《瘧原蟲檢測免疫層析法》PPT課件自2026年3月1日起施行目錄02關鍵定義與概念01標準背景與概述03檢測原理04樣本檢測操作05試紙條制備規(guī)范06應用與意義標準背景與概述01發(fā)布單位與實施日期部門規(guī)范性文件效力文件效力等級明確為部門規(guī)范性文件，目前處于尚未生效狀態(tài)，需待正式實施后方具強制約束力。13項配套標準同步施行該標準與《瘧原蟲檢測蟲種核酸鑒定法》《尿中氟化物測定全自動電位法》等12項標準共同構成公共衛(wèi)生檢測體系，實施日期統(tǒng)一為2026年3月1日。國家疾控局發(fā)布由國家疾病預防控制局作為行業(yè)標準發(fā)布主體，體現(xiàn)其權威性和規(guī)范性，屬于疾病預防控制領域的重要技術文件。起草單位與適用范圍4雙重應用價值3標準化技術規(guī)范2覆蓋全鏈條檢測場景1多機構聯(lián)合起草既可作為顯微鏡檢的補充手段，也能在資源有限地區(qū)獨立用于瘧疾快速診斷，提升公共衛(wèi)生應急響應能力。適用于各級醫(yī)療機構和疾病預防控制機構，涵蓋從基層篩查到專業(yè)實驗室的瘧疾診斷需求。文件嚴格規(guī)定免疫層析法檢測人體血液樣本中瘧原蟲抗原的技術流程，包括樣本處理、試劑制備和結果判讀等全環(huán)節(jié)。主要起草單位包括上海出入境檢驗檢疫局、河北出入境檢驗檢疫局及中國疾控中心寄生蟲病預防控制所，融合了檢驗檢疫與疾控系統(tǒng)的專業(yè)技術力量。標準替代與更新情況技術迭代升級相較于舊版檢測方法，新標準引入泛種瘧原蟲抗原檢測概念，新增對乳酸脫氫酶和醛縮酶等保守抗原的檢測要求。質(zhì)控體系強化在附錄B中詳細規(guī)定試紙條制備工藝，包括樣品墊處理、結合墊抗體標記等技術參數(shù)，確保批間一致性。標準要求試劑需能同時檢測HRP-2和pLDH兩種抗原，通過顯色條帶組合提高間日瘧、三日瘧的鑒別診斷準確性。多抗原聯(lián)檢優(yōu)化關鍵定義與概念02瘧原蟲抗原是瘧原蟲產(chǎn)生的能與相應抗體特異性結合的蛋白性成分，主要包括富組氨酸蛋白Ⅱ(HRP-2)、乳酸脫氫酶(pLDH)和醛縮酶等，這些抗原在紅細胞內(nèi)期裂殖體增殖階段大量產(chǎn)生。01040302瘧原蟲抗原定義特異性蛋白成分作為瘧疾實驗室檢測的核心指標，通過檢測全血樣本中的這些特異性抗原成分，可實現(xiàn)對現(xiàn)癥瘧疾患者的輔助診斷，具有快速、便捷的特點。診斷核心指標抗原的產(chǎn)生與瘧原蟲紅細胞內(nèi)期裂殖增殖直接相關，不同種類瘧原蟲的裂殖周期差異導致抗原表達時相和量的差異，如惡性瘧原蟲HRP-2抗原在感染后5-7天可被檢出。生命周期關聯(lián)某些抗原如HRP-2具有種屬特異性，可用于區(qū)分惡性瘧原蟲與其他瘧原蟲感染，而pLDH等抗原則與瘧原蟲的紅細胞內(nèi)發(fā)育階段呈正相關。種屬特異性泛種瘧原蟲抗原解釋屬特異性抗原泛種瘧原蟲抗原是指人體瘧原蟲共有的、保守程度較高的抗原，主要包括乳酸脫氫酶(pLDH)和醛縮酶等，這些抗原在所有瘧原蟲感染中均可表達。由于其在所有瘧原蟲中均存在，因此可用于瘧疾的初步篩查，當檢測到泛種抗原時提示可能存在瘧原蟲感染，但無法區(qū)分具體種類。在快速診斷試紙條中，泛種抗原檢測線通常與種特異性抗原(如HRP-2)聯(lián)合使用，通過顯色條帶組合模式來判斷感染類型，提高診斷準確性。廣譜檢測價值輔助鑒別診斷快速診斷試紙條描述免疫層析原理快速診斷試紙條(RDT)基于免疫層析技術，將瘧原蟲特異性抗體固定于硝酸纖維素膜的檢測區(qū)帶，通過毛細作用使樣本移動并與抗體結合，利用膠體金或酶顯色實現(xiàn)檢測。01多組分結構試紙條由樣品墊、結合墊(含標記抗體)、硝酸纖維素膜(包被檢測線和質(zhì)控線抗體)、吸水墊等組成，通常裝載于條卡型或板型外殼中便于操作。雙抗體夾心法主流試劑采用雙抗體夾心法原理，可同時檢測HRP-2和pLDH兩種抗原，血樣中的抗原先與標記抗體結合，再被檢測線固定抗體捕獲形成"抗體-抗原-抗體"復合物顯色。操作便捷性檢測時只需將外周血和裂解液加入試紙條加樣孔，15-20分鐘內(nèi)即可通過顯色條帶判讀結果，無需專業(yè)設備，適合基層和現(xiàn)場篩查。020304檢測原理03免疫層析法基礎原理毛細作用驅動利用硝酸纖維素膜的毛細管效應，使樣本溶液在膜上定向遷移，實現(xiàn)無需外部設備的自動層析過程。采用標記抗體（膠體金/熒光）與固定化抗體形成夾心結構，確保僅目標抗原能被特異性捕獲并顯色。通過層析介質(zhì)對不同分子量物質(zhì)的遷移速率差異，實現(xiàn)血細胞、血漿蛋白與目標抗原的物理分離。雙抗體夾心設計多組分分離將瘧原蟲特異性抗體通過氨基或羧基共價結合到硝酸纖維素膜檢測線，保證抗體在濕潤環(huán)境下的穩(wěn)定性。共價偶聯(lián)技術固定化過程中采用BSA封閉和蔗糖保護劑，維持抗體的抗原結合位點空間構象。構象保持樣本遷移時，抗原與標記抗體的預結合復合物以10^8-10^10M^-1的親和力與固定抗體二次結合。動態(tài)結合平衡抗體固定與抗原結合膠體金顯色采用HRP-底物系統(tǒng)時，TMB顯色靈敏度可達0.1-1ng/mL，需配套閱讀儀分析。酶促顯色熒光標記量子點或銪微球標記時，激發(fā)光波長與發(fā)射波長差≥100nm，有效避免背景干擾。40nm金顆粒等離子共振產(chǎn)生酒紅色條帶，最低可見濃度達5-10ng/mL，可通過反射光密度計量化。顏色顯示機制樣本檢測操作04樣本采集與處理采集部位選擇優(yōu)先采集指尖或耳垂末梢血，確保血量充足（10-20μl），避免溶血或凝血影響檢測準確性?？鼓齽┦褂貌捎肊DTA抗凝管保存樣本，防止血液凝固導致瘧原蟲形態(tài)破壞，保持抗原完整性。運輸與儲存樣本需在4℃條件下2小時內(nèi)送檢，若延遲檢測應置于-20℃冷凍保存，避免反復凍融。試紙條使用步驟樣本加載精確吸取15μL全血加入樣本孔，隨后立即加入2滴裂解液（約100μL），避免交叉污染反應時間控制嚴格遵循說明書要求的反應時間（通常10-15分鐘），超時判讀可能導致假陽性試劑準備從鋁箔袋取出試紙條前需平衡至室溫，檢查包裝完整性，裂解液使用前需充分混勻層析過程將試條水平放置于干燥環(huán)境，觀察溶液層析進度，正常情況下液體應在5分鐘內(nèi)流經(jīng)檢測區(qū)結果判讀標準陽性結果檢測線（T線）與質(zhì)控線（C線）同時出現(xiàn)紅色條帶，提示存在瘧原蟲特異性抗原（pfLDH/panLDH）無效結果質(zhì)控線未顯色需重新檢測，可能因試條失效、操作錯誤或樣本量不足導致陰性結果僅質(zhì)控線（C線）顯色且檢測線無顯色，表明樣本中瘧原蟲抗原濃度低于檢測限試紙條制備規(guī)范05組件制備（樣品墊、結合墊）樣品墊通常采用玻璃纖維材質(zhì)，需經(jīng)過緩沖液（如Tris-HCl或PBS）預處理以優(yōu)化樣本流動性和抗原結合效率。處理后的材料需在潔凈環(huán)境下干燥，避免污染。樣品墊處理結合墊固定膠體金標記抗體（如抗panLDH單抗），需精確控制金標抗體的噴涂濃度（通常1-5μg/cm2）和均勻性。噴涂后經(jīng)冷凍干燥或37℃烘干以保持抗體活性。結合墊制備檢測線包被特異性抗體（如pfLDH或panLDH單抗），質(zhì)控線包被抗鼠IgG多抗。包被時需控制抗體濃度（0.5-2mg/mL）和劃線速度（1-2μL/cm），確保條帶清晰無擴散。硝酸纖維素膜包被將樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙按順序層壓在PVC背襯上，各組件重疊1-2mm以保證層析連續(xù)性。組裝過程需在濕度<30%的環(huán)境中進行，防止材料受潮。層壓組裝每份鋁箔袋包裝內(nèi)需放置硅膠干燥劑（1-2g），確保濕度<10%。包裝后需進行氣密性測試，防止運輸過程中受潮失效。干燥劑配置條卡型外殼需預留加樣孔和觀察窗，確保加樣量（5-10μL）和結果判讀無遮擋。板型外殼需密封防塵，避免試紙條暴露于光線或濕氣。外殼封裝外包裝需標明生產(chǎn)批號、有效期（通常24個月）和儲存條件（4-30℃避光），并附注冊產(chǎn)品標準編號（如YZB/國4201-2011）。標簽與批號組裝與包裝要求01020304裂解液主要含0.15MNH4Cl（pH7.8±0.2），輔以1mMNa4EDTA（抗凝）和10mMKHCO3（維持滲透壓）。配制時需用超純水溶解，經(jīng)0.22μm濾膜除菌。裂解液制備方法基礎配方可添加0.1%TritonX-100以增強紅細胞裂解效率，或0.5%BSA減少非特異性結合。添加后需驗證對抗原抗體結合的影響。添加劑控制裂解液分裝至避光瓶中，標注配制日期和批號。4℃保存時有效期6個月，避免反復凍融。使用前需恢復至室溫并檢查有無沉淀或變色。分裝與儲存應用與意義06公共衛(wèi)生價值基層篩查優(yōu)勢免疫層析法無需專業(yè)設備與實驗室條件，適用于醫(yī)療資源匱乏地區(qū)。通過檢測瘧原蟲特異性抗原（如HRP-2/pLDH），可在15分鐘內(nèi)完成現(xiàn)場篩查，顯著提升瘧疾早期診斷覆蓋率，阻斷傳播鏈。輸入病例防控我國消除瘧疾后，輸入性病例成為主要風險。該方法可快速篩查歸國人員及邊境流動人口，配合顯微鏡復檢形成雙重保障，有效防止本地再傳播。操作便捷性采用膠體金標記和雙抗體夾心技術，僅需外周血和裂解液即可完成檢測。試紙條顯色直觀，非專業(yè)人員經(jīng)培訓即可判讀結果，適合大規(guī)模應急使用。優(yōu)缺點分析檢測局限性無法區(qū)分活動性感染與治愈后殘留抗原（如HRP-2可存留28天），對低密度感染（<100寄生蟲/μL）靈敏度下降。不同瘧原蟲種屬的抗原表達差異可能導致交叉反應。成本效益比單次檢測成本低于PCR但高于鏡檢，批量采購可降低至合理范圍。需平衡儲存條件（避光防潮）與試劑穩(wěn)定