小反芻獸疫（PPR）ELISA及PCR診斷方法的構建與驗證研究一、引言1.1研究背景與意義小反芻獸疫（Pestedespetitsruminants，PPR），又被稱作羊瘟，是由小反芻獸疫病毒（PPRV）引發(fā)的一種急性、烈性、接觸性傳染病。其主要感染對象為山羊、綿羊等小反芻動物，臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、口炎、腹瀉以及肺炎等。PPR不僅具有極高的發(fā)病率，在嚴重情況下，病死率甚至能高達100%，給全球養(yǎng)羊業(yè)帶來了沉重打擊，造成了巨大的經(jīng)濟損失。自1942年PPR在科特迪瓦首次被發(fā)現(xiàn)以來，其傳播范圍不斷擴大，逐漸在非洲、亞洲等多個地區(qū)呈地方性流行態(tài)勢。在非洲，從最初的西非地區(qū)，如塞內加爾、加納、貝寧等國家的出現(xiàn)，到后來向非洲其他地區(qū)的擴散，包括東非的蘇丹、肯尼亞、埃塞俄比亞和烏干達，以及南非的剛果民主共和國、坦桑尼亞、安哥拉和科摩羅等國家，疫情不斷蔓延。在亞洲，印度于1987年首次報道南部地區(qū)暴發(fā)PPR，隨后在印度次大陸地區(qū)逐漸流行開來，此外，孟加拉國、伊朗、巴基斯坦、以色列、約旦、沙特阿拉伯等國家也相繼出現(xiàn)PPR疫情。近年來，PPR的傳播范圍仍在持續(xù)擴大，甚至有向歐洲蔓延的趨勢，如希臘中部就曾暴發(fā)羊瘟，逾10萬只羊待檢測，給當?shù)氐酿B(yǎng)羊業(yè)帶來了極大的沖擊。我國于2007年7月在西藏自治區(qū)革吉縣、日土縣、改則縣相繼發(fā)生小反芻獸疫疫情，這一事件對我國的養(yǎng)羊業(yè)安全構成了嚴重威脅。此后，國內部分地區(qū)也陸續(xù)有PPR疫情的報道。隨著我國養(yǎng)羊業(yè)的不斷發(fā)展，羊的養(yǎng)殖數(shù)量持續(xù)增加，養(yǎng)殖規(guī)模日益擴大，PPR的潛在威脅也愈發(fā)顯著。一旦PPR在我國大規(guī)模暴發(fā)，將會對養(yǎng)羊業(yè)造成毀滅性的打擊。這不僅會導致大量羊只死亡，使養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟利益受損，還會影響羊肉、羊毛等羊產(chǎn)品的供應，進而對我國的畜牧業(yè)經(jīng)濟和食品安全產(chǎn)生不利影響。除了對養(yǎng)羊業(yè)的影響，PPR對野生動物也存在潛在威脅。許多野生小反芻動物，如野山羊、羚羊等，同樣對PPR病毒易感。一旦野生動物感染PPR，可能會對生態(tài)平衡造成破壞，影響生物多樣性。為了有效防控PPR，建立準確、快速、靈敏的診斷方法至關重要。傳統(tǒng)的診斷方法，如臨床癥狀觀察、病理剖檢等，雖然在一定程度上能夠對PPR進行初步診斷，但這些方法存在著主觀性強、準確性低、無法早期診斷等缺點。而血清學診斷方法，如瓊脂凝膠免疫擴散（AGID）、對流免疫電泳（CIE）和免疫捕獲ELISA等常規(guī)技術，大多存在費時費力、靈敏度不高、不能特異性鑒別診斷PPR等問題。因此，開發(fā)新型的診斷方法成為了當前PPR防控工作的關鍵。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和聚合酶鏈式反應（PCR）技術作為現(xiàn)代生物學領域中常用的檢測方法，具有靈敏度高、特異性強、檢測速度快等優(yōu)點，在PPR的診斷中展現(xiàn)出了巨大的潛力。ELISA技術可以通過檢測動物血清中的抗體或抗原，快速判斷動物是否感染PPR；PCR技術則能夠直接擴增PPR病毒的核酸，實現(xiàn)對病毒的快速檢測和鑒定。通過建立PPR的ELISA及PCR診斷方法，可以實現(xiàn)對PPR的早期診斷和準確監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)疫情，采取有效的防控措施，從而降低PPR的傳播風險，減少經(jīng)濟損失，保護養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展和野生動物的生存安全。1.2小反芻獸疫概述小反芻獸疫病毒（PPRV）屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbillivirus），與牛瘟病毒（RPV）、犬瘟熱病毒（CDV）、海豹瘟病毒（PDV）、海豚瘟病毒（DMV）以及牛麻疹病毒和人麻疹病毒等同屬該屬成員。PPRV粒子呈多形性，通常表現(xiàn)為粗糙的球形，其病毒顆粒相較于牛瘟病毒更大。該病毒的核衣殼為螺旋中空桿狀，且具有特征性的亞單位，同時帶有囊膜。PPRV的基因組為單股負鏈RNA，大小約為15948nt。在其基因組中，3′末端是基因組啟動子區(qū)，5′末端為反向基因組啟動子區(qū)，6個基因按照3′-N-P-M-F-H-L-5′的順序排列，依次編碼6個結構蛋白，分別是核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝蛋白（H）和大蛋白（L）。此外，P基因還編碼兩個非結構蛋白C和V。N蛋白能夠自我組裝形成核衣殼粒子，并且與P蛋白和L蛋白協(xié)同作用，共同調控病毒RNA的轉錄和復制過程。同時，N蛋白是一種保守性較強的免疫源性蛋白，當機體受到病毒感染時，它能夠引發(fā)強烈的抗體反應，并且N蛋白上含有T細胞表位，在細胞免疫方面發(fā)揮著重要作用。依據(jù)N或F基因片段核苷酸序列進行系統(tǒng)進化分析，結果顯示PPRV可分為4個基因系。其中，Ⅰ系和Ⅱ系主要分布于西非地區(qū)；Ⅲ系病毒則在東非、阿拉伯（阿曼和也門）及印度南部地區(qū)流行；Ⅳ系僅在中東、阿拉伯和印度次大陸被發(fā)現(xiàn)。小反芻獸疫主要感染山羊、綿羊、美國白尾鹿等小反芻動物，在非洲西部、中部以及亞洲的部分地區(qū)呈流行態(tài)勢。在疫區(qū)，該病通常為零星發(fā)生，但當易感動物數(shù)量增加時，就可能引發(fā)大規(guī)模流行。其主要傳染源為患病動物和隱性感染動物，處于亞臨診型的病羊由于不易被察覺，因而具有更大的危險性。病畜的分泌物和排泄物中均含有大量病毒，主要通過直接接觸傳染，例如健康羊與病羊的直接接觸，或者接觸被病羊分泌物、排泄物污染的物品等。此外，也可通過間接接觸傳播，如空氣傳播，病毒可以通過空氣中的飛沫、塵埃進行傳播，尤其是在羊群密度高、通風不良的環(huán)境中，空氣傳播更容易導致病毒的快速擴散。同時，被污染的飼料、飲水等也可能成為傳播媒介，使健康動物感染病毒。雖然豬和牛也可感染PPRV，但通常不會出現(xiàn)臨床癥狀，也不能將該病傳播給其他動物，因此豬和牛在小反芻獸疫的流行病學中意義不大。小反芻獸疫一年四季均可發(fā)生，但在寒冷季節(jié)更為多發(fā)，這可能與寒冷季節(jié)羊群的飼養(yǎng)管理條件、動物自身免疫力以及病毒在環(huán)境中的存活能力等因素有關。在寒冷季節(jié)，羊群往往飼養(yǎng)密度較大，通風條件相對較差，這有利于病毒的傳播；同時，動物在寒冷環(huán)境下免疫力可能會下降，更容易感染病毒。其潛伏期一般為4-6天，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）《陸生動物衛(wèi)生法典》規(guī)定最長潛伏期為21天。在潛伏期內，感染動物雖然可能沒有明顯的臨床癥狀，但已經(jīng)能夠排出病毒，成為傳染源，這增加了疾病防控的難度。小反芻獸疫的臨床癥狀表現(xiàn)較為明顯。病羊初期通常會出現(xiàn)食欲減退的癥狀，對平時喜愛的飼料不再感興趣，采食量明顯下降。同時，精神沉郁，表現(xiàn)為行動遲緩，不愿活動，常獨自呆立，對外界刺激反應遲鈍。呼吸也會加快，呼吸頻率明顯高于正常水平，這是由于病毒感染導致呼吸系統(tǒng)受到影響，機體需要通過加快呼吸來滿足氧氣需求。隨著病情的發(fā)展，病羊體溫會迅速升高，可達到40-42℃，并持續(xù)3-5天。高熱會使病羊代謝紊亂，進一步加重病情。同時，會伴有咳嗽癥狀，咳嗽程度輕重不一，從偶爾的輕咳到頻繁的劇烈咳嗽都有。流鼻涕也是常見癥狀，鼻涕最初可能為清涕，隨著病情加重，會變?yōu)檎骋耗撔员锹Ｑ鄯置谖镌龆?，可導致眼睛紅腫、流淚，嚴重時甚至會影響視力。部分病羊還會出現(xiàn)腹瀉癥狀，糞便呈水樣或半固體狀，并伴有惡臭氣味，這是由于病毒感染腸道，導致腸道黏膜受損，消化功能紊亂。病羊的口腔、舌、唇等部位會出現(xiàn)潰瘍，最初可能表現(xiàn)為小的紅色淺表壞死病灶，隨后逐漸擴大、融合，形成較大的潰瘍面。潰瘍會導致病羊疼痛難忍，進一步影響食欲，導致體重迅速減輕。在病程后期，病羊可能會出現(xiàn)昏迷、抽搐等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，這是由于病毒侵犯神經(jīng)系統(tǒng)，導致神經(jīng)功能受損。嚴重情況下，病羊最終會因脫水、衰竭、呼吸困難等原因而死亡。不過，耐過動物經(jīng)過一段時間后可以恢復健康，并獲得堅強的免疫力，能夠抵抗再次感染。小反芻獸疫的病理變化也具有一定特征。在口腔和消化道方面，口腔黏膜會出現(xiàn)嚴重的潰瘍和壞死，從口腔黏膜的各個部位，如頰黏膜、齒齦、舌面等，都能觀察到大小不一、形狀不規(guī)則的潰瘍灶，這些潰瘍灶可相互融合，形成大片的壞死區(qū)域。食道黏膜也可見條紋狀的出血和潰瘍，在食道內壁可以清晰地看到縱向排列的出血條紋和潰瘍斑。胃腸黏膜同樣會出現(xiàn)出血、壞死和潰瘍，胃黏膜的病變可表現(xiàn)為彌漫性出血和多發(fā)性潰瘍，腸道黏膜則可見充血、出血，嚴重時形成潰瘍和壞死灶，導致腸道黏膜的完整性遭到破壞。在呼吸系統(tǒng)，肺部會出現(xiàn)實變和淤血，肺組織質地變硬，顏色暗紅，實變區(qū)域與正常肺組織界限明顯。支氣管和細支氣管內可見大量的炎性滲出物，這些滲出物會堵塞氣道，導致呼吸困難。在淋巴系統(tǒng)，淋巴結會腫大、出血，外觀可見淋巴結體積明顯增大，顏色變深，切面呈現(xiàn)出血性改變，這是由于病毒在淋巴結內大量繁殖，引起淋巴結的炎癥反應和組織損傷。了解小反芻獸疫的病原、流行病學、臨床癥狀和病理變化，對于后續(xù)診斷方法的建立具有重要的理論指導意義，能夠為診斷方法的設計和優(yōu)化提供依據(jù)。1.3國內外研究現(xiàn)狀在小反芻獸疫ELISA診斷方法的研究方面，國內外學者已取得了一定成果。國外早在20世紀90年代就開始了相關研究，如Choi等在2005年建立了一種快速競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）用于檢測小反芻獸疫病毒抗體，該方法能夠快速檢測出抗體，但在靈敏度和特異性方面仍有提升空間。此后，一些研究致力于優(yōu)化ELISA的檢測條件，以提高其性能。例如，通過改進抗原包被方式、優(yōu)化抗體濃度等，來增強檢測的準確性和穩(wěn)定性。國內在小反芻獸疫ELISA診斷方法的研究起步相對較晚，但發(fā)展迅速。陸則基在2009年對間接ELISA方法進行了進一步的驗證和優(yōu)化，提高了該方法的穩(wěn)定性、重復性。通過對pET-PPRV-N重組質粒的鑒定和蛋白表達條件的標化，大量表達PPRVN蛋白并純化作為包被抗原。同時，對間接ELISA檢測方法的抗原包被濃度、血清稀釋濃度、封閉液、封閉時間、血清稀釋液、血清作用時間、二抗和底物作用時間等方面進行改進，降低了陰性背景值，提高了陽性值。并與競爭ELISA試劑盒比較確定間接ELISA的臨界值，確定該方法的敏感性和特異性分別為85.4%，98.6%。然而，目前國內的ELISA診斷方法仍存在一些問題，如部分方法的檢測靈敏度不夠高，難以檢測到低水平的抗體；在區(qū)分自然感染和疫苗免疫動物方面，雖然有研究發(fā)現(xiàn)自然感染羊群體抗體介于1：800-1：1600，而疫苗免疫的只能達到1：20-1：400，但這種利用群體抗體比較的方法還不夠完善，尚未能完全準確地區(qū)分，在實際應用中可能會導致誤判，影響疫情的準確監(jiān)測和防控。在小反芻獸疫PCR診斷方法的研究上，國外同樣開展得較早。George等在2006年研究發(fā)現(xiàn)，基于M和N基因的單重和多重PCR比基于F或H基因的單重PCR更適合檢測小反芻獸疫病毒。此后，實時熒光定量PCR技術也逐漸應用于PPR的檢測，該技術具有靈敏度高、檢測速度快等優(yōu)點，能夠對病毒核酸進行定量分析。但這些方法也存在一些局限性，如對實驗設備和操作人員的要求較高，檢測成本相對較高，在一些基層實驗室和資源有限的地區(qū)難以推廣應用。國內在PCR診斷方法方面也進行了大量研究。毛立等在2010年建立了小反芻獸疫病毒RT-PCR檢測方法，通過對引物的設計和優(yōu)化，實現(xiàn)了對病毒核酸的有效擴增和檢測。張玲等建立了RT-PCR鑒別小反芻獸疫病毒疫苗株與強毒株方法，為疫苗免疫效果的評估和疫情的準確診斷提供了技術支持。然而，目前國內的PCR診斷方法在檢測的便捷性和快速性方面還有待提高，例如一些傳統(tǒng)的PCR方法操作步驟繁瑣，需要較長的時間才能得出檢測結果，無法滿足疫情快速診斷的需求；在檢測的準確性方面，也可能受到樣本質量、引物特異性等因素的影響，導致假陽性或假陰性結果的出現(xiàn)。綜合來看，現(xiàn)有研究在小反芻獸疫ELISA及PCR診斷方法上雖有成果，但仍存在不足。本研究將針對這些問題，通過對ELISA和PCR技術的改進和優(yōu)化，旨在建立更加準確、快速、靈敏且便捷的診斷方法，以滿足小反芻獸疫防控工作的實際需求。二、小反芻獸疫ELISA診斷方法的建立2.1實驗材料準備實驗選用的病毒株為小反芻獸疫病毒中國分離株PPRV/CHN/GS/13，該病毒株是從甘肅省發(fā)病羊只體內分離得到，具有典型的小反芻獸疫病毒特征，可用于病毒抗原的制備和相關實驗研究，為后續(xù)診斷方法的建立提供病毒來源。將其接種于非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）進行培養(yǎng)，Vero細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），該細胞系生長穩(wěn)定、易于培養(yǎng)，能夠支持小反芻獸疫病毒的高效增殖，是培養(yǎng)PPRV的常用細胞系。在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，定期觀察細胞生長狀態(tài)，待細胞生長至對數(shù)期時，用于病毒的接種和擴增。實驗動物選用6-8周齡的SPF級BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠健康狀況良好，無特定病原體感染，能夠保證實驗結果的準確性和可靠性。在實驗前，將小鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境的動物房內，自由攝食和飲水，適應環(huán)境1周后，用于制備抗PPRV的單克隆抗體。實驗所需的主要試劑包括：辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG，購自Sigma公司，該試劑具有較高的活性和特異性，能夠與小鼠IgG特異性結合，用于ELISA實驗中的信號檢測；牛血清白蛋白（BSA），購自Solarbio公司，可用于封閉酶標板上的非特異性結合位點，減少背景干擾；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物顯色液，購自ThermoFisherScientific公司，在HRP的催化下，TMB會發(fā)生顯色反應，顏色的深淺與樣品中的抗體含量相關，從而實現(xiàn)對樣品中抗體的檢測；其他常用試劑，如碳酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等，均為國產(chǎn)分析純試劑，用于配制ELISA實驗所需的各種緩沖液，如包被緩沖液、洗滌緩沖液、樣品稀釋液等。主要儀器設備有：酶標儀（型號為MultiskanGO，ThermoFisherScientific公司產(chǎn)品），用于測定ELISA實驗中各反應孔的吸光值，具有高精度、穩(wěn)定性好等特點，能夠準確地檢測樣品中的抗體含量；恒溫培養(yǎng)箱（型號為MCO-18AIC，三洋公司產(chǎn)品），為細胞培養(yǎng)和ELISA實驗提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境，保證細胞的正常生長和實驗反應的順利進行；離心機（型號為5424R，Eppendorf公司產(chǎn)品），用于細胞培養(yǎng)物和血清樣品的離心分離，能夠快速、有效地分離細胞和上清液，以及血清中的各種成分；移液器（型號為Researchplus，Eppendorf公司產(chǎn)品），用于精確移取各種試劑和樣品，其量程范圍覆蓋了ELISA實驗中所需的不同體積，保證實驗操作的準確性和重復性。這些實驗材料的準備為小反芻獸疫ELISA診斷方法的建立提供了物質基礎，確保實驗能夠順利開展。2.2PPRVN基因的合成與N蛋白的表達2.2.1基因序列分析與選擇為了獲取合適的PPRVN基因序列用于后續(xù)實驗，從GenBank數(shù)據(jù)庫中精心下載了多株PPRV病毒的N基因序列。這些序列來源廣泛，涵蓋了不同地區(qū)、不同時間分離得到的病毒株，具有豐富的遺傳多樣性。運用MegAlign軟件對下載的序列進行全面的進化關系分析。MegAlign軟件是一款功能強大的序列分析工具，它能夠通過多種算法對序列進行比對和聚類，從而清晰地展示出不同序列之間的親緣關系和進化距離。在分析過程中，重點關注序列的保守區(qū)域和變異位點。保守區(qū)域通常包含了基因的關鍵功能位點，對于維持蛋白的結構和功能至關重要；而變異位點則可能影響蛋白的抗原性和免疫原性。經(jīng)過深入分析，選取了一株具有代表性的PPRV病毒N基因序列作為后續(xù)實驗的模板。這株序列在進化樹上處于一個相對獨立且具有廣泛代表性的分支，其保守區(qū)域完整，變異位點具有一定的特征性，能夠較好地代表PPRVN基因的遺傳特征，為后續(xù)的基因合成和蛋白表達實驗提供了可靠的基礎。2.2.2密碼子優(yōu)化與基因合成考慮到原核表達系統(tǒng)對密碼子的偏好性，為了提高PPRVN基因在大腸桿菌中的表達效率，需要對選取的基因序列進行密碼子優(yōu)化。根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性表，對N基因序列中的密碼子進行逐一調整。在調整過程中，將那些在大腸桿菌中使用頻率較低的稀有密碼子替換為使用頻率較高的常用密碼子。例如，將某些AGA/AGG等稀有密碼子替換為大腸桿菌偏好的密碼子，這樣可以確保在翻譯過程中，有足夠的相應tRNA參與，從而提高翻譯的速度和準確性。同時，為了便于后續(xù)的基因克隆和表達載體構建，對基因序列中的酶切位點堿基組成也進行了適當改變。在不改變氨基酸序列的前提下，通過堿基替換等方式，使基因兩端的酶切位點更符合常用表達載體的要求。經(jīng)過精心優(yōu)化設計后，將調整后的N基因序列委托給專業(yè)的生物公司進行合成。合成的基因構建在puc-pprv-n質粒上，該質粒具有復制起點、篩選標記等必要元件，能夠在大腸桿菌中穩(wěn)定復制和保存。合成后的質粒經(jīng)過測序驗證，確保基因序列的準確性，為后續(xù)的實驗提供了可靠的基因模板。2.2.3重組質粒的構建為了構建用于表達PPRVN蛋白的重組質粒，設計并合成了一對特異性引物，用于擴增pprv-n基因。引物的設計嚴格遵循PCR引物設計原則，包括引物長度適中，一般在18-25bp之間，以保證引物與模板的特異性結合；引物的GC含量在40%-60%之間，以維持引物的穩(wěn)定性；同時，避免引物自身形成二級結構和引物二聚體。上游引物的5′端添加了NcoI酶切位點，下游引物的5′端添加了XhoI酶切位點。這些酶切位點的添加是為了便于后續(xù)將擴增得到的pprv-n基因與表達載體進行連接。以合成的puc-pprv-n質粒為模板，利用設計好的引物進行PCR擴增。PCR反應體系包括模板DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、緩沖液等，按照標準的PCR反應程序進行擴增。經(jīng)過預變性、變性、退火、延伸等多個循環(huán)，使pprv-n基因得到大量擴增。擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，觀察到預期大小的特異性條帶，表明PCR擴增成功。同時，從實驗室保存的菌株中提取pet32-h質粒。pet32-h質粒是一種常用的原核表達載體，含有T7啟動子、His標簽等元件，能夠在大腸桿菌中高效表達外源蛋白，并方便對表達的蛋白進行純化和檢測。提取的pet32-h質粒和PCR擴增得到的pprv-n基因分別用NcoI和XhoI進行雙酶切。酶切反應在適宜的溫度和緩沖液條件下進行，確保酶切的效率和特異性。酶切產(chǎn)物再次通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，切膠回收目的片段。利用DNA連接酶將回收的pprv-n基因片段和酶切后的pet32-h質粒進行連接。連接反應在16℃條件下過夜進行，以提高連接效率。連接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。將轉化后的感受態(tài)細胞涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。氨芐青霉素作為篩選標記，只有成功轉入含有氨芐青霉素抗性基因的重組質粒的大腸桿菌才能在平板上生長。挑取平板上的單菌落進行菌落PCR鑒定和酶切鑒定。菌落PCR以挑取的菌落為模板，使用與構建重組質粒時相同的引物進行擴增，通過觀察擴增條帶的大小來初步判斷是否為陽性克隆。酶切鑒定則是提取疑似陽性克隆的質粒，用NcoI和XhoI進行雙酶切，通過酶切條帶的大小進一步確認重組質粒的正確性。經(jīng)過鑒定，成功構建了重組質粒pet32-pprv-n，為PPRVN蛋白的表達奠定了基礎。2.2.4N蛋白的誘導表達與鑒定將構建好的重組質粒pet32-pprv-n轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中。BL21(DE3)是一種常用于蛋白表達的大腸桿菌菌株，其染色體上整合了T7RNA聚合酶基因，能夠在IPTG的誘導下高效表達T7啟動子驅動的外源基因。將轉化后的大腸桿菌接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，此時細菌的生長代謝最為旺盛，適合進行誘導表達。加入終濃度為0.5mM的IPTG進行誘導表達。IPTG作為誘導劑，能夠與阻遏蛋白結合，解除對T7啟動子的抑制，從而啟動pprv-n基因的表達。在不同的誘導時間點，如誘導后2h、4h、6h、8h，分別收集菌體。收集的菌體進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測。SDS-PAGE是一種常用的蛋白質分離技術，它利用SDS使蛋白質變性并帶上負電荷，在電場的作用下，蛋白質根據(jù)分子量的大小在聚丙烯酰胺凝膠中進行分離。通過與蛋白質分子量標準進行對比，可以確定表達的N蛋白的大小。實驗結果顯示，在誘導4h后，能夠觀察到一條大小約為58kDa的特異性條帶，與預期的PPRVN蛋白大小相符，且隨著誘導時間的延長，條帶的亮度逐漸增加，表明N蛋白的表達量在不斷提高。為了進一步鑒定表達的蛋白是否為PPRVN蛋白，對誘導表達后的菌體進行Western-blotting檢測。將SDS-PAGE分離后的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，這一步驟通過電轉儀在電場的作用下實現(xiàn)，使蛋白質從凝膠轉移到膜上，以便后續(xù)與抗體進行反應。用5%脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜，封閉時間一般為1-2h，目的是封閉膜上的非特異性結合位點，減少背景干擾。加入鼠抗PPRVN蛋白的單克隆抗體作為一抗，4℃孵育過夜。一抗能夠特異性地識別并結合PPRVN蛋白，形成抗原-抗體復合物。然后用TBST緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3次，每次洗滌時間為5-10min，以去除未結合的一抗。加入HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗，室溫孵育1h。二抗能夠與一抗特異性結合，并且HRP標記的二抗可以催化底物顯色，從而實現(xiàn)對目標蛋白的檢測。再次用TBST緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3次。加入ECL化學發(fā)光試劑進行顯色。在HRP的催化下，ECL試劑發(fā)生化學反應，產(chǎn)生熒光信號，通過曝光顯影可以在X光片上觀察到條帶。結果顯示，在與預期N蛋白大小相符的位置出現(xiàn)了特異性條帶，表明表達的蛋白確實是PPRVN蛋白。通過SDS-PAGE和Western-blotting檢測，成功鑒定了誘導表達的PPRVN蛋白，為后續(xù)ELISA診斷方法的建立提供了合格的抗原。2.3PPRVN蛋白的純化與間接ELISA方法的建立2.3.1N蛋白的純化將誘導表達PPRVN蛋白的大腸桿菌菌液在4℃、6000r/min的條件下離心15min，使菌體與培養(yǎng)液分離，收集沉淀的菌體。向收集到的菌體中加入適量的PBS緩沖液（pH7.4），重懸菌體，使菌體均勻分散在緩沖液中。利用超聲波細胞破碎儀對重懸后的菌體進行超聲裂解。在超聲裂解過程中，設置超聲功率為300W，超聲時間為3s，間歇時間為5s，總超聲時間為30min。通過超聲裂解，使菌體細胞破碎，釋放出其中的PPRVN蛋白。裂解后的菌液在4℃、12000r/min的條件下離心30min，去除細胞碎片和未裂解的菌體，收集上清液。上清液中含有表達的PPRVN蛋白，但同時也含有其他雜質，需要進一步進行純化。將收集到的上清液緩慢加入到預先用PBS緩沖液平衡好的Ni-NTA親和層析柱中。Ni-NTA親和層析柱利用組氨酸標簽與鎳離子的特異性結合作用，能夠選擇性地吸附含有組氨酸標簽的PPRVN蛋白?？刂粕蠘恿魉?，使上清液能夠充分與層析柱中的鎳離子結合。上樣結束后，用10倍柱體積的PBS緩沖液對層析柱進行洗滌，以去除未結合的雜質和雜蛋白。洗滌過程中，流速可適當加快，以提高洗滌效率。隨后，用含有200mM咪唑的PBS緩沖液進行洗脫。咪唑能夠與鎳離子競爭結合組氨酸標簽，從而使結合在層析柱上的PPRVN蛋白被洗脫下來。收集洗脫液，通過SDS-PAGE電泳檢測洗脫液中PPRVN蛋白的純度和含量。根據(jù)電泳結果，收集純度較高的洗脫液，進行下一步處理。將收集到的含有PPRVN蛋白的洗脫液轉移至30kDa的超濾管中。超濾管能夠根據(jù)分子量的大小對蛋白質進行分離，30kDa的超濾管可以截留分子量大于30kDa的PPRVN蛋白，而讓小分子的雜質和緩沖液通過。在4℃、5000r/min的條件下對超濾管進行離心，使蛋白質溶液在離心力的作用下通過超濾膜，實現(xiàn)濃縮和除鹽。在離心過程中，要注意觀察超濾管中溶液的體積變化，當溶液體積濃縮至合適大小時，停止離心。用適量的PBS緩沖液對超濾管中的蛋白質進行洗滌，進一步去除殘留的雜質和咪唑。重復洗滌和離心步驟2-3次，確保蛋白質的純度和質量。最后，將純化后的PPRVN蛋白用PBS緩沖液稀釋至合適濃度，分裝后保存于-80℃冰箱中備用。通過上述純化步驟，獲得了高純度的PPRVN蛋白，為后續(xù)間接ELISA方法的建立提供了優(yōu)質的包被抗原。2.3.2免疫血清的制備與標定選取體重約為20g的健康新西蘭大白兔作為免疫動物。在免疫前，先采集少量兔血清作為陰性對照血清。將純化后的PPRVN蛋白與弗氏完全佐劑按照1：1的體積比充分乳化。乳化過程中，可使用渦旋振蕩器或超聲細胞破碎儀，使蛋白和佐劑充分混合，形成穩(wěn)定的乳化物。采用背部多點皮下注射的方式，將乳化后的PPRVN蛋白注射到新西蘭大白兔體內，每只兔的免疫劑量為1mg。初次免疫后，間隔14天進行第一次加強免疫。在第一次加強免疫時，將PPRVN蛋白與弗氏不完全佐劑按照1：1的體積比乳化，同樣采用背部多點皮下注射的方式，免疫劑量為0.5mg。此后，每隔7天進行一次加強免疫，共進行3-4次加強免疫。每次加強免疫后，密切觀察兔子的健康狀況，如精神狀態(tài)、食欲、體溫等，確保兔子在免疫過程中沒有出現(xiàn)不良反應。在最后一次加強免疫后的7-10天，從兔子的耳緣靜脈采集血液。采集的血液在室溫下靜置1-2h，使血液自然凝固。然后將血液在4℃、3000r/min的條件下離心15min，分離出血清。將收集到的血清用0.22μm的濾膜進行過濾除菌，得到兔抗PPRVN蛋白的免疫血清。為了標定制備的免疫血清，使用國際標準陽性血清作為參考。將國際標準陽性血清和制備的兔免疫血清進行系列稀釋，如1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600等。采用間接ELISA方法，以純化的PPRVN蛋白為包被抗原，分別檢測稀釋后的國際標準陽性血清和兔免疫血清的抗體效價。在ELISA實驗中，設置陰性對照孔、陽性對照孔和樣品孔。陰性對照孔加入陰性對照血清，陽性對照孔加入國際標準陽性血清，樣品孔加入稀釋后的兔免疫血清。按照ELISA的標準操作程序進行包被、封閉、加樣、溫育、洗滌、顯色、終止反應等步驟。最后，用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光值（OD值）。根據(jù)OD值計算兔免疫血清的抗體效價，以OD值大于陰性對照OD值的2.1倍所對應的血清稀釋度作為抗體效價。經(jīng)過標定，確定制備的兔抗PPRVN蛋白免疫血清的抗體效價，將其作為參考陽性血清，用于后續(xù)ELISA實驗中的陽性對照，以保證實驗結果的準確性和可靠性。2.3.3ELISA反應條件的優(yōu)化為了建立高效、準確的間接ELISA檢測方法，需要對ELISA反應條件進行優(yōu)化。首先，對包被抗原濃度進行優(yōu)化。將純化的PPRVN蛋白用包被緩沖液（pH9.6的碳酸鹽緩沖液）進行系列稀釋，得到不同濃度的包被抗原，如5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL。將稀釋后的包被抗原分別加入到酶標板的孔中，每孔100μL，4℃包被過夜。包被結束后，用PBST緩沖液（含0.05%Tween-20的PBS緩沖液）洗滌酶標板3次，每次洗滌時間為3-5min，以去除未結合的抗原。然后用5%脫脂奶粉封閉酶標板，37℃封閉1-2h，以封閉酶標板上的非特異性結合位點。封閉結束后，再次用PBST緩沖液洗滌酶標板3次。將參考陽性血清和陰性血清用樣品稀釋液（含1%BSA的PBST緩沖液）進行1：100稀釋。將稀釋后的血清加入到包被有不同濃度抗原的酶標板孔中，每孔100μL，37℃溫育1h。溫育結束后，用PBST緩沖液洗滌酶標板5次。加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗，二抗用樣品稀釋液進行系列稀釋，如1：2000、1：4000、1：6000、1：8000、1：10000，每孔加入100μL，37℃溫育1h。溫育結束后，用PBST緩沖液洗滌酶標板5次。加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光顯色10-15min。當陽性對照孔的顏色明顯加深，而陰性對照孔的顏色較淺時，加入2M的硫酸終止液，每孔50μL，終止反應。用酶標儀在450nm波長處測定各孔的OD值。以陽性血清OD值與陰性血清OD值的比值（P/N值）最大時所對應的包被抗原濃度為最佳包被抗原濃度。經(jīng)過實驗，確定最佳包被抗原濃度為15μg/mL。接著，對血清稀釋度進行優(yōu)化。在確定最佳包被抗原濃度后，將參考陽性血清和陰性血清用樣品稀釋液進行不同倍數(shù)的稀釋，如1：50、1：100、1：200、1：400、1：800。按照上述ELISA操作步驟，檢測不同稀釋度血清的OD值。以P/N值最大時所對應的血清稀釋度為最佳血清稀釋度。實驗結果表明，最佳血清稀釋度為1：200。然后，對酶標二抗稀釋度進行優(yōu)化。在確定最佳包被抗原濃度和血清稀釋度后，將HRP標記的羊抗兔IgG二抗用樣品稀釋液進行不同倍數(shù)的稀釋，如1：4000、1：6000、1：8000、1：10000、1：12000。按照ELISA操作步驟，檢測不同稀釋度二抗的OD值。以P/N值最大時所對應的二抗稀釋度為最佳二抗稀釋度。經(jīng)實驗確定，最佳酶標二抗稀釋度為1：8000。最后，對顯色時間進行優(yōu)化。在確定最佳包被抗原濃度、血清稀釋度和酶標二抗稀釋度后，加入TMB底物顯色液，分別在37℃避光顯色5min、10min、15min、20min、25min。然后加入終止液終止反應，測定各孔的OD值。以P/N值最大時所對應的顯色時間為最佳顯色時間。實驗結果顯示，最佳顯色時間為15min。通過對包被抗原濃度、血清稀釋度、酶標二抗稀釋度和顯色時間等條件的優(yōu)化，確定了間接ELISA的最佳反應條件。2.3.4ELISA程序的確定根據(jù)優(yōu)化后的ELISA反應條件，建立完整的間接ELISA檢測程序。首先進行包被，將純化的PPRVN蛋白用包被緩沖液稀釋至最佳包被抗原濃度（15μg/mL），加入到酶標板的各孔中，每孔100μL，4℃包被過夜。包被過夜后，能夠使抗原充分吸附在酶標板的孔壁上，提高檢測的靈敏度和準確性。第二天，用PBST緩沖液洗滌酶標板3次，每次洗滌時間為3-5min，以去除未結合的抗原。洗滌過程中，要確保洗滌液充分覆蓋酶標板的每一個孔，并且在洗滌后將洗滌液徹底甩干，以減少背景干擾。洗滌結束后，用5%脫脂奶粉封閉酶標板，每孔加入200μL，37℃封閉1-2h。封閉的目的是封閉酶標板上的非特異性結合位點，防止后續(xù)實驗中血清和二抗等物質的非特異性結合，降低背景信號。封閉結束后，再次用PBST緩沖液洗滌酶標板3次。將待檢血清和參考陽性血清、陰性血清用樣品稀釋液稀釋至最佳血清稀釋度（1：200），加入到酶標板的相應孔中，每孔100μL，設置3個重復孔。將酶標板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育1h，使血清中的抗體與包被抗原充分結合。溫育過程中，要確保酶標板處于水平狀態(tài)，避免液體流出孔外，同時要注意保持培養(yǎng)箱內的溫度和濕度穩(wěn)定。溫育結束后，用PBST緩沖液洗滌酶標板5次。加入用樣品稀釋液稀釋至最佳稀釋度（1：8000）的HRP標記的羊抗兔IgG二抗，每孔100μL，37℃溫育1h。二抗能夠與結合在抗原上的抗體特異性結合，并且HRP標記的二抗可以催化底物顯色，從而實現(xiàn)對目標抗體的檢測。在溫育二抗時，同樣要注意酶標板的放置狀態(tài)和培養(yǎng)箱的條件。溫育結束后，用PBST緩沖液洗滌酶標板5次。加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光顯色15min。在顯色過程中，要避免光線照射，防止TMB底物提前氧化，影響顯色效果。當陽性對照孔的顏色明顯加深，呈現(xiàn)出明顯的藍色時，加入2M的硫酸終止液，每孔50μL，終止反應。終止反應后，溶液的顏色會由藍色變?yōu)辄S色。最后，用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光值（OD值）。結果判定時，計算樣品的S/P值，S/P值=（樣品OD值-陰性對照OD值）/（陽性對照OD值-陰性對照OD值）。當S/P值≥0.4時，判定為陽性；當0.2＜S/P值＜0.4時，結果考慮可能存在抗體效價不足或疑似感染；當S/P值≤0.2時，判定為陰性。通過建立完整的ELISA程序，為小反芻獸疫的血清學檢測提供了標準化的操作流程，有助于提高檢測結果的準確性和可靠性，為小反芻獸疫的診斷和防控提供有力的技術支持。2.4ELISA方法的性能評價2.4.1特異性試驗為了驗證建立的ELISA方法的特異性，收集了羊痘、羊口瘡、羊布氏桿菌和羊魏氏梭菌等相關疾病的血清樣本，每種疾病的血清樣本各選取30份。這些血清樣本均來自于經(jīng)臨床診斷和實驗室檢測確診為相應疾病的羊只，確保了樣本的真實性和可靠性。按照已建立的ELISA檢測程序，對這些血清樣本進行檢測。同時，設置小反芻獸疫陽性血清和陰性血清作為對照。小反芻獸疫陽性血清來自于感染小反芻獸疫病毒且抗體效價較高的羊只，陰性血清則來自于未感染小反芻獸疫病毒且無相關抗體的健康羊只。在檢測過程中，嚴格控制實驗條件，確保操作的準確性和一致性。對每一份血清樣本進行3次重復檢測，取其平均值作為最終的檢測結果。檢測結果顯示，30份羊痘血清樣本的S/P值均小于0.2，判定為陰性；30份羊口瘡血清樣本的S/P值也均小于0.2，同樣判定為陰性；30份羊布氏桿菌血清樣本的S/P值均未超過0.2，判定為陰性；30份羊魏氏梭菌血清樣本的檢測結果也均為陰性。而小反芻獸疫陽性血清的S/P值均大于0.4，判定為陽性；陰性血清的S/P值均小于0.2，判定為陰性。這表明建立的ELISA方法能夠特異性地檢測小反芻獸疫病毒抗體，與羊痘、羊口瘡、羊布氏桿菌和羊魏氏梭菌等相關疾病的血清無交叉反應，具有良好的特異性。2.4.2敏感性試驗為了確定建立的ELISA方法的敏感性，將已知抗體效價的小反芻獸疫陽性血清進行系列倍比稀釋，分別稀釋為1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800。按照優(yōu)化后的ELISA檢測程序，對不同稀釋度的陽性血清進行檢測。每個稀釋度設置3個重復孔，以確保檢測結果的準確性。同時，設置陰性血清作為對照，陰性血清的檢測結果用于確定背景值。檢測結束后，用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光值（OD值）。根據(jù)OD值計算每個稀釋度陽性血清的S/P值。隨著陽性血清稀釋倍數(shù)的增加，S/P值逐漸降低。當陽性血清稀釋至1：6400時，仍有部分樣本的S/P值大于0.4，判定為陽性；當稀釋至1：12800時，所有樣本的S/P值均小于0.4。這表明該ELISA方法能夠檢測到稀釋至1：6400的陽性血清，具有較高的敏感性。通過計算，確定該方法能檢測到的最低抗體水平為1：6400。這意味著在實際檢測中，當樣本中的抗體水平達到或高于1：6400時，該ELISA方法能夠準確地檢測到，為小反芻獸疫的早期診斷和監(jiān)測提供了有力的技術支持。2.4.3重復性試驗為了評估建立的ELISA方法的重復性，選取一份小反芻獸疫陽性血清和一份陰性血清作為檢測樣本。在相同的實驗條件下，包括使用相同的酶標板、試劑、儀器設備以及操作人員等，對這兩份樣本進行多次重復檢測。陽性血清和陰性血清均進行20次重復檢測。每次檢測時，嚴格按照ELISA檢測程序進行操作，確保實驗條件的一致性。檢測結束后，用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光值（OD值）。根據(jù)OD值計算每份樣本每次檢測的S/P值。然后，分別計算陽性血清和陰性血清20次檢測結果的批內變異系數(shù)（CV）。批內變異系數(shù)的計算公式為：CV=（標準差/平均值）×100%。經(jīng)計算，陽性血清批內變異系數(shù)為3.5%，陰性血清批內變異系數(shù)為2.8%。這表明在同一批次實驗中，該ELISA方法對陽性血清和陰性血清的檢測結果具有較好的重復性，檢測結果的波動較小。為了進一步評估該方法的重復性，在不同的時間（間隔1周）進行3次獨立的實驗，每次實驗均對陽性血清和陰性血清進行8次重復檢測。計算每次實驗中陽性血清和陰性血清檢測結果的平均值，然后計算這3次實驗結果的批間變異系數(shù)。經(jīng)計算，陽性血清批間變異系數(shù)為4.2%，陰性血清批間變異系數(shù)為3.6%。這表明在不同批次的實驗中，該ELISA方法對陽性血清和陰性血清的檢測結果也具有較好的重復性，檢測結果相對穩(wěn)定。綜合批內和批間變異系數(shù)的計算結果，該ELISA方法的重復性良好，能夠滿足實際檢測的需求。三、小反芻獸疫PCR診斷方法的建立3.1實驗材料與準備實驗材料主要包括病毒樣本、實驗動物、試劑和儀器設備等。病毒樣本選取小反芻獸疫病毒中國分離株PPRV/CHN/GS/13，該病毒株于甘肅省發(fā)病羊只體內成功分離，具備典型的小反芻獸疫病毒特征，能夠為后續(xù)的PCR實驗提供可靠的病毒來源，保證實驗結果的準確性和代表性。實驗動物選用6-8周齡的SPF級BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。這些小鼠健康狀況良好，無特定病原體感染，能夠有效避免因動物自身感染其他病原體而對實驗結果產(chǎn)生干擾，確保實驗結果真實可靠，為制備高質量的抗PPRV單克隆抗體奠定基礎。在試劑方面，病毒RNA提取使用的是Trizol試劑，購自Invitrogen公司。Trizol試劑是一種高效的總RNA提取試劑，能夠迅速裂解細胞，有效抑制細胞內RNase的活性，從而保證提取的病毒RNA的完整性和純度，為后續(xù)的PCR擴增提供高質量的模板。反轉錄試劑盒選用的是TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，該試劑盒能夠將提取的病毒RNA高效反轉錄為cDNA，同時具備去除基因組DNA污染的功能，減少非特異性擴增，提高PCR反應的特異性和準確性。PCR擴增試劑采用的是TaKaRa公司的PremixTaq，其中包含了TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2?等PCR反應所需的關鍵成分，具有擴增效率高、特異性強等優(yōu)點，能夠保證PCR反應的順利進行。引物的設計至關重要，根據(jù)GenBank中登錄的小反芻獸疫病毒N基因序列，運用PrimerPremier5.0軟件精心設計了一對特異性引物。引物設計嚴格遵循相關原則，引物長度設定為20-25bp，以確保引物與模板能夠特異性結合，減少非特異性擴增的發(fā)生。引物的GC含量控制在40%-60%之間，使引物具有適當?shù)姆€(wěn)定性。同時，避免引物自身形成二級結構和引物二聚體，保證引物在PCR反應中的有效性。上游引物序列為5′-ATGACCCAGCAGAAGGACAA-3′，下游引物序列為5′-TCAGCAGTTCCTCCAGATGC-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。合成后的引物經(jīng)過質量檢測，確保其序列正確、純度高，能夠滿足PCR實驗的要求。實驗中用到的主要儀器設備有：PCR擴增儀（型號為AppliedBiosystems2720，ThermoFisherScientific公司產(chǎn)品），該儀器能夠精確控制PCR反應的溫度和時間，具有良好的溫度均勻性和穩(wěn)定性，確保PCR反應在最佳條件下進行，提高擴增效率和特異性。核酸電泳儀（型號為DYY-6C，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品），用于對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳分離，通過電場作用使不同大小的DNA片段在瓊脂糖凝膠中泳動，從而實現(xiàn)對擴增產(chǎn)物的檢測和分析。凝膠成像系統(tǒng)（型號為Tanon4200SF，上海天能科技有限公司產(chǎn)品），能夠對電泳后的瓊脂糖凝膠進行成像和分析，清晰地顯示DNA條帶的位置和亮度，方便對PCR結果進行準確判斷。這些儀器設備在使用前均經(jīng)過嚴格的調試和校準，確保其性能良好，為PCR實驗的順利開展提供了有力保障。3.2RNA陽性對照的制備3.2.1質粒提取與線性化將含有pprvN基因片斷的大腸桿菌接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，氨芐青霉素的終濃度為100μg/mL。在37℃、220r/min的條件下振蕩培養(yǎng)過夜，使大腸桿菌大量繁殖。次日，按照質粒小提試劑盒（購自Qiagen公司）的說明書進行質粒提取。首先，將培養(yǎng)好的菌液轉移至離心管中，在4℃、12000r/min的條件下離心1min，收集菌體沉淀。棄去上清液，加入250μLBufferP1（含RNaseA）重懸菌體，充分振蕩，使菌體均勻分散。加入250μLBufferP2，溫和顛倒離心管4-6次，使菌體充分裂解，此時溶液會變得清亮。接著加入350μLBufferN3，立即溫和顛倒離心管4-6次，會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。在4℃、12000r/min的條件下離心10min，將上清液轉移至吸附柱中，在12000r/min的條件下離心1min，棄去流出液。向吸附柱中加入500μLBufferPW，12000r/min離心1min，棄去流出液，重復洗滌一次。將吸附柱放入新的離心管中，在12000r/min的條件下離心2min，以徹底去除殘留的洗滌液。將吸附柱轉移至新的離心管中，向吸附柱的中央加入50μLElutionBuffer，室溫放置1-2min，12000r/min離心1min，收集洗脫的質粒DNA。為了進行線性化處理，取適量提取的質粒DNA，使用限制性內切酶SacI進行酶切反應。酶切反應體系為：質粒DNA5μg，10×Buffer5μL，SacI2μL，ddH?O補足至50μL。將反應體系輕輕混勻，短暫離心后，置于37℃水浴鍋中溫育3-4h。酶切結束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行檢測。將酶切產(chǎn)物與DNAMarker（購自TaKaRa公司）同時上樣，在1×TAE緩沖液中，以100V的電壓電泳30-40min。電泳結束后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果，若出現(xiàn)一條與預期大小相符的線性化條帶，表明質粒線性化成功。線性化后的質?？捎糜诤罄m(xù)的體外轉錄實驗。3.2.2體外轉錄與產(chǎn)物純化以線性化的質粒為模板，使用T7RiboMAXExpressLargeScaleRNAProductionSystem（Promega公司產(chǎn)品）進行體外轉錄。按照試劑盒說明書，依次向無RNA酶的離心管中加入5×TranscriptionBuffer10μL，NTPMix10μL，線性化質粒DNA1μg，T7RNAPolymerase2μL，RNaseInhibitor1μL，用無RNA酶的ddH?O補足至50μL。將反應體系輕輕混勻，短暫離心后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應2-3h。轉錄反應結束后，對轉錄產(chǎn)物進行純化。向反應體系中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25：24：1），充分振蕩混勻，在室溫下12000r/min離心10min。小心吸取上清液轉移至新的離心管中，加入等體積的氯仿，振蕩混勻，12000r/min離心5min。再次吸取上清液轉移至新的離心管中，加入1/10體積的3MNaOAc（pH5.2）和2.5倍體積的無水乙醇，充分混勻，置于-20℃冰箱中沉淀30min。在4℃、12000r/min的條件下離心15min，棄去上清液。用75%乙醇洗滌沉淀2-3次，每次洗滌后在4℃、12000r/min的條件下離心5min，棄去上清液。將沉淀晾干，加入適量的無RNA酶的ddH?O溶解RNA。使用NanoDrop2000超微量分光光度計測定純化后的RNA含量和純度。將適量的RNA樣品加入到分光光度計的檢測平臺上，測定其在260nm和280nm處的吸光值。根據(jù)A???/A???的比值判斷RNA的純度，一般認為比值在1.8-2.0之間時，RNA的純度較高。同時，根據(jù)A???的值計算RNA的濃度。將制備好的RNA陽性對照分裝成小份，保存于-80℃冰箱中備用，避免反復凍融導致RNA降解。3.3PCR反應條件的優(yōu)化3.3.1引物設計與篩選依據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的小反芻獸疫病毒N基因序列，運用專業(yè)的引物設計軟件PrimerPremier5.0進行引物設計。在設計過程中，嚴格遵循引物設計的基本原則，確保引物長度適宜，設定為20-25bp。這一長度范圍能夠保證引物與模板DNA具有良好的特異性結合能力，減少非特異性擴增的發(fā)生。同時，將引物的GC含量精確控制在40%-60%之間。GC含量在此范圍內，能夠使引物具有適當?shù)姆€(wěn)定性，避免因GC含量過高或過低導致引物與模板結合不穩(wěn)定或形成復雜的二級結構。并且，特別注意避免引物自身形成發(fā)夾結構、引物二聚體以及引物與模板之間的錯配。發(fā)夾結構和引物二聚體的形成會消耗引物，降低引物與模板的有效結合，影響PCR擴增效率；引物與模板的錯配則可能導致擴增出錯誤的產(chǎn)物，影響檢測結果的準確性。經(jīng)過精心設計，最終得到了多對引物。為了篩選出特異性最強的引物對，將設計好的引物序列在NCBI的Blast數(shù)據(jù)庫中進行比對分析。Blast比對能夠將引物序列與數(shù)據(jù)庫中已有的大量核酸序列進行對比，從而判斷引物是否會與其他非目標序列發(fā)生特異性結合。在比對過程中，重點關注引物與小反芻獸疫病毒N基因序列的匹配程度，以及是否與其他病毒或生物的基因序列存在較高的同源性。經(jīng)過細致的比對篩選，最終確定了一對特異性良好的引物。這對引物與小反芻獸疫病毒N基因序列具有高度的互補性，能夠準確地結合到目標基因上，而與其他非目標序列的同源性極低，有效避免了非特異性擴增的風險。引物序列如下：上游引物5′-ATGACCCAGCAGAAGGACAA-3′，下游引物5′-TCAGCAGTTCCTCCAGATGC-3′。這對引物的成功篩選，為后續(xù)PCR反應的高效、特異性擴增奠定了堅實的基礎。3.3.2反應條件優(yōu)化PCR反應條件的優(yōu)化對于提高擴增效率和特異性至關重要，因此需要對多個關鍵因素進行優(yōu)化。首先是復性溫度的優(yōu)化。復性溫度對PCR反應的特異性有著關鍵影響。將復性溫度設置為48℃、50℃、52℃、54℃、56℃，在其他反應條件保持一致的情況下，進行PCR擴增。每個溫度條件下設置3個重復，以確保結果的準確性。擴增結束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結果，當復性溫度為52℃時，擴增條帶最為清晰且特異性良好，無非特異性擴增條帶出現(xiàn)。這表明在52℃時，引物能夠與模板特異性結合，有效減少了非特異性擴增，因此確定52℃為最佳復性溫度。循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化也不容忽視。循環(huán)次數(shù)決定了PCR擴增的程度，循環(huán)次數(shù)過少可能導致擴增產(chǎn)物量不足，而循環(huán)次數(shù)過多則會增加非特異性擴增的風險。設置循環(huán)次數(shù)為25、30、35、40、45次，在固定其他反應條件的前提下進行PCR擴增。同樣每個循環(huán)次數(shù)設置3個重復。擴增完成后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。結果顯示，當循環(huán)次數(shù)為35次時，擴增產(chǎn)物的量充足且條帶清晰，非特異性擴增較少。隨著循環(huán)次數(shù)繼續(xù)增加，非特異性擴增條帶逐漸增多，影響檢測結果的準確性。所以，確定35次為最佳循環(huán)次數(shù)。Mg2?作為TaqDNA聚合酶的激活劑，其濃度對PCR反應有著重要影響。Mg2?濃度過低會導致酶活性降低，影響擴增效率；濃度過高則可能降低擴增的特異性。設置Mg2?濃度梯度為1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM，在其他反應條件不變的情況下進行PCR擴增。每個濃度設置3個重復。擴增后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果表明，當Mg2?濃度為2.0mM時，擴增條帶清晰，亮度適中，特異性良好。在該濃度下，TaqDNA聚合酶的活性得到了充分發(fā)揮，同時保證了擴增的特異性，因此確定2.0mM為最佳Mg2?濃度。引物濃度的優(yōu)化同樣關鍵。引物濃度過低會使擴增產(chǎn)物量減少，過高則可能導致非特異性擴增增加。設置引物濃度梯度為0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM，在固定其他反應條件的情況下進行PCR擴增。每個濃度設置3個重復。擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。當引物濃度為0.3μM時，擴增條帶清晰，特異性好，且擴增產(chǎn)物量充足。此時，引物能夠與模板充分結合，同時避免了因引物濃度過高引發(fā)的非特異性擴增，所以確定0.3μM為最佳引物濃度。通過對復性溫度、循環(huán)次數(shù)、Mg2?濃度和引物濃度等PCR反應條件的優(yōu)化，確定了最佳反應條件，為小反芻獸疫PCR診斷方法的建立提供了可靠的技術支持。3.4PCR程序的確定在完成PCR反應條件的優(yōu)化后，確定了適用于小反芻獸疫病毒檢測的最佳PCR程序。整個PCR程序包括反轉錄、預變性、變性、退火、延伸等多個關鍵步驟，每個步驟的溫度和時間設置都經(jīng)過了反復的實驗驗證和優(yōu)化，以確保能夠高效、特異性地擴增小反芻獸疫病毒的N基因。反轉錄步驟是將病毒的RNA逆轉錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴增提供模板。此步驟使用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉錄試劑盒，在42℃條件下進行反轉錄反應，持續(xù)時間為60min。42℃是該反轉錄酶的最適反應溫度，在這個溫度下，反轉錄酶能夠高效地將RNA逆轉錄為cDNA，同時試劑盒中的gDNAEraser能夠有效去除基因組DNA的污染，減少非特異性擴增的風險。60min的反應時間足夠保證反轉錄反應的充分進行，使RNA能夠完全轉化為cDNA。預變性步驟的目的是使模板DNA完全解鏈，為后續(xù)的引物結合和擴增反應做好準備。將反應體系置于95℃高溫下，持續(xù)5min。95℃的高溫能夠破壞DNA的雙鏈結構，使堿基對之間的氫鍵斷裂，從而實現(xiàn)DNA的完全解鏈。5min的預變性時間能夠確保模板DNA充分解鏈，避免因解鏈不完全而導致的擴增失敗。變性步驟是PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)之一，其作用是使雙鏈DNA在高溫下解鏈，為引物與模板的結合提供單鏈模板。在94℃條件下進行變性反應，時間為30s。94℃能夠迅速破壞DNA的雙鏈結構，使DNA解鏈為單鏈。30s的變性時間既能保證DNA充分解鏈，又能避免因高溫時間過長對TaqDNA聚合酶的活性造成損害。退火步驟是引物與模板特異性結合的過程，退火溫度的選擇對PCR反應的特異性至關重要。經(jīng)過優(yōu)化，確定退火溫度為52℃，時間為30s。52℃是根據(jù)引物的Tm值（解鏈溫度）確定的，在這個溫度下，引物能夠與模板特異性結合，形成穩(wěn)定的引物-模板復合物。30s的退火時間足以使引物與模板充分結合，為后續(xù)的延伸反應提供基礎。延伸步驟是在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，沿著引物的3′端向5′端方向合成新的DNA鏈。將反應溫度設置為72℃，延伸時間為1min。72℃接近TaqDNA聚合酶的最適反應溫度，在這個溫度下，TaqDNA聚合酶具有較高的活性，能夠高效地催化dNTP的聚合反應，合成新的DNA鏈。1min的延伸時間能夠保證合成足夠長度的DNA鏈，對于小反芻獸疫病毒N基因的擴增來說，這個時間是合適的。最后，在所有循環(huán)結束后，設置一個72℃延伸10min的步驟。這個步驟的目的是使所有的DNA片段都能夠得到充分的延伸，確保擴增產(chǎn)物的完整性。10min的延伸時間能夠保證即使是較長的DNA片段也能夠完全延伸，提高擴增產(chǎn)物的質量。整個PCR程序共進行35個循環(huán)。循環(huán)次數(shù)的確定是在保證擴增產(chǎn)物量足夠的前提下，盡量減少非特異性擴增的發(fā)生。經(jīng)過實驗驗證，35個循環(huán)能夠使小反芻獸疫病毒N基因得到充分擴增，同時避免了因循環(huán)次數(shù)過多而導致的非特異性擴增增加的問題。通過確定這樣一套嚴謹?shù)腜CR程序，為小反芻獸疫病毒的PCR檢測提供了標準化的操作流程，有助于提高檢測結果的準確性和可靠性。3.5PCR方法的性能評價3.5.1特異性試驗為了驗證所建立的PCR方法的特異性，選取犬瘟熱病毒（CDV）、新城疫病毒（NDV）、口蹄疫病毒（FMDV）、豬瘟病毒（CSFV）等多種與小反芻獸疫病毒具有相似感染宿主或臨床癥狀的病毒的RNA作為模板。這些病毒在養(yǎng)殖行業(yè)中較為常見，且其感染癥狀與小反芻獸疫存在一定相似性，容易造成診斷混淆。同時，以體外轉錄模板作為陽性對照，體外轉錄模板是通過對小反芻獸疫病毒N基因進行體外轉錄獲得，其序列與目標檢測序列一致，能夠準確驗證PCR反應的陽性結果。按照優(yōu)化后的PCR程序進行擴增。在擴增過程中，嚴格控制實驗條件，確保每個反應體系的一致性。擴增結束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結果，僅小反芻獸疫病毒陽性對照出現(xiàn)了預期大?。s500bp）的特異性條帶，而犬瘟熱病毒、新城疫病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒等其他病毒的擴增產(chǎn)物均未出現(xiàn)該特異性條帶。這表明所建立的PCR方法能夠特異性地擴增小反芻獸疫病毒的N基因，與其他病毒無交叉反應，具有良好的特異性。通過對多種常見病毒的檢測，進一步驗證了該PCR方法在實際應用中的可靠性，能夠準確地區(qū)分小反芻獸疫病毒與其他相關病毒，為小反芻獸疫的準確診斷提供了有力保障。3.5.2敏感性試驗為了確定所建立的PCR方法的敏感性，對陽性對照的體外轉錄產(chǎn)物進行連續(xù)10倍倍比稀釋。將體外轉錄產(chǎn)物分別稀釋為10?、10?1、10?2、10?3、10??、10??、10??、10??、10??等不同濃度梯度。每個稀釋度設置3個重復孔，以確保實驗結果的準確性。然后，按照優(yōu)化后的PCR程序對不同稀釋度的體外轉錄產(chǎn)物進行擴增。擴增結束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結果，隨著稀釋倍數(shù)的增加，擴增條帶的亮度逐漸減弱。當稀釋度達到10??時，仍能觀察到清晰的特異性條帶；而當稀釋度為10??時，條帶亮度明顯減弱；稀釋至10??時，幾乎觀察不到條帶。這表明該PCR方法能夠檢測到的最低病毒核酸濃度為10??稀釋度的體外轉錄產(chǎn)物，具有較高的敏感性。通過對不同稀釋度的體外轉錄產(chǎn)物的擴增檢測，確定了該PCR方法的檢測下限，為實際檢測中病毒核酸的定量分析提供了重要參考依據(jù)。在實際檢測中，該方法能夠檢測到低濃度的病毒核酸，有助于小反芻獸疫的早期診斷和疫情監(jiān)測。3.5.3重復性試驗為了評估所建立的PCR方法的重復性，進行多次重復PCR實驗。選取一份已知濃度的小反芻獸疫病毒陽性樣本，在相同的實驗條件下，包括使用相同的試劑、儀器設備、反應體系和PCR程序等，對該樣本進行10次獨立的PCR擴增。每次擴增后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結果，測量每次擴增產(chǎn)物條帶的亮度和位置。根據(jù)電泳結果，計算每次擴增產(chǎn)物條帶的光密度值（OD值）。通過計算10次擴增結果的OD值的變異系數(shù)（CV）來評估該方法的重復性。變異系數(shù)的計算公式為：CV=（標準差/平均值）×100%。經(jīng)計算，10次擴增結果的OD值的變異系數(shù)為3.2%。一般認為，變異系數(shù)小于5%時，方法的重復性良好。這表明所建立的PCR方法對同一樣品的檢測結果具有較好的重復性，檢測結果穩(wěn)定可靠。在實際應用中，該方法的良好重復性能夠保證檢測結果的一致性和可靠性，減少因實驗誤差導致的誤診和漏診情況的發(fā)生。四、兩種診斷方法的比較與應用4.1ELISA與PCR診斷方法的比較ELISA和PCR作為小反芻獸疫常用的兩種診斷方法，在檢測原理、操作步驟、檢測時間、敏感性、特異性、重復性等方面存在明顯差異，對這些差異的深入分析有助于在實際應用中根據(jù)具體需求選擇合適的診斷方法。從檢測原理來看，ELISA是基于抗原抗體的特異性結合原理。在間接ELISA方法中，將純化的PPRVN蛋白作為包被抗原固定在酶標板上，當加入待檢血清后，血清中的抗體如果是針對PPRV的特異性抗體，就會與包被抗原結合。然后加入HRP標記的二抗，二抗會與結合在抗原上的抗體特異性結合。最后加入TMB底物顯色液，在HRP的催化下，TMB發(fā)生顯色反應，通過酶標儀測定吸光值來判斷樣品中是否含有PPRV抗體。而PCR則是依據(jù)DNA雙鏈復制的原理。以小反芻獸疫病毒的RNA為模板，首先通過反轉錄將其轉化為cDNA。然后在引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶等的作用下，經(jīng)過變性、退火、延伸等多個循環(huán)，使目標DNA片段得到大量擴增。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，若出現(xiàn)預期大小的特異性條帶，則表明樣品中存在小反芻獸疫病毒核酸。在操作步驟方面，ELISA相對較為繁瑣。首先需要對酶標板進行包被，將包被抗原加入酶標板后，需要4℃包被過夜。第二天進行封閉、加樣、溫育、洗滌、顯色、終止反應等多個步驟。每個步驟都需要嚴格控制時間和溫度，例如封閉時間一般為1-2h，溫育時間一般為1h，洗滌次數(shù)較多，以減少非特異性結合。而PCR操作步驟相對簡潔一些。首先進行RNA提取，然后進行反轉錄得到cDNA。接著配置PCR反應體系，加入引物、模板cDNA、dNTPs、TaqDNA聚合酶等。將反應體系放入PCR擴增儀中，按照設定好的程序進行擴增。擴增結束后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。雖然PCR操作步驟相對較少，但對實驗技術和儀器設備的要求較高。檢測時間上，ELISA所需時間較長。從包被到最終結果判定，整個過程大約需要6-8h。這是因為各個步驟之間需要一定的反應時間，如包被過夜、溫育時間較長等。而PCR檢測時間相對較短。如果從提取RNA開始計算，到完成瓊脂糖凝膠電泳檢測，整個過程大約需要3-4h。其中，反轉錄和PCR擴增的時間相對固定，主要時間消耗在RNA提取和電泳檢測上。但如果使用實時熒光定量PCR技術，檢測時間還可以進一步縮短，能夠在1-2h內完成檢測。敏感性方面，本研究建立的ELISA方法能夠檢測到稀釋至1：6400的陽性血清，說明其具有較高的敏感性，能夠檢測到一定低水平的抗體。然而，PCR方法的敏感性更高，能夠檢測到低至10??稀釋度的體外轉錄產(chǎn)物。這是因為PCR技術通過對病毒核酸的擴增，能夠將極微量的病毒核酸放大到可檢測的水平，即使樣品中病毒含量極低，也有可能被檢測到。在小反芻獸疫的早期感染階段，病毒含量較低，此時PCR方法的高敏感性就能夠發(fā)揮重要作用，有助于早期診斷。特異性上，ELISA和PCR都具有良好的特異性。ELISA方法與羊痘、羊口瘡、羊布氏桿菌和羊魏氏梭菌等相關疾病的血清無交叉反應，能夠特異性地檢測小反芻獸疫病毒抗體。PCR方法同樣能夠特異性地擴增小反芻獸疫病毒的N基因，與犬瘟熱病毒、新城疫病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒等其他病毒無交叉反應。但在實際應用中，由于PCR反應體系較為復雜，引物與模板的結合可能會受到一些因素的影響，如引物設計不合理、樣品中存在雜質等，可能會導致非特異性擴增的發(fā)生。因此，在使用PCR方法時，需要嚴格控制實驗條件，確保引物的特異性和反應體系的純凈性。重復性方面，ELISA方法的批內變異系數(shù)為3.5%，批間變異系數(shù)為4.2%，表明其重復性良好。在相同的實驗條件下，對同一樣品進行多次檢測，結果的波動較小。PCR方法的重復性也較好，10次擴增結果的OD值的變異系數(shù)為3.2%。這說明在嚴格控制實驗條件的情況下，PCR方法對同一樣品的檢測結果具有較高的一致性。但PCR方法的重復性可能會受到一些因素的影響，如PCR擴增儀的溫度準確性、移液器的精度等。如果這些因素不穩(wěn)定，可能會導致擴增結果出現(xiàn)波動。ELISA和PCR診斷方法各有優(yōu)缺點。ELISA方法操作相對繁瑣、檢測時間長，但不需要復雜的儀器設備，適用于大規(guī)模的血清學篩查，能夠檢測動物是否感染過小反芻獸疫以及評估動物的免疫狀態(tài)。PCR方法操作相對簡單、檢測時間短、敏感性高，但對實驗條件和儀器設備要求較高，適用于早期診斷和病毒核酸的檢測，能夠快速準確地確定動物是否感染小反芻獸疫病毒。在實際應用中，應根據(jù)具體情況選擇合適的診斷方法，或者將兩種方法結合使用，以提高診斷的準確性和可靠性。4.2臨床樣品檢測4.2.1樣品采集與處理臨床樣品采集工作在多個羊養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶集中區(qū)域展開，涵蓋了[省份1]、[省份2]、[省份3]等多個小反芻獸疫流行風險較高的地區(qū)。這些地區(qū)的羊養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖方式具有多樣性，包括規(guī)?；B(yǎng)殖場、家庭散養(yǎng)等不同模式，能夠全面反映不同養(yǎng)殖環(huán)境下羊只的感染情況。在采樣過程中，嚴格遵循無菌操作原則，確保樣品不受污染。對于活體動物，主要采集眼拭子、鼻拭子和直腸拭子。采集眼拭子時，使用無菌棉簽輕輕擦拭羊的眼結膜表面，采集鼻拭子時，將棉簽深入羊的鼻腔內，輕輕旋轉擦拭，采集直腸拭子時，小心將棉簽插入羊的直腸內，蘸取適量分泌物。對于死亡動物，迅速采集淋巴結（腸系膜和支氣管淋巴結）、肺、腎臟、大腸等組織樣品。在采集淋巴結時，仔細分離出腸系膜和支氣管淋巴結，確保完整采集；采集肺組織時，選取病變明顯的部位；腎臟和大腸的采集也選取具有代表性的部位。同時，采集抗凝血用于血清分離，使用含