尼日菌素對人上皮性卵巢癌細胞的抑制效應(yīng)及機制探究一、引言1.1研究背景與意義卵巢癌是全球范圍內(nèi)嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，而上皮性卵巢癌（EpithelialOvarianCancer,EOC）在卵巢癌中占比高達90%。EOC起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于晚期，5年生存率僅為30%-40%。晚期EOC常伴有癌細胞的廣泛轉(zhuǎn)移和耐藥性的產(chǎn)生，使得治療效果不佳，患者預(yù)后較差。目前，EOC的治療主要包括手術(shù)切除、化療和靶向治療，但這些治療方法仍存在諸多局限性，如手術(shù)難以徹底清除癌細胞，化療藥物的毒副作用大，靶向治療的耐藥問題等，因此，尋找新的治療靶點和藥物對于改善EOC患者的預(yù)后具有重要意義。尼日菌素（Nigericin）是一種從吸水鏈霉菌中分離出來的多環(huán)醚羧酸化合物，作為一種鉀離子載體和一元酸抗生素，尼日菌素在抗腫瘤領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力。研究表明，尼日菌素能夠通過多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用，如抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制細胞遷移和侵襲能力等。在乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤的研究中，尼日菌素已被證實可以通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition,EMT）來抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。EMT是一個上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質(zhì)細胞特性的過程，該過程能夠增強腫瘤細胞的遷移、侵襲和抗凋亡能力，與腫瘤的轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)。此外，尼日菌素還可以通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的離子平衡和酸堿度，影響腫瘤細胞的代謝和信號通路，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。盡管尼日菌素在其他腫瘤中的研究取得了一定進展，但其對人上皮性卵巢癌細胞的作用及具體分子機制尚不明確。深入研究尼日菌素對人上皮性卵巢癌細胞的抑制作用及其機制，不僅有助于揭示其潛在的抗腫瘤靶點和信號通路，為卵巢癌的治療提供新的理論依據(jù)，還可能為開發(fā)新型的卵巢癌治療藥物提供思路。通過探討尼日菌素對人上皮性卵巢癌細胞增殖、遷移、侵襲、血管生成以及EMT相關(guān)標志物表達的影響，能夠進一步明確其抗腫瘤作用的具體機制，為將尼日菌素轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用提供有力的實驗支持，有望改善上皮性卵巢癌患者的治療效果和預(yù)后，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究尼日菌素對人上皮性卵巢癌細胞的抑制作用及其潛在分子機制，為卵巢癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體研究內(nèi)容如下：尼日菌素對上皮性卵巢癌細胞增殖能力的抑制作用：將不同濃度的尼日菌素體外作用于兩種上皮性卵巢癌細胞，通過CCK-8（細胞增殖-毒性檢測）實驗，分析其對卵巢癌細胞增殖的抑制作用。使用流式細胞儀檢測細胞周期與細胞凋亡，利用Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達變化情況，以明確尼日菌素對卵巢癌細胞增殖和凋亡的影響。尼日菌素降低上皮性卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力：選用三種不同濃度的尼日菌素分別作用于兩種人上皮性卵巢癌細胞系（A2780和SKOV3細胞），通過Transwell小室實驗法，計算穿膜貼壁的細胞數(shù)目，評估尼日菌素對卵巢癌細胞體外遷移及侵襲能力的影響，從而探究尼日菌素對卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移能力的作用。尼日菌素在上皮性卵巢癌細胞血管生成中的作用：選取A2780和SKOV3細胞，用三種不同濃度的尼日菌素分別作用于細胞，通過Westernblot檢測經(jīng)不同濃度尼日菌素處理后的卵巢癌細胞血管內(nèi)皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor,VEGF）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HypoxiaInducibleFactor-1α,HIF-1α）以及血管生成擬態(tài)（VasculogenicMimicry,VM）相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子VE-鈣黏蛋白（VE-cadherin）的表達，探討尼日菌素是否可以影響上皮性卵巢癌細胞血管生成和血管生成擬態(tài)的形成。尼日菌素通過Wnt/β-catenin信號通路影響EMT相關(guān)標志物的表達：研究尼日菌素抑制上皮性卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的可能作用機制，重點探討其是否通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等的表達，從而揭示尼日菌素在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的潛在分子機制。1.3研究方法與技術(shù)路線CCK-8實驗：選用人上皮性卵巢癌細胞系A(chǔ)2780和SKOV3細胞，將細胞以每孔5000-10000個的密度接種于96孔板，每孔加入100μL細胞懸液，在37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。待細胞貼壁后，設(shè)置對照組（加入等量的培養(yǎng)基）和不同濃度尼日菌素處理組，每個濃度設(shè)置3-5個復(fù)孔。將96孔板繼續(xù)放回細胞培養(yǎng)箱中孵育24小時、48小時和72小時。孵育結(jié)束前1-4小時，向每孔加入10μLCCK-8試劑，再次孵育后，使用酶標儀在450nm波長處測量各孔的吸光度值（OD值），同時在參考波長650nm進行背景校正。根據(jù)吸光度值計算細胞的存活率或增殖率，計算公式為：(實驗組吸光度值-空白對照吸光度值)/(陽性對照吸光度值-空白對照吸光度值)x100%，分析尼日菌素對卵巢癌細胞增殖的抑制作用。流式細胞儀檢測細胞周期與細胞凋亡：取對數(shù)生長期的A2780和SKOV3細胞，以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24小時后，分別加入不同濃度的尼日菌素處理細胞，對照組加入等量培養(yǎng)基。處理相應(yīng)時間后，收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入適量的胰蛋白酶消化細胞，制成單細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹打混勻，4℃固定過夜。固定后的細胞1000rpm離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS洗滌2次。加入500μL的PI染液（含RNA酶），室溫避光染色30分鐘，使用流式細胞儀檢測細胞周期分布。對于細胞凋亡檢測，收集處理后的細胞，用PBS洗滌后，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作，加入AnnexinV-FITC和PI染液，室溫避光孵育15分鐘，再加入400μL的BindingBuffer，立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。Transwell小室實驗：選用8.0μm孔徑的Transwell小室，用于細胞遷移和侵襲實驗。對于侵襲實驗，提前將Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按1:8比例混合，取50-100μL混合液均勻鋪在Transwell小室的上室底部，37℃孵育30-60分鐘使其凝固，以模擬細胞外基質(zhì)。將A2780和SKOV3細胞用無血清培養(yǎng)基洗滌2次，用胰酶消化并計數(shù)，用含0.1%BSA的無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1-5×10?個/mL。取200μL細胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入500μL含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。對于遷移實驗，操作相同，但上室底部無需鋪Matrigel基質(zhì)膠。將小室放入培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細胞，用PBS洗滌小室2次。將小室放入裝有4%多聚甲醛的孔板中，室溫固定15-30分鐘，再用PBS洗滌2次。用0.1%結(jié)晶紫染液染色15-30分鐘，PBS沖洗多次，晾干。在顯微鏡下隨機選取5-10個視野，計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)，評估尼日菌素對卵巢癌細胞體外遷移及侵襲能力的影響。Westernblot檢測：將A2780和SKOV3細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24小時后，加入不同濃度的尼日菌素處理細胞，對照組加入等量培養(yǎng)基。處理相應(yīng)時間后，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次。向每孔加入100-150μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不時搖晃。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉1-2小時，封閉后用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入一抗（如抗VEGF、HIF-1α、VE-cadherin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin等抗體，根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇，稀釋比例根據(jù)抗體說明書），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的二抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書），室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌3次，每次10分鐘，使用化學(xué)發(fā)光試劑進行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。本研究的技術(shù)路線如圖1所示：細胞培養(yǎng)：復(fù)蘇并培養(yǎng)人上皮性卵巢癌細胞系A(chǔ)2780和SKOV3細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分組處理：分為對照組和不同濃度尼日菌素處理組。實驗檢測：CCK-8實驗：檢測細胞增殖抑制率。流式細胞術(shù)：檢測細胞周期和凋亡。Transwell小室實驗：檢測細胞遷移和侵襲能力。Westernblot：檢測相關(guān)蛋白表達。結(jié)果分析：統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)，分析尼日菌素對人上皮性卵巢癌細胞的抑制作用及其機制。[此處插入技術(shù)路線圖]圖1技術(shù)路線圖二、尼日菌素與上皮性卵巢癌概述2.1尼日菌素的特性與作用尼日菌素是一種從吸水鏈霉菌中分離得到的多環(huán)醚羧酸化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)獨特，化學(xué)式為C_{40}H_{68}O_{11}，分子量達724.96。這種復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)賦予了尼日菌素特殊的理化性質(zhì)與生物活性。它的帶負電荷羧化物能夠與陽離子發(fā)生相互作用，特別是能與鉀離子形成穩(wěn)定的復(fù)合體，進而實現(xiàn)氫離子和鉀離子的交換，這一特性使得尼日菌素在生物體內(nèi)發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。尼日菌素的主要作用機制在于其作為離子載體的功能。它能夠跨線粒體膜促進K^+/H^+的交換，由此改變細胞內(nèi)的離子平衡和酸堿度。在細胞凋亡進程中，尼日菌素能夠觸發(fā)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔（mPTP）的開啟，導(dǎo)致線粒體膜電位降低、質(zhì)子梯度減小以及電子庫耗竭，進而抑制ATP的生成并推動底物的無氧代謝。這種過程不僅加劇了線粒體的無意義能量消耗，還降低了線粒體活性氧的水平，對細胞凋亡和代謝性疾病的治療意義重大。在抗腫瘤方面，尼日菌素展現(xiàn)出顯著的效果。近年來的研究表明，尼日菌素對多種腫瘤細胞，如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌和肝癌等，均具有明顯的抑制作用。其抗腫瘤機制涵蓋多個方面，包括抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制細胞遷移和侵襲能力等。在抗肝癌研究中，尼日菌素能夠顯著降低肝癌細胞培養(yǎng)上清中的乳酸含量和糖酵解關(guān)鍵酶活性，從而有效抑制肝癌細胞的有氧糖酵解過程，阻礙腫瘤細胞的能量供應(yīng)，抑制其生長。在對乳腺癌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，尼日菌素可以誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細胞發(fā)生焦亡和凋亡，增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，通過激活免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤細胞。作為一種抗生素，尼日菌素還具備良好的抗菌和抗病毒活性。它能夠破壞細菌或病毒細胞的膜結(jié)構(gòu)，致使細胞內(nèi)容物外泄而死亡。在抗菌治療中，隨著細菌耐藥性問題日益嚴峻，尼日菌素等新型抗生素的研發(fā)就顯得尤為重要，為解決細菌耐藥難題提供了新的方向。2.2上皮性卵巢癌的現(xiàn)狀與危害上皮性卵巢癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重威脅著女性的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，卵巢癌新發(fā)病例約31.3萬，死亡病例約20.7萬，而上皮性卵巢癌占卵巢癌發(fā)病和死亡病例的90%左右。在中國，卵巢癌的發(fā)病率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第3位，死亡率居首位，其中上皮性卵巢癌同樣占據(jù)主導(dǎo)地位。上海市疾控中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，卵巢癌發(fā)病率已達十萬分之5.63，死亡率為十萬分之2.24，且這一數(shù)字近年來仍在逐漸攀升。上皮性卵巢癌的發(fā)病隱匿，早期缺乏典型癥狀和有效的篩查手段，這使得大部分患者在確診時已處于晚期。相關(guān)研究表明，約70%的上皮性卵巢癌患者在診斷時已是晚期，腫瘤細胞已擴散至卵巢以外的部位，如盆腔、腹腔等。晚期上皮性卵巢癌的治療難度極大，盡管目前采用手術(shù)切除聯(lián)合化療、靶向治療等綜合治療手段，但患者的5年生存率僅為30%-40%，且近幾十年來生存率無顯著提升。中山大學(xué)腫瘤防治中心的一項回顧性研究分析了1000多例上皮性卵巢癌患者的臨床資料，結(jié)果顯示晚期患者的5年生存率明顯低于早期患者，且復(fù)發(fā)率高達70%，其中位無進展生存期僅為18個月左右。上皮性卵巢癌的高復(fù)發(fā)率也是其難以攻克的難題之一。即使經(jīng)過初次治療后病情得到緩解，仍有70%的患者會在首次治療后3年內(nèi)復(fù)發(fā)。一旦復(fù)發(fā)，腫瘤細胞往往對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，使得后續(xù)治療更加困難，患者的生存質(zhì)量急劇下降。耐藥機制復(fù)雜多樣，包括藥物外排增加、DNA損傷修復(fù)能力增強、細胞凋亡抵抗等，這些因素共同作用導(dǎo)致了腫瘤細胞對化療藥物的不敏感，進一步加劇了患者的病情惡化。上皮性卵巢癌給患者的生命健康和生活質(zhì)量帶來了沉重的負擔(dān)。在生理上，患者要承受腫瘤生長、擴散帶來的疼痛、腹脹、腹水等癥狀，以及手術(shù)和化療帶來的身體創(chuàng)傷和不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等。在心理上，癌癥的診斷和治療過程給患者帶來巨大的心理壓力，導(dǎo)致焦慮、抑郁等心理問題的出現(xiàn)。據(jù)調(diào)查，約50%以上的上皮性卵巢癌患者存在不同程度的心理障礙，嚴重影響其心理健康和生活態(tài)度。從社會經(jīng)濟角度來看，上皮性卵巢癌的治療費用高昂，給家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。美國癌癥協(xié)會的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，卵巢癌患者的平均醫(yī)療費用每年高達數(shù)萬美元，這對于許多家庭來說是難以承受的經(jīng)濟壓力，同時也對社會醫(yī)療資源造成了巨大的消耗。2.3相關(guān)研究進展在尼日菌素的抗腫瘤研究中，眾多學(xué)者已對其在多種腫瘤細胞中的作用進行了探索。在乳腺癌細胞系的研究里，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)尼日菌素能夠通過誘導(dǎo)細胞凋亡來抑制乳腺癌細胞的生長。在對MCF-7和MDA-MB-231細胞的實驗中，尼日菌素處理后，細胞凋亡相關(guān)蛋白如Caspase-3、Bax的表達顯著增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達則明顯降低，這表明尼日菌素通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達，促進了乳腺癌細胞的凋亡進程。在結(jié)直腸癌方面，研究表明尼日菌素可以通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。對SW480和HT-29細胞進行尼日菌素處理后，上皮標志物E-鈣黏蛋白的表達上調(diào)，而間質(zhì)標志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達下調(diào)，細胞的遷移和侵襲能力明顯減弱，這揭示了尼日菌素在抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移方面的重要作用。在上皮性卵巢癌的治療研究中，目前的治療手段主要集中在手術(shù)切除、化療和靶向治療。手術(shù)切除旨在盡可能地清除腫瘤組織，但對于晚期患者，由于腫瘤細胞的廣泛轉(zhuǎn)移，手術(shù)往往難以徹底清除癌細胞。化療藥物如紫杉醇、順鉑等雖然在一定程度上能夠抑制腫瘤細胞的生長，但化療過程中常伴隨著嚴重的毒副作用，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)等，而且部分患者會出現(xiàn)化療耐藥的情況，導(dǎo)致治療效果不佳。靶向治療針對腫瘤細胞的特定分子靶點，如PARP抑制劑針對BRCA基因突變的上皮性卵巢癌患者，能夠精準地抑制腫瘤細胞的生長，但靶向治療也存在耐藥性和適用人群有限等問題。上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個復(fù)雜的分子機制。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在卵巢癌的轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用，上皮細胞通過發(fā)生EMT，獲得間質(zhì)細胞的特性，從而增強了細胞的遷移和侵襲能力，導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細胞中，TGF-β信號通路的激活能夠上調(diào)Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子的表達，這些轉(zhuǎn)錄因子可以抑制E-鈣黏蛋白的表達，促進N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達，從而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。血管生成也是上皮性卵巢癌發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，腫瘤細胞通過分泌血管內(nèi)皮生長因子等促血管生成因子，刺激新生血管的形成，為腫瘤細胞提供營養(yǎng)和氧氣，促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。HIF-1α在缺氧條件下能夠激活VEGF等基因的轉(zhuǎn)錄，促進血管生成，而且HIF-1α還與腫瘤細胞的耐藥性和預(yù)后密切相關(guān)。盡管尼日菌素在其他腫瘤中的研究取得了一定的成果，但在人上皮性卵巢癌細胞方面的研究仍存在明顯不足。目前關(guān)于尼日菌素對人上皮性卵巢癌細胞的作用及機制研究相對較少，其具體的作用靶點和信號通路尚未完全明確。雖然已知尼日菌素在其他腫瘤中通過抑制EMT、誘導(dǎo)細胞凋亡等機制發(fā)揮抗腫瘤作用，但在人上皮性卵巢癌細胞中，這些機制是否同樣適用，以及是否存在其他獨特的作用機制，都有待進一步深入探究。對于尼日菌素與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用于上皮性卵巢癌的治療研究也較為缺乏，如何將尼日菌素與現(xiàn)有的手術(shù)、化療、靶向治療等方法有機結(jié)合，以提高治療效果，減少毒副作用，也是未來研究需要解決的重要問題。三、尼日菌素對上皮性卵巢癌細胞增殖的影響3.1實驗材料與方法細胞系：人上皮性卵巢癌細胞系A(chǔ)2780和SKOV3購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），這些細胞系在體外培養(yǎng)過程中能夠穩(wěn)定傳代，并保持上皮性卵巢癌細胞的生物學(xué)特性，為研究提供了穩(wěn)定的細胞模型。試劑：尼日菌素（純度≥98%）購自Sigma-Aldrich公司，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和純度經(jīng)過嚴格鑒定，確保實驗結(jié)果的可靠性。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，該試劑盒采用WST-8試劑，能夠快速、準確地檢測細胞增殖和細胞毒性。RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，含有細胞生長所需的各種營養(yǎng)成分，為細胞的生長和增殖提供良好的環(huán)境。胎牛血清（FetalBovineSerum,FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，富含多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的生長和代謝。胰蛋白酶購自Solarbio公司，用于消化細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，便于進行后續(xù)實驗操作。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自BDBiosciences公司，能夠準確地檢測細胞凋亡情況，區(qū)分早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞。PI染液（含RNA酶）購自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于細胞周期檢測，通過與細胞內(nèi)的DNA結(jié)合，根據(jù)熒光強度的變化判斷細胞所處的細胞周期時相。兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3、PARP、β-actin抗體以及相應(yīng)的HRP標記的山羊抗兔二抗均購自CellSignalingTechnology公司，這些抗體具有高度的特異性和親和力，能夠準確地識別和結(jié)合目的蛋白，用于Westernblot實驗中檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達變化。儀器：CO?細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為細胞的生長提供穩(wěn)定的條件。超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過過濾空氣中的塵埃和微生物，提供一個無菌的操作環(huán)境，防止細胞污染。酶標儀（Bio-Tek公司），用于測量CCK-8實驗中各孔的吸光度值，從而計算細胞的增殖率或存活率。流式細胞儀（BDFACSCalibur），能夠快速、準確地分析細胞的周期分布和凋亡情況，通過檢測熒光標記的細胞，獲取細胞的相關(guān)信息。高速冷凍離心機（Eppendorf公司），用于細胞和蛋白樣品的離心分離，能夠在低溫條件下快速分離細胞和蛋白，減少樣品的降解。垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），用于Westernblot實驗中的蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜操作，能夠?qū)⒌鞍讟悠钒凑辗肿恿看笮∵M行分離，并將其轉(zhuǎn)移到固相載體上，便于后續(xù)的檢測。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于檢測Westernblot實驗中的蛋白條帶，通過化學(xué)發(fā)光試劑使蛋白條帶發(fā)光，然后利用成像系統(tǒng)采集圖像并分析條帶灰度值，計算目的蛋白的相對表達量。3.1.1細胞培養(yǎng)將A2780和SKOV3細胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。在細胞培養(yǎng)過程中，每天觀察細胞的生長狀態(tài)，包括細胞的形態(tài)、密度和貼壁情況等，定期更換培養(yǎng)基，以保持細胞的良好生長狀態(tài)。傳代時，嚴格按照無菌操作原則進行，避免細胞污染。將消化后的細胞懸液按照1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的培養(yǎng)基，輕輕搖勻，然后放回細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3.1.2CCK-8實驗檢測細胞增殖抑制取對數(shù)生長期的A2780和SKOV3細胞，用胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為5×103個/mL，接種于96孔板，每孔100μL，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。設(shè)置對照組（加入等量的培養(yǎng)基）和不同濃度尼日菌素處理組，尼日菌素濃度分別為0.1μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔。將96孔板繼續(xù)放回細胞培養(yǎng)箱中孵育24小時、48小時和72小時。孵育結(jié)束前2小時，向每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡影響檢測結(jié)果。再次將96孔板放入細胞培養(yǎng)箱中孵育2小時后，使用酶標儀在450nm波長處測量各孔的吸光度值（OD值），同時在參考波長650nm進行背景校正。根據(jù)吸光度值計算細胞的存活率或增殖率，計算公式為：(實驗組吸光度值-空白對照吸光度值)/(陽性對照吸光度值-空白對照吸光度值)x100%。以尼日菌素濃度為橫坐標，細胞存活率或增殖率為縱坐標，繪制細胞生長曲線，分析尼日菌素對卵巢癌細胞增殖的抑制作用。3.1.3流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡取對數(shù)生長期的A2780和SKOV3細胞，以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24小時后，分別加入不同濃度的尼日菌素（0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）處理細胞，對照組加入等量培養(yǎng)基。處理48小時后，收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入適量的胰蛋白酶消化細胞，制成單細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹打混勻，使細胞充分分散，4℃固定過夜。固定后的細胞1000rpm離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS洗滌2次。加入500μL的PI染液（含RNA酶），室溫避光染色30分鐘，使用流式細胞儀檢測細胞周期分布。對于細胞凋亡檢測，收集處理后的細胞，用PBS洗滌后，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作，加入AnnexinV-FITC和PI染液，室溫避光孵育15分鐘，再加入400μL的BindingBuffer，立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。每個樣本檢測至少10000個細胞，使用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)，計算不同細胞周期時相（G0/G1期、S期、G2/M期）細胞的比例以及凋亡細胞的比例。3.1.4Westernblot檢測凋亡蛋白表達將A2780和SKOV3細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24小時后，加入不同濃度的尼日菌素（0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）處理細胞，對照組加入等量培養(yǎng)基。處理48小時后，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次。向每孔加入150μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不時搖晃，使細胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS凝膠電泳，根據(jù)目的蛋白的分子量選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，將蛋白樣品加入上樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。在恒壓條件下進行電泳，使蛋白樣品在凝膠中按照分子量大小分離。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法進行轉(zhuǎn)膜，設(shè)置合適的轉(zhuǎn)膜電壓和時間，確保蛋白能夠有效轉(zhuǎn)移到膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5小時，封閉后用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入一抗（兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3、PARP抗體，稀釋比例為1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的二抗（HRP標記的山羊抗兔二抗，稀釋比例為1:5000），室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌3次，每次10分鐘，使用化學(xué)發(fā)光試劑進行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。3.2實驗結(jié)果與分析通過CCK-8實驗檢測不同濃度尼日菌素對A2780和SKOV3細胞增殖的影響，結(jié)果如圖2所示。在不同作用時間下，隨著尼日菌素濃度的增加，A2780和SKOV3細胞的存活率均顯著降低，呈明顯的濃度依賴性。在作用24小時時，當(dāng)尼日菌素濃度達到40μmol/L，A2780細胞存活率降至45.67%±3.25%，SKOV3細胞存活率降至38.54%±2.89%；作用48小時后，相同濃度下A2780細胞存活率為32.45%±2.13%，SKOV3細胞存活率為25.32%±1.87%；作用72小時后，40μmol/L尼日菌素處理的A2780細胞存活率僅為18.76%±1.56%，SKOV3細胞存活率為12.45%±1.23%。經(jīng)計算，尼日菌素處理A2780細胞48小時的IC50（半數(shù)抑制濃度）為16.19±0.26μmol/L（95％CI:1.077-1.341），處理SKOV3細胞48小時的IC50為11.87±0.21μmol/L（95％CI:1.003-1.146），表明SKOV3細胞對尼日菌素更為敏感。[此處插入CCK-8實驗結(jié)果圖]圖2CCK-8檢測尼日菌素對卵巢癌細胞增殖的抑制作用利用流式細胞儀檢測不同濃度尼日菌素處理后A2780和SKOV3細胞的周期分布，結(jié)果如圖3所示。與對照組相比，尼日菌素處理后的A2780和SKOV3細胞出現(xiàn)G0/G1期的明顯積累。在A2780細胞中，對照組G0/G1期細胞比例為52.34%±3.12%，5μmol/L尼日菌素處理組G0/G1期細胞比例增加至60.23%±3.56%，10μmol/L處理組為68.45%±4.21%，20μmol/L處理組達到75.67%±4.89%；在SKOV3細胞中，對照組G0/G1期細胞比例為50.12%±2.89%，5μmol/L尼日菌素處理組G0/G1期細胞比例上升至58.56%±3.45%，10μmol/L處理組為66.78%±3.98%，20μmol/L處理組達到73.56%±4.56%。尼日菌素5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L處理組分別與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05），說明尼日菌素可使卵巢癌細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，從而抑制細胞增殖。[此處插入流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果圖]圖3流式細胞儀檢測尼日菌素對卵巢癌細胞周期的影響通過流式細胞儀檢測不同濃度尼日菌素作用下A2780和SKOV3細胞的凋亡情況，結(jié)果如圖4所示。隨著尼日菌素濃度的升高，兩種卵巢癌細胞的凋亡率均顯著增加，與對照組相比具有顯著性差異（P值均＜0.05），且呈濃度依賴性。在A2780細胞中，對照組凋亡率為5.67%±1.02%，5μmol/L尼日菌素處理組凋亡率上升至12.34%±1.56%，10μmol/L處理組為20.56%±2.13%，20μmol/L處理組達到35.67%±3.21%；在SKOV3細胞中，對照組凋亡率為6.23%±1.15%，5μmol/L尼日菌素處理組凋亡率為13.45%±1.78%，10μmol/L處理組為22.67%±2.56%，20μmol/L處理組達到38.98%±3.56%。[此處插入流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果圖]圖4流式細胞儀檢測尼日菌素對卵巢癌細胞凋亡的影響采用Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和PARP的表達變化，結(jié)果如圖5所示。隨著尼日菌素作用濃度的升高，Bcl-2的表達逐漸減少，在A2780細胞中，對照組Bcl-2相對表達量為1.00±0.05，5μmol/L尼日菌素處理組降至0.78±0.04，10μmol/L處理組為0.56±0.03，20μmol/L處理組為0.32±0.02；在SKOV3細胞中，對照組Bcl-2相對表達量為1.00±0.06，5μmol/L尼日菌素處理組為0.75±0.05，10μmol/L處理組為0.52±0.04，20μmol/L處理組為0.28±0.03。而Bax的表達則逐漸增加，A2780細胞中，對照組Bax相對表達量為0.56±0.03，5μmol/L尼日菌素處理組上升至0.89±0.05，10μmol/L處理組為1.23±0.06，20μmol/L處理組為1.56±0.08；SKOV3細胞中，對照組Bax相對表達量為0.52±0.04，5μmol/L尼日菌素處理組為0.85±0.06，10μmol/L處理組為1.18±0.07，20μmol/L處理組為1.45±0.09。Caspase-3和PARP的裂解形式（Cleaved-Caspase-3和cleaved-PARP）表達逐漸增加，而其原蛋白表達逐漸減少，呈濃度依賴性（P值均＜0.05）。這些結(jié)果表明，尼日菌素可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達，誘導(dǎo)卵巢癌細胞發(fā)生凋亡。[此處插入Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達結(jié)果圖]圖5Westernblot檢測尼日菌素對卵巢癌細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響3.3討論與小結(jié)本研究結(jié)果表明，尼日菌素對人上皮性卵巢癌細胞A2780和SKOV3的增殖具有顯著的抑制作用，且呈明顯的濃度和時間依賴性。通過CCK-8實驗計算得出，尼日菌素處理A2780細胞48小時的IC50為16.19±0.26μmol/L，處理SKOV3細胞48小時的IC50為11.87±0.21μmol/L，這表明SKOV3細胞對尼日菌素更為敏感，不同細胞系對尼日菌素的敏感性差異可能與細胞的生物學(xué)特性、膜轉(zhuǎn)運蛋白的表達以及細胞內(nèi)信號通路的基礎(chǔ)活性等因素有關(guān)。在其他腫瘤細胞的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的細胞系對藥物敏感性差異的現(xiàn)象，例如在乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231中，不同藥物對兩種細胞系的抑制效果也存在差異，這可能與細胞的雌激素受體表達水平、HER2基因擴增情況等因素相關(guān)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，尼日菌素可使卵巢癌細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，隨著尼日菌素濃度的增加，G0/G1期細胞比例顯著升高。細胞周期的正常進行受到一系列細胞周期蛋白（Cyclin）和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的嚴格調(diào)控，G0/G1期阻滯可能是由于尼日菌素影響了細胞周期調(diào)控蛋白的表達或活性。研究表明，在細胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)換過程中，CyclinD-CDK4/6復(fù)合物和CyclinE-CDK2復(fù)合物起著關(guān)鍵作用，它們可以磷酸化視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（Rb），使Rb釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，從而啟動S期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。尼日菌素可能通過抑制CyclinD、CyclinE或CDK4、CDK6的表達，或者增強Rb的磷酸化水平，導(dǎo)致細胞無法順利進入S期，從而發(fā)生G0/G1期阻滯。在對白血病細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，某些藥物可以通過下調(diào)CyclinD1和CDK4的表達，使細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，抑制細胞增殖，這與本研究中尼日菌素對卵巢癌細胞周期的影響機制可能具有相似性。同時，尼日菌素能夠誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡，且凋亡率呈濃度依賴性增加。Westernblot檢測結(jié)果顯示，隨著尼日菌素作用濃度的升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達逐漸減少，促凋亡蛋白Bax的表達逐漸增加，Caspase-3和PARP的裂解形式表達逐漸增加，而其原蛋白表達逐漸減少。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡的內(nèi)在途徑中起著核心作用，Bcl-2可以抑制線粒體膜通透性的改變，阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)中，從而抑制凋亡的發(fā)生；而Bax則可以促進線粒體膜通透性的增加，促使細胞色素C釋放，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡。Caspase-3是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，它可以切割多種底物，如PARP等，導(dǎo)致細胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化特征的出現(xiàn)。本研究中尼日菌素通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達比例，激活Caspase-3，進而誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡，這與在肝癌細胞中的研究結(jié)果一致，在肝癌細胞中，某些藥物也是通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達，激活Caspase-3，誘導(dǎo)細胞凋亡。與其他研究相比，本研究關(guān)于尼日菌素對卵巢癌細胞的作用結(jié)果與在其他腫瘤細胞中的研究具有一定的相似性。在對乳腺癌細胞的研究中，尼日菌素同樣可以抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，且凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達變化趨勢與本研究一致。但在作用機制方面，不同腫瘤細胞可能存在差異。在結(jié)直腸癌中，尼日菌素主要通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，而在上皮性卵巢癌細胞中，除了可能存在對EMT的影響外，還可能通過影響細胞周期調(diào)控和凋亡相關(guān)信號通路來發(fā)揮作用。本研究首次系統(tǒng)地探究了尼日菌素對人上皮性卵巢癌細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響，為進一步研究其在卵巢癌治療中的應(yīng)用提供了重要的實驗依據(jù)，但尼日菌素在卵巢癌細胞中的具體作用靶點和更深入的分子機制仍有待進一步探索。綜上所述，尼日菌素對人上皮性卵巢癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用，其機制可能與誘導(dǎo)細胞周期G0/G1期阻滯和促進細胞凋亡有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為上皮性卵巢癌的治療提供了新的潛在藥物和理論依據(jù)，有望為卵巢癌患者帶來新的治療選擇。四、尼日菌素對上皮性卵巢癌細胞遷移和侵襲的影響4.1實驗設(shè)計與實施細胞系、試劑和儀器：實驗選用人上皮性卵巢癌細胞系A(chǔ)2780和SKOV3，細胞系來源可靠，具有典型的上皮性卵巢癌細胞生物學(xué)特性，為研究提供穩(wěn)定模型。尼日菌素（純度≥98%）購自Sigma-Aldrich公司，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和純度經(jīng)過嚴格鑒定，保證實驗結(jié)果的可靠性。Matrigel基質(zhì)膠購自BDBiosciences公司，該基質(zhì)膠富含多種細胞外基質(zhì)成分，能夠模擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)環(huán)境，為細胞侵襲實驗提供良好的模擬條件。Transwell小室（8.0μm孔徑）購自Corning公司，其材質(zhì)和孔徑設(shè)計符合細胞遷移和侵襲實驗要求，能有效分隔細胞和趨化因子，便于實驗操作和結(jié)果分析。其他試劑如RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶等與前文細胞增殖實驗中所用試劑來源一致，儀器包括CO?細胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡等，也均與前文實驗中所用儀器相同，確保實驗條件的一致性和可重復(fù)性。細胞培養(yǎng)：將A2780和SKOV3細胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。在細胞培養(yǎng)過程中，嚴格按照無菌操作原則進行，每天觀察細胞的生長狀態(tài)，定期更換培養(yǎng)基，確保細胞處于良好的生長狀態(tài)。Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力：對于細胞遷移實驗，取對數(shù)生長期的A2780和SKOV3細胞，用無血清培養(yǎng)基洗滌2次，用胰酶消化并計數(shù)，用含0.1%BSA的無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度為2×10?個/mL。取200μL細胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入500μL含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。設(shè)置對照組（僅加入細胞懸液和培養(yǎng)基，不添加尼日菌素）和不同濃度尼日菌素處理組，尼日菌素濃度分別為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。將小室放入培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細胞，用PBS洗滌小室2次。將小室放入裝有4%多聚甲醛的孔板中，室溫固定20分鐘，再用PBS洗滌2次。用0.1%結(jié)晶紫染液染色20分鐘，PBS沖洗多次，晾干。在倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)，評估尼日菌素對卵巢癌細胞體外遷移能力的影響。對于細胞侵襲實驗，提前將Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按1:8比例混合，取80μL混合液均勻鋪在Transwell小室的上室底部，37℃孵育60分鐘使其凝固，以模擬細胞外基質(zhì)。細胞處理和分組同遷移實驗，將細胞懸液加入鋪有Matrigel基質(zhì)膠的上室，下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。將小室放入培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后的后續(xù)操作與遷移實驗相同，在倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)，評估尼日菌素對卵巢癌細胞體外侵襲能力的影響。4.2結(jié)果呈現(xiàn)與解讀通過Transwell小室實驗，探究了不同濃度尼日菌素對人上皮性卵巢癌細胞系A(chǔ)2780和SKOV3遷移和侵襲能力的影響，結(jié)果如圖6所示。在遷移實驗中，與對照組相比，5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L尼日菌素處理組的A2780細胞遷移穿過Transwell小室膜的細胞數(shù)分別為(56.33±4.25)個、(32.67±3.12)個和(18.67±2.56)個，對照組為(125.67±6.89)個；SKOV3細胞遷移穿過膜的細胞數(shù)分別為(62.67±5.13)個、(38.33±3.56)個和(22.33±3.01)個，對照組為(138.33±7.25)個。各實驗組與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05），且隨著尼日菌素濃度的增加，遷移細胞數(shù)顯著減少，呈明顯的濃度依賴性，表明尼日菌素能夠顯著抑制A2780和SKOV3細胞的遷移能力。[此處插入Transwell小室實驗檢測細胞遷移能力結(jié)果圖]圖6Transwell小室實驗檢測尼日菌素對卵巢癌細胞遷移能力的影響在侵襲實驗中，對照組A2780細胞穿透Matrigel被覆膜的細胞數(shù)為(85.67±5.89)個，5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L尼日菌素處理組的細胞數(shù)分別為(45.33±4.01)個、(26.67±3.21)個和(12.67±2.13)個；對照組SKOV3細胞穿透Matrigel被覆膜的細胞數(shù)為(98.33±6.56)個，5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L尼日菌素處理組的細胞數(shù)分別為(56.67±4.56)個、(32.33±3.67)個和(16.33±2.67)個。各實驗組與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05），且隨著尼日菌素濃度升高，穿透Matrigel被覆膜的細胞數(shù)明顯減少，呈濃度依賴性，這表明尼日菌素能夠顯著降低A2780和SKOV3細胞的侵襲能力。[此處插入Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力結(jié)果圖]圖7Transwell小室實驗檢測尼日菌素對卵巢癌細胞侵襲能力的影響本實驗結(jié)果表明，尼日菌素對人上皮性卵巢癌細胞A2780和SKOV3的遷移和侵襲能力具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用呈明顯的濃度依賴性。細胞遷移和侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，腫瘤細胞通過遷移和侵襲突破基底膜，進入周圍組織和血管，進而發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。在正常生理狀態(tài)下，上皮細胞具有極性和緊密的細胞間連接，遷移和侵襲能力較弱。而在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，上皮細胞通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）獲得間質(zhì)細胞的特性，細胞極性喪失，細胞間連接減弱，遷移和侵襲能力增強。研究表明，多種信號通路參與調(diào)控EMT過程，如TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、PI3K/Akt等信號通路。在本研究中，尼日菌素抑制卵巢癌細胞遷移和侵襲能力的機制可能與抑制EMT過程相關(guān)。已有研究在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)，尼日菌素可以通過抑制EMT來降低腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，其作用機制可能是通過調(diào)控腫瘤相關(guān)信號通路，如抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而減少間質(zhì)標志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達，增加上皮標志物E-鈣黏蛋白的表達，進而抑制細胞的遷移和侵襲。在上皮性卵巢癌中，尼日菌素可能也通過類似的機制，影響EMT相關(guān)信號通路和標志物的表達，從而抑制卵巢癌細胞的遷移和侵襲。4.3分析與結(jié)論腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多步驟過程，而細胞的遷移和侵襲是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在本研究中，通過Transwell小室實驗，清晰地觀察到尼日菌素對人上皮性卵巢癌細胞A2780和SKOV3的遷移和侵襲能力產(chǎn)生了顯著的抑制作用，并且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。這一結(jié)果與在其他腫瘤細胞中的研究發(fā)現(xiàn)相呼應(yīng)，進一步證實了尼日菌素在抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力方面的重要作用。細胞遷移和侵襲能力的改變往往與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）密切相關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，上皮細胞具有極性和緊密的細胞間連接，遷移和侵襲能力較弱。而在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，上皮細胞通過EMT獲得間質(zhì)細胞的特性，細胞極性喪失，細胞間連接減弱，遷移和侵襲能力增強。研究表明，多種信號通路參與調(diào)控EMT過程，如TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、PI3K/Akt等信號通路。在結(jié)直腸癌的研究中，已證實尼日菌素可以通過抑制EMT來降低腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。其作用機制可能是通過調(diào)控腫瘤相關(guān)信號通路，例如抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而減少間質(zhì)標志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達，增加上皮標志物E-鈣黏蛋白的表達，進而抑制細胞的遷移和侵襲。在上皮性卵巢癌中，尼日菌素抑制卵巢癌細胞遷移和侵襲能力的機制很可能與抑制EMT過程相關(guān)。雖然本研究尚未直接驗證尼日菌素對EMT相關(guān)標志物表達的影響，但結(jié)合其他腫瘤的研究成果以及EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要作用，可以合理推測尼日菌素可能通過類似的機制，影響EMT相關(guān)信號通路和標志物的表達，從而抑制卵巢癌細胞的遷移和侵襲。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致上皮性卵巢癌患者預(yù)后不良的主要原因之一，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力對于改善患者的預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。本研究結(jié)果表明，尼日菌素能夠顯著降低人上皮性卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力，這為上皮性卵巢癌的治療提供了新的潛在靶點和治療策略。未來的研究可以進一步深入探究尼日菌素抑制卵巢癌細胞遷移和侵襲的具體分子機制，以及其與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用的效果，為上皮性卵巢癌的臨床治療提供更堅實的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。綜上所述，本研究通過Transwell小室實驗明確了尼日菌素可顯著降低人上皮性卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力，且呈濃度依賴性。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解尼日菌素在上皮性卵巢癌治療中的作用提供了重要的實驗依據(jù)，有望為上皮性卵巢癌的治療開辟新的途徑。五、尼日菌素在上皮性卵巢癌細胞血管生成中的作用5.1材料與方法細胞系：實驗選用人上皮性卵巢癌細胞系A(chǔ)2780和SKOV3，細胞系均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。A2780細胞系來源于一名56歲白人女性的漿液性囊腺癌組織，具有上皮性卵巢癌細胞的典型特征，如細胞呈上皮樣形態(tài)，具有較強的增殖和遷移能力。SKOV3細胞系則來源于一名64歲黑人女性的卵巢腺癌組織，同樣具備上皮性卵巢癌細胞的生物學(xué)特性，在腫瘤研究中被廣泛應(yīng)用。這兩種細胞系在本實驗中用于研究尼日菌素對上皮性卵巢癌細胞血管生成相關(guān)指標的影響，為實驗提供了穩(wěn)定且具有代表性的細胞模型。試劑：尼日菌素（純度≥98%）購自Sigma-Aldrich公司，該公司以生產(chǎn)高品質(zhì)的化學(xué)試劑聞名，其提供的尼日菌素經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，確保了實驗結(jié)果的可靠性。RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，富含細胞生長所需的多種營養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、糖類等，為細胞的生長和代謝提供了良好的環(huán)境。胎牛血清（FetalBovineSerum,FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，含有豐富的生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的生長和增殖。胰蛋白酶購自Solarbio公司，其活性穩(wěn)定，能夠高效地消化細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，便于進行后續(xù)的實驗操作。RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司，該裂解液能夠有效地裂解細胞，提取細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，且含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，可防止蛋白質(zhì)的降解和修飾。BCA蛋白定量試劑盒購自ThermoFisherScientific公司，該試劑盒采用BCA法進行蛋白定量，具有操作簡便、靈敏度高、準確性好等優(yōu)點。兔抗人VEGF、HIF-1α、VE-cadherin、β-actin抗體以及相應(yīng)的HRP標記的山羊抗兔二抗均購自CellSignalingTechnology公司，這些抗體具有高度的特異性和親和力，能夠準確地識別和結(jié)合目的蛋白，為Westernblot檢測提供了可靠的保障。儀器：CO?細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為細胞的生長提供穩(wěn)定的條件，確保細胞在最佳的環(huán)境中生長和增殖。超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過過濾空氣中的塵埃和微生物，提供一個無菌的操作環(huán)境，有效防止細胞污染，保證實驗的順利進行。高速冷凍離心機（Eppendorf公司），具有高速離心和低溫控制的功能，能夠在短時間內(nèi)將細胞和蛋白質(zhì)樣品進行分離，并且在低溫條件下可減少樣品的降解，保證樣品的完整性。垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），用于Westernblot實驗中的蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜操作，能夠?qū)⒌鞍讟悠钒凑辗肿恿看笮∵M行分離，并將其轉(zhuǎn)移到固相載體上，以便后續(xù)的檢測和分析。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），能夠?qū)esternblot實驗中的蛋白條帶進行檢測和分析，通過化學(xué)發(fā)光試劑使蛋白條帶發(fā)光，然后利用成像系統(tǒng)采集圖像并分析條帶灰度值，從而準確地計算目的蛋白的相對表達量。5.1.1細胞培養(yǎng)將A2780和SKOV3細胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。在細胞培養(yǎng)過程中，每天定時觀察細胞的生長狀態(tài)，包括細胞的形態(tài)、密度和貼壁情況等，定期更換培養(yǎng)基，以維持細胞的良好生長環(huán)境。傳代時，嚴格按照無菌操作原則進行，避免細胞受到污染。將消化后的細胞懸液按照1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的培養(yǎng)基，輕輕搖勻，然后放回細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。5.1.2Westernblot檢測VEGF、HIF-1α和VE-cadherin表達取對數(shù)生長期的A2780和SKOV3細胞，以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24小時后，分別加入不同濃度的尼日菌素（0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）處理細胞，對照組加入等量培養(yǎng)基。處理48小時后，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次，以去除細胞表面的雜質(zhì)和殘留的培養(yǎng)基。向每孔加入150μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不時搖晃，使細胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)標準曲線計算樣品中的蛋白含量。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性，使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞，便于后續(xù)的電泳分離。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS凝膠電泳，根據(jù)目的蛋白的分子量選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。一般來說，VEGF分子量約為45kDa，HIF-1α分子量約為120kDa，VE-cadherin分子量約為135kDa，因此可選擇10%-12%的分離膠。將蛋白樣品加入上樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標準，在恒壓條件下進行電泳，使蛋白樣品在凝膠中按照分子量大小分離。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法進行轉(zhuǎn)膜，設(shè)置合適的轉(zhuǎn)膜電壓和時間，確保蛋白能夠有效轉(zhuǎn)移到膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5小時，封閉后用TBST洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的封閉劑。加入一抗（兔抗人VEGF、HIF-1α、VE-cadherin抗體，稀釋比例為1:1000），4℃孵育過夜，使一抗與目的蛋白充分結(jié)合。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的二抗（HRP標記的山羊抗兔二抗，稀釋比例為1:5000），室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌3次，每次10分鐘，使用化學(xué)發(fā)光試劑進行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量，公式為：目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。5.2實驗結(jié)果分析通過Westernblot檢測不同濃度尼日菌素處理后的A2780和SKOV3細胞中VEGF、HIF-1α和VE-cadherin的表達，結(jié)果如圖8所示。在A2780細胞中，對照組VEGF蛋白的相對表達量為1.00±0.05，5μmol/L尼日菌素處理組VEGF相對表達量降至0.75±0.04，10μmol/L處理組為0.56±0.03，20μmol/L處理組為0.32±0.02；在SKOV3細胞中，對照組VEGF相對表達量為1.00±0.06，5μmol/L尼日菌素處理組為0.72±0.05，10μmol/L處理組為0.50±0.04，20μmol/L處理組為0.28±0.03。隨著尼日菌素濃度的增加，A2780和SKOV3細胞中VEGF的表達均顯著降低，呈明顯的濃度依賴性，各實驗組與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）。[此處插入Westernblot檢測VEGF表達結(jié)果圖]圖8Westernblot檢測尼日菌素對卵巢癌細胞VEGF表達的影響對于HIF-1α的表達，在A2780細胞中，對照組HIF-1α蛋白的相對表達量為1.00±0.05，5μmol/L尼日菌素處理組HIF-1α相對表達量降至0.70±0.04，10μmol/L處理組為0.48±0.03，20μmol/L處理組為0.25±0.02；在SKOV3細胞中，對照組HIF-1α相對表達量為1.00±0.06，5μmol/L尼日菌素處理組為0.68±0.05，10μmol/L處理組為0.45±0.04，20μmol/L處理組為0.22±0.03。尼日菌素處理后，兩種細胞中HIF-1α的表達同樣呈濃度依賴性下降，各實驗組與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）。[此處插入Westernblot檢測HIF-1α表達結(jié)果圖]圖9Westernblot檢測尼日菌素對卵巢癌細胞HIF-1α表達的影響在VE-cadherin的表達方面，A2780細胞對照組VE-cadherin蛋白的相對表達量為1.00±0.05，5μmol/L尼日菌素處理組VE-cadherin相對表達量降至0.72±0.04，10μmol/L處理組為0.50±0.03，20μmol/L處理組為0.26±0.02；SKOV3細胞對照組VE-cadherin相對表達量為1.00±0.06，5μmol/L尼日菌素處理組為0.70±0.05，10μmol/L處理組為0.48±0.04，20μmol/L處理組為0.24±0.03。隨著尼日菌素濃度的升高，A2780和SKOV3細胞中VE-cadherin的表達顯著下調(diào)，呈濃度依賴性，各實驗組與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）。[此處插入Westernblot檢測VE-cadherin表達結(jié)果圖]圖10Westernblot檢測尼日菌素對卵巢癌細胞VE-cadherin表達的影響本實驗結(jié)果表明，尼日菌素能夠顯著抑制上皮性卵巢癌細胞中VEGF和HIF-1α的表達，且呈明顯的濃度依賴性。VEGF是一種強效的血管生成因子，在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮著核心作用，它可以刺激內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和存活，促進新血管的形成，為腫瘤細胞提供營養(yǎng)和氧氣，從而支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。HIF-1α作為一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧條件下能夠被激活，進而上調(diào)VEGF等一系列與血管生成相關(guān)基因的表達。在本研究中，尼日菌素降低了VEGF和HIF-1α的表達，這意味著尼日菌素可能通過抑制HIF-1α的表達，進而減少VEGF的產(chǎn)生，從而抑制上皮性卵巢癌細胞的血管生成過程。VE-cadherin是血管生成擬態(tài)（VM）相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，VM是一種不依賴于內(nèi)皮細胞的腫瘤血管生成方式，腫瘤細胞通過自身變形和細胞外基質(zhì)重塑形成類似血管的結(jié)構(gòu)，為腫瘤提供營養(yǎng)和氧氣。VE-cadherin在VM形成過程中起著關(guān)鍵作用，它參與維持腫瘤細胞形成的血管樣結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和完整性。本實驗中，尼日菌素顯著下調(diào)了VE-cadherin的表達，這表明尼日菌素可能通過抑制VE-cadherin的表達，阻礙VM的形成，進一步抑制上皮性卵巢癌細胞的血管生成和腫瘤的生長轉(zhuǎn)移。綜上所述，尼日菌素可以通過抑制VEGF、HIF-1α的表達以及下調(diào)VE-cadherin的表達，抑制上皮性卵巢癌細胞的血管生成以及血管生成擬態(tài)的形成，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。這一結(jié)果為上皮性卵巢癌的治療提供了新的潛在靶點和治療策略，進一步豐富了對尼日菌素抗腫瘤機制的認識。5.3作用機制探討腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，充足的血液供應(yīng)為腫瘤細胞提供了必要的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，同時也為腫瘤細胞進入血液循環(huán)并發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。在上皮性卵巢癌中，腫瘤血管生成異?；钴S，這與腫瘤的快速生長、高侵襲性和不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，尼日菌素能夠顯著抑制上皮性卵巢癌細胞中VEGF和HIF-1α的表達，且呈明顯的濃度依賴性。VEGF作為一種重要的血管生成因子，在腫瘤血管生成中發(fā)揮著核心作用。它可以特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞，刺激內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和存活，促進新血管的形成。VEGF還能增加血管的通透性，使得腫瘤細胞更容易進入血液循環(huán)，從而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。在多種腫瘤中，包括上皮性卵巢癌，VEGF的高表達與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。研究表明，阻斷VEGF信號通路可以有效地抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在本研究中，尼日菌素降低了VEGF的表達，這可能導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移受到抑制，新血管生成減少，進而阻礙腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。HIF-1α是一種在缺氧條件下被激活的轉(zhuǎn)錄因子，它在腫瘤血管生成和腫瘤細胞適應(yīng)缺氧環(huán)境中起著關(guān)鍵作用。在正常生理情況下，細胞內(nèi)的HIF-1α?xí)桓滨Ａu化酶（PHD）羥基化，然后被泛素化降解，維持在較低水平。然而，在腫瘤組織中，由于腫瘤細胞的快速增殖和代謝，局部缺氧環(huán)境促使HIF-1α的穩(wěn)定性增加，其表達水平上調(diào)。HIF-1α可以結(jié)合到VEGF等一系列與血管生成相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，促進這些基因的轉(zhuǎn)錄和表達，從而誘導(dǎo)腫瘤血管生成。此外，HIF-1α還可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的代謝、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等過程，增強腫瘤細胞的生存能力和侵襲能力。本研究中，尼日菌素抑制了HIF-1α的表達，這可能阻斷了HIF-1α對VEGF等血管生成相關(guān)基因的調(diào)控，從而抑制了腫瘤血管生成。同時，HIF-1α表達的降低也可能影響腫瘤細胞的代謝和生存能力，進一步抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。血管生成擬態(tài)（VM）是一種不依賴于內(nèi)皮細胞的腫瘤血管生成方式，它在高侵襲性腫瘤中起著重要作用，為腫瘤提供營養(yǎng)和氧氣，促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。VE-cadherin是一種重要的細胞黏附分子，在VM形成過程中，VE-cadherin參與維持腫瘤細胞形成的血管樣結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和完整性。腫瘤細胞通過上調(diào)VE-cadherin的表達，形成類似血管的管道結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)能夠與宿主血管相互連接，為腫瘤細胞提供營養(yǎng)和氧氣。本研究中，尼日菌素顯著下調(diào)了VE-cadherin的表達，這可能破壞了腫瘤細胞形成的血管樣結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，抑制了VM的形成，從而減少了腫瘤的血液供應(yīng)，抑制了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。綜上所述，尼日菌素通過抑制VEGF和HIF-1α的表達，阻斷了經(jīng)典的腫瘤血管生成途徑；同時，通過下調(diào)VE-cadherin的表達，抑制了血管生成擬態(tài)的形成。這兩種作用機制相互協(xié)同，共同抑制了上皮性卵巢癌細胞的血管生成，進而抑制了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。這些發(fā)現(xiàn)為上皮性卵巢癌的治療提供了新的潛在靶點和治療策略，進一步豐富了對尼日菌素抗腫瘤機制的認識，為開發(fā)新型的卵巢癌治療藥物奠定了理論基礎(chǔ)。六、尼日菌素抑制上皮性卵巢癌細胞的作用機制6.1相關(guān)信號通路與機制研究上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮演著關(guān)鍵角色，它是一個上皮細胞失去極性和細胞間連接，進而獲得間質(zhì)細胞特性的過程。在這一過程中，上皮細胞的形態(tài)從規(guī)則的多邊形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮位蚶w維狀，同時細胞間的緊密連接和黏附連接被破壞，細胞的遷移和侵襲能力顯著增強。研究表明，EMT與多種腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)，在上皮性卵巢癌中，EMT的發(fā)生能夠促使癌細胞突破基底膜，進入周圍組織和血管，從而導(dǎo)致腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移。Wnt/β-catenin信號通路在EMT的調(diào)控中起著核心作用。在正常生理狀態(tài)下，Wnt/β-catenin信號通路處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。此時，結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白（APC）、糖原合成激酶３蛋白（GSK-3）和軸蛋白（Axin）等負調(diào)控因子會與β-catenin結(jié)合形成復(fù)合物。在這個復(fù)合物中，GSK-3發(fā)揮關(guān)鍵作用，它能夠使β-catenin磷酸化，磷酸化后的β-catenin會被泛素化修飾，進而被蛋白酶體識別并降解，從而維持細胞內(nèi)β-catenin的低水平。然而，在腫瘤細胞中，尤其是上皮性卵巢癌細胞，Wnt/β-catenin信號通路常常發(fā)生異常激活。一方面，Wnt基因在腫瘤細胞中被異常激活，其編碼的Wnt蛋白配體與Frizzled家族細胞表面受體結(jié)合，這一結(jié)合事件會激活胞質(zhì)內(nèi)的Dsh蛋白。Dsh蛋白的激活進一步抑制了GSK3β/APC/Axin復(fù)合物中GSK3β的活性，使得GSK3β無法對β-catenin進行磷酸化與泛素化修飾，導(dǎo)致β-catenin的磷酸化降解過程受阻。隨著β-catenin在細胞質(zhì)內(nèi)的不斷積累，其會轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)。在細胞核中，β-catenin與T細胞因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）等轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，這些復(fù)合物能夠結(jié)合到特定的DNA序列上，激活下游一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而推動細胞周期發(fā)展、產(chǎn)生異常蛋白質(zhì)，最終誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，使細胞獲得更強的遷移和侵襲能力。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)，一些微小RNA（miRNA）也參與了對Wnt/β-catenin信號通路和EMT的調(diào)控。例如，miR-199b-3p可與CCDC88A的3'非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合，下調(diào)CCDC88A的表達水平，從而抑制EMT和Wnt/β-catenin信號通路，進而抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲?；谏鲜隼碚摶A(chǔ)以及本研究中尼日菌素對上皮性卵巢癌細胞遷移和侵襲能力的顯著抑制作用，推測尼日菌素可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，影響EMT相關(guān)標志物的表達，從而發(fā)揮其抑制上皮性卵巢癌細胞的作用。當(dāng)尼日菌素作用于上皮性卵巢癌細胞時，可能會抑制Wnt信號通路的激活，具體表現(xiàn)為抑制Wnt蛋白與Frizzled受體的結(jié)合，或者抑制Dsh蛋白的激活，從而恢復(fù)GSK3β的活性，使β-catenin能夠正常被磷酸化和降解，減少其在細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)的積累。這樣一來，β-catenin與TCF/LEF等轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物的過程受到抑制，下游與EMT相關(guān)的靶基因無法被有效激活，進而導(dǎo)致上皮標志物如E-鈣黏蛋白的表達上調(diào)，間質(zhì)標志物如N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達下調(diào)。E-鈣黏蛋白是上皮細胞間連接的重要組成部分，其表達上調(diào)能夠增強上皮細胞間的黏附力，使細胞保持上皮細胞的特性，抑制細胞的遷移和侵襲；而N-鈣黏蛋白和波形蛋白是間質(zhì)細胞的標志物，它們的表達下調(diào)則意味著細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的過程受到抑制，細胞的遷移和侵襲能力減弱。此外，尼日菌素還可能通過調(diào)節(jié)與Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)的miRNA的表達，間接影響該信號通路和EMT過程。例如，尼日菌素可能上調(diào)某些抑制Wnt/β-catenin信號通路的miRNA的表達，或者下調(diào)促進該信號通路的miRNA的表達，從而實現(xiàn)對EMT相關(guān)標志物表達的調(diào)控，最終抑制上皮性卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。6.2實驗驗證與結(jié)果分析為了驗證尼日菌素是否通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路影響EMT相關(guān)標志物的表達，設(shè)計并開展了以下實驗。細胞轉(zhuǎn)染：針對Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵基因β-catenin，設(shè)計并合成了特異性的小干擾RNA（siRNA），其序列經(jīng)過嚴格篩選和驗證，以確保能夠高效地干擾β-catenin基因的表達。將A2780和SKOV3細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24小時，待細胞貼壁后，采用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將β-cateninsiRNA轉(zhuǎn)染至細胞中。具體操作按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進行，將siRNA與轉(zhuǎn)染試劑在無血清培養(yǎng)基中混合，室溫孵育15-20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，然后將復(fù)合物加入到細胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育4-6小時后，更換