時空轉錄組解析乳腺癌淋巴結轉移與免疫調控相關性的進展2026目前，乳腺癌已經成為女性群體中發(fā)病率最高的惡性腫瘤［1］，區(qū)域淋巴結轉移（lymphnodemetastasis，LNM）狀況是其預后預測的重要指標。腫瘤演進與免疫浸潤是相互影響的動態(tài)過程，淋巴結作為免疫系統(tǒng)的一部分，具有活躍的抗腫瘤免疫功能［2］。腫瘤細胞的侵襲和增殖使局部免疫反應失效，從而破壞正常淋巴結的免疫功能，使受侵襲的淋巴結成為進一步轉移的起點［3］。目前的研究未能對有關乳腺癌的LNM免疫微環(huán)境進行深入探索，尚缺乏為臨床決策提供預測信息的相關標準的臨床標志物。近年來，隨著單細胞測序、空間轉錄組、質譜流式細胞術等先進技術的更迭，乳腺癌腫瘤微環(huán)境（tumormicroenvironment，TME）中多種免疫細胞的單細胞譜揭示了可能成為潛在免疫治療靶點的特定免疫細胞亞群［4］。本文對生物信息技術革新下乳腺癌的LNM與免疫調控的相關性進行綜述，以期為優(yōu)化乳腺癌區(qū)域淋巴結精準診斷與個體化處理提供理論依據(jù)（表1）。1、T淋巴細胞群體T淋巴細胞（簡稱T細胞）克隆擴增和類型轉換是免疫應答和免疫激活的表現(xiàn)，在特定抗原的刺激下，T細胞在淋巴結中活化并隨后遷移至腫瘤部位發(fā)揮作用。T細胞受體（T-cellreceptor，TCR）是存在于T細胞表面的蛋白質復合物，決定了T細胞的抗原特異性。具有相同或相似序列TCR的T細胞群體發(fā)生增殖，成為對腫瘤具有反應性的T細胞，其對腫瘤細胞有直接的殺傷作用。1.1

TCR克隆性與淋巴結免疫響應的動態(tài)演變Mao等［5］的研究通過單細胞T細胞受體（single-cellT-cellreceptor，scTCR）測序追蹤特定T細胞克隆在不同組織中的分布模式和活性狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)轉移淋巴結（metastaticlymphnode，MetLN）中的CD8+T細胞、CD4+T細胞與腫瘤中的T細胞群體的TCR克隆高度一致。免疫系統(tǒng)通過識別腫瘤抗原并啟動特異性免疫應答，此過程動員了特定的T細胞克隆在原發(fā)灶和引流淋巴結之間共享。然而，這種高度一致性并非預示著較強的抗腫瘤免疫反應，而是標志著一場動態(tài)演變的開始，其最終結局往往是免疫逃逸。這一現(xiàn)象表明，被動員的T細胞具備識別腫瘤細胞表面抗原并與之相互作用的潛力。相比之下，正常淋巴結中的T細胞亞群與原發(fā)腫瘤的相似性較低，提示其在腫瘤特異性免疫應答中較差的免疫響應能力。因此，基于TCR測序的檢測通過對不同組織來源中共存的TCR克隆類型能夠區(qū)分腫瘤特異性T細胞與旁觀者T細胞，可為適應不同轉移狀態(tài)下的T細胞受體嵌合T細胞免疫（T-cellreceptorchimericantigenreceptorT-cell，TCR-T）治療提供新思路。1.2

“前轉移微環(huán)境”（pre-metastaticniche，PMN）的形成與免疫監(jiān)視功能的“讓渡”淋巴結在腫瘤免疫中的角色是動態(tài)變化的，其功能可從抗腫瘤免疫中心轉變?yōu)榇俎D移的“避難所”，這一轉變并非在腫瘤細胞到達后才發(fā)生，而是在一個被稱為PMN的階段就已啟動。在腫瘤細胞浸潤淋巴結前，原發(fā)腫瘤便可通過分泌可溶性因子和釋放細胞外囊泡等方式遠程“改造”引流淋巴結。這一過程導致了免疫監(jiān)視功能的“讓渡”，通過免疫集群和代謝環(huán)境的改變塑造PMN。乳腺癌、黑色素瘤和宮頸癌中，PMN中CD4+/CD8+

T細胞比例的變化顯著且通常伴隨調節(jié)性T細胞（regulatoryTcell，Treg）比率的升高，而在腫瘤細胞轉移至淋巴結后這種改變更為明顯［6-8］。因此，當具有高度克隆一致性的腫瘤特異性T細胞到達淋巴結時，淋巴結此時已從一個免疫激活的指揮中心，轉變?yōu)橐粋€促進腫瘤生存、生長乃至進一步播散的“庇護所”。1.3

MetLN中T細胞亞群的重塑與功能耗竭目前，單細胞轉錄組測序（singlecellRNAtranscriptome，scRNA-seq）已經能夠全面表征腫瘤浸潤免疫細胞的基本特性，并且已經在TME中確定了廣譜的T細胞亞群［9-10］。然而，T細胞群體在MetLN中經歷了深刻的構成重塑和功能失調，CD8+T細胞和CD4+T細胞在乳腺癌原發(fā)腫瘤中的克隆擴增明顯多于MetLN［11］，且MetLN中的T細胞在功能上受到抑制，表現(xiàn)出免疫活化基因的下調。單細胞質譜流式細胞術（masscytometry，MC）能夠精準捕捉不同表型免疫細胞亞群的變化和功能失調。有研究報道，通過CyTOF分析來自不同樣本的免疫細胞表面和功能性標志物［12］，結果發(fā)現(xiàn)，MetLN中的CD8+T和Treg細胞比例顯著增加，而CD4+T細胞的比例減少。在腫瘤進展的晚期，CD4+T細胞的優(yōu)勢亞群從早期起抗腫瘤作用的Th1細胞，轉變?yōu)榇龠M腫瘤的Treg和Th17細胞。T細胞免疫受體含免疫球蛋白和ITIM結構域（TcellimmunoreceptorwithIgandITIMdomain，TIGIT）且程序性死亡受體-1（programmeddeath-1，PD-1）高表達，這意味著長期的抗原刺激使T細胞逐漸失去對腫瘤細胞的有效殺傷功能，而PD-1/PD-L1抑制劑的免疫療法正是通過阻斷這些抑制信號來恢復T細胞的功能，促進它們重新發(fā)揮抗腫瘤作用。Li等［13］從FVB/NJ小鼠和MMTV-PyMT小鼠的淋巴結中也觀察到CD4+T細胞和CD8+T細胞的比例減少，而Treg細胞的比例顯著增加。然而，該研究發(fā)現(xiàn)記憶T細胞的比例顯著減少，可能與研究的樣本來源差異有關?；蚣献儺惙治觯℅eneSetVariationAnalysis，GSVA）進一步顯示，CD4+T細胞和CD8+T細胞的血管生成基因集顯著上調，表明其可能促進淋巴結中的血管生成，或為腫瘤細胞的營養(yǎng)供給和轉移提供支持。不同于CD8+T細胞的快速克隆擴增［14］，研究發(fā)現(xiàn)MetLN中的CD4+T細胞的TCR更具多樣性［5］，Treg和Th1/Th17的分化極具腫瘤特異性，作為腫瘤免疫的研究熱點，二者的免疫平衡側面揭示了淋巴結在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中承擔的雙重角色。然而，轉化生長因子β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）超家族在乳腺癌LNM中的濃度依賴性誘導作用尚無確切定論。包括乳腺癌和卵巢癌在內的多種腫瘤出現(xiàn)Treg數(shù)量增加［15-16］，作為Treg的關鍵轉錄因子標志，嗜酸性粒細胞和叉頭框蛋白P3（forkheadboxP3，F(xiàn)oxP3）相關轉錄控制基因集在乳腺癌小鼠模型的淋巴結中顯著上調，而干擾素α反應、干擾素γ反應、同種移植排斥反應和炎癥反應等信號轉導通路顯著下調，顯示出淋巴結中受抑制的抗腫瘤免疫反應［13］。免疫無能是建立免疫耐受的關鍵機制，特指對抗原特異性識別功能降低的T細胞無應答狀態(tài)。無能T細胞可以通過誘導Treg生成實現(xiàn)免疫抑制微環(huán)境的構建［17］，Treg則通過抑制效應T細胞的激活和擴增促進腫瘤進展和維持親腫瘤環(huán)境。Treg在循環(huán)和組織駐留庫中存在分子和功能異質性［18］，表達抑制性表型（HELIOS、CD25和CD39）的Treg隨著淋巴結受到侵襲而顯著擴增（P＜0.05）［19］，腫瘤細胞浸潤主要誘導Th1樣（表達CXCR3和T-bet）Treg，其擴增頻率與效應Th1顯著相關（P=0.008），暗示二者相似的遷移和轉錄適應過程。研究最終通過生存分析評估出Treg中最具臨床相關性的差異表達基因，Treg的CD80/FoxP3mRNA比值與乳腺癌患者較差的無病生存期（disease-freesurvival，DFS）和總生存期（overallsurvival，OS）呈顯著正相關（P=0.032），其生存關聯(lián)并未在動物模型中得到有效驗證。1.4

新興免疫靶點的臨床意義與展望值得注意的是，Jiao等［20］在乳腺癌的原發(fā)腫瘤中發(fā)現(xiàn)約有10.9%的擴增T細胞克隆并未在淋巴結中出現(xiàn)，其高表達的CXC族趨化因子受體6（CXCchemokinereceptor6，CXCR6）和整聯(lián)蛋白αE亞基（integrinsubunitalphaE，ITGAE）介導T細胞組織駐留，提示這部分T細胞可以獨立于前哨淋巴結（sentinellymphnode，SLN）而受到腫瘤內部的三級淋巴結構（tertiarylymphoidstructure，TLS）特異性誘導，這些發(fā)現(xiàn)為理解T細胞行為和開發(fā)新療法提供了重要線索。其中，CXCR6作為組織駐留記憶T細胞（tissue-residentmemoryTcell，TRM）的核心標志物，其高表達通常與乳腺癌等多種癌癥的更有利預后及更好的免疫治療響應相關，有望成為預測免疫檢查點抑制劑（immunecheckpointinhibitor，ICI）療效的生物標志物。因此，增強CXCR6-CXCL16軸的功能，例如通過基因工程手段使CAR-T細胞表達CXCR6，可顯著增強其在腫瘤內的積聚，為提高細胞免疫療法的效果提供了新方向。此外，另一關鍵分子——自然殺傷細胞組2（naturalkillergroup2，NKG2A）與CD39一樣是表達在活化T細胞上的抑制性受體，其編碼基因的高水平共表達提示腫瘤內部特異性擴展的T細胞更具功能障礙。NKG2A作為一種新興的關鍵共抑制性免疫檢查點，其在TME中的表達升高與細胞功能耗竭及患者不良預后密切相關。因此，阻斷NKG2A-HLA-E信號轉導通路具有巨大的治療潛力。靶向NKG2A的單克隆抗體（如monalizumab）能夠有效地解除對NK細胞和CD8+T細胞的雙重抑制，其單用或與PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合使用的策略，有望為對免疫治療耐藥的患者提供新的選擇。2、B細胞群體B細胞是免疫系統(tǒng)的核心組成部分，其在腫瘤免疫中的作用極為復雜且具有雙重性，既可抑制腫瘤生長，也可促進其進展。其最終效應高度依賴于B細胞的亞群表型、分化狀態(tài)、空間定位以及與TME中其他細胞的相互作用［21-22］。2.1

TLS中的免疫中樞在TME中，B細胞最主要的抗腫瘤功能體現(xiàn)在其作為TLS的關鍵組織者和參與者。發(fā)揮抗腫瘤作用的B細胞主要包括初始B細胞、記憶B細胞和漿細胞，它們聚集在TLS的B細胞濾泡中，與濾泡輔助性T細胞（follicularhelperTcell，Tfh）緊密互作，形成生發(fā)中心樣結構。在TLS內部，B細胞通過多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用。首先，作為高效的抗原呈遞細胞，B細胞能夠呈遞腫瘤相關抗原，激活T細胞。其次，在Tfh細胞的輔助下，B細胞分化為能夠分泌高親和力抗腫瘤抗體的漿細胞，通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用等機制清除腫瘤細胞。此外，B細胞還能分泌促炎細胞因子和趨化因子，放大抗腫瘤免疫的效果。TLS的存在與成熟度是乳腺癌等多種實體瘤患者良好預后及對ICI響應更佳的標志。腫瘤內高密度的B細胞浸潤預示著患者對ICI治療有更高的響應率。未來的治療策略可以致力于在腫瘤內誘導TLS的形成，以“點燃”免疫“冷”腫瘤。2.2

B細胞的促腫瘤機制：調節(jié)性B細胞（regulatoryBcell，Breg）介導的免疫抑制

B細胞的特定亞群，尤其是Breg，在腫瘤進展中扮演了“幫兇”的角色。一類被稱為“腫瘤馴化的B細胞”在乳腺癌小鼠淋巴結中高度積累，表現(xiàn)出顯著的促轉移特性。Breg主要通過分泌IL-10、IL-35和TGF-β等抑制性細胞因子來發(fā)揮功能，這些細胞因子可以直接抑制細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxicTlymphocyte，CTL）和NK細胞的功能，或通過誘導Treg的擴增來建立免疫抑制微環(huán)境。Liu等［23］發(fā)現(xiàn)腫瘤馴化的B細胞在乳腺癌小鼠淋巴結中高度積累，這些B細胞通過產生靶向熱激蛋白A家族成員4（heatshockproteinfamilyAmember4，HSPA4）的IgG抗體觸發(fā)腫瘤細胞中的Src/NF-κB信號轉導通路，其下游的CXCR4/SDF1α軸能夠顯著增強腫瘤細胞向淋巴結的遷移和侵襲，這與Ganti等［24］在B16-F10黑色素瘤模型中的發(fā)現(xiàn)一致，T2-MZP型（B220+、IgM高、CD21高、CD23+）Breg在淋巴結中優(yōu)先積累且促進腫瘤生長。腫瘤浸潤B細胞（tumorinfiltratingBcell，TIB）的組成和其在TME中的異質性功能已得到充分闡述［24-26］，TIB在免疫應答中的功能包括但不限于細胞因子產生、抗原呈遞與共刺激以及在淋巴組織發(fā)育過程中的貢獻。在TME中，B細胞與Tfh細胞形成TLS，提示乳腺癌的良好預后，其存在與化療及免疫檢查點治療的效果有關［24］。多項研究證實了腫瘤浸潤Breg產生的IL-10、IL-35和TGF-β等通過誘導Treg積累或抑制CTL的功能協(xié)助塑造免疫抑制微環(huán)境［26-28］。在另一項研究中，Liu等［13］在乳腺癌的小鼠模型中觀察到淋巴結邊緣區(qū)B細胞的減少，這與之前的研究結論相悖［23］。在此項研究中，與B細胞相關的血管生成信號轉導通路顯著上調，干擾素-γ、PI3K-AKT-mTOR、糖酵解及腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α）信號轉導通路通過NF-κB信號顯著下調，說明這部分B細胞在淋巴結經歷重編程后，同樣表現(xiàn)出向抑制性免疫表型的轉變以及增殖能力的減弱。肌細胞增強因子2（myocyteenhancerfactor2CC，Mef2c）能夠在應激條件下調節(jié)B細胞的產生，而編碼布魯頓酪氨酸激酶抑制因子的SH3結構域結合蛋白5（domainbindingprotein5，SH3BP5）可能抑制B細胞的發(fā)育或成熟，二者均表現(xiàn)出顯著的差異表達。2.3

B細胞在MetLN中的狀態(tài)與臨床轉化B細胞在MetLN的分群聚類變化不及T細胞顯著。Xu等［29］將原發(fā)腫瘤和MetLN的B細胞聚類為初始B細胞和記憶B細胞，不同于活躍的增殖的幼稚B細胞群體，細胞代謝標志物MKI-67在記憶B細胞中的低表達表明其處于較低的細胞分裂和增殖狀態(tài)，與其長期存活并在二次免疫反應中迅速產生抗體的功能特性相符。免疫球蛋白編碼基因IGHA和IGHG，致癌轉錄因子基因KLF-6和螯合磷脂酰肌醇4,5-二磷酸的蛋白質的編碼基因MARCKS，同時在幼稚和記憶B細胞中高度表達，表明MetLN中免疫細胞增殖活躍且運動性增加。有研究［6］通過識別Ig相關編碼基因表達，將4例乳腺癌患者的原發(fā)腫瘤、鄰近正常組織和腋窩淋巴結中觀測到的B細胞進行聚類，這些B細胞亞群更多表現(xiàn)為“耗竭狀態(tài)”，且沒有表現(xiàn)出細胞亞群占比與預后的顯著相關，但通過Ig相關編碼基因表達可以預測患者的生存，這可能暗示B細胞對抗腫瘤免疫集群的貢獻［30］并不取決于細胞豐度，而是與其特異性抗原的表達水平有關。此外，Huang等［31］首次揭示了一簇共表達CD24和CD27的Breg（CD24hiCD27+

Breg）在MetLN中的關鍵作用，CD24hiCD27+

Breg通過分泌白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和TNF-α等，促進乳腺癌腫瘤細胞的多藥耐藥性和干細胞樣特性，乳腺癌腫瘤細胞又通過CD40L和PD-L1信號轉導通路反向激活CD24hiCD27+

Breg，當這種正反饋環(huán)路被PD-L1阻斷時，小鼠荷瘤模型中MetLN的病理學完全緩解（pathologicalcompleteresponse，pCR）率顯著提高，為乳腺癌患者的免疫聯(lián)合治療策略提供了重要依據(jù)。3、巨噬細胞群體有研究［32］報道，LNM的腫瘤細胞可以清除特異性表達CD169的巨噬細胞，這種細胞缺失的出現(xiàn)可能先于CD4+T細胞、CD8+T細胞的減少或C反應蛋白系統(tǒng)性炎癥的變化等其他免疫失調表現(xiàn)，且隨著乳腺癌進展而進一步加劇。來自58例患者的474份切片的組織學分析顯示，CD169+巨噬細胞的逐漸減少與淋巴結的病理學分期相關（P=0.022），與腫瘤大小及轉移腫瘤的體積無關，這提示靶向CD169+巨噬細胞及相關信號轉導通路，維持其在淋巴結中的分布密度及功能活性或有助于增強抗腫瘤免疫治療的效果，但目前的研究未能對CD169+巨噬細胞減少的潛在機制及其與其他細胞群體的相互作用進行深入探討。造血功能失調可顯著增加腫瘤患者外周單核細胞數(shù)量，隨后這些髓源單核細胞在TME中募集，受到腫瘤和TME來源的信號的作用發(fā)生極化并進行功能重編程，促進腫瘤細胞的增殖和轉移［33-34］。腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associatedmacrophage，TAM）是TME免疫浸潤的主要組成部分，常見的分類是根據(jù)生物標志物將其分為促炎的M1型和抗炎的M2型，前者具有較強的抗原呈遞功能，能夠激活Th1型免疫反應，發(fā)揮促炎和抗腫瘤作用；后者則表現(xiàn)出免疫抑制特性，傾向于支持腫瘤進展。M2型巨噬細胞數(shù)量的增加與LNM、腫瘤體積增大、腫瘤細胞分化差以及乳腺癌復發(fā)風險升高有顯著相關性［35］。在健康組織中，巨噬細胞能夠有效地處理和呈遞抗原，激活T細胞反應，來自同一乳腺癌患者的匹配樣本（腫瘤組織、MetLN、正常淋巴結）的比較顯示，TAM同樣在抗原處理與呈遞的信號轉導通路中顯著富集（P＜0.001），相關的抗原呈遞基因（HLA-A/B/C/E）在TAM中高表達［36］。對比乳腺癌的原發(fā)腫瘤與MetLN，TAM分布并無明顯比例差異，但位于原發(fā)腫瘤的巨噬細胞表現(xiàn)出更高的活化標志［干擾素誘導蛋白44樣（interferon-inducedprotein44-like，IFI44L）和IFI27］，提示原發(fā)腫瘤存在更加明顯的免疫激活［11］。MetLN中以CD14、CD68、CD16a表達為特征的巨噬細胞能顯著上調免疫功能障礙生物標志物［T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域蛋白3（T-cellimmunoglobulinandmucindomain-containingprotein3，TIM-3）］的表達［29］，其誘導的T細胞耗竭和免疫耐受將進一步促使腫瘤實現(xiàn)免疫逃逸，PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合靶向TIM-3的單克隆抗體可能逆轉T細胞耗竭，提升免疫治療的效果。有研究［37］報道，在浸潤性乳腺癌中，TAM亞群在LNM中發(fā)揮關鍵作用，血管內皮生長因子C（vascularendothelialgrowthfactorC，VEGF-C）表達的TAM促進乳腺癌淋巴管生成和淋巴血管侵襲，Ⅰ型跨膜糖蛋白平足蛋白（podoplanin，PDPN）參與TAM亞群及淋巴內皮細胞的附著，與乳腺癌患者的淋巴結及遠端器官轉移的發(fā)生率高度相關［38］。TME促使TAM極化為M2型，使其失去有效的抗原呈遞能力，甚至可能促進T細胞的耗竭和功能障礙。Shen等［39］對GEO數(shù)據(jù)庫中1例luminalB型乳腺癌患者的單細胞數(shù)據(jù)進行分析，證實MetLN中顯著富集M2型巨噬細胞，其在免疫激活和細胞遷移中的相關基因（TREM2、MMP-14、C5AR1）的表達水平上調，且顯著高于正常淋巴結中的巨噬細胞。未來研究可嘗試在動物模型中通過去除或重編程M2巨噬細胞提升抗腫瘤免疫效能，為改善乳腺癌患者的預后提供線索。4、樹突狀細胞（dendriticcell，DC）群體DC是先天免疫細胞中的主要抗原呈遞細胞，在細胞免疫的啟動中起著關鍵作用。在腫瘤免疫中，DC負責將腫瘤抗原攜帶到淋巴結，從而啟動腫瘤特異性免疫反應，并通過重新激活腫瘤部位的T細胞來維持抗腫瘤作用［40］，當TME缺乏DC浸潤時，T細胞的抗腫瘤活性顯著減弱［41］。圍繞乳腺癌免疫微環(huán)境的研究更多來自免疫組織化學檢測提供的證據(jù)。已有研究［8］證明，DC可能參與乳腺癌的LNM過程，與正常淋巴結相比，轉移的SLN中細胞因子的產生減少，DC則以IL-8、IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10水平降低為主。漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoiddendriticcell，pDC）的高浸潤可能通過TNF-α介導的NF-κB激活促進乳腺癌組織中CXCR4的表達