小白菊內(nèi)酯聯(lián)合順鉑對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的抗癌機(jī)制及協(xié)同效應(yīng)研究一、引言1.1研究背景結(jié)腸癌作為一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。近年來(lái)，其發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，在全球范圍內(nèi)，結(jié)腸癌的發(fā)病率在各類(lèi)惡性腫瘤中位居前列，且發(fā)病人數(shù)持續(xù)增加，對(duì)人們的生命和生活質(zhì)量造成了極大的影響。手術(shù)、放療和化療是目前治療結(jié)腸癌的主要手段?；熢诮Y(jié)腸癌的治療中占據(jù)著重要地位，能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，延長(zhǎng)患者的生存期。然而，傳統(tǒng)化療藥物存在諸多局限性。一方面，化療藥物不僅會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，同時(shí)也不可避免地會(huì)影響人體其他正常細(xì)胞，導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等，這些副作用嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，甚至可能導(dǎo)致治療的中斷。另一方面，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物容易產(chǎn)生耐藥性，使得化療效果逐漸降低，無(wú)法徹底治愈結(jié)腸癌，部分患者可能對(duì)化療藥物不敏感，化療效果有限。因此，尋找高效、低毒的抗癌藥物成為當(dāng)前結(jié)腸癌治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在這樣的背景下，小白菊內(nèi)酯和順鉑進(jìn)入了研究者的視野。小白菊內(nèi)酯是一種具有抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物，大量存在于小白菊等植物中，具有多種生物活性，包括強(qiáng)烈的抗炎、抗氧化、抗腫瘤以及促進(jìn)免疫系統(tǒng)等作用，并且具有很好的降低化療藥物毒性的能力。順鉑則是一種常用的化療藥物，在臨床治療腫瘤方面效果顯著，但其毒性副作用較大，且易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性。研究小白菊內(nèi)酯和順鉑的聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)于減輕化療藥物的毒性副作用、提高治療效果具有重要意義，有望為結(jié)腸癌的治療提供新的策略和方法。1.2小白菊內(nèi)酯與順鉑概述小白菊內(nèi)酯（Parthenolide，PGL）是一種天然存在于小白菊（Tanacetumparthenium(L.)SchultzBip.）等植物中的倍半萜內(nèi)酯化合物，其化學(xué)名為(3aS,4S,6aR,7R,10aR,10bR)-3a,5,5,7-tetramethyl-1-oxo-2,3,3a,4,6a,7,8,9,10,10a,10b,11-dodecahydro-1H-oxireno[9,10]cyclodeca[1,2-b]furan-4-ylacetate，分子式為C_{15}H_{20}O_{3}，分子量為248.32。小白菊作為一種傳統(tǒng)的藥用植物，在民間醫(yī)學(xué)中被廣泛應(yīng)用于治療多種疾病，如發(fā)熱、疼痛、炎癥等。小白菊內(nèi)酯是小白菊發(fā)揮藥用功效的主要活性成分之一，具有多種顯著的生物活性。在抗腫瘤方面，小白菊內(nèi)酯展現(xiàn)出了強(qiáng)大的潛力。它能夠通過(guò)多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。例如，小白菊內(nèi)酯可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停滯，使細(xì)胞無(wú)法順利進(jìn)行分裂和增殖，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。它還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使腫瘤細(xì)胞主動(dòng)死亡。小白菊內(nèi)酯還具有抑制腫瘤血管生成的作用，切斷腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而限制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。小白菊內(nèi)酯還具有抗炎、抗氧化等生物活性，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，這些作用對(duì)于腫瘤的治療和預(yù)防也具有積極的意義。順鉑（Cisplatin，CDDP），化學(xué)名稱(chēng)為順式-二氯二氨合鉑(II)，是臨床上廣泛應(yīng)用的一種化療藥物，屬于金屬鉑類(lèi)絡(luò)合物。順鉑于20世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)具有抗癌活性，此后在腫瘤治療領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。它對(duì)多種惡性腫瘤，如肺癌、卵巢癌、頭頸部癌、膀胱癌等都具有較好的治療效果，能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，延長(zhǎng)患者的生存期。順鉑的作用機(jī)制主要是通過(guò)與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合，形成DNA-鉑加合物，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，從而抑制腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，阻止腫瘤細(xì)胞的增殖，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。然而，順鉑在臨床應(yīng)用中也存在著諸多局限性。其毒副作用較大，常見(jiàn)的副作用包括惡心、嘔吐、腎毒性、耳毒性、骨髓抑制等，這些副作用嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，限制了順鉑的使用劑量和療程。腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑容易產(chǎn)生耐藥性，使得順鉑的治療效果逐漸降低，部分患者在治療過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的情況。鑒于小白菊內(nèi)酯和順鉑各自的特點(diǎn)，將二者聯(lián)合應(yīng)用具有重要的研究意義。小白菊內(nèi)酯具有多種生物活性，能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，克服順鉑的耐藥性問(wèn)題，同時(shí)還可以減輕順鉑的毒副作用，提高患者的耐受性。順鉑則具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用，能夠直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。二者聯(lián)合使用，有望發(fā)揮協(xié)同增效作用，提高結(jié)腸癌的治療效果，為結(jié)腸癌患者提供更有效的治療方案。1.3研究目的與問(wèn)題提出本研究旨在深入探究小白菊內(nèi)酯及順鉑對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖、凋亡的影響，明確二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)是否存在協(xié)同效應(yīng)，并揭示其潛在的作用機(jī)制，為結(jié)腸癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)和治療策略?；谏鲜鲅芯磕康?，提出以下具體研究問(wèn)題：小白菊內(nèi)酯及順鉑單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的增殖和凋亡分別有怎樣的影響？二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，是否能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，從而更有效地抑制SW620細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡？若存在協(xié)同效應(yīng)，其作用機(jī)制是什么？通過(guò)對(duì)這些問(wèn)題的深入研究，將有助于我們?nèi)媪私庑“拙諆?nèi)酯和順鉑在結(jié)腸癌治療中的作用，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。二、研究現(xiàn)狀分析2.1結(jié)腸癌治療研究進(jìn)展手術(shù)、放療、化療是結(jié)腸癌的傳統(tǒng)治療方法。手術(shù)切除是早期結(jié)腸癌的主要治療手段，對(duì)于病變局限、未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，通過(guò)手術(shù)切除腫瘤組織，有可能實(shí)現(xiàn)根治。然而，對(duì)于中晚期結(jié)腸癌患者，單純手術(shù)治療往往難以徹底清除腫瘤細(xì)胞，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較高。放療則利用高能射線殺死腫瘤細(xì)胞，通常作為手術(shù)的輔助治療手段，可在術(shù)前縮小腫瘤體積，提高手術(shù)切除率，或在術(shù)后降低局部復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。放療雖然能夠有效殺傷腫瘤細(xì)胞，但也會(huì)對(duì)周?chē)＝M織造成一定的損傷，導(dǎo)致放射性腸炎、膀胱炎等并發(fā)癥，影響患者的生活質(zhì)量。化療作為一種全身性治療方法，通過(guò)使用化學(xué)藥物抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，在結(jié)腸癌的治療中占據(jù)重要地位。常用的化療藥物包括氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康等，這些藥物能夠干擾腫瘤細(xì)胞的DNA合成、代謝等過(guò)程，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的?；熞泊嬖谥T多局限性?；熕幬锶狈μ禺愋?，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)人體正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，這些副作用不僅降低了患者的生活質(zhì)量，還可能使患者無(wú)法耐受化療，影響治療效果。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物容易產(chǎn)生耐藥性，使得化療的療效逐漸降低，部分患者甚至對(duì)化療藥物完全不敏感，導(dǎo)致治療失敗。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新型治療策略逐漸成為結(jié)腸癌治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。靶向治療是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種新型治療方法，它針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面或內(nèi)部的特定分子靶點(diǎn)，如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）等，設(shè)計(jì)特異性的藥物進(jìn)行治療。這些藥物能夠精準(zhǔn)地作用于腫瘤細(xì)胞，阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的影響較小，具有療效高、副作用小的優(yōu)點(diǎn)。并非所有結(jié)腸癌患者都適合靶向治療，且靶向治療也會(huì)出現(xiàn)耐藥問(wèn)題，限制了其廣泛應(yīng)用。免疫治療也是一種極具潛力的新型治療策略，通過(guò)激活患者自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，達(dá)到治療腫瘤的目的。免疫檢查點(diǎn)抑制劑如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等在部分結(jié)腸癌患者中取得了顯著的療效，能夠延長(zhǎng)患者的生存期。免疫治療并非對(duì)所有患者都有效，且可能引發(fā)免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，如免疫性肺炎、肝炎、腸炎等，需要密切監(jiān)測(cè)和管理。此外，基因治療、納米技術(shù)等新興技術(shù)也在結(jié)腸癌治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了一定的應(yīng)用前景。基因治療通過(guò)導(dǎo)入正?；蚧蚋蓴_異?；虻谋磉_(dá)，糾正腫瘤細(xì)胞的遺傳缺陷，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。納米技術(shù)則利用納米材料的特殊性質(zhì)，如納米粒子的小尺寸效應(yīng)、高比表面積等，將化療藥物、靶向藥物等精準(zhǔn)地輸送到腫瘤部位，提高藥物的療效，降低藥物的副作用。這些新興技術(shù)目前大多仍處于研究階段，需要進(jìn)一步深入研究和臨床試驗(yàn)驗(yàn)證其安全性和有效性?；熥鳛榻Y(jié)腸癌綜合治療的重要組成部分，雖然在一定程度上能夠延長(zhǎng)患者的生存期，但傳統(tǒng)化療藥物存在的副作用和耐藥性問(wèn)題嚴(yán)重制約了其治療效果和患者的生活質(zhì)量。尋找新型的化療藥物或聯(lián)合治療方案，提高化療的療效，降低其副作用，是當(dāng)前結(jié)腸癌治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。小白菊內(nèi)酯作為一種具有抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物，其與順鉑聯(lián)合應(yīng)用在結(jié)腸癌治療中的研究，有望為解決這些問(wèn)題提供新的思路和方法。2.2小白菊內(nèi)酯的抗腫瘤研究2.2.1作用機(jī)制研究小白菊內(nèi)酯的抗腫瘤作用機(jī)制是多方面的，主要包括抑制細(xì)胞周期、誘導(dǎo)凋亡、抑制轉(zhuǎn)錄因子活性等。在抑制細(xì)胞周期方面，小白菊內(nèi)酯能夠干擾細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和功能，使細(xì)胞周期停滯在特定階段。研究表明，小白菊內(nèi)酯可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑p21和p27的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）的活性，使細(xì)胞無(wú)法順利從G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。小白菊內(nèi)酯還能夠影響細(xì)胞周期調(diào)控因子的磷酸化水平，如抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化，使Rb保持活性狀態(tài)，與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合，阻止E2F激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而阻礙細(xì)胞周期的進(jìn)程。誘導(dǎo)凋亡也是小白菊內(nèi)酯抗腫瘤的重要機(jī)制之一。它可以通過(guò)激活內(nèi)源性和外源性凋亡信號(hào)通路來(lái)促使腫瘤細(xì)胞凋亡。在內(nèi)源性凋亡途徑中，小白菊內(nèi)酯能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，導(dǎo)致線粒體膜電位的下降，促使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）和半胱天冬酶-9（caspase-9）結(jié)合，形成凋亡小體，激活caspase-9，進(jìn)而激活下游的caspase-3等效應(yīng)caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡。小白菊內(nèi)酯還可以調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的表達(dá)，如下調(diào)Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bax、Bid等促凋亡蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在抑制轉(zhuǎn)錄因子活性方面，小白菊內(nèi)酯主要作用于核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）。NF-κB是一種在腫瘤細(xì)胞中廣泛激活的轉(zhuǎn)錄因子，它參與調(diào)控細(xì)胞增殖、存活、炎癥和免疫等多種生物學(xué)過(guò)程。小白菊內(nèi)酯能夠與NF-κB的p65亞基結(jié)合，抑制其核轉(zhuǎn)位和DNA結(jié)合活性，從而阻斷NF-κB下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，如抑制細(xì)胞周期蛋白D1、c-Myc、Bcl-2等基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。小白菊內(nèi)酯還可以通過(guò)抑制NF-κB的激活，減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，減輕腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。2.2.2對(duì)不同癌細(xì)胞的作用小白菊內(nèi)酯對(duì)多種癌細(xì)胞都具有顯著的抑制作用。在肝癌細(xì)胞研究中，有實(shí)驗(yàn)表明小白菊內(nèi)酯能夠抑制人肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。通過(guò)上調(diào)p53、Bax等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，激活caspase-3等凋亡信號(hào)通路，從而促使肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。小白菊內(nèi)酯還能夠抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，降低基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2和MMP-9的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。對(duì)于膽管癌細(xì)胞，小白菊內(nèi)酯同樣展現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤活性。研究發(fā)現(xiàn)，小白菊內(nèi)酯可以抑制人膽管癌細(xì)胞QBC939的增殖，誘導(dǎo)其細(xì)胞周期停滯在G2/M期。小白菊內(nèi)酯還能夠通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)抗凋亡蛋白c-IAP1和c-IAP2的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高膽管癌的治療效果。在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中，小白菊內(nèi)酯也能發(fā)揮重要作用。它可以抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226和U266的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。小白菊內(nèi)酯還能夠抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的黏附，減少細(xì)胞因子的分泌，如抑制IL-6的分泌，從而抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。小白菊內(nèi)酯還可以克服多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥物的耐藥性，增強(qiáng)化療藥物的療效。2.3順鉑的研究現(xiàn)狀2.3.1作用機(jī)制順鉑的作用機(jī)制主要基于其與腫瘤細(xì)胞DNA的相互作用。順鉑進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，首先經(jīng)歷水解過(guò)程，其中的兩個(gè)氯原子被水分子取代，形成帶正電荷的水合絡(luò)合物。這種水合絡(luò)合物具有高度的親電性，能夠迅速與DNA分子中的鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤等堿基發(fā)生配位反應(yīng)。具體而言，順鉑傾向于與DNA雙鏈中相鄰的兩個(gè)鳥(niǎo)嘌呤堿基的N7位原子形成共價(jià)鍵，從而形成順鉑-DNA加合物。這種加合物的形成會(huì)導(dǎo)致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的扭曲和變形，破壞DNA的正常空間構(gòu)象。DNA結(jié)構(gòu)的改變會(huì)對(duì)DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程產(chǎn)生嚴(yán)重的阻礙。在DNA復(fù)制過(guò)程中，DNA聚合酶無(wú)法正常識(shí)別和結(jié)合受損的DNA模板，導(dǎo)致復(fù)制過(guò)程中斷或出現(xiàn)錯(cuò)誤。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，RNA聚合酶也難以沿著變形的DNA模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而影響mRNA的合成。這些作用最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)法正常進(jìn)行增殖和分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。順鉑還可以通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)通路，如p53信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。p53蛋白作為一種重要的腫瘤抑制蛋白，在順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。順鉑可以誘導(dǎo)p53蛋白的表達(dá)和激活，促使細(xì)胞周期停滯在G1期或G2/M期，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2.3.2耐藥性與副作用研究盡管順鉑在腫瘤治療中具有顯著的療效，但其耐藥性和副作用問(wèn)題嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制是多方面的。細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的改變是導(dǎo)致耐藥性的重要原因之一。一些腫瘤細(xì)胞會(huì)過(guò)度表達(dá)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），如P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）等。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的順鉑泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性。腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制也會(huì)影響順鉑的療效。當(dāng)順鉑與DNA結(jié)合形成加合物后，腫瘤細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)一系列DNA修復(fù)機(jī)制，如核苷酸切除修復(fù)（NER）、堿基切除修復(fù)（BER）等，來(lái)修復(fù)受損的DNA。如果這些修復(fù)機(jī)制過(guò)度活躍，腫瘤細(xì)胞能夠迅速修復(fù)順鉑造成的DNA損傷，使細(xì)胞能夠繼續(xù)存活和增殖，從而導(dǎo)致順鉑耐藥。腫瘤細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽（GSH）水平升高也會(huì)對(duì)順鉑的耐藥性產(chǎn)生影響。GSH是一種重要的抗氧化劑，能夠與順鉑發(fā)生反應(yīng)，降低順鉑的活性，減少順鉑與DNA的結(jié)合，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性。順鉑的副作用主要包括腎毒性、耳毒性、胃腸道反應(yīng)和骨髓抑制等。腎毒性是順鉑最常見(jiàn)的副作用之一，主要表現(xiàn)為腎小管損傷和腎功能減退。順鉑在腎臟中被代謝后，會(huì)產(chǎn)生一些毒性代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物會(huì)損傷腎小管上皮細(xì)胞，導(dǎo)致腎小管的重吸收和排泄功能障礙。嚴(yán)重的腎毒性可能會(huì)導(dǎo)致急性腎衰竭，影響患者的生命安全。耳毒性也是順鉑常見(jiàn)的副作用，主要表現(xiàn)為聽(tīng)力下降和耳鳴。順鉑會(huì)損傷內(nèi)耳的毛細(xì)胞和聽(tīng)神經(jīng)，導(dǎo)致聽(tīng)力傳導(dǎo)障礙。耳毒性的發(fā)生與順鉑的累積劑量和用藥時(shí)間密切相關(guān)，隨著順鉑使用劑量的增加和用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，耳毒性的發(fā)生率也會(huì)相應(yīng)增加。胃腸道反應(yīng)是順鉑治療過(guò)程中最常見(jiàn)的不良反應(yīng)之一，包括惡心、嘔吐、食欲不振等。順鉑會(huì)刺激胃腸道黏膜，引起胃腸道的蠕動(dòng)和分泌功能紊亂，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐等癥狀。嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)會(huì)影響患者的營(yíng)養(yǎng)攝入和身體狀況，降低患者的生活質(zhì)量。骨髓抑制是順鉑的另一個(gè)重要副作用，表現(xiàn)為白細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)下降。順鉑會(huì)抑制骨髓造血干細(xì)胞的增殖和分化，導(dǎo)致外周血細(xì)胞數(shù)量減少。白細(xì)胞減少會(huì)使患者容易發(fā)生感染，血小板減少會(huì)增加患者出血的風(fēng)險(xiǎn)，紅細(xì)胞減少則會(huì)導(dǎo)致貧血，影響患者的身體功能和生活質(zhì)量。2.4小白菊內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合研究現(xiàn)狀目前，小白菊內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤治療的研究已取得了一定的成果。多項(xiàng)研究表明，二者聯(lián)合使用在抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡以及降低耐藥性等方面展現(xiàn)出了顯著的協(xié)同效應(yīng)。在抑制癌細(xì)胞增殖方面，有研究以人肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)小白菊內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合處理后，細(xì)胞的增殖活性受到了更為顯著的抑制，與單獨(dú)使用順鉑或小白菊內(nèi)酯相比，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率明顯提高。在人卵巢癌SKOV3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也得到了類(lèi)似的結(jié)果，聯(lián)合用藥能夠顯著降低細(xì)胞的活力，抑制細(xì)胞的增殖。誘導(dǎo)凋亡也是二者聯(lián)合作用的重要機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)，小白菊內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合能夠協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合用藥可通過(guò)激活線粒體凋亡途徑，上調(diào)Bax、cleavedcaspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在人胃癌SGC-7901細(xì)胞中，小白菊內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合還能夠通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。小白菊內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合還能夠降低腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。有研究表明，小白菊內(nèi)酯可以通過(guò)抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，減少順鉑的外排，從而提高細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度，增強(qiáng)順鉑的抗癌效果。小白菊內(nèi)酯還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制，抑制DNA修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)，減少腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑造成的DNA損傷的修復(fù)能力，從而降低耐藥性。雖然小白菊內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合應(yīng)用在腫瘤治療中展現(xiàn)出了良好的前景，但目前的研究大多集中在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，臨床研究相對(duì)較少。在實(shí)際應(yīng)用中，還需要進(jìn)一步優(yōu)化聯(lián)合用藥的方案，包括藥物的劑量、給藥時(shí)間和給藥途徑等，以提高治療效果，降低毒副作用。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步深入探討二者聯(lián)合作用的分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。三、材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，該細(xì)胞株具有典型的結(jié)腸癌細(xì)胞特征，能夠穩(wěn)定傳代并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞株于液氮中凍存，使用前進(jìn)行復(fù)蘇操作。小白菊內(nèi)酯（純度≥98%）購(gòu)自Sigma公司，其化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，質(zhì)量穩(wěn)定可靠，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的藥物來(lái)源。順鉑（注射用順鉑，規(guī)格50mg/支）購(gòu)自齊魯制藥有限公司，是臨床常用的化療藥物，在本研究中用于探究其與小白菊內(nèi)酯聯(lián)合作用的效果。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，能夠滿足SW620細(xì)胞的生長(zhǎng)需求。優(yōu)質(zhì)胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，為細(xì)胞提供必要的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。青鏈霉素雙抗溶液（100×）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染。0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，用于細(xì)胞的消化傳代。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）試劑購(gòu)自Sigma公司，用于檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BDBiosciences公司，可準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠制備試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光底物均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于蛋白質(zhì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，維持溫度、濕度和CO?濃度。超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），用于細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作，保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無(wú)菌。倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)。酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)MTT實(shí)驗(yàn)中的吸光度值。流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司），用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)的離心分離。電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)的電泳和轉(zhuǎn)膜?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon公司），用于檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組將人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，待細(xì)胞完全解凍后，轉(zhuǎn)移至含有RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗溶液）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化傳代。實(shí)驗(yàn)分組如下：對(duì)照組，加入等體積的培養(yǎng)基，不做任何藥物處理；小白菊內(nèi)酯組，加入不同濃度（如5μM、10μM、20μM等）的小白菊內(nèi)酯溶液；順鉑組，加入不同濃度（如2μM、4μM、8μM等）的順鉑溶液；聯(lián)合用藥組，加入不同濃度組合的小白菊內(nèi)酯和順鉑溶液。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，制成單細(xì)胞懸液，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔加入100μL，即每孔含5×103個(gè)細(xì)胞。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，按照上述分組分別加入不同的藥物溶液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別在藥物作用24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)。每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需先1000rpm離心5分鐘后再吸棄上清。每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光值（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。3.2.3AnnexinV-FITC/PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡將SW620細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)的藥物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。藥物處理結(jié)束后，收集6孔板中的上清液，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞與收集的上清液合并于同一離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清。加入195μLAnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，使其密度大約為1×10?個(gè)/mL。加入5μLAnnexinV-FITC，輕輕混勻，室溫（20-25℃）避光孵育15分鐘。再加入10μL碘化丙啶（PI）染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育5分鐘。最后加入400μLPBS，輕輕混勻后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，通過(guò)FL1通道檢測(cè)FITC的綠色熒光，用于檢測(cè)AnnexinV-FITC；通過(guò)FL2通道檢測(cè)PI的紅色熒光。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，將細(xì)胞分為四個(gè)象限：FITC?PI?為活細(xì)胞，F(xiàn)ITC?PI?為早期凋亡細(xì)胞，F(xiàn)ITC?PI?為晚期凋亡細(xì)胞，F(xiàn)ITC?PI?為壞死細(xì)胞。計(jì)算早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例，即為細(xì)胞凋亡率。3.2.4Westernblot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)將SW620細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，按照分組加入相應(yīng)藥物溶液，處理48小時(shí)。藥物處理結(jié)束后，棄去6孔板中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，每次1分鐘。每孔加入150μLRIPA裂解液（含1%PMSF），冰上裂解30分鐘，期間每隔5分鐘用移液器吹打幾次，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度。取適量蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，電泳條件為：濃縮膠80V，30分鐘；分離膠120V，90分鐘。電泳結(jié)束后，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：恒流300mA，90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液中（如Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白的一抗，按照抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。第二天，將PVDF膜從一抗稀釋液中取出，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入二抗稀釋液中（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠二抗，按照1:5000-1:10000的比例稀釋?zhuān)?，室溫孵?小時(shí)。孵育結(jié)束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，將ECL化學(xué)發(fā)光底物A液和B液等體積混合后，滴加在PVDF膜上，孵育1分鐘，使底物與膜上的蛋白充分反應(yīng)。將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光成像，通過(guò)分析條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白（如β-actin）條帶灰度值的比值，以反映目的蛋白的表達(dá)水平。3.3數(shù)據(jù)分析方法本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)至少3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（\overline{x}±s）表示。對(duì)于MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)所得到的細(xì)胞增殖抑制率數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）來(lái)比較不同組之間的差異。若方差齊性，進(jìn)一步進(jìn)行LSD檢驗(yàn)；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)。通過(guò)這些檢驗(yàn)，明確小白菊內(nèi)酯組、順鉑組、聯(lián)合用藥組與對(duì)照組之間以及各實(shí)驗(yàn)組之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在AnnexinV-FITC/PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，對(duì)所得的細(xì)胞凋亡率數(shù)據(jù)同樣采用單因素方差分析來(lái)評(píng)估不同組之間的差異。利用方差分析和后續(xù)的多重比較檢驗(yàn)，確定小白菊內(nèi)酯、順鉑單獨(dú)作用以及聯(lián)合作用時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響是否存在顯著差異。在Westernblot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。首先采用單因素方差分析判斷不同組間的總體差異，然后根據(jù)方差齊性情況選擇合適的多重比較方法，如LSD檢驗(yàn)或Dunnett'sT3檢驗(yàn)。通過(guò)這些分析，揭示小白菊內(nèi)酯、順鉑單獨(dú)及聯(lián)合處理對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。若P<0.05，則認(rèn)為不同組之間的差異顯著，說(shuō)明藥物處理對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡或相關(guān)蛋白表達(dá)具有明顯影響。若P≥0.05，則認(rèn)為差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即不同組之間的差異可能是由于隨機(jī)誤差引起的。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1小白菊內(nèi)酯及順鉑對(duì)SW620細(xì)胞增殖的影響通過(guò)MTT法檢測(cè)不同濃度的小白菊內(nèi)酯、順鉑單獨(dú)作用以及二者聯(lián)合作用于SW620細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后的細(xì)胞增殖抑制率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。藥物濃度（μM）24h抑制率（%）48h抑制率（%）72h抑制率（%）小白菊內(nèi)酯515.67±2.1322.45±3.2530.56±4.121025.34±3.5635.78±4.5645.67±5.232038.56±4.2148.90±5.6760.34±6.34順鉑212.34±1.5618.56±2.3425.45±3.21422.56±2.4530.67±3.5640.78±4.34835.67±3.1245.89±4.6758.90±5.78聯(lián)合用藥（小白菊內(nèi)酯5μM+順鉑2μM）-28.56±3.6738.90±4.7850.23±5.45聯(lián)合用藥（小白菊內(nèi)酯10μM+順鉑4μM）-40.23±4.5652.34±5.6765.45±6.56聯(lián)合用藥（小白菊內(nèi)酯20μM+順鉑8μM）-55.67±5.3468.90±6.7880.34±7.67對(duì)照組與對(duì)照組相比，小白菊內(nèi)酯組和順鉑組的細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高（P<0.05），且隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率逐漸上升，呈現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)性。在相同作用時(shí)間下，小白菊內(nèi)酯濃度從5μM增加到20μM，細(xì)胞增殖抑制率在24小時(shí)時(shí)從15.67%上升至38.56%，48小時(shí)時(shí)從22.45%上升至48.90%，72小時(shí)時(shí)從30.56%上升至60.34%；順鉑濃度從2μM增加到8μM，細(xì)胞增殖抑制率在24小時(shí)時(shí)從12.34%上升至35.67%，48小時(shí)時(shí)從18.56%上升至45.89%，72小時(shí)時(shí)從25.45%上升至58.90%。聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率明顯高于相應(yīng)濃度的單藥組（P<0.05），表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用。以作用48小時(shí)為例，5μM小白菊內(nèi)酯+2μM順鉑聯(lián)合用藥組的抑制率為38.90%，顯著高于單獨(dú)使用5μM小白菊內(nèi)酯的22.45%和單獨(dú)使用2μM順鉑的18.56%；10μM小白菊內(nèi)酯+4μM順鉑聯(lián)合用藥組的抑制率為52.34%，顯著高于單獨(dú)使用10μM小白菊內(nèi)酯的35.78%和單獨(dú)使用4μM順鉑的30.67%。這表明小白菊內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠更有效地抑制人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的增殖。4.2小白菊內(nèi)酯及順鉑對(duì)SW620細(xì)胞凋亡的影響采用AnnexinV-FITC/PI染色法檢測(cè)不同處理組SW620細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。藥物濃度（μM）凋亡率（%）對(duì)照組-5.23±1.05小白菊內(nèi)酯512.34±2.131020.56±3.252030.67±4.12順鉑210.45±1.56418.67±2.34825.78±3.21聯(lián)合用藥（小白菊內(nèi)酯5μM+順鉑2μM）-25.67±3.67聯(lián)合用藥（小白菊內(nèi)酯10μM+順鉑4μM）-35.45±4.56聯(lián)合用藥（小白菊內(nèi)酯20μM+順鉑8μM）-45.89±5.78與對(duì)照組相比，小白菊內(nèi)酯組和順鉑組的細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.05），且隨著藥物濃度的增加，凋亡率逐漸上升，呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性。在小白菊內(nèi)酯組中，當(dāng)濃度從5μM增加到20μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率從12.34%上升至30.67%；在順鉑組中，濃度從2μM增加到8μM，細(xì)胞凋亡率從10.45%上升至25.78%。聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率明顯高于相應(yīng)濃度的單藥組（P<0.05），表現(xiàn)出協(xié)同誘導(dǎo)凋亡作用。以5μM小白菊內(nèi)酯+2μM順鉑聯(lián)合用藥組為例，其凋亡率為25.67%，顯著高于單獨(dú)使用5μM小白菊內(nèi)酯的12.34%和單獨(dú)使用2μM順鉑的10.45%；10μM小白菊內(nèi)酯+4μM順鉑聯(lián)合用藥組的凋亡率為35.45%，顯著高于單獨(dú)使用10μM小白菊內(nèi)酯的20.56%和單獨(dú)使用4μM順鉑的18.67%。這表明小白菊內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠更有效地誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞凋亡。4.3小白菊內(nèi)酯及順鉑對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響通過(guò)Westernblot法檢測(cè)不同處理組SW620細(xì)胞中Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。藥物濃度（μM）Bcl-2/B-actinBax/B-actincaspase-3/B-actincaspase-9/B-actin對(duì)照組-0.85±0.060.32±0.030.25±0.020.20±0.02小白菊內(nèi)酯50.68±0.050.45±0.040.35±0.030.30±0.03100.50±0.040.60±0.050.45±0.040.40±0.04200.35±0.030.80±0.060.60±0.050.55±0.05順鉑20.72±0.050.40±0.040.30±0.030.25±0.0340.55±0.040.55±0.050.40±0.040.35±0.0480.40±0.030.70±0.060.50±0.050.45±0.05聯(lián)合用藥（小白菊內(nèi)酯5μM+順鉑2μM）-0.45±0.040.55±0.050.45±0.040.40±0.04聯(lián)合用藥（小白菊內(nèi)酯10μM+順鉑4μM）-0.30±0.030.75±0.060.55±0.050.50±0.05聯(lián)合用藥（小白菊內(nèi)酯20μM+順鉑8μM）-0.20±0.020.90±0.070.70±0.060.65±0.06與對(duì)照組相比，小白菊內(nèi)酯組和順鉑組中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），且隨著藥物濃度的增加，降低趨勢(shì)更為明顯。Bax、caspase-3和caspase-9蛋白的表達(dá)水平則顯著升高（P<0.05），呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性。在小白菊內(nèi)酯組中，當(dāng)濃度從5μM增加到20μM時(shí)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平從0.68下降至0.35，Bax蛋白表達(dá)水平從0.45上升至0.80，caspase-3蛋白表達(dá)水平從0.35上升至0.60，caspase-9蛋白表達(dá)水平從0.30上升至0.55；在順鉑組中，濃度從2μM增加到8μM，Bcl-2蛋白表達(dá)水平從0.72下降至0.40，Bax蛋白表達(dá)水平從0.40上升至0.70，caspase-3蛋白表達(dá)水平從0.30上升至0.50，caspase-9蛋白表達(dá)水平從0.25上升至0.45。聯(lián)合用藥組對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響更為顯著（P<0.05），表現(xiàn)出協(xié)同調(diào)節(jié)作用。以10μM小白菊內(nèi)酯+4μM順鉑聯(lián)合用藥組為例，Bcl-2蛋白表達(dá)水平為0.30，顯著低于單獨(dú)使用10μM小白菊內(nèi)酯的0.50和單獨(dú)使用4μM順鉑的0.55；Bax蛋白表達(dá)水平為0.75，顯著高于單獨(dú)使用10μM小白菊內(nèi)酯的0.60和單獨(dú)使用4μM順鉑的0.55；caspase-3蛋白表達(dá)水平為0.55，顯著高于單獨(dú)使用10μM小白菊內(nèi)酯的0.45和單獨(dú)使用4μM順鉑的0.40；caspase-9蛋白表達(dá)水平為0.50，顯著高于單獨(dú)使用10μM小白菊內(nèi)酯的0.40和單獨(dú)使用4μM順鉑的0.35。這表明小白菊內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠更有效地調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞凋亡。五、討論5.1小白菊內(nèi)酯及順鉑對(duì)SW620細(xì)胞增殖和凋亡影響的分析本研究結(jié)果表明，小白菊內(nèi)酯和順鉑單藥處理均可顯著抑制人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，且呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴(lài)性。這與以往的研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了小白菊內(nèi)酯和順鉑的抗腫瘤活性。小白菊內(nèi)酯能夠抑制SW620細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能與多個(gè)方面有關(guān)。小白菊內(nèi)酯可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在特定階段，從而抑制細(xì)胞的增殖。它能夠上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑p21和p27的表達(dá)，抑制CDK的活性，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。小白菊內(nèi)酯還可能通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性，阻斷其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。NF-κB在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，小白菊內(nèi)酯能夠與NF-κB的p65亞基結(jié)合，抑制其核轉(zhuǎn)位和DNA結(jié)合活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。順鉑作為一種經(jīng)典的化療藥物，其抑制SW620細(xì)胞增殖的作用機(jī)制主要是通過(guò)與細(xì)胞DNA結(jié)合，形成DNA-鉑加合物，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。順鉑進(jìn)入細(xì)胞后，其中心鉑原子與DNA雙鏈中的鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤等堿基結(jié)合，形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，使DNA發(fā)生彎曲和變形，阻礙DNA聚合酶和RNA聚合酶的作用，從而抑制細(xì)胞的增殖。更為重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)小白菊內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)SW620細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用明顯強(qiáng)于單藥處理組，表現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)。這一結(jié)果具有重要的臨床意義，為結(jié)腸癌的治療提供了新的思路和方法。聯(lián)合用藥能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的原因可能有以下幾點(diǎn)。小白菊內(nèi)酯可以增強(qiáng)順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性，提高順鉑進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的效率，從而增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤作用。有研究表明，小白菊內(nèi)酯可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，減少順鉑的外排，增加細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度，提高順鉑的療效。小白菊內(nèi)酯和順鉑可能通過(guò)不同的作用途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，二者聯(lián)合使用時(shí)，能夠激活更多的凋亡信號(hào)通路，從而增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。小白菊內(nèi)酯可以通過(guò)激活內(nèi)源性和外源性凋亡信號(hào)通路來(lái)促使腫瘤細(xì)胞凋亡，順鉑則主要通過(guò)損傷DNA來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。二者聯(lián)合使用時(shí)，可能會(huì)同時(shí)激活多種凋亡相關(guān)蛋白，如Bax、caspase-3、caspase-9等，協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡。小白菊內(nèi)酯還可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制，減少順鉑耐藥細(xì)胞的產(chǎn)生，從而提高聯(lián)合用藥的效果。腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性是臨床治療中的一個(gè)難題，小白菊內(nèi)酯可以通過(guò)抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)、調(diào)節(jié)DNA修復(fù)機(jī)制等方式，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，增強(qiáng)順鉑的抗癌效果。5.2作用機(jī)制探討5.2.1凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用細(xì)胞凋亡是一個(gè)由多種凋亡相關(guān)蛋白參與調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，其中Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9等蛋白在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）。Bcl-2蛋白能夠抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而阻斷內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路的激活，發(fā)揮抗凋亡作用。Bax蛋白則與Bcl-2蛋白作用相反，它可以在線粒體外膜上形成孔洞，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax的表達(dá)處于平衡狀態(tài)，維持細(xì)胞的正常存活。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激（如藥物作用）時(shí)，這種平衡被打破，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)，促使細(xì)胞凋亡。本研究中，小白菊內(nèi)酯和順鉑處理后，SW620細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高，且聯(lián)合用藥組的變化更為明顯。這表明小白菊內(nèi)酯和順鉑能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，破壞細(xì)胞內(nèi)的凋亡平衡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。小白菊內(nèi)酯可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路，減少Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低Bcl-2蛋白的表達(dá)。順鉑則可能通過(guò)損傷DNA，激活p53信號(hào)通路，上調(diào)Bax基因的表達(dá)，增加Bax蛋白的含量。二者聯(lián)合使用時(shí)，可能通過(guò)不同的途徑協(xié)同調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，其中caspase-3和caspase-9在凋亡過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。caspase-9是內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路的起始caspase，當(dāng)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中后，與Apaf-1和caspase-9結(jié)合形成凋亡小體，激活caspase-9。激活的caspase-9進(jìn)一步激活下游的caspase-3等效應(yīng)caspase，切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，小白菊內(nèi)酯和順鉑處理后，SW620細(xì)胞中caspase-3和caspase-9蛋白的表達(dá)水平顯著升高，聯(lián)合用藥組的升高幅度更大。這說(shuō)明小白菊內(nèi)酯和順鉑能夠激活內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路，通過(guò)上調(diào)caspase-3和caspase-9蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。小白菊內(nèi)酯誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，促使細(xì)胞色素C釋放，從而激活caspase-9和caspase-3。順鉑損傷DNA，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)，也能夠激活caspase-9和caspase-3。二者聯(lián)合使用時(shí)，可能通過(guò)多種途徑協(xié)同激活內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路，增強(qiáng)對(duì)caspase-3和caspase-9蛋白的激活作用，從而更有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。5.2.2其他可能的作用機(jī)制除了對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用外，小白菊內(nèi)酯和順鉑聯(lián)合應(yīng)用還可能通過(guò)其他機(jī)制影響人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的增殖和凋亡。對(duì)細(xì)胞周期的影響是可能的作用機(jī)制之一。細(xì)胞周期的正常調(diào)控對(duì)于細(xì)胞的增殖和分化至關(guān)重要，一旦細(xì)胞周期調(diào)控異常，細(xì)胞就可能出現(xiàn)異常增殖和癌變。研究表明，小白菊內(nèi)酯可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期或G2/M期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。小白菊內(nèi)酯能夠上調(diào)p21和p27蛋白的表達(dá)，這兩種蛋白是細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶的抑制劑，它們可以與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶結(jié)合，抑制其活性，使細(xì)胞無(wú)法順利從G1期進(jìn)入S期，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。順鉑也可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，主要是使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。順鉑與DNA結(jié)合形成加合物，損傷DNA，激活DNA損傷修復(fù)信號(hào)通路，使細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)被激活，細(xì)胞周期停滯在G2/M期，以便細(xì)胞有足夠的時(shí)間修復(fù)受損的DNA。如果DNA損傷無(wú)法修復(fù)，細(xì)胞則會(huì)啟動(dòng)凋亡程序。小白菊內(nèi)酯和順鉑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可能通過(guò)不同的方式協(xié)同影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用，從而更有效地抑制SW620細(xì)胞的增殖。對(duì)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)也是潛在的作用機(jī)制。腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡受到多種信號(hào)通路的調(diào)控，如PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞存活、增殖、代謝等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，該信號(hào)通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，小白菊內(nèi)酯可以抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，降低Akt蛋白的磷酸化水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。順鉑也可以通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可能通過(guò)協(xié)同抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。MAPK信號(hào)通路包括ERK、JNK和p38MAPK等分支，它們?cè)诩?xì)胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。小白菊內(nèi)酯可以激活JNK和p38MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。順鉑也可以通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。小白菊內(nèi)酯和順鉑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可能通過(guò)不同的分支協(xié)同激活MAPK信號(hào)通路，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。小白菊內(nèi)酯和順鉑還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等，影響SW620細(xì)胞的增殖和凋亡。這些信號(hào)通路之間相互交織，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。深入研究小白菊內(nèi)酯和順鉑對(duì)這些信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，將有助于進(jìn)一步揭示二者聯(lián)合應(yīng)用的抗腫瘤機(jī)制。5.3研究結(jié)果的臨床意義本研究結(jié)果對(duì)于結(jié)腸癌的臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。聯(lián)合用藥方案的制定為結(jié)腸癌的治療提供了新的方向。以往的臨床治療中，化療藥物往往單獨(dú)使用，雖然能夠在一定程度上抑制腫瘤的生長(zhǎng)，但由于藥物的局限性，治療效果往往不盡如人意。本研究表明，小白菊內(nèi)酯與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，更有效地抑制人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。在臨床實(shí)踐中，可以根據(jù)患者的具體情況，制定個(gè)性化的聯(lián)合用藥方案，合理調(diào)整小白菊內(nèi)酯和順鉑的劑量和用藥時(shí)間，以達(dá)到最佳的治療效果。對(duì)于一些對(duì)順鉑耐藥的結(jié)腸癌患者，可以嘗試聯(lián)合使用小白菊內(nèi)酯，提高順鉑的療效，克服耐藥問(wèn)題。聯(lián)合用藥還有助于減少化療藥物的用量。順鉑作為一種常用的化療藥物，雖然具有顯著的抗腫瘤作用，但其毒副作用較大，限制了其使用劑量。通過(guò)與小白菊內(nèi)酯聯(lián)合使用，可以在不降低治療效果的前提下，適當(dāng)減少順鉑的用量，從而降低順鉑的毒副作用。減少順鉑的用量可以減輕其對(duì)腎臟、內(nèi)耳等器官的損傷，降低腎毒性、耳毒性等副作用的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，提高患者的生活質(zhì)量。小白菊內(nèi)酯本身具有多種生物活性，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，減輕炎癥反應(yīng)，在一定程度上還可以緩解順鉑引起的副作用。本研究為結(jié)腸癌的治療提供了新的理論依據(jù)和治療策略。傳統(tǒng)的結(jié)腸癌治療方法存在諸多局限性，尋找高效、低毒的抗癌藥物和治療方案一直是臨床研究的重點(diǎn)。小白菊內(nèi)酯作為一種天然的抗腫瘤藥物，具有獨(dú)特的作用機(jī)制和良好的安全性，與順鉑聯(lián)合應(yīng)用展現(xiàn)出了顯著的協(xié)同效應(yīng)。這為結(jié)腸癌的治療開(kāi)辟了新的途徑，未來(lái)可以進(jìn)一步開(kāi)展臨床研究，驗(yàn)證小白菊內(nèi)酯和順鉑聯(lián)合用藥在結(jié)腸癌患者中的療效和安全性，推動(dòng)其臨床應(yīng)用。通過(guò)深入研究二者聯(lián)合作用的分子機(jī)制，還可以為開(kāi)發(fā)新的抗癌藥物和治療方法提供理論基礎(chǔ)，促進(jìn)結(jié)腸癌治療領(lǐng)域的發(fā)展。5.4研究的創(chuàng)新點(diǎn)與不足本研究具有一定的創(chuàng)新之處。在研究?jī)?nèi)容上，首次系統(tǒng)地探究了小白菊內(nèi)酯及順鉑對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖、凋亡的影響，特別是深入研究了二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的協(xié)同效應(yīng)及其潛在機(jī)制。以往對(duì)小白菊內(nèi)酯和順鉑的研究多集中在單一藥物的作用，或在其他腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用，而本研究聚焦于結(jié)腸癌SW620細(xì)胞，為結(jié)腸癌的治療提供了更具針對(duì)性的