒng)有關(guān)。此外，預存免疫可顯著降低有效劑量——若患者體內(nèi)存在AAV中和抗體，即使高劑量遞送，靶組織中的病毒基因組拷貝數(shù)仍不足10copies/cell，無法達到編輯閾值（通常需>50copies/cell才能產(chǎn)生療效）。組織靶向性：“精準導航”的生物學難題非病毒載體的“劑量效率困境”LNP遞送的CRISPRcomponents需在細胞質(zhì)中達到一定濃度才能形成功能性RNP，但高劑量LNP可引發(fā)補體激活相關(guān)假性過敏反應（CARPA）（如發(fā)熱、血壓下降）和肝細胞凋亡。在ATTR臨床試驗中，患者接受LNP-Cas9mRNA/sgRNA遞送后，血清轉(zhuǎn)氨酶升高3倍以上的發(fā)生率達15%，需使用糖皮質(zhì)激素預防。然而，低劑量LNP的編輯效率顯著下降（如肝臟編輯效率<5%），難以滿足疾病治療需求。（二）長期安全性與脫靶效應：“編輯持久性”與“基因組穩(wěn)定”的隱憂CRISPR編輯的長期安全性是監(jiān)管機構(gòu)和臨床醫(yī)生關(guān)注的焦點，包括脫靶編輯、基因組插入突變、免疫原性等，這些風險可能在治療數(shù)月甚至數(shù)年后才顯現(xiàn)。組織靶向性：“精準導航”的生物學難題脫靶效應：“精準編輯”的“意外失誤”脫靶效應是CRISPR技術(shù)的固有風險，指gRNA非靶向位點編輯。在體外實驗中，通過全基因組測序（WGS）和GUIDE-seq等技術(shù)可檢測脫靶位點，但體內(nèi)脫靶效應的評估更為復雜：組織微環(huán)境影響編輯特異性（如氧化應激狀態(tài)可能改變Cas9活性）、長期表達增加脫靶風險（持續(xù)表達的Cas9可能識別低同源性位點）。例如，在治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）的AAV-CRISPR臨床試驗中，患者骨骼肌組織檢測到脫靶編輯（如DMD基因內(nèi)含子的非預期剪切），雖未引起臨床癥狀，但提示需長期隨訪。此外，載體整合（如AAV隨機插入、LNP遞送的DNA質(zhì)粒隨機整合）可能破壞基因組穩(wěn)定性，激活原癌基因（如MYC基因附近插入導致細胞增殖異常）。組織靶向性：“精準導航”的生物學難題免疫原性：“編輯持久性”的“隱形殺手”CRISPRcomponents和遞送載體均可能引發(fā)免疫應答，導致編輯效率下降或嚴重不良反應。-固有免疫：Cas9蛋白來源于細菌，可被Toll樣受體（TLR2/TLR4）識別，激活NF-κB通路，釋放促炎因子（如IL-6、TNF-α），引發(fā)急性炎癥反應。例如，在CRISPR-Cas9治療HIV感染的I期臨床試驗中，患者接受LV遞送的Cas9后，出現(xiàn)發(fā)熱、疲勞等流感樣癥狀，與Cas9蛋白激活TLR2相關(guān)。-適應性免疫：若患者曾接觸細菌（如鏈球菌，Cas9來源于化膿性鏈球菌），體內(nèi)可能存在抗Cas9的T細胞和B細胞，導致編輯細胞被清除。一項研究顯示，約40%健康人群血清中存在抗Cas9抗體，可中和遞送的Cas9蛋白，降低編輯效率。規(guī)模化生產(chǎn)與質(zhì)量控制：“從實驗室到生產(chǎn)線”的挑戰(zhàn)CRISPR臨床治療需大規(guī)模生產(chǎn)符合GMP標準的遞送系統(tǒng)，但病毒載體和非病毒載體的生產(chǎn)均面臨“產(chǎn)量低、成本高、質(zhì)控難”的問題。規(guī)模化生產(chǎn)與質(zhì)量控制：“從實驗室到生產(chǎn)線”的挑戰(zhàn)病毒載體的“生產(chǎn)瓶頸”AAV生產(chǎn)主要依賴于“三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)”（將AAVrep/cap基因、ITR側(cè)翼的therapeuticgene、輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞），但生產(chǎn)效率低（每升細胞培養(yǎng)液僅獲得1013-1014vg）、批次差異大（不同批次病毒衣殼蛋白表達量、純度差異顯著）。此外，空殼顆粒（不含therapeuticgene的AAV衣殼）占比高達70%-90%，需通過色譜純化去除，但純化過程可能導致病毒活性下降。規(guī)?；a(chǎn)與質(zhì)量控制：“從實驗室到生產(chǎn)線”的挑戰(zhàn)非病毒載體的“質(zhì)控難題”LNP的生產(chǎn)雖可采用微流控技術(shù)（如薄膜水化法、微混合器法）實現(xiàn)高通量制備，但粒徑分布（需控制在50-200nm，否則影響組織靶向性）、包封率（理想>90%）、穩(wěn)定性（儲存過程中易聚集）等質(zhì)控參數(shù)需嚴格監(jiān)控。例如，Patisiran的生產(chǎn)中，LNP的粒徑需控制在80±10nm，包封率>95%，任何偏差均可能影響療效和安全性。03監(jiān)管與倫理挑戰(zhàn)：從“技術(shù)可行”到“合規(guī)應用”的跨越監(jiān)管與倫理挑戰(zhàn)：從“技術(shù)可行”到“合規(guī)應用”的跨越CRISPR臨床遞送系統(tǒng)的應用不僅涉及技術(shù)問題，還需應對監(jiān)管機構(gòu)的審評要求、倫理規(guī)范的約束及公眾對基因編輯的擔憂，這些“軟性壁壘”同樣影響技術(shù)的落地速度。監(jiān)管標準的“空白與模糊”目前，全球尚無針對CRISPR遞送系統(tǒng)的統(tǒng)一監(jiān)管指南，不同監(jiān)管機構(gòu)（FDA、EMA、NMPA）的要求存在差異，給企業(yè)研發(fā)帶來不確定性。-遞送系統(tǒng)的表征方法：病毒載體的“空殼率”“衣殼完整性”需通過電鏡、ELISA等方法檢測，但非病毒載體（如LNP）的“體內(nèi)釋放動力學”“細胞內(nèi)分布”等關(guān)鍵參數(shù)尚缺乏標準化檢測方法。-長期安全性評估：CRISPR編輯的長期風險（如脫靶效應的延遲顯現(xiàn)）需在動物模型中進行長達2年的隨訪，但嚙齒類動物與人類的代謝差異可能導致動物數(shù)據(jù)無法外推。例如，AAV在小鼠肝臟中主要表達于肝細胞，而在非人靈長類動物中，肝竇內(nèi)皮細胞和Kupffer細胞的表達占比更高，提示動物模型的安全性數(shù)據(jù)需謹慎解讀。倫理與公平性：“技術(shù)紅利”的“分配難題”CRISPR臨床治療的成本高昂（如Zynteglo治療β-地中海貧血的費用高達210萬美元/例），可能導致“富人專屬”的醫(yī)療不公平。此外，生殖細胞編輯的倫理爭議尚未平息——2018年“基因編輯嬰兒”事件后，全球科學界達成共識，禁止生殖細胞編輯的臨床應用，但體細胞編輯的“邊界”仍需明確（如是否允許編輯增強性狀，如身高、智力）。在遞送系統(tǒng)研發(fā)中，倫理問題同樣突出：弱勢群體保護（如兒童、認知障礙患者）需確保知情同意的充分性；基因驅(qū)動技術(shù)（通過遞送系統(tǒng)編輯昆蟲基因，控制瘧疾傳播）可能影響生態(tài)系統(tǒng)，需進行風險評估。04未來突破方向：多學科交叉驅(qū)動的“遞送革命”未來突破方向：多學科交叉驅(qū)動的“遞送革命”面對CRISPR臨床遞送系統(tǒng)的多重挑戰(zhàn)，需從載體設計、遞送策略、多學科交叉等維度尋求突破，推動技術(shù)向“高效、安全、可及”的方向發(fā)展。新型載體設計：“智能型”遞送系統(tǒng)的構(gòu)建-工程化病毒載體：通過定向進化（如構(gòu)建AAV衣殼突變庫，篩選高靶向性突變體）或理性設計（如插入組織特異性肽段，修改衣殼蛋白電荷），提高靶向性。例如，AAV-LK03（通過定向進化篩選）對心肌細胞靶向性較AAV9提高10倍，已進入心血管疾病臨床前研究。-智能響應型非病毒載體：開發(fā)環(huán)境響應型載體（如pH敏感型LNP、酶敏感型聚合物），在病變微環(huán)境（如腫瘤微環(huán)境的低pH、高谷胱甘肽濃度）中釋放CRISPRcomponents，提高靶向性。例如，谷胱甘肽（GSH）敏感型聚合物（如二硫鍵交聯(lián)的聚β-氨基酯）在細胞質(zhì)高GSH環(huán)境下降解，釋放RNP，內(nèi)體逃逸效率提高至30%。遞送策略優(yōu)化：“聯(lián)合遞送”與“局部遞送”的協(xié)同-RNP聯(lián)合遞送：將Cas9蛋白、gRNA、內(nèi)體逃逸劑（如氯喹）封裝于同一LNP中，可提高編輯效率（較單獨遞送Cas9mRNA提高5-10倍）。此外，通過“兩步法”遞送（先遞送內(nèi)體逃逸劑，再遞