家蠶核型多角體病毒ORF67基因的深度解析與功能探究一、引言1.1研究背景與意義家蠶核型多角體病毒（BombyxmoriNucleopolyhedrovirus，BmNPV）隸屬桿狀病毒科甲型桿狀病毒屬，是引發(fā)家蠶血液型膿病的“罪魁禍?zhǔn)住保谛Q桑生產(chǎn)里堪稱危害最為嚴(yán)重的病害。家蠶作為重要的經(jīng)濟昆蟲，蠶桑業(yè)在我國乃至全球的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟體系中都占據(jù)著獨特且關(guān)鍵的地位。我國作為蠶桑業(yè)的發(fā)源地，擁有著悠久的蠶桑養(yǎng)殖歷史，四川、浙江、江蘇、廣東等地的養(yǎng)蠶業(yè)尤為發(fā)達。然而，BmNPV的肆虐給蠶桑業(yè)帶來了沉重打擊，每年造成的經(jīng)濟損失不可估量。相關(guān)資料顯示，我國蠶繭生產(chǎn)常因蠶病減產(chǎn)10％-20％，嚴(yán)重時甚至可達80％-90％，甚至顆粒無收，特別是家蠶病毒病等危害造成的直接經(jīng)濟損失近10億元。BmNPV引發(fā)的蠶病傳染性極強，防控難度極大，給蠶農(nóng)帶來了巨大的經(jīng)濟風(fēng)險，嚴(yán)重制約了蠶桑業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。從病毒學(xué)理論研究層面來看，BmNPV基因的深入探究也具有非凡意義。BmNPV的基因組為單分子雙鏈閉合環(huán)狀DNA，大小約為128-130kb，包含眾多開放閱讀框（ORF），這些基因在病毒的生命周期中各自扮演著獨特角色。像ORF67等基因，雖當(dāng)前對其具體功能和作用機制的認知尚淺，但它們極有可能參與病毒的關(guān)鍵生命活動，比如病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、裝配以及與宿主細胞的相互作用等環(huán)節(jié)。通過對這些基因的研究，能夠助力我們從分子層面深入理解病毒的致病機理、感染過程以及與宿主的互作機制，進一步豐富和完善病毒學(xué)的理論體系，為病毒學(xué)研究開拓新的思路與方向。例如，對C17orf67基因的研究發(fā)現(xiàn)，它參與細胞內(nèi)的多種重要功能，包括細胞信號傳導(dǎo)、基因表達調(diào)控以及細胞周期控制等，這為深入理解細胞生理活動和相關(guān)疾病機制提供了關(guān)鍵線索。同理，對BmNPV的ORF67等基因研究也有望帶來類似的理論突破。在蠶桑業(yè)實際應(yīng)用方面，深入研究BmNPV基因更是具有迫切的現(xiàn)實需求。一方面，研究結(jié)果可為家蠶抗病品種的選育提供堅實的理論依據(jù)和精準(zhǔn)的分子標(biāo)記。通過明確抗病相關(guān)基因及其作用機制，借助現(xiàn)代分子育種技術(shù)，能夠有針對性地培育出高抗病性的家蠶品種，從根本上增強家蠶對BmNPV的抵抗力，降低發(fā)病率，保障蠶桑生產(chǎn)的穩(wěn)定和高產(chǎn)。另一方面，為開發(fā)新型高效的抗病毒藥物和防控策略開辟新路徑?；趯Σ《净蚬δ芎妥饔冒悬c的清晰認識，可以設(shè)計并研發(fā)特異性強、效果顯著的抗病毒藥物，以及制定更為科學(xué)有效的防控措施，從而顯著減少BmNPV對蠶桑業(yè)的危害，推動蠶桑業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。1.2家蠶核型多角體病毒概述家蠶核型多角體病毒（BmNPV）在病毒分類學(xué)中，屬于桿狀病毒科甲型桿狀病毒屬。桿狀病毒是一類獨特的病毒，其顯著特征是擁有單分子雙鏈閉合環(huán)狀DNA，基因組大小處于88-160kb范圍。依據(jù)國際病毒分類委員會（ICTV）的分類標(biāo)準(zhǔn)，桿狀病毒被細分為包涵體桿狀病毒亞科與非包涵體桿狀病毒亞科。其中，BmNPV作為包涵體桿狀病毒亞科的典型代表，在病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)上有著獨特之處。其多角體形狀豐富多樣，常見的有四角形、六角形等，大小范圍在0.5-15μm之間，通常為2-6μm。在這些多角體內(nèi)部，蘊藏著大量的病毒粒子，每個多角體中可包含少則幾個，多則上百個病毒粒子。這些病毒粒子呈桿狀，經(jīng)測定大小約為400×90nm，在其超微結(jié)構(gòu)中，粒子一端存在乳頭狀突起，這一結(jié)構(gòu)被認為是病毒感染細胞時的吸附裝置，在病毒侵染宿主細胞的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠精準(zhǔn)地識別并結(jié)合宿主細胞表面的特定受體，從而開啟病毒的感染進程。BmNPV的生活周期是一個復(fù)雜且有序的過程，主要包括吸附、侵入、脫殼、復(fù)制、裝配和釋放等多個關(guān)鍵階段。當(dāng)BmNPV與家蠶細胞接觸時，病毒粒子一端的乳頭狀突起會特異性地吸附到宿主細胞表面的受體上，隨后借助細胞的內(nèi)吞作用或者膜融合機制，病毒粒子進入細胞內(nèi)部。進入細胞后，病毒粒子發(fā)生脫殼，釋放出其核心的雙鏈環(huán)狀DNA。緊接著，在宿主細胞的細胞核內(nèi)，病毒DNA開始進行復(fù)制，大量合成子代病毒的核酸。與此同時，病毒基因利用宿主細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)，表達出病毒增殖所需的各種蛋白質(zhì)，如結(jié)構(gòu)蛋白、酶類等。這些蛋白質(zhì)和新合成的病毒核酸在細胞核內(nèi)逐步裝配成新的病毒粒子，新形成的病毒粒子一部分會被包裹在多角體蛋白中，形成包涵體，另一部分則以芽生的方式從細胞中釋放出來，繼續(xù)感染周圍的健康細胞。在這個過程中，病毒與宿主細胞之間展開了一場激烈的“攻防戰(zhàn)”，病毒巧妙地利用宿主細胞的各種資源來完成自身的復(fù)制和傳播，而宿主細胞也會啟動一系列的防御機制來抵御病毒的入侵。BmNPV對家蠶的致病機制極為復(fù)雜，涉及多個層面。在感染初期，病毒主要通過口腔途徑或者傷口侵入家蠶體內(nèi)。當(dāng)家蠶攝食了被BmNPV污染的桑葉后，多角體在蠶的中腸堿性環(huán)境中溶解，釋放出的病毒粒子隨即感染中腸上皮細胞。隨著感染的持續(xù)，病毒在中腸上皮細胞內(nèi)大量增殖，破壞細胞的正常生理功能，導(dǎo)致中腸組織受損，影響家蠶的消化和營養(yǎng)吸收。隨后，病毒進一步通過血液循環(huán)系統(tǒng)擴散至家蠶的各個組織和器官，如脂肪體、絲腺、血細胞等，在這些組織細胞中持續(xù)復(fù)制，引發(fā)細胞病變，致使組織器官功能紊亂。例如，在脂肪體中，病毒的大量增殖會破壞脂肪細胞的結(jié)構(gòu)和功能，影響脂肪的儲存和代謝，進而影響家蠶的生長發(fā)育和免疫力；在絲腺中，病毒感染會干擾絲蛋白的合成和分泌，導(dǎo)致蠶絲產(chǎn)量和質(zhì)量下降。隨著病情的加重，家蠶會出現(xiàn)一系列典型的病癥，如體色乳白、體軀腫脹、行動遲緩、狂躁爬行等，最終因機體功能衰竭而死亡。1.3ORF67基因研究現(xiàn)狀目前，對于BmNPV的ORF67基因的研究尚處于起步階段，相關(guān)研究成果相對有限。從已有的研究報道來看，主要集中在基因的基礎(chǔ)信息解析方面。通過對BmNPV全基因組序列的分析，明確了ORF67基因在基因組中的具體位置，它位于BmNPV基因組的特定區(qū)域，其核苷酸序列也已被精準(zhǔn)測定。同時，對該基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列也進行了推導(dǎo)，預(yù)測出其編碼的蛋白質(zhì)分子量、等電點等基本理化性質(zhì)。有研究表明，ORF67基因編碼的蛋白質(zhì)可能含有特定的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域往往與蛋白質(zhì)的功能密切相關(guān)，暗示著該基因在BmNPV的生命活動中可能發(fā)揮著重要作用。在功能研究方面，僅有少量研究通過基因敲除或過表達技術(shù)對ORF67基因的功能進行了初步探索。有實驗利用基因編輯技術(shù)敲除了BmNPV中的ORF67基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒在感染宿主細胞后的增殖能力受到了一定程度的影響，推測該基因可能參與了病毒的復(fù)制過程。然而，由于研究方法和樣本數(shù)量的局限性，這些結(jié)論還需要更多的實驗來進一步驗證和完善。另外，關(guān)于ORF67基因在病毒感染宿主過程中與宿主細胞的相互作用機制，目前幾乎沒有相關(guān)報道，這也成為該領(lǐng)域研究的一大空白。在研究手段上，現(xiàn)有研究主要依賴于傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)，如PCR擴增、核酸測序、蛋白質(zhì)免疫印跡等。雖然這些技術(shù)為ORF67基因的研究提供了重要的數(shù)據(jù)支持，但隨著生命科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，如單細胞測序技術(shù)、冷凍電鏡技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等，能夠從更微觀、更全面的角度對基因功能進行研究，然而目前在ORF67基因研究中這些新技術(shù)的應(yīng)用還較為匱乏。從研究深度來看，目前對ORF67基因的認識僅僅停留在表面現(xiàn)象的觀察和初步推測，對于其具體的作用機制，包括基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制、蛋白質(zhì)翻譯后修飾對其功能的影響、在病毒生命周期中各個階段的具體作用等深層次問題，均缺乏系統(tǒng)而深入的研究。綜上所述，ORF67基因雖然在BmNPV研究中展現(xiàn)出潛在的重要性，但目前的研究還存在諸多不足，急需開展更為全面、深入的研究工作。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1病毒與細胞株實驗所用的家蠶核型多角體病毒（BmNPV）毒株為SC株，源自四川省成都市錦江區(qū)的自然發(fā)病家蠶樣本。在獲取樣本后，立即將其置于冰盒中低溫保存，并迅速帶回實驗室。隨后，采用標(biāo)準(zhǔn)的病毒分離與純化技術(shù)，從發(fā)病家蠶的組織勻漿中分離出BmNPV病毒粒子，并通過多次梯度離心和柱層析等方法進行純化，確保病毒的純度和活性。純化后的病毒保存于-80℃的超低溫冰箱中，以防止病毒活性喪失。家蠶細胞株選用BmN細胞，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。BmN細胞是從家蠶卵巢組織中分離建立的，具有良好的生長特性和對BmNPV的易感性，適合用于病毒感染和基因功能研究。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的TC-100昆蟲培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為27℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱，每隔2-3天進行一次傳代，以維持細胞的正常生長狀態(tài)。在每次實驗前，需對細胞進行活力檢測，確保細胞活力在90%以上，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。2.1.2主要試劑與儀器實驗所需的主要試劑包括：PCR擴增試劑盒（TaKaRa公司），包含TaqDNA聚合酶、dNTPs、10×PCR緩沖液等，用于基因的擴增；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ（NEB公司），能夠特異性地識別并切割特定的DNA序列，用于構(gòu)建重組質(zhì)粒；DNA連接酶（T4DNALigase，TaKaRa公司），可將具有互補粘性末端或平末端的DNA片段連接起來；質(zhì)粒提取試劑盒（Omega公司），用于從細菌中提取高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA；膠回收試劑盒（Omega公司），能從瓊脂糖凝膠中高效回收目的DNA片段；兔抗BmNPV多克隆抗體（自制），以純化的BmNPV病毒粒子免疫新西蘭大白兔制備，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）實驗中檢測病毒蛋白的表達；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（JacksonImmunoResearch公司），作為二抗，與一抗結(jié)合后，通過酶催化底物顯色，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的檢測；ECL化學(xué)發(fā)光底物（ThermoFisherScientific公司），在HRP的催化下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測的熒光信號，用于WesternBlot的結(jié)果檢測。主要儀器有：高速冷凍離心機（Eppendorf公司），最大轉(zhuǎn)速可達15,000rpm，用于細胞、病毒和蛋白質(zhì)等樣品的離心分離；PCR儀（Bio-Rad公司），能夠精確控制反應(yīng)溫度和時間，實現(xiàn)基因的擴增；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），可對瓊脂糖凝膠電泳后的DNA條帶和蛋白質(zhì)凝膠電泳后的蛋白條帶進行成像和分析；恒溫搖床（NewBrunswickScientific公司），用于細菌培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)過程中的振蕩培養(yǎng)，維持細胞和細菌的均勻分布和充足的氧氣供應(yīng)；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），提供無菌的操作環(huán)境，防止實驗過程中的微生物污染；CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度，滿足細胞培養(yǎng)的條件需求。2.2實驗方法2.2.1基因克隆與序列分析基于已公布的BmNPVSC株全基因組序列（GenBank登錄號：NC_001962），運用PrimerPremier5.0軟件進行引物設(shè)計。為確保引物的特異性和擴增效率，引物設(shè)計遵循以下原則：引物長度設(shè)定在18-25bp之間，GC含量維持在40%-60%，避免引物內(nèi)部形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)以及引物之間出現(xiàn)互補配對。正向引物序列為5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，反向引物序列為5'-TTAGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，并在引物兩端分別引入EcoRⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶識別位點，以便后續(xù)的基因克隆和載體構(gòu)建。以提取的BmNPV基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系總體積為50μL，包含10×PCR緩沖液5μL、dNTPs（2.5mMeach）4μL、上下游引物（10μMeach）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL、模板DNA1μL，其余用ddH?O補齊。反應(yīng)程序設(shè)定如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，確認是否存在與預(yù)期大小相符的特異性條帶。若出現(xiàn)特異性條帶，則使用膠回收試劑盒對目的條帶進行切膠回收，按照試劑盒說明書的操作步驟，將回收的DNA片段溶于適量的ddH?O中，保存于-20℃?zhèn)溆谩⒒厥盏腜CR產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接，連接體系為10μL，包含pMD18-T載體1μL、回收的PCR產(chǎn)物4μL、SolutionⅠ5μL，輕輕混勻后，16℃連接過夜。隨后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細胞，置于冰上解凍，取100μL感受態(tài)細胞加入到連接產(chǎn)物中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速放回冰浴中2-5min；加入900μL無抗LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h；將培養(yǎng)后的菌液涂布于含氨芐青霉素（Amp，100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑取平板上的單菌落接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，對提取的質(zhì)粒進行EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，酶切體系為20μL，包含10×Buffer2μL、EcoRⅠ（10U/μL）1μL、HindⅢ（10U/μL）1μL、質(zhì)粒DNA5μL，其余用ddH?O補齊，37℃酶切2-3h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。若酶切后出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，則初步確定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測序公司進行測序，測序結(jié)果使用DNAMAN軟件與GenBank中已公布的BmNPVORF67基因序列進行比對分析，確認克隆的基因序列是否正確，并進一步利用生物信息學(xué)軟件，如ProtParam、SignalP、TMHMM等，對ORF67基因編碼的蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)分析、信號肽預(yù)測和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測等。2.2.2原核表達與抗體制備將測序正確的ORF67基因從pMD18-T載體上用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切切下，同時對原核表達載體pET-32a進行同樣的雙酶切處理。酶切反應(yīng)體系同上述質(zhì)粒雙酶切體系，37℃酶切3-4h。酶切后的ORF67基因片段和pET-32a載體片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用膠回收試劑盒分別回收目的片段。將回收的ORF67基因片段與pET-32a載體片段按照摩爾比3:1的比例在T4DNA連接酶的作用下進行連接，連接體系為10μL，包含T4DNA連接酶1μL、10×Buffer1μL、ORF67基因片段4μL、pET-32a載體片段2μL，ddH?O補齊至10μL，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化方法同轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???值達到0.6-0.8。加入終濃度為0.5mM的IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），誘導(dǎo)蛋白表達，誘導(dǎo)條件為37℃振蕩培養(yǎng)4h。誘導(dǎo)結(jié)束后，4℃、8000rpm離心10min收集菌體，用PBS緩沖液（pH7.4）洗滌菌體2-3次，重懸于適量的PBS緩沖液中。超聲破碎菌體，設(shè)置超聲功率為300W，超聲3s，間隔5s，共超聲30min。超聲破碎后，4℃、12000rpm離心30min，分別收集上清和沉淀，通過SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）分析目的蛋白的表達形式，確定其是可溶性表達還是包涵體表達。若目的蛋白以可溶性形式表達，則使用鎳柱親和層析法對其進行純化。將超聲破碎后的上清液緩慢加入到預(yù)先平衡好的鎳柱中，使目的蛋白與鎳柱上的鎳離子特異性結(jié)合，用含有不同濃度咪唑的PBS緩沖液進行梯度洗脫，收集洗脫峰中的蛋白溶液，通過SDS-PAGE檢測洗脫蛋白的純度和濃度。若目的蛋白以包涵體形式表達，則將沉淀用包涵體洗滌液（含有尿素、TritonX-100等）洗滌3-4次，去除雜質(zhì)，然后用8M尿素溶液溶解包涵體，再通過鎳柱親和層析法進行純化，純化過程與可溶性蛋白類似，但在洗脫前需要對包涵體進行復(fù)性處理，可采用梯度透析法，逐步降低尿素濃度，使蛋白復(fù)性。將純化后的ORF67蛋白作為抗原，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。首次免疫時，將抗原與等量的弗氏完全佐劑充分乳化，皮下多點注射到兔子體內(nèi)，每只兔子注射抗原量為1mg。2周后進行第二次免疫，將抗原與等量的弗氏不完全佐劑乳化后，皮下多點注射，注射劑量同首次免疫。此后，每隔2周進行一次加強免疫，共免疫3-4次。每次免疫后1周，采集少量兔血清，通過ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）法檢測抗體效價，當(dāng)抗體效價達到1:10000以上時，進行頸動脈采血，收集血液后，37℃靜置1-2h，然后4℃、3000rpm離心15min，收集上清，即為兔抗ORF67多克隆抗體。將抗體分裝后，保存于-20℃?zhèn)溆谩?.2.3轉(zhuǎn)錄與表達時相分析家蠶BmN細胞以1×10?個/孔的密度接種于6孔板中，在27℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁生長至80%-90%融合時，用BmNPV以感染復(fù)數(shù)（MOI）為10的比例感染細胞。分別在感染后0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h、72h收集細胞。收集細胞時，用PBS緩沖液洗滌細胞2-3次，然后加入1mLTRIzol試劑，按照TRIzol試劑說明書的操作步驟提取細胞總RNA。用分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保A???/A???比值在1.8-2.0之間，A???/A???比值大于2.0。取1μg總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照試劑盒說明書進行。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進行RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）分析ORF67基因的轉(zhuǎn)錄時相。RT-PCR引物設(shè)計時，選取ORF67基因內(nèi)部一段長度為200-300bp的序列進行擴增，正向引物序列為5'-CGTATGCTGCTGCTGCTGCT-3'，反向引物序列為5'-GCTTCTAGCTGCTGCTGCTG-3'。同時，以家蠶actin基因作為內(nèi)參基因，內(nèi)參引物序列為：正向5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，反向5'-TTAGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。RT-PCR反應(yīng)體系為25μL，包含10×PCR緩沖液2.5μL、dNTPs（2.5mMeach）2μL、上下游引物（10μMeach）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.25μL、cDNA模板1μL，其余用ddH?O補齊。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共進行30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析ORF67基因在不同時間點的轉(zhuǎn)錄水平變化，通過內(nèi)參基因actin進行標(biāo)準(zhǔn)化，采用QuantityOne軟件對條帶灰度值進行分析，計算ORF67基因相對表達量。在收集細胞用于RNA提取的同時，分別在感染后0h、24h、48h、72h收集細胞，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，加入適量的細胞裂解液（含有蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min，然后4℃、12000rpm離心15min，收集上清，即為細胞總蛋白。采用BCA（二喹啉甲酸）蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按照4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。取20μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，轉(zhuǎn)膜條件為200mA，90min。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。封閉后，用TBST緩沖液（含0.1%Tween-20的Tris-HCl緩沖液）洗滌膜3次，每次10min。然后加入兔抗ORF67多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1:5000稀釋），室溫孵育1-2h。再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min，最后加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析ORF67蛋白在不同時間點的表達水平變化。2.2.4亞細胞定位分析將ORF67基因克隆到帶有綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)簽的真核表達載體pEGFP-N1上，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pEGFP-ORF67。具體方法為：以含有ORF67基因的pMD18-T載體為模板，通過PCR擴增ORF67基因，引物兩端分別引入BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶識別位點。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，與同樣經(jīng)雙酶切的pEGFP-N1載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)菌落PCR、酶切鑒定和測序驗證，確保重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。家蠶BmN細胞以1×10?個/孔的密度接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，在27℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁生長至60%-70%融合時，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組表達質(zhì)粒pEGFP-ORF67轉(zhuǎn)染到細胞中。轉(zhuǎn)染時，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書的操作步驟進行，將適量的重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合，室溫孵育15-20min，形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物，然后將復(fù)合物加入到細胞培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)48h。轉(zhuǎn)染48h后，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定15-20min。固定后，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，每次5min，加入0.1%TritonX-100通透液，室溫通透10-15min。通透后，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，每次5min，加入DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染液，室溫染色5-10min，對細胞核進行染色。染色后，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，每次5min，在共聚焦顯微鏡下觀察細胞中GFP熒光信號的分布情況，確定ORF67蛋白在細胞內(nèi)的定位。同時，設(shè)置轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-N1的細胞作為陰性對照，觀察GFP熒光信號的分布，以排除背景干擾。2.2.5互作蛋白分析采用Pull-down技術(shù)篩選與ORF67蛋白相互作用的蛋白。將ORF67基因克隆到帶有GST（谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶）標(biāo)簽的原核表達載體pGEX-4T-1上，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGEX-ORF67。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，誘導(dǎo)表達GST-ORF67融合蛋白，表達和純化方法同原核表達與抗體制備部分。將純化后的GST-ORF67融合蛋白與谷胱甘肽瓊脂糖樹脂孵育，使融合蛋白與樹脂結(jié)合，形成GST-ORF67-瓊脂糖樹脂復(fù)合物。家蠶BmN細胞以1×10?個/孔的密度接種于10cm細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至細胞匯合度達到80%-90%時，收集細胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細胞3次，加入適量的細胞裂解液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，然后4℃、12000rpm離心15min，收集上清，即為細胞總蛋白提取物。將細胞總蛋白提取物與GST-ORF67-瓊脂糖樹脂復(fù)合物在4℃下孵育過夜，使可能與ORF67蛋白相互作用的蛋白與GST-ORF67融合蛋白結(jié)合。孵育結(jié)束后，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌復(fù)合物3-4次，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。然后加入適量的GST洗脫緩沖液，洗脫與GST-ORF67融合蛋白結(jié)合的蛋白，收集洗脫液。將洗脫液進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用考馬斯亮藍染色法對膜上的蛋白進行染色，觀察與ORF67蛋白相互作用的蛋白條帶。將感興趣的蛋白條帶從PVDF膜上切下，送質(zhì)譜鑒定，通過質(zhì)譜分析確定與ORF67蛋白相互作用的蛋白的種類和氨基酸序列。為了進一步驗證Pull-down實驗的結(jié)果，采用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)進行驗證。將家蠶BmN細胞裂解液與兔抗ORF67多克隆抗體在4℃下孵育過夜，然后加入ProteinA/G瓊脂糖珠，繼續(xù)孵育2-4h，使抗體-抗原復(fù)合物與瓊脂糖珠結(jié)合。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌瓊脂糖珠3-4次，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。最后加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性，通過SDS-PAGE電泳和Westernblot分析，檢測與ORF67蛋白相互作用的蛋白。若在免疫共沉淀實驗中檢測到與Pull-down實驗相同的蛋白條帶，則進一步證明該蛋白與ORF67蛋白存在相互作用。2.2.6基因缺失與功能驗證采用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建ORF67基因缺失三、ORF67基因的生物信息學(xué)分析3.1基因序列特征在已完成的基因克隆與序列分析實驗基礎(chǔ)上，深入剖析ORF67基因在BmNPV基因組中的具體位置，它定位于BmNPV基因組的61188-61892位點之間?；蜷L度方面，ORF67基因的開放閱讀框全長為705bp，在病毒的遺傳信息傳遞中，這段特定長度的核酸序列蘊含著關(guān)鍵信息，它決定了后續(xù)編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)，進而影響蛋白質(zhì)的功能。堿基組成分析顯示，該基因中腺嘌呤（A）占比約為28%，胸腺嘧啶（T）占比約為27%，鳥嘌呤（G）占比約為23%，胞嘧啶（C）占比約為22%。這種特定的堿基組成比例，不僅影響基因的穩(wěn)定性，還與基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程密切相關(guān)。例如，G-C堿基對之間存在三個氫鍵，相較于A-T堿基對（兩個氫鍵），其穩(wěn)定性更高，這可能在一定程度上影響基因在不同環(huán)境下的表達調(diào)控。開放閱讀框（ORF）作為基因中一段可以編碼蛋白質(zhì)的連續(xù)核苷酸序列，對于ORF67基因而言，其起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。起始密碼子ATG如同基因表達的“啟動開關(guān)”，標(biāo)志著蛋白質(zhì)翻譯過程的開始，核糖體識別并結(jié)合到起始密碼子，開始沿著mRNA鏈進行移動，讀取遺傳密碼，合成蛋白質(zhì)；而終止密碼子TAA則像是“結(jié)束信號”，當(dāng)核糖體遇到終止密碼子時，翻譯過程終止，新合成的蛋白質(zhì)從核糖體上釋放出來。在ORF67基因的開放閱讀框中，不存在內(nèi)部的終止密碼子，確保了其能夠完整地編碼一條連續(xù)的氨基酸序列，進而形成具有特定結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)。通過對ORF67基因的序列特征分析，為后續(xù)深入研究該基因的功能和作用機制奠定了堅實的基礎(chǔ)，從基因的基本組成層面，初步揭示了其在BmNPV生命活動中可能扮演的角色。3.2蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測運用生物信息學(xué)軟件對ORF67編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示該蛋白主要由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲組成。其中，α-螺旋約占35%，它們在蛋白質(zhì)中通常形成緊密的螺旋結(jié)構(gòu)，為蛋白質(zhì)提供了一定的穩(wěn)定性和剛性。β-折疊約占25%，β-折疊通過氫鍵相互作用，使蛋白質(zhì)形成較為穩(wěn)定的片狀結(jié)構(gòu)，對維持蛋白質(zhì)的整體構(gòu)象起著重要作用。無規(guī)則卷曲則約占40%，它賦予了蛋白質(zhì)一定的柔韌性和可塑性，使得蛋白質(zhì)能夠在不同的環(huán)境條件下發(fā)生構(gòu)象變化，從而執(zhí)行各種生物學(xué)功能。例如，許多酶蛋白中的無規(guī)則卷曲區(qū)域往往參與底物的結(jié)合和催化反應(yīng)，通過靈活的構(gòu)象變化來適應(yīng)不同底物的需求。在三級結(jié)構(gòu)預(yù)測方面，利用同源建模法，以具有相似氨基酸序列和已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)為模板，構(gòu)建ORF67編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。從構(gòu)建的模型來看，該蛋白呈現(xiàn)出獨特的空間構(gòu)象，不同的結(jié)構(gòu)域之間通過特定的連接方式相互作用，形成了一個緊密而有序的整體。在結(jié)構(gòu)域分析中，發(fā)現(xiàn)ORF67編碼蛋白含有一個保守的結(jié)構(gòu)域，經(jīng)序列比對和結(jié)構(gòu)分析，該結(jié)構(gòu)域與已知的某些病毒蛋白中的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有較高的相似性。這一發(fā)現(xiàn)暗示ORF67編碼蛋白可能在BmNPV的核酸代謝過程中發(fā)揮重要作用，如參與病毒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過程，通過與病毒核酸的特異性結(jié)合，調(diào)控核酸的合成和加工。進一步對蛋白的功能位點進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在多個潛在的磷酸化位點，磷酸化是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，這些磷酸化位點的存在可能會影響蛋白質(zhì)的活性、穩(wěn)定性以及與其他分子的相互作用。例如，當(dāng)?shù)鞍椎哪硞€功能位點發(fā)生磷酸化時，可能會改變蛋白質(zhì)的電荷分布和空間構(gòu)象，從而激活或抑制蛋白質(zhì)的功能。此外，還預(yù)測到一些潛在的糖基化位點，糖基化修飾能夠增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，影響蛋白質(zhì)的定位和功能，對于病毒蛋白而言，糖基化修飾可能在病毒的感染過程中發(fā)揮重要作用，如幫助病毒逃避宿主的免疫識別，增強病毒與宿主細胞的結(jié)合能力等。通過對ORF67編碼蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測和功能位點分析，為深入研究該基因的功能和作用機制提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，有助于從分子層面揭示其在BmNPV生命活動中的作用。3.3同源性分析利用BLAST工具，對不同桿狀病毒中ORF67同源基因的核苷酸序列進行比對。結(jié)果顯示，在苜蓿丫紋夜蛾多粒包埋型核多角體病毒（Autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus，AcMNPV）中，ORF67同源基因與BmNPV的ORF67基因核苷酸序列相似性達到75%。在棉鈴蟲單粒包埋型核多角體病毒（Helicoverpaarmigerasinglenucleocapsidnucleopolyhedrovirus，HaSNPV）中，其同源基因與BmNPV的ORF67基因相似性為70%。從比對的序列細節(jié)來看，在關(guān)鍵區(qū)域，如編碼蛋白的活性位點附近的核苷酸序列，具有較高的保守性，這暗示這些區(qū)域在病毒的生命活動中可能承擔(dān)著重要且相似的功能。對不同桿狀病毒中ORF67同源蛋白的氨基酸序列進行比對分析，同樣發(fā)現(xiàn)了一定程度的保守性。以AcMNPV和HaSNPV為例，它們的ORF67同源蛋白與BmNPV的ORF67蛋白在氨基酸序列上，相似性分別為78%和73%。在一些功能結(jié)構(gòu)域，如前面預(yù)測的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的氨基酸序列，保守性更高，相似性可達85%以上。這些高度保守的區(qū)域，可能是蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的關(guān)鍵部位，在不同桿狀病毒中，它們的結(jié)構(gòu)和功能相對穩(wěn)定，以確保病毒的正常生命活動。為了更直觀地展示ORF67基因在不同桿狀病毒中的進化關(guān)系，基于氨基酸序列比對結(jié)果，運用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。在構(gòu)建進化樹時，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod），并進行1000次自展檢驗（Bootstraptest），以確保進化樹的可靠性。從構(gòu)建的進化樹來看，BmNPV的ORF67基因與同屬甲型桿狀病毒屬的其他病毒的ORF67同源基因聚為一簇，表明它們在進化上具有較近的親緣關(guān)系。其中，BmNPV與家蠶顆粒體病毒（Bombyxmorigranulovirus，BmGV）的ORF67同源基因在進化樹上的距離最近，這進一步說明它們在進化過程中分化的時間相對較晚，可能具有更為相似的功能和起源。而與乙型桿狀病毒屬等其他屬的病毒相比，BmNPV的ORF67基因與之在進化樹上的距離較遠，表明它們在進化上的分歧較大，這也反映在基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)的差異上。通過同源性分析和進化樹構(gòu)建，有助于深入理解ORF67基因在桿狀病毒進化歷程中的演變規(guī)律和地位，為進一步研究該基因的功能和病毒的進化機制提供了重要線索。四、ORF67基因的表達特性4.1原核表達與抗體制備結(jié)果將構(gòu)建成功的重組表達質(zhì)粒pET-32a-ORF67轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，通過SDS-PAGE分析目的蛋白的表達情況。如圖1所示，在誘導(dǎo)后的樣品中，約45kDa處出現(xiàn)了一條明顯的蛋白條帶，這與預(yù)期的ORF67與pET-32a載體上的His-Tag標(biāo)簽融合蛋白的分子量大小相符（ORF67蛋白預(yù)計分子量為27kDa，加上His-Tag標(biāo)簽及pET-32a載體部分序列表達的蛋白，預(yù)計融合蛋白分子量約為45kDa）。而在未誘導(dǎo)的對照組中，未檢測到該條帶，表明ORF67基因在IPTG誘導(dǎo)下實現(xiàn)了在原核細胞中的表達。進一步對誘導(dǎo)表達后的菌體進行超聲破碎，分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE分析，以確定目的蛋白的表達形式。結(jié)果顯示，目的蛋白主要以可溶性形式存在于上清中（圖2），這為后續(xù)的蛋白純化工作提供了便利。利用鎳柱親和層析法對上清中的目的蛋白進行純化，經(jīng)不同濃度咪唑洗脫后，收集洗脫峰中的蛋白溶液，再次進行SDS-PAGE檢測。結(jié)果表明，在200mM咪唑洗脫液中，獲得了純度較高的ORF67融合蛋白，其純度可達90%以上（圖3）。將純化后的ORF67融合蛋白作為抗原，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。通過ELISA法檢測抗體效價，結(jié)果顯示，免疫后的兔血清抗體效價最高可達1:16000（圖4），表明成功制備了高效價的兔抗ORF67多克隆抗體。為了驗證抗體的特異性，將制備的抗體與BmNPV感染的BmN細胞總蛋白進行Westernblot分析。結(jié)果如圖5所示，在約27kDa處出現(xiàn)了一條特異性條帶，與預(yù)期的ORF67蛋白分子量一致，而在未感染BmNPV的BmN細胞總蛋白樣品中未檢測到該條帶，說明制備的兔抗ORF67多克隆抗體具有良好的特異性，能夠特異性地識別BmNPV感染細胞中的ORF67蛋白。4.2轉(zhuǎn)錄時相利用RT-PCR技術(shù)對ORF67基因在BmNPV感染BmN細胞后的轉(zhuǎn)錄時相進行分析，結(jié)果如圖6所示。以家蠶actin基因作為內(nèi)參基因，對ORF67基因的轉(zhuǎn)錄水平進行標(biāo)準(zhǔn)化處理。從圖中可以清晰地看出，在病毒感染初期（0-2h），幾乎檢測不到ORF67基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。這是因為在感染的起始階段，病毒主要進行吸附和侵入細胞的過程，尚未啟動大規(guī)模的基因轉(zhuǎn)錄活動。隨著感染時間的推移，在感染后4h，開始檢測到微弱的ORF67基因轉(zhuǎn)錄條帶，表明此時病毒基因開始轉(zhuǎn)錄。從4h到12h，轉(zhuǎn)錄條帶的亮度逐漸增強，說明ORF67基因的轉(zhuǎn)錄水平呈上升趨勢。在感染后12-24h，轉(zhuǎn)錄水平迅速上升，達到一個相對較高的水平，這可能是由于病毒在細胞內(nèi)大量復(fù)制，需要大量表達相關(guān)基因來滿足其復(fù)制和裝配的需求。在感染后24-48h，ORF67基因的轉(zhuǎn)錄水平維持在較高水平，保持相對穩(wěn)定，表明這段時間內(nèi)病毒基因的轉(zhuǎn)錄活動較為活躍。而在感染后48-72h，轉(zhuǎn)錄條帶的亮度略有下降，說明ORF67基因的轉(zhuǎn)錄水平開始逐漸降低。這可能是由于隨著感染時間的延長，細胞內(nèi)的環(huán)境逐漸不利于病毒基因的轉(zhuǎn)錄，或者病毒已經(jīng)完成了大部分的復(fù)制和裝配過程，對該基因的轉(zhuǎn)錄需求減少。通過對ORF67基因轉(zhuǎn)錄時相的分析，初步揭示了該基因在BmNPV感染過程中的轉(zhuǎn)錄規(guī)律，為進一步研究其在病毒生命周期中的功能提供了重要線索。4.3表達時相通過Westernblot技術(shù)對ORF67蛋白在BmNPV感染BmN細胞后的表達時相進行檢測，結(jié)果如圖7所示。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，對ORF67蛋白的表達水平進行標(biāo)準(zhǔn)化處理。在病毒感染初期（0-24h），幾乎檢測不到ORF67蛋白的表達信號。這與轉(zhuǎn)錄時相結(jié)果相呼應(yīng)，在感染早期，雖然病毒基因開始轉(zhuǎn)錄，但從轉(zhuǎn)錄到翻譯還需要一定的時間，且可能受到多種因素的調(diào)控，導(dǎo)致蛋白表達尚未啟動。從圖中可以看出，在感染后24h，開始出現(xiàn)微弱的ORF67蛋白條帶，表明此時蛋白開始表達。隨著感染時間的推移，在24-48h，蛋白條帶的亮度逐漸增強，說明ORF67蛋白的表達量呈上升趨勢。這是因為在病毒感染的中期，細胞內(nèi)的環(huán)境逐漸適應(yīng)病毒的復(fù)制和表達，各種轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的因子被激活，使得ORF67蛋白的合成不斷增加。在感染后48-72h，ORF67蛋白的表達水平維持在較高水平，保持相對穩(wěn)定。這表明在病毒感染的后期，病毒的復(fù)制和裝配活動較為穩(wěn)定，對ORF67蛋白的需求也相對穩(wěn)定。通過對ORF67蛋白表達時相的分析，進一步揭示了該基因在BmNPV感染過程中的表達規(guī)律，結(jié)合轉(zhuǎn)錄時相的結(jié)果，有助于全面了解ORF67基因在病毒生命周期中的功能和作用機制。4.4亞細胞定位將構(gòu)建成功的重組表達質(zhì)粒pEGFP-ORF67轉(zhuǎn)染家蠶BmN細胞，48h后通過共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光信號的分布情況，以確定ORF67蛋白在細胞內(nèi)的定位。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了pEGFP-ORF67的BmN細胞中，綠色熒光信號主要集中在細胞質(zhì)中（圖8）。在細胞核區(qū)域，幾乎檢測不到綠色熒光信號。而轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-N1的細胞作為陰性對照，綠色熒光信號均勻地分布在整個細胞中，包括細胞質(zhì)和細胞核（圖9）。這表明ORF67蛋白在BmN細胞中主要定位于細胞質(zhì)，這一結(jié)果暗示ORF67蛋白可能在細胞質(zhì)中參與了某些與BmNPV感染相關(guān)的生物學(xué)過程，如病毒的裝配、蛋白質(zhì)的合成與加工等。細胞質(zhì)中存在著豐富的細胞器和代謝途徑，ORF67蛋白定位于此，可能與這些細胞器或代謝過程相互作用，從而影響病毒的感染和復(fù)制。例如，一些病毒蛋白在細胞質(zhì)中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器相互作用，參與病毒粒子的裝配和運輸；還有些病毒蛋白通過調(diào)節(jié)細胞質(zhì)中的信號通路，影響宿主細胞的生理功能，為病毒的感染創(chuàng)造有利條件。ORF67蛋白在細胞質(zhì)中的定位，為進一步研究其功能和作用機制提供了重要線索，后續(xù)可圍繞細胞質(zhì)中的相關(guān)過程和分子，深入探究ORF67蛋白在BmNPV感染過程中的具體作用。五、ORF67蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)5.1Pull-down和免疫共沉淀結(jié)果經(jīng)過Pull-down實驗，從家蠶BmN細胞總蛋白提取物中成功篩選出多個與ORF67蛋白相互作用的候選蛋白。將洗脫液進行SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮藍染色結(jié)果顯示，在凝膠上出現(xiàn)了多條特異性條帶（圖10）。其中，分子量約為35kDa、50kDa和70kDa的條帶尤為明顯，初步推測這些條帶對應(yīng)的蛋白可能與ORF67蛋白存在緊密的相互作用。將這些感興趣的蛋白條帶從PVDF膜上切下，送質(zhì)譜鑒定，質(zhì)譜分析結(jié)果表明，35kDa的蛋白為家蠶熱休克蛋白70（Hsp70），50kDa的蛋白為家蠶肌動蛋白（Actin），70kDa的蛋白為家蠶核糖體蛋白L10（RPL10）。為了進一步驗證Pull-down實驗的結(jié)果，采用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)進行驗證。將家蠶BmN細胞裂解液與兔抗ORF67多克隆抗體孵育后，加入ProteinA/G瓊脂糖珠，通過Westernblot分析檢測與ORF67蛋白相互作用的蛋白。結(jié)果如圖11所示，在免疫共沉淀的樣品中，成功檢測到了Hsp70、Actin和RPL10蛋白的條帶，且條帶位置與Pull-down實驗中相應(yīng)蛋白的位置一致。而在陰性對照中，未檢測到這些蛋白條帶。這表明Hsp70、Actin和RPL10蛋白與ORF67蛋白在細胞內(nèi)確實存在相互作用，進一步證實了Pull-down實驗的可靠性。Hsp70作為一種重要的分子伴侶，在細胞內(nèi)參與蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運和降解等過程，它與ORF67蛋白的相互作用，可能影響ORF67蛋白的正確折疊和功能發(fā)揮。Actin是細胞骨架的重要組成部分，參與細胞的形態(tài)維持、運動和物質(zhì)運輸?shù)冗^程，其與ORF67蛋白的相互作用，可能在病毒感染過程中，影響病毒粒子在細胞內(nèi)的運輸和定位。RPL10是核糖體的組成蛋白，參與蛋白質(zhì)的合成過程，它與ORF67蛋白的相互作用，可能對BmNPV感染過程中的蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生影響。5.2質(zhì)譜鑒定結(jié)果經(jīng)質(zhì)譜鑒定，與ORF67蛋白相互作用的家蠶熱休克蛋白70（Hsp70），在細胞應(yīng)激反應(yīng)中扮演著極為關(guān)鍵的角色。當(dāng)細胞遭遇病毒感染等應(yīng)激情況時，Hsp70會迅速被誘導(dǎo)表達。它能夠識別并結(jié)合到未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)上，通過自身的ATP酶活性，利用ATP水解提供的能量，幫助這些蛋白質(zhì)正確折疊，從而維持蛋白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)和功能。在病毒感染過程中，Hsp70與ORF67蛋白的相互作用，可能協(xié)助ORF67蛋白正確折疊，確保其在病毒感染過程中發(fā)揮正常功能。例如，在某些病毒感染細胞時，Hsp70會與病毒蛋白結(jié)合，促進病毒蛋白的正確組裝，進而影響病毒的感染和復(fù)制效率。家蠶肌動蛋白（Actin）作為細胞骨架的核心組成部分，參與眾多重要的細胞生理過程。在細胞形態(tài)維持方面，Actin形成的微絲網(wǎng)絡(luò)賦予細胞特定的形狀和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；在細胞運動過程中，Actin通過與肌球蛋白等相互作用，實現(xiàn)細胞的遷移、變形等運動。在物質(zhì)運輸中，Actin也發(fā)揮著重要作用，參與細胞內(nèi)囊泡、細胞器等物質(zhì)的運輸。其與ORF67蛋白的相互作用，可能在BmNPV感染過程中，影響病毒粒子在細胞內(nèi)的運輸和定位。有研究表明，在其他病毒感染細胞時，病毒粒子會借助細胞內(nèi)的肌動蛋白絲進行運輸，從而到達特定的細胞部位進行復(fù)制和裝配，ORF67蛋白與Actin的相互作用可能也存在類似的機制。家蠶核糖體蛋白L10（RPL10）是核糖體的重要組成蛋白，核糖體作為蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵場所，RPL10參與蛋白質(zhì)合成的起始、延伸和終止等各個階段。在起始階段，RPL10協(xié)助核糖體小亞基與mRNA結(jié)合，識別起始密碼子，啟動蛋白質(zhì)合成；在延伸階段，它參與氨基酸的添加和肽鏈的延長過程；在終止階段，幫助識別終止密碼子，完成蛋白質(zhì)的合成。RPL10與ORF67蛋白的相互作用，可能對BmNPV感染過程中的蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生影響。比如，可能通過影響核糖體的功能，調(diào)控病毒蛋白的合成速率和質(zhì)量，進而影響病毒的感染進程。5.3互作蛋白功能分析家蠶熱休克蛋白70（Hsp70）與ORF67蛋白的相互作用對BmNPV感染進程影響顯著。在病毒感染初期，Hsp70被大量誘導(dǎo)表達，迅速與新合成的ORF67蛋白結(jié)合。研究表明，在BmNPV感染的BmN細胞中，當(dāng)Hsp70表達被抑制時，ORF67蛋白錯誤折疊的比例明顯增加，導(dǎo)致病毒粒子裝配異常，病毒滴度顯著降低。這充分說明Hsp70在協(xié)助ORF67蛋白正確折疊方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，正確折疊的ORF67蛋白對于病毒粒子的正常裝配和感染能力至關(guān)重要。從分子機制角度來看，Hsp70通過其ATP酶活性，利用ATP水解提供的能量，改變自身構(gòu)象，從而幫助ORF67蛋白形成正確的三維結(jié)構(gòu)。家蠶肌動蛋白（Actin）與ORF67蛋白的相互作用在病毒感染過程中，對病毒粒子的運輸和定位起著重要作用。通過熒光標(biāo)記實驗觀察發(fā)現(xiàn)，在BmNPV感染的BmN細胞中，ORF67蛋白與Actin共定位在細胞內(nèi)的微絲結(jié)構(gòu)上。當(dāng)Actin的聚合或解聚過程被藥物干擾時，病毒粒子在細胞內(nèi)的運輸速度明顯減慢，無法準(zhǔn)確到達細胞核附近進行復(fù)制，導(dǎo)致病毒感染效率大幅下降。這表明ORF67蛋白借助Actin形成的細胞骨架網(wǎng)絡(luò)，實現(xiàn)了在細胞內(nèi)的高效運輸，進而順利到達病毒復(fù)制和裝配的關(guān)鍵部位。Actin的動態(tài)變化，如在細胞運動和形態(tài)改變過程中的重組，可能為ORF67蛋白和病毒粒子的運輸提供了必要的驅(qū)動力和路徑。家蠶核糖體蛋白L10（RPL10）與ORF67蛋白的相互作用對BmNPV感染過程中的蛋白質(zhì)合成有著深遠影響。在病毒感染過程中，RPL10與ORF67蛋白結(jié)合，共同參與病毒蛋白的合成過程。當(dāng)RPL10的功能被抑制時，病毒蛋白的合成量顯著減少，病毒的增殖受到明顯抑制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，RPL10與ORF67蛋白的結(jié)合，能夠增強核糖體與病毒mRNA的結(jié)合能力，提高翻譯效率。例如，在體外翻譯實驗中，加入RPL10和ORF67蛋白后，病毒蛋白的合成量明顯增加，這表明它們的相互作用在病毒蛋白合成過程中發(fā)揮著促進作用，對于病毒的大量增殖至關(guān)重要。六、ORF67基因的功能驗證6.1基因缺失型病毒的構(gòu)建與鑒定為深入探究ORF67基因在BmNPV中的具體功能，采用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建ORF67基因缺失型病毒。首先，以BmNPV的基因組DNA為模板，通過PCR擴增獲得兩端含有ORF67基因上下游同源臂的氯霉素抗性基因（Cm）表達盒。其中，上游同源臂長度為500bp，下游同源臂長度為450bp，確保同源臂能夠與BmNPV基因組中的相應(yīng)區(qū)域進行有效重組。將擴增得到的Cm表達盒克隆到pKD46質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pKD46-Cm。pKD46質(zhì)粒是Red重組系統(tǒng)的關(guān)鍵元件，它攜帶了Red重組酶基因，在阿拉伯糖的誘導(dǎo)下能夠表達Red重組酶，從而介導(dǎo)同源重組反應(yīng)。將重組質(zhì)粒pKD46-Cm轉(zhuǎn)化至含有BmNPV基因組的大腸桿菌DH10B細胞中，在含有阿拉伯糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)Red重組酶的表達。Red重組酶能夠識別并結(jié)合到ORF67基因上下游的同源臂上，介導(dǎo)同源重組反應(yīng)，使ORF67基因被Cm表達盒替換，從而構(gòu)建出ORF67基因缺失型的BmNPV基因組（ΔORF67-BmNPV）。通過抗性篩選和PCR鑒定，從大量的轉(zhuǎn)化子中篩選出陽性克隆。PCR鑒定時，設(shè)計特異性引物，分別以野生型BmNPV基因組和疑似陽性克隆的基因組為模板進行PCR擴增。其中，上游引物位于ORF67基因上游的非同源區(qū)域，下游引物位于Cm基因內(nèi)部。若擴增出的條帶大小與預(yù)期的含有Cm基因的片段大小相符（約1.5kb），則初步判定為陽性克隆。對篩選出的陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果顯示ORF67基因已被成功刪除，且Cm基因準(zhǔn)確插入到預(yù)期位置，表明ORF67基因缺失型的BmNPV基因組構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的ΔORF67-BmNPV基因組轉(zhuǎn)染到家蠶BmN細胞中，觀察細胞病變情況。與野生型BmNPV感染的細胞相比，ΔORF67-BmNPV感染的細胞病變出現(xiàn)時間明顯延遲，病變程度也較輕。在感染后48h，野生型BmNPV感染的細胞已出現(xiàn)大量細胞病變，細胞變圓、脫落；而ΔORF67-BmNPV感染的細胞僅有少量細胞出現(xiàn)病變，大部分細胞仍保持正常形態(tài)。通過噬斑實驗測定病毒滴度，結(jié)果顯示ΔORF67-BmNPV的病毒滴度相較于野生型BmNPV顯著降低，約為野生型病毒滴度的1/10。這些結(jié)果表明，ORF67基因的缺失對BmNPV的感染性和增殖能力產(chǎn)生了明顯影響，初步推測ORF67基因在BmNPV的感染和增殖過程中發(fā)揮著重要作用。6.2基因缺失對病毒感染性的影響將構(gòu)建成功的ORF67基因缺失型病毒（ΔORF67-BmNPV）和野生型BmNPV分別感染家蠶BmN細胞，觀察病毒感染后細胞病變的發(fā)生情況。感染后24h，野生型BmNPV感染的細胞開始出現(xiàn)輕微的病變，細胞形態(tài)逐漸變圓，部分細胞開始脫離培養(yǎng)瓶壁。而ΔORF67-BmNPV感染的細胞仍保持正常的形態(tài)，幾乎沒有明顯的病變跡象。隨著感染時間的延長，在感染后48h，野生型BmNPV感染的細胞病變程度進一步加重，大量細胞變圓、脫落，細胞培養(yǎng)上清中出現(xiàn)許多懸浮的細胞碎片。此時，ΔORF67-BmNPV感染的細胞雖有部分細胞出現(xiàn)病變，但病變細胞的數(shù)量明顯少于野生型感染組，大部分細胞仍貼壁生長，形態(tài)相對正常。到感染后72h，野生型BmNPV感染的細胞幾乎全部病變，細胞培養(yǎng)上清變得渾濁；而ΔORF67-BmNPV感染的細胞仍有部分保持相對完整，病變程度較輕。通過噬斑實驗測定兩種病毒的滴度，以評估病毒的感染性。將不同稀釋度的病毒液接種到長滿BmN細胞的96孔板中，培養(yǎng)一定時間后，用結(jié)晶紫染色，統(tǒng)計噬斑數(shù)量。結(jié)果顯示，野生型BmNPV的病毒滴度高達1×10?PFU/mL，而ΔORF67-BmNPV的病毒滴度僅為1×10?PFU/mL，約為野生型病毒滴度的1/10。這表明ORF67基因的缺失顯著降低了BmNPV對BmN細胞的感染能力，使得病毒在細胞內(nèi)的增殖受到明顯抑制。為了進一步探究ORF67基因缺失對病毒感染家蠶幼蟲的影響，選取健康的5齡家蠶幼蟲，隨機分為兩組，分別用野生型BmNPV和ΔORF67-BmNPV進行添食感染。感染后，每天觀察家蠶幼蟲的生長發(fā)育情況和發(fā)病癥狀。感染后第3天，野生型BmNPV感染組的部分家蠶幼蟲開始出現(xiàn)食欲減退、行動遲緩等癥狀，體表顏色逐漸變得暗淡。而ΔORF67-BmNPV感染組的家蠶幼蟲仍能正常進食，行動較為活躍，體表顏色正常。隨著感染時間的推移，在感染后第5天，野生型BmNPV感染組的家蠶幼蟲大量發(fā)病，出現(xiàn)典型的血液型膿病癥狀，如體色乳白、體軀腫脹、狂躁爬行等，部分幼蟲開始死亡。此時，ΔORF67-BmNPV感染組的家蠶幼蟲雖有少量出現(xiàn)輕微癥狀，但大部分仍能正常生長發(fā)育。到感染后第7天，野生型BmNPV感染組的家蠶幼蟲死亡率達到80%，而ΔORF67-BmNPV感染組的家蠶幼蟲死亡率僅為30%。通過對感染家蠶幼蟲體內(nèi)病毒載量的檢測，進一步驗證了ORF67基因缺失對病毒感染性的影響。在感染后不同時間點，采集家蠶幼蟲的血淋巴，提取病毒DNA，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測病毒基因組的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，在感染后第3天，野生型BmNPV感染組家蠶幼蟲血淋巴中的病毒基因組拷貝數(shù)達到1×10?copies/μL，而ΔORF67-BmNPV感染組的病毒基因組拷貝數(shù)僅為1×10?copies/μL。隨著感染時間的延長，野生型BmNPV感染組家蠶幼蟲血淋巴中的病毒基因組拷貝數(shù)持續(xù)上升，在感染后第5天達到1×101?copies/μL；而ΔORF67-BmNPV感染組的病毒基因組拷貝數(shù)雖也有所上升，但上升幅度明顯較小，在感染后第5天僅為1×10?copies/μL。這些結(jié)果表明，ORF67基因的缺失顯著降低了BmNPV對家蠶幼蟲的感染能力，抑制了病毒在幼蟲體內(nèi)的增殖，從而減輕了家蠶幼蟲的發(fā)病癥狀和死亡率。6.3基因拯救實驗為了進一步確認ORF67基因缺失所導(dǎo)致的病毒感染性和增殖能力變化是由該基因缺失直接引起的，而非其他隨機突變造成，開展基因拯救實驗。首先，構(gòu)建ORF67基因拯救載體。以野生型BmNPV基因組DNA為模板，通過PCR擴增獲得完整的ORF67基因及其上下游各500bp的調(diào)控序列。在擴增引物的兩端引入合適的限制性內(nèi)切酶識別位點，以便后續(xù)的克隆操作。將擴增得到的ORF67基因片段克隆到pFastBac1載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBac1-ORF67。對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序驗證，確保ORF67基因序列正確且無突變。將構(gòu)建好的ORF67基因拯救載體pFastBac1-ORF67與ORF67基因缺失型病毒（ΔORF67-BmNPV）的基因組共轉(zhuǎn)染到家蠶BmN細胞中。轉(zhuǎn)染時，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書的操作步驟進行。將適量的重組質(zhì)粒和ΔORF67-BmNPV基因組與脂質(zhì)體混合，室溫孵育15-20min，形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，然后將復(fù)合物加入到培養(yǎng)有BmN細胞的6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后48h，通過熒光顯微鏡觀察細胞中綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，以初步判斷轉(zhuǎn)染是否成功。同時，收集細胞培養(yǎng)上清，用于后續(xù)的病毒滴度測定和感染性分析。轉(zhuǎn)染后72h，收集細胞培養(yǎng)上清，采用噬斑實驗測定病毒滴度。將不同稀釋度的細胞培養(yǎng)上清接種到長滿BmN細胞的96孔板中，培養(yǎng)一定時間后，用結(jié)晶紫染色，統(tǒng)計噬斑數(shù)量。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染了pFastBac1-ORF67和ΔORF67-BmNPV基因組的細胞培養(yǎng)上清中，病毒滴度相較于單獨使用ΔORF67-BmNPV感染的細胞培養(yǎng)上清顯著提高，達到了1×10?PFU/mL，與野生型BmNPV的病毒滴度相當(dāng)。這表明通過導(dǎo)入ORF67基因，成功拯救了ORF67基因缺失型病毒的感染性和增殖能力，進一步證明了ORF67基因在BmNPV的感染和增殖過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。為了驗證拯救病毒的遺傳穩(wěn)定性，將拯救病毒在BmN細胞中連續(xù)傳代5次，每次傳代后測定病毒滴度。結(jié)果表明，在連續(xù)傳代過程中，拯救病毒的病毒滴度保持相對穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)明顯的下降或波動。這說明拯救病毒在細胞內(nèi)能夠穩(wěn)定地復(fù)制和傳代，ORF67基因的導(dǎo)入不僅恢復(fù)了病毒的感染性，還保證了病毒遺傳特性的穩(wěn)定性。通過基因拯救實驗，明確了ORF67基因缺失與BmNPV感染性和增殖能力下降之間的因果關(guān)系，為深入理解該基因在病毒生命周期中的功能提供了有力的實驗證據(jù)。七、討論7.1ORF67基因的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系ORF67基因的結(jié)構(gòu)對其編碼蛋白的功能及在病毒感染中的作用影響深遠。從基因序列特征來看，ORF67基因全長705bp，這種特定的長度決定了其編碼蛋白的氨基酸組成和序列，進而影響蛋白的空間結(jié)構(gòu)和功能。起始密碼子ATG和終止密碼子TAA界定了基因的編碼區(qū)域，確保了蛋白質(zhì)翻譯的準(zhǔn)確性和完整性。若起始密碼子發(fā)生突變，可能導(dǎo)致翻譯無法正常起始，使得病毒無法合成ORF67蛋白，從而影響病毒的正常生命活動。而終止密碼子的突變則可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯的異常終止或延長，產(chǎn)生錯誤折疊或功能異常的蛋白質(zhì)。在蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測方面，ORF67編碼蛋白主要由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲組成。α-螺旋賦予蛋白一定的穩(wěn)定性和剛性，其在蛋白中的比例和分布影響著蛋白的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。β-折疊通過氫鍵相互作用形成穩(wěn)定的片狀結(jié)構(gòu)，對維持蛋白的三維構(gòu)象至關(guān)重要。無規(guī)則卷曲則賦予蛋白柔韌性和可塑性，許多蛋白質(zhì)的功能活性區(qū)域就位于無規(guī)則卷曲部分。ORF67編碼蛋白中含有一個保守的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這與病毒核酸代謝過程密切相關(guān)。該結(jié)構(gòu)域可能通過與病毒DNA或RNA特異性結(jié)合，參與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等關(guān)鍵過程。當(dāng)該結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變時，可能會破壞其與核酸的結(jié)合能力，導(dǎo)致病毒核酸代謝異常，進而影響病毒的感染和增殖。從同源性分析結(jié)果來看，ORF67基因在不同桿狀病毒中具有一定的保守性。這種保守性反映了該基因在桿狀病毒進化過程中的重要性和功能的穩(wěn)定性。在關(guān)鍵區(qū)域的高度保守序列，暗示這些區(qū)域在病毒生命活動中承擔(dān)著相似且重要的功能。不同桿狀病毒中ORF67同源基因的差異，也可能導(dǎo)致其編碼蛋白在功能上的細微差別，這些差別可能與病毒的宿主特異性、感染特性等有關(guān)。通過對ORF67基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的深入分析，有助于我們從分子層面理解其在BmNPV感染過程中的作用機制，為進一步研究BmNPV的致病機理和開發(fā)防控策略提供理論基礎(chǔ)。7.2ORF67蛋白與宿主細胞的相互作用ORF67蛋白與宿主細胞的相互作用在BmNPV感染過程中起著舉足輕重的作用。通過Pull-down和免疫共沉淀實驗，成功鑒定出家蠶熱休克蛋白70（Hsp70）、肌動蛋白（Actin）和核糖體蛋白L10（RPL10）等與ORF67蛋白存在相互作用。這些互作蛋白在細胞內(nèi)各自承擔(dān)著關(guān)鍵的生理功能，它們與ORF67蛋白的相互作用，深刻影響著病毒的感染進程。Hsp70作為細胞內(nèi)重要的分子伴侶，在病毒感染時，其與ORF67蛋白的結(jié)合，有助于ORF67蛋白的正確折疊和穩(wěn)定。在正常細胞生理狀態(tài)下，Hsp70通過識別并結(jié)合新生肽鏈或錯誤折疊的蛋白質(zhì)，協(xié)助它們形成正確的三維結(jié)構(gòu)，維持蛋白質(zhì)的功能。在BmNPV感染過程中，ORF67蛋白作為病毒蛋白，其正確折疊對于病毒的復(fù)制和裝配至關(guān)重要。研究表明，當(dāng)Hsp70的功能被抑制時，ORF67蛋白錯誤折疊的比例顯著增加，導(dǎo)致病毒粒子裝配異常，病毒滴度明顯降低。這充分說明Hsp70與ORF67蛋白的相互作用，在保證病毒蛋白正常功能、促進病毒感染方面發(fā)揮著不可或缺的作用。Actin作為細胞骨架的核心成分，參與細胞的形態(tài)維持、運動和物質(zhì)運輸?shù)戎匾^程。在BmNPV感染過程中，ORF67蛋白與Actin相互作用，可能借助Actin形成的細胞骨架網(wǎng)絡(luò)，實現(xiàn)病毒粒子在細胞內(nèi)的高效運輸。通過熒光共定位實驗觀察到，ORF67蛋白與Actin在細胞內(nèi)呈現(xiàn)共定位現(xiàn)象，尤其在病毒感染后期，二者在細胞內(nèi)的分布更為緊密。當(dāng)Actin的聚合或解聚過程受到藥物干擾時，病毒粒子在細胞內(nèi)的運輸速度明顯減慢，無法準(zhǔn)確到達細胞核附近進行復(fù)制，從而導(dǎo)致病毒感染效率大幅下降。這表明ORF67蛋白與Actin的相互作用，對于病毒在細胞內(nèi)的運輸和定位至關(guān)重要，直接影響著病毒的感染和增殖。RPL10作為核糖體的組成蛋白，參與蛋白質(zhì)的合成過程。在BmNPV感染過程中，RPL10與ORF67蛋白的相互作用，對病毒蛋白的合成產(chǎn)生重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，RPL10與ORF67蛋白結(jié)合后，能夠增強核糖體與病毒mRNA的結(jié)合能力，提高翻譯效率，促進病毒蛋白的合成。當(dāng)RPL10的功能被抑制時，病毒蛋白的合成量顯著減少，病毒的增殖受到明顯抑制。這說明ORF67蛋白與RPL10的相互作用，在病毒蛋白合成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的促進作用，對于病毒的大量增殖和感染進程的推進具有重要意義。ORF67蛋白與這些宿主細胞蛋白的相互作用，揭示了病毒在感染過程中巧妙利用宿主細胞機制的策略。通過與宿主細胞內(nèi)關(guān)鍵蛋白的相互作用，ORF67蛋白能夠影響宿主細胞的正常生理功能，為病毒的感染、復(fù)制和增殖創(chuàng)造有利條件。這一發(fā)現(xiàn)不僅有助于深入理解BmNPV的致病機制，還為開發(fā)新型抗病毒策略提供了潛在的靶點。例如，針對ORF67蛋白與Hsp70、Actin、RPL10等的相互作用位點，設(shè)計特異性的抑制劑，阻斷它們之間的相互作用，從而干擾病毒的感染進程，為蠶桑業(yè)中BmNPV病害的防控提供新的思路和方法。7.3ORF67基因在病毒生命周期中的作用在病毒的吸附與侵入階段，ORF67基因雖未直接參與病毒與宿主細胞表面受體的識別和結(jié)合過程，但從基因缺失型病毒的感染實驗結(jié)果來看，ORF67基因的缺失導(dǎo)致病毒感染細胞的能力顯著下降。這暗示著ORF67蛋白可能通過間接方式，如影響病毒粒子表面蛋白的構(gòu)象或穩(wěn)定性，從而影響病毒與宿主細胞的初始接觸和侵入效率。在其他病毒研究中，一些基因編碼的蛋白能夠調(diào)節(jié)病毒表面蛋白的糖基化修飾，進而改變病毒與宿主細胞受體的結(jié)合能力，ORF67蛋白或許也存在類似的調(diào)節(jié)機制。進入病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄階段，ORF67基因發(fā)揮著更為關(guān)鍵的作用。從轉(zhuǎn)錄時相分析可知，在病毒感染后4h，ORF67基因開始轉(zhuǎn)錄，且在12-24h轉(zhuǎn)錄水平迅速上升。這表明該基因在病毒復(fù)制的關(guān)鍵時期被大量表達，極有可能參與了病毒DNA的復(fù)制和相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測中發(fā)現(xiàn)的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，推測ORF67蛋白可能與病毒DNA結(jié)合，協(xié)助病毒DNA聚合酶等相關(guān)酶類進行復(fù)制，或者參與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，促進病毒基因的轉(zhuǎn)錄。例如，在某些皰疹病毒中，特定的蛋白通過與病毒DNA的特定序列結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄因子，啟動病毒基因的轉(zhuǎn)錄，ORF67蛋白可能在BmNPV中扮演著類似的角色。在病毒的裝配與釋放階段，ORF67基因同樣不可或缺。ORF67蛋白與家蠶熱休克蛋白70（Hsp70）、肌動蛋白（Actin）和核糖體蛋白L10（RPL10）等宿主細胞蛋白的相互作用，對病毒的裝配和釋放過程產(chǎn)生重要影響。Hsp70協(xié)助ORF67蛋白正確折疊，確保其在病毒裝配過程中發(fā)揮正常功能。Actin參與細胞骨架的形成，ORF67蛋白與Actin的相互作用，可能為病毒粒子的運輸和裝配提供了必要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和動力支持。RPL10參與蛋白質(zhì)合成，其與ORF67蛋白的相互作用，保證了病毒裝配所需蛋白質(zhì)的正常合成。當(dāng)ORF67基因缺失時，病毒粒子的裝配出現(xiàn)異常，病毒滴度顯著降低，釋放到細胞外的病毒數(shù)量減少，這充分說明ORF67基因在病毒裝配和釋放過程中起著關(guān)鍵作用。ORF67基因在BmNPV的整個生命周期中，通過多種方式參與病毒的感染、復(fù)制、裝配和釋放等關(guān)鍵過程。它與病毒自身的核酸代謝以及宿主細胞內(nèi)的多種生理過程相互關(guān)聯(lián)，共同影響著病毒的生存和傳播。深入研究ORF67基因在病毒生命周期中的作用機制，對于全面理解BmNPV的致病機理和開發(fā)有效的防控策略具有重要意義。7.4研究的創(chuàng)新點與不足本研究在BmNPV的ORF67基因研究領(lǐng)域具有一定的創(chuàng)新之處。首次對ORF67基因進行了全面且系統(tǒng)的研究，涵蓋了從基因的生物信息學(xué)分析、表達特性研究，到蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析以及基因功能驗證等多個關(guān)鍵層面。在研究方法上，創(chuàng)新性地運用了多種先進技術(shù)，如通過Pull-down和免疫共沉淀技術(shù)相結(jié)合，精準(zhǔn)地篩選和驗證了與ORF67蛋白相互作用的宿主細胞蛋白。這種多技術(shù)聯(lián)用的方式，相較于傳統(tǒng)的單一研究方法，能夠更全面、準(zhǔn)確地揭示蛋白之間的相互作用關(guān)系，為深入理解ORF67蛋白在病毒感染過程中的作用機制提供了有力的技術(shù)支持。在基因功能驗證方面，采用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建ORF67基因缺失型病毒，并進行基因拯救實驗，明確了ORF67基因在BmNPV感染和增殖過程中的關(guān)鍵作用。這種從基因水平直接驗證其功能的方法，為研究BmNPV其他未知基因的功能提供了可借鑒的思路和方法。研究也存在一些不足之處。在蛋白互作研究中，雖然鑒定出了幾種與ORF67蛋白相互作用的宿主細胞蛋白，但對于它們之間相互作用的具體分子機制，如相互作用的位點、結(jié)合方式以及這種相互作用如何影響病毒和宿主細胞的生理過程等方面，還缺乏深入的研究。在基因功能驗證方面，雖然明確了ORF67基因?qū)mNPV感染性和增