花椒麻味物質(zhì)的制備工藝優(yōu)化分析案例目錄TOC\o"1-3"\h\u15752花椒麻味物質(zhì)的制備工藝優(yōu)化分析案例 1302251前言 1212752結(jié)果與分析 123612.1花椒麻味物質(zhì)提取條件的確立 170662.2冷石油醚除雜條件的確立 6125363.1HSCCC溶劑系統(tǒng)的選擇 1028953.2HSCCC分離結(jié)果 11279404討論 12298345小結(jié) 131前言朱羽堯等設(shè)計(jì)了基于超臨界CO2萃取和結(jié)晶純化的制備工藝（朱羽堯等2015）。薛小輝將粗提物經(jīng)過(guò)柱層析法確定得到的兩種麻味物質(zhì)（薛小輝2013）。上述方法雖然可以獲得一定純度的酰胺化合物，但是有機(jī)萃取制備麻味物質(zhì)經(jīng)有機(jī)溶劑提取后雜質(zhì)較高，而后使用柱層析法則提取時(shí)間長(zhǎng)且難以大量制備，超臨界CO2萃取法因其設(shè)備昂貴未能普遍使用；因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)麻味物質(zhì)制備方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用有機(jī)溶劑提取花椒油樹脂，再經(jīng)過(guò)石油醚除雜，后使用高速逆流色譜法進(jìn)一步純化，冷凍結(jié)晶后得到麻味物質(zhì)。該方法具有制備量大，制備時(shí)間短，易操作等優(yōu)點(diǎn)，旨在為典型酰胺類麻味物質(zhì)的制備及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。2結(jié)果與分析2.1花椒麻味物質(zhì)提取條件的確立2.1.1料液比對(duì)麻味物質(zhì)提取效果的影響圖1料液比對(duì)提取效果的影響Fig.1Theeffectofsolid-liquidratioonextraction注：不同字母表示組內(nèi)顯著性差異，顯著水平p<0.05Note:Differentlettersindicatesignificantdifferenceswithinthegroup,significantlevelp<0.05如圖所示，料液比的下降時(shí)，麻味物質(zhì)提取效果增強(qiáng)，用料體積比為1:14時(shí)的提取效果顯著優(yōu)于其他料液比。2.1.2溫度對(duì)提取效果的影響圖2溫度對(duì)提取效果的影響Fig.2Theeffectoftemperatureonextraction注：不同字母表示組內(nèi)顯著性差異，顯著水平p<0.05Note:Differentlettersindicatesignificantdifferenceswithinthegroup,significantlevelp<0.05如上圖所示，，花椒麻味物質(zhì)的提取效果隨著浸提溫度的升高逐漸增強(qiáng)，50℃時(shí)的提取效果最好。溫度繼續(xù)升高，得率不再提高不。推測(cè)可能是低溫時(shí)麻味物質(zhì)擴(kuò)散速率低，不利于的提取，隨溫度升高逐漸增大，得率有所上升，但溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致麻味物質(zhì)降解。2.1.3提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響圖3提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.3Theeffectoftimeonextraction注：不同字母表示組內(nèi)顯著性差異，顯著水平p<0.05Note:Differentlettersindicatesignificantdifferenceswithinthegroup,significantlevelp<0.05從圖3可以看出，麻味物質(zhì)提取效果隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。8h和9h之間，得率明顯提高，10h時(shí)得率為最大值，而后得率緩慢下降。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，麻味物質(zhì)可能被改變性質(zhì)，得率會(huì)下降。。2.1.4正交試驗(yàn)表3L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果測(cè)定Table3L9（34）orthogonaltestdesignanddeterminationresults試驗(yàn)序號(hào)Testnumber因素/FactorsA料液比（g/mL）B提取溫度（℃）C提取時(shí)間（h）得率（%）13315.4421236.3033136.3841325.6552337.2963226.5472216.0382125.8391115.54K11.3021.3231.165K21.5721.3971.464K31.2291.3831.474k10.4340.4410.388k20.5240.4660.488k30.4100.4610.491R0.1230.0250.103主次順序A>C>B最優(yōu)水平A2B3C3最優(yōu)組合A2B3C3正交試驗(yàn)結(jié)果，見表1和表3。如表3所示，3個(gè)因素對(duì)麻味物質(zhì)得率的影響的程度關(guān)系依次為A＞B＞C。由R值得出最佳條件為A2B2C2。1:14、55℃、11h，為花椒麻味物質(zhì)粗提取的最佳工藝條件。在此條件：11h，55℃，1:14下，所得到的麻味物質(zhì)的平均得率為7.30%，三次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)穩(wěn)定，說(shuō)明此工藝條件是可靠的。2.2冷石油醚除雜條件的確立2.2.1石油醚用量的確定圖4料液比對(duì)除雜效果的影響Fig.4Theeffectofsolid-liquidratioonimpurityremovaleffect注：不同字母表示組內(nèi)顯著性差異，顯著水平p<0.05Note:Differentlettersindicatesignificantdifferenceswithinthegroup,significantlevelp<0.05如上圖所示，麻味物質(zhì)的純度隨著石油醚用量的增加而明顯增加后緩慢降低，但當(dāng)石油醚用量增大到一定程度以后，其純度基本上已趨于平穩(wěn)，變化幅度減小。從節(jié)約溶劑的。最終選擇最佳的料液比為1：3。2.2.2石油醚除雜時(shí)間的確定圖5提取時(shí)間對(duì)吸光度值的影響Fig.5Theeffectoftimeontheabsorbance注：不同字母表示組內(nèi)顯著性差異，顯著水平p<0.05Note:Differentlettersindicatesignificantdifferenceswithinthegroup,significantlevelp<0.05如上圖所示，麻味物質(zhì)的純度隨著時(shí)間的增加先增減后減少，當(dāng)除雜時(shí)間為2h時(shí)純度最高達(dá)到最大值，而后純度逐漸下降。故選擇最佳的除雜時(shí)間為2.0h。2.3熱石油醚精制條件的確定2.3.1熱石油醚用量的確定圖6料液比對(duì)純度的影響Fig.6Theeffectofsolid-liquidratioonpurity注：不同字母表示組內(nèi)顯著性差異，顯著水平p<0.05Note:Differentlettersindicatesignificantdifferenceswithinthegroup,significantlevelp<0.05如上圖所示，隨著熱石油醚用量的增加，精制后的麻味物質(zhì)的純度逐漸提高，當(dāng)料液比為1:5時(shí)，純度提高不明顯。溶劑用量增加，純度不再顯著提高。并且為了不浪費(fèi)溶解故選擇料液比為1：4。2.3.2精制時(shí)間的確定圖7提取時(shí)間對(duì)純度的影響Fig.7Theeffectoftimeonpurity注：不同字母表示組內(nèi)顯著性差異，顯著水平p<0.05Note:Differentlettersindicatesignificantdifferenceswithinthegroup,significantlevelp<0.05如上圖所示，精制后麻味物質(zhì)的純度隨著精制時(shí)間的增加而先提高后減少，2h以后，純度顯著降低，實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中花椒樣品顏色變深并且更加粘稠，性質(zhì)發(fā)生改變。因此，選擇精制時(shí)間為2h。2.3.3精制溫度的確定圖8溫度對(duì)純度的影響Fig.8Theeffectoftemperatureonpurity注：不同字母表示組內(nèi)顯著性差異，顯著水平p<0.05Note:Differentlettersindicatesignificantdifferenceswithinthegroup,significantlevelp<0.05如上圖所示，石油醚精制后麻味物質(zhì)的純度隨著溫度的增加而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，溫度在50℃以后，純度開始減小?？赡苁沁^(guò)高的溫度對(duì)改變花椒麻味物質(zhì)的性質(zhì)。所以選擇石油醚精制溫度為50℃。2.3.4正交試驗(yàn)

表4L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果測(cè)定Table4L9（34）orthogonaltestdesignanddeterminationresults試驗(yàn)序號(hào)Testnumber因素/FactorsA料液比（g/mL）B溫度（℃）C時(shí)間（h）純度（%）133169.97212372.85331375.50413282.47523378.86632281.51722189.20821265.64911175.01K12.3032.16152.3418K22.33702.43562.2961K32.26972.31292.2721k10.76780.72050.7806k20.77900.81190.7654k30.75660.77100.7574R0.02240.09140.0232主次順序B>C>A最優(yōu)水平A2B2C1最優(yōu)組合A2B2C1由表4的正交結(jié)果可知，因素對(duì)純度的影響程度依次為B>C>A，由R值可得到最佳的條件為A2B2C1，即料液比為l：4，50℃，1.5h。在此條件：料液比為l：4，50℃，1.5h，可獲得麻味物質(zhì)的純度為89.21%，表明由正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的條件是穩(wěn)定可行的。3.1HSCCC溶劑系統(tǒng)的選擇為進(jìn)一步提純麻味物質(zhì)，采用高速逆流色譜法對(duì)精制后的產(chǎn)物進(jìn)行純化。為了達(dá)到更好的純化效果，首先對(duì)溶劑系統(tǒng)進(jìn)行了選擇。表5不同溶劑體系分層時(shí)間和分配系數(shù)Table5Settlingtimeofdifferenttwo-phasesolventsystemsandpartitioncoefficientsofsample溶劑體系比例(V/V)沉降時(shí)間/s分配系數(shù)(K)123正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水3:5:3:5240.450.380.292:5:5:3180.580.640.69乙酸乙酯-乙醇-水2:1:2130.330.250.14氯仿-甲醇-水4:2:2301.231.181.09，當(dāng)K＜＜0.5時(shí)，出峰快，分離度較差；當(dāng)K＞＞1時(shí)，時(shí)間長(zhǎng)，且峰形寬。根據(jù)表1的數(shù)據(jù)，選取正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水溶劑體系，比例為2∶5∶5∶3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如上圖，此體系可以分離出3種典型花椒麻味物質(zhì)且圖譜峰型較好。3.2HSCCC分離結(jié)果圖9花椒麻素粗提物高效逆流色譜分離圖譜Fig.9HSCCCchromatogramofcrudeextractofZanthoxylumbungeanumMaxim.圖10分離前HPLC色譜圖Fig.10HPLCchromatogrambeforeseparation圖112號(hào)分離峰的HPLC色譜圖Fig.11HPLCchromatogramofNo.2separationpeak1號(hào)和3號(hào)峰為雜質(zhì)峰，2號(hào)峰為三種典型酰胺類物質(zhì)。經(jīng)檢測(cè)2號(hào)峰中的麻味物質(zhì)為羥基-ε-山椒素、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素，總純度為94.21%，總得率為7.80%。4討論傳統(tǒng)方法制備麻味物質(zhì)經(jīng)有機(jī)溶劑提取后雜質(zhì)較高，而后使用柱層析法則提取時(shí)間長(zhǎng)且難以大量制備。莫彬彬等采用超臨界CO2分步萃取麻味物質(zhì)，提取物得率為2.0%（莫彬彬等2009）。江燕竹以石油醚為溶劑，使用大孔樹脂精制除雜后，純化花椒麻味物質(zhì)，但是大孔吸附樹脂與制備型高效液相色譜純化過(guò)程復(fù)雜且處理時(shí)間長(zhǎng)（江燕竹2016）。與上述方法相比，本文方法富集和純化酰胺類化合物具有操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、制備量大等優(yōu)點(diǎn)，一次性可進(jìn)樣60mg石油醚精制產(chǎn)物，得到典型酰胺類物質(zhì)羥基-ε-山椒素、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素，總純度為94.21%，平均得率為7.30%。此方法一次分離即可獲得高純度的酰胺類化合物，極大的提高了制備效率。本實(shí)驗(yàn)改善了麻味物質(zhì)制備方法，經(jīng)過(guò)石油醚除雜并且使用高速逆流色譜法進(jìn)一步純化，縮短了操作時(shí)間，提高了提取純度，可為典型酰胺類麻味物質(zhì)的制備提供參考。5小結(jié)實(shí)驗(yàn)提出了以花椒果皮為原料，采用有機(jī)溶劑萃取，石油醚除雜，高速逆流色譜法純化，冷凍結(jié)