第五章酶工程酶工程定義定義:將酶所具有的生物催化功能,借助工程手段應(yīng)用于社會生活的一門科學(xué)技術(shù)；利用酶催化的作用,在一定的生物反應(yīng)器中,將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化為所需要的產(chǎn)品；利用酶、細(xì)胞器或細(xì)胞的特異催化功能，通過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品或達(dá)到某種特殊目的的一門技術(shù)科學(xué)。(大唐搜索)領(lǐng)域:酶學(xué)理論與工程技術(shù)相結(jié)合而形成的新技術(shù)“酶工程”的定義運用酶學(xué)知識結(jié)合數(shù)學(xué)和/或其他系統(tǒng)性知識設(shè)計有實用價值的新酶(生物催化劑，固定化生物催化劑，生物催化反應(yīng)體系,生物催化反應(yīng)器。。。)一門研究如何發(fā)揮酶的催化功能的技術(shù)科學(xué)/show/DqeOCVM1Ni8a-Kwv.html酶學(xué)知識酶是什么？有催化活力的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)一般不穩(wěn)定,反應(yīng)條件溫和催化能力高效性,專一性化學(xué)選擇性，區(qū)域選擇性，立體選擇性TheMechanismofEnzymeCatalysis酶與過渡態(tài)中間物的緊密結(jié)合，穩(wěn)定了底物的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)，從而降低了底物形成其過渡態(tài)所需克服的能壘，提高了反應(yīng)的速度酶學(xué)相關(guān)定義U酶活力單位

1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1umol底物所需酶量Vmax

最大反應(yīng)速度酶分子所有的活性部位都被底物占據(jù)時的反應(yīng)速度Km米氏常數(shù)反應(yīng)速度達(dá)到Vmax一半時的底物濃度Kcat

酶轉(zhuǎn)換數(shù)

以每分鐘每酶分子形成的產(chǎn)物的分子數(shù)表示的Vmax米氏方程酶的命名

氧、轉(zhuǎn)、水、裂、異、合(連)

Oxidoreductases

氧化還原酶Transferases

轉(zhuǎn)移酶Hydrolases

水解酶Lyases

裂合酶Isomerases

異構(gòu)酶Ligases

連接酶ATP水解偶聯(lián)國際酶學(xué)委員會EnzymeCommission(EC)酶知識復(fù)習(xí)小結(jié)酶是有催化活力的蛋白質(zhì)酶與過渡態(tài)中間物的緊密結(jié)合，穩(wěn)定了底物的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)，從而降低了底物形成其過渡態(tài)所需克服的能壘，提高了反應(yīng)的速度酶分為6大類，酶的命名可以在http:///enzyme上查詢酶的生產(chǎn)方法重組表達(dá)系統(tǒng)酶的分離提取酶的固定化技術(shù)酶反應(yīng)器酶工程的歷史酶的歷史在麥芽中發(fā)現(xiàn)淀粉酶 1833在胃中發(fā)現(xiàn)消化酶--胃蛋白酶 1836

1873

從小牛胃提取凝乳酶用于制酪Enzyme定名--意為"在酵母中" 1878鑰匙-鎖理論提出

1894

以米曲霉生產(chǎn)淀粉酶作為消化酶中間產(chǎn)物學(xué)說

米氏方程 1913獲得脲酶結(jié)晶

酶是蛋白質(zhì) 1926 1949液體深層發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌α-淀粉酶固定化酶 1953操縱子學(xué)說酶生物合成機(jī)制 1960

1969

固定化氨基?；干a(chǎn)L-氨基酸

1973基因工程技術(shù)

1978定點突變技術(shù)

1984

TyrRS的蛋白質(zhì)工程

1986重組酶生產(chǎn)

1993定向進(jìn)化

1994DNAshuffling

酶的生產(chǎn)植物來源來源 酶 應(yīng)用刀豆 脲酶 診斷木瓜 木瓜蛋白酶 烘焙，制酪，制革，

嫩肉粉，啤酒澄清無花果 無花果蛋白酶 嫩肉粉菠蘿 菠蘿蛋白酶 烘焙辣根 辣根過氧化物酶 診斷檸檬 β-糖苷酶 科研小麥 酯酶 酯水解與合成大麥 β-淀粉酶 烘焙，麥芽糖漿大豆 β-淀粉酶 烘焙，麥芽糖漿動物來源的工業(yè)用酶來源酶工業(yè)用途肝過氧化氫酶食品胰腺胰凝乳蛋白酶制革胰腺脂肪酶食品皺胃凝乳酶制酪胰腺胰蛋白酶皮革微生物來源的工業(yè)用酶EnzymeECnumberSourceIntra/extra-cellular

ScaleofproductionIndustrialuseBacterialenzymesa-AmylaseBacillusE+++Starchb-AmylaseBacillusE+StarchAsparaginaseEscherichiacoliI-HealthGlucoseisomeraseBacillusI++FructosesyrupPenicillinamidase1BacillusI-PharmaceuticalProtease4BacillusE+++DetergentPullulanase1KlebsiellaE-StarchFungalenzymesa-AmylaseAspergillusE++BakingAminoacylase4AspergillusI-PharmaceuticalGlucoamylaseAspergillusE+++StarchCatalaseAspergillusI-FoodCellulaseTrichodermaE-WasteDextranase1PenicilliumE-FoodGlucoseoxidaseAspergillusI-FoodLactase3AspergillusE-DairyLipaseRhizopusE-FoodRennetMucor

mieheiE++CheesePectinase5AspergillusE++DrinksPectinlyase0AspergillusE-DrinksProteaseAspergillusE+BakingRaffinase2MortierellaI-FoodYeastenzymes

Invertase6SaccharomycesI/E

-ConfectioneryLactase3KluyveromycesI/E-DairyLipaseCandidaE-FoodRaffinase2SaccharomycesI-Food微生物酶生產(chǎn)率提高的手段菌種選育 －－誘變育種發(fā)酵工藝優(yōu)化－－發(fā)酵工程重組表達(dá)－－基因工程酶制劑使用添加劑共價修飾固定化小結(jié)酶的來源很多，但主要來源于微生物發(fā)酵酶的工業(yè)化應(yīng)用取決于他們的效果，成本和安全性離心一般用于收集含酶固體

過濾更多用于液體酶回收

雙水相體系將會在酶回收操作中得到更多應(yīng)用制備工業(yè)用酶需盡量壓縮分離提取步驟酶制劑必須穩(wěn)定，使用安全固定化酶優(yōu)點便于從反應(yīng)體系中分離從而易于控制反應(yīng)時間，減少酶失活可反復(fù)使用降低用酶成本提高酶穩(wěn)定性缺點傳質(zhì)限制動力學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化固定化增加額外成本

a.吸附

b.共價連接

c.包埋

d.膜限制

酶的固定化方法多點作用使酶穩(wěn)定化固定化載體EupergitC?

Sepabeads?series新型固定化方法—無載體固定化Thedifferentapproachestotheproductionofcarrier-freeimmobilisedenzymes:crystallization;(b)aggregation;(c)spray-drying;(d)directcross-linking.AGG,aggregates;CRY,crystals;SDE,spray-driedenzyme.固定化酶小結(jié)酶的固定化使得他們能高效和連續(xù)使用酶的固定化形式有4種酶的固定化影響動力學(xué)性質(zhì)酶的固定化一般可提高其使用的經(jīng)濟(jì)性酶的固定化新技術(shù)－－無載體固定化酶反應(yīng)器圖解小結(jié)重組微生物是酶的最重要來源工業(yè)用酶的分離提取對成本敏感固定化酶是工業(yè)用酶制劑的重要形式酶反應(yīng)器對于發(fā)揮酶的催化作用也很重要酶的改造獲得新酶的途徑自然界中獲取有理設(shè)計新酶隨機(jī)方法篩選新酶生物多樣性與新酶的發(fā)現(xiàn)嗜熱菌（Thermophiles)嗜冷菌（Phyphophiles)嗜酸菌（Acidophiles)嗜堿菌（Alkaliphiles)嗜鹽菌（Halophiles)嗜壓菌（Barophiles)

極端微生物的特殊生長環(huán)境及代謝產(chǎn)物，使酶在“惡劣”環(huán)境下能夠發(fā)揮高效催化作用。目前已經(jīng)有158種微生物的基因組被全測序SαIβDistributionforpenicillinGacylasePGAprecursorstructure天然酶化學(xué)

-轉(zhuǎn)化天然底物物理 -耐受差生物 -代謝調(diào)控和高轉(zhuǎn)換數(shù)環(huán)境不同要求不同自然進(jìn)化中天然酶的結(jié)構(gòu)功能對應(yīng)于其活細(xì)胞的生理功能而進(jìn)化的天然酶往往不適用于生物技術(shù)應(yīng)用改造目的高專一性

只催化所需反應(yīng)

減少甚至沒有副產(chǎn)物高活性高生產(chǎn)率不易受抑制高穩(wěn)定性

存放時間長操作穩(wěn)定性高生物催化劑應(yīng)用依賴于天然酶改造或重新設(shè)計方法酶的改造蛋白質(zhì)工程－－理性設(shè)計

通過蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)和動力學(xué)的研究獲取關(guān)于蛋白質(zhì)物理、化學(xué)等方面的信息，在此基礎(chǔ)上對編碼該蛋白的基因進(jìn)行有目的的設(shè)計改造，并通過基因工程等手段將其進(jìn)行表達(dá)和分離純化，最終將其投入實際應(yīng)用?；蚬こ蹋Y(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)化學(xué)修飾固定化定向進(jìn)化－－非理性設(shè)計有理設(shè)計根據(jù)詳盡的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系知識結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu) 氨基酸順序二級結(jié)構(gòu) a-螺旋,b-折疊,轉(zhuǎn)角,無規(guī)卷曲三級結(jié)構(gòu) 3D折疊(結(jié)晶，NMR)功能活性位點 氨基酸殘基和輔因子催化 機(jī)理,

特異性和動力學(xué)調(diào)節(jié) 競爭性抑制和變構(gòu)控制

怎么獲得這些信息？經(jīng)典途徑純化目標(biāo)酶，分析氨基酸序列分離基因并重組表達(dá)結(jié)晶目標(biāo)酶，X射線分析序列與結(jié)構(gòu)分析多重聯(lián)配 序列保守性信息結(jié)晶/同源模建 獲得立體結(jié)構(gòu)三維結(jié)構(gòu)分析 分子圖像分析有理設(shè)計目標(biāo)催化效率穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性有機(jī)溶劑穩(wěn)定性pH曲線提高熱穩(wěn)定性的重要全局性因素環(huán)區(qū)長度減少以及隨之而來的二級結(jié)構(gòu)增加表面電荷相互作用敏感氨基酸殘基減少

(如半胱氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺)芳香環(huán)堆積增加疏水作用增加金屬離子結(jié)合能力提高寡聚增加常用提高穩(wěn)定性方法 引入二硫鍵和/或鹽橋CCOOCCOOCCOOCCOOCCOOIndex1Index2Index3Index40<OSP<0.150.15<OSP<0.300.30<OSP<0.450.45<OSP<0.600.60<OSP<0.75FullyexposedstateExposedstateBoundarystateBuriedstateWell-buriedstateIndex5氨基酸殘基分布差異高

PRO

低

MET

低

極顯著低低SER

（低）

低（低）

ASN高

TYR高

TRP

低LYS

高

極顯著

高

GLU

高

高

ARG

高

ILE

低

VAL高

極顯著

低

極顯著

ALA完全包埋包埋部分包埋/部分暴露暴露完全暴露

對于熱穩(wěn)定性改造的具體指導(dǎo)完全暴露

SER,LYS

ILE

暴露

ALA,VAL,ASN,SER

ARG,GLU

部分包埋/部分暴露SER

?

包埋： MET

ARG,GLU

完全包埋： ?

ALA,TRP,TYR,PRO

pH曲線的改變將蛋白質(zhì)表面變得更帶負(fù)電荷將提高酸性基團(tuán)的pKa值，因為它們在離子化時丟失質(zhì)子。反之，將表面變得更帶正電荷則降低所有酸性基團(tuán)的pKa值。低離子強(qiáng)度時變化將最大如果避免多電荷抗衡離子，當(dāng)離子強(qiáng)度高至0.1M時會出現(xiàn)明顯的變化。突變設(shè)計應(yīng)避免在活性中心空穴附近聚集抗衡離子。融合蛋白質(zhì)－－廣義的有理設(shè)計組氨酸標(biāo)簽(Histidine-tag,his-tag)谷胱甘肽合成酶

(glutathionesynthetase,GST)麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)

(maltosebindingprotein,MBP)內(nèi)含肽(Intein)各種信號肽改善重組蛋白可溶性，便于親和層析純化。。。生物催化劑的定向進(jìn)化進(jìn)化

逐步過程自然進(jìn)化

自發(fā)突變

重組

自然選擇達(dá)爾文進(jìn)化理論

生命的復(fù)雜性是突變，重組和自然選擇算法的結(jié)果人類的作物，花卉和家禽家畜育種實踐有幾千年歷史加速進(jìn)化

快速改變農(nóng)業(yè)進(jìn)化

自發(fā)突變

育種

篩選革命

極快改變實驗室進(jìn)化

加快突變速度 分子育種

篩選實驗室進(jìn)化不同于自然進(jìn)化在于其明確的進(jìn)化目標(biāo).在此意義上它是“定向”并且更像育種。此外，它非?？?。加速進(jìn)化

快速改變農(nóng)業(yè)進(jìn)化

自發(fā)突變

育種

篩選革命

極快改變實驗室進(jìn)化

加快突變速度

分子育種

篩選進(jìn)化

逐步過程自然進(jìn)化

自發(fā)突變

重組

自然選擇定向進(jìn)化的基本過程SinglegeneDNAshufflingMultiplegenesDNAfamilyshufflingExpressionandscreenRepeatedasneededComparisonofsinglesequenceshufflingversussequencefamilyshuffling高通量篩選－－無理設(shè)計的有理部分selection選擇screening篩選定向進(jìn)化的應(yīng)用BiocatalystsProteinDrugEvolvedVectorVaccineGeneTherapySmallMoleculePharmaceuticalsAntibodyStrainEvolutionMilestonesinDirectedEvolution

Kauffmanpatent ’85

DNAshuffling ’94

Familyshuf