山東省禽源大腸桿菌的血清型解析與喹諾酮耐藥性探秘一、引言1.1研究背景家禽養(yǎng)殖業(yè)在我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占據(jù)重要地位，為人們提供了豐富的禽肉、禽蛋等產(chǎn)品。然而，家禽疾病的頻繁發(fā)生嚴(yán)重制約了家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，其中禽源大腸桿菌病是最為常見且危害較大的疾病之一。禽源大腸桿菌（AvianEscherichiacoli）是一種革蘭氏陰性菌，作為一種條件性致病菌，在正常情況下，其在家禽腸道內(nèi)處于相對平衡的狀態(tài)，不會(huì)引發(fā)疾病。但當(dāng)家禽受到各種應(yīng)激因素影響，如飼養(yǎng)環(huán)境惡劣（溫度、濕度不適宜，通風(fēng)不良等）、飼養(yǎng)密度過大、飼料營養(yǎng)不均衡、免疫抑制性疾病感染等，家禽機(jī)體免疫力下降，腸道微生態(tài)平衡被打破，禽源大腸桿菌就會(huì)趁機(jī)大量繁殖并侵入家禽機(jī)體的其他組織和器官，從而引發(fā)一系列嚴(yán)重的病癥。禽源大腸桿菌可引起家禽多種疾病，如急性敗血癥、氣囊炎、肝周炎、心包炎、卵黃性腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、關(guān)節(jié)炎、臍炎、肉芽腫等。這些病癥對家禽的生長發(fā)育、生產(chǎn)性能和繁殖能力造成極大的負(fù)面影響，導(dǎo)致家禽生長緩慢、飼料轉(zhuǎn)化率降低、產(chǎn)蛋量下降、孵化率降低，甚至大量死亡。例如，在一些規(guī)模化養(yǎng)雞場中，一旦爆發(fā)禽源大腸桿菌病，雛雞的死亡率可達(dá)20%-50%，成年雞的產(chǎn)蛋率可下降30%-50%，給養(yǎng)殖戶帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。血清型鑒定對于深入了解禽源大腸桿菌的致病機(jī)制、傳播規(guī)律以及制定有效的防控策略具有至關(guān)重要的意義。禽源大腸桿菌具有復(fù)雜多樣的血清型，不同血清型在致病性、傳播途徑和流行特點(diǎn)等方面存在顯著差異。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，目前已發(fā)現(xiàn)的禽源大腸桿菌血清型多達(dá)數(shù)百種。其中，O1、O2、O78等血清型較為常見且致病性較強(qiáng)，在許多地區(qū)的禽源大腸桿菌病流行中占據(jù)主導(dǎo)地位。通過準(zhǔn)確鑒定禽源大腸桿菌的血清型，能夠明確疾病的病原體，追蹤傳染源和傳播途徑，為針對性的防控措施提供科學(xué)依據(jù)。例如，在某地區(qū)的禽病調(diào)查中，通過血清型鑒定發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)厍菰创竽c桿菌病主要由O78血清型引起，于是針對該血清型研發(fā)和使用特異性疫苗，有效控制了疾病的傳播和流行。耐藥性問題是當(dāng)前禽源大腸桿菌病防治面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一。隨著抗生素在獸醫(yī)臨床的廣泛應(yīng)用，禽源大腸桿菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，耐藥譜逐漸擴(kuò)大，多重耐藥現(xiàn)象日益普遍。耐藥性的產(chǎn)生使得傳統(tǒng)抗生素治療效果大打折扣，甚至失效，導(dǎo)致禽源大腸桿菌病的治療難度顯著增加，治療成本大幅上升。例如，一些原本對大腸桿菌敏感的抗生素，如氨芐西林、阿莫西林等，由于耐藥性的產(chǎn)生，現(xiàn)在對禽源大腸桿菌的治療效果明顯下降。此外，耐藥性大腸桿菌還可能通過食物鏈傳播給人類，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成潛在威脅。喹諾酮類藥物作為一類廣譜、高效的抗菌藥物，在禽源大腸桿菌病的治療中曾經(jīng)發(fā)揮了重要作用。然而，近年來，由于喹諾酮類藥物的不合理使用和濫用，禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性呈快速上升趨勢。研究表明，部分地區(qū)禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥率已超過50%，嚴(yán)重影響了喹諾酮類藥物的臨床療效。耐藥性的產(chǎn)生不僅與藥物的使用劑量、使用頻率和使用時(shí)間等因素有關(guān)，還與細(xì)菌自身的耐藥機(jī)制密切相關(guān)。禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制主要包括藥物作用靶位的改變、藥物外排泵的過度表達(dá)以及細(xì)菌細(xì)胞壁通透性的降低等。山東省作為我國的家禽養(yǎng)殖大省，家禽養(yǎng)殖規(guī)模龐大，家禽存欄量和出欄量均位居全國前列。然而，山東省家禽養(yǎng)殖業(yè)也面臨著嚴(yán)重的禽源大腸桿菌病威脅。了解山東省禽源大腸桿菌的血清型分布特征以及對喹諾酮類藥物的耐藥性狀況，對于指導(dǎo)山東省家禽養(yǎng)殖業(yè)合理用藥，有效防控禽源大腸桿菌病具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，針對山東省禽源大腸桿菌的相關(guān)研究相對較少，尤其是在血清型鑒定和喹諾酮類藥物耐藥性方面的系統(tǒng)研究還存在不足。因此，開展本研究具有迫切的必要性和重要的科學(xué)價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1禽源大腸桿菌血清型鑒定研究現(xiàn)狀在國外，對禽源大腸桿菌血清型的研究開展較早且較為深入。早在20世紀(jì)中葉，國外學(xué)者就開始系統(tǒng)地對禽源大腸桿菌的血清型進(jìn)行分類和鑒定。經(jīng)過多年的研究，已經(jīng)明確了眾多血清型與禽病之間的關(guān)聯(lián)。例如，美國的相關(guān)研究表明，O1、O2和O78血清型在禽源大腸桿菌病的爆發(fā)中最為常見，是導(dǎo)致家禽感染的主要血清型。這些血清型具有較強(qiáng)的致病性，能夠引起家禽嚴(yán)重的全身性感染，導(dǎo)致較高的死亡率和生產(chǎn)性能下降。此外，歐洲的一些研究也發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的禽源大腸桿菌血清型分布存在一定差異。在一些北歐國家，O15、O20等血清型相對較為流行，而在南歐地區(qū)，O1、O2、O78等血清型仍然占據(jù)主導(dǎo)地位。這種地區(qū)差異可能與當(dāng)?shù)氐募仪蒺B(yǎng)殖模式、環(huán)境因素以及疫苗使用情況等多種因素有關(guān)。國外在血清型鑒定技術(shù)方面也取得了顯著進(jìn)展。傳統(tǒng)的血清型鑒定方法主要基于血清學(xué)反應(yīng)，如玻片凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)。這些方法操作相對簡單，成本較低，但存在一定的局限性，如檢測速度較慢、準(zhǔn)確性有限，且對于一些不常見的血清型難以準(zhǔn)確鑒定。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基于基因檢測的血清型鑒定方法逐漸成為研究熱點(diǎn)。例如，多位點(diǎn)序列分型（MLST）技術(shù)通過對多個(gè)管家基因的測序和分析，能夠準(zhǔn)確地確定大腸桿菌的基因型和血清型，具有分辨率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。此外，PCR-RFLP（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性）技術(shù)、基因芯片技術(shù)等也被廣泛應(yīng)用于禽源大腸桿菌血清型的鑒定。這些技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出目標(biāo)血清型，大大提高了鑒定效率和準(zhǔn)確性。在國內(nèi)，禽源大腸桿菌血清型的研究也受到了廣泛關(guān)注。國內(nèi)學(xué)者通過對不同地區(qū)家禽養(yǎng)殖場的調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)我國禽源大腸桿菌的血清型也呈現(xiàn)出多樣化的特點(diǎn)。除了常見的O1、O2、O78血清型外，還發(fā)現(xiàn)了許多其他血清型，如O68、O18、O35等。一些研究表明，不同地區(qū)的優(yōu)勢血清型存在差異。在東北地區(qū)，O1、O2、O78血清型較為常見；而在華南地區(qū)，除了上述常見血清型外，O68血清型的檢出率也相對較高。這種地區(qū)差異可能與我國地域廣闊、氣候條件多樣以及家禽養(yǎng)殖品種和管理水平的差異有關(guān)。在血清型鑒定技術(shù)方面，國內(nèi)也緊跟國際步伐，不斷引進(jìn)和創(chuàng)新。目前，傳統(tǒng)的血清學(xué)方法仍然是我國禽源大腸桿菌血清型鑒定的主要手段之一。許多基層實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖場通過玻片凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)對禽源大腸桿菌進(jìn)行初步的血清型鑒定。同時(shí)，國內(nèi)一些科研機(jī)構(gòu)和高校也積極開展分子生物學(xué)技術(shù)在血清型鑒定中的應(yīng)用研究。例如，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的研究人員利用PCR-RFLP技術(shù)對禽源大腸桿菌的O抗原基因進(jìn)行分析，成功鑒定出多種血清型。此外，一些國內(nèi)企業(yè)也開始研發(fā)基于基因芯片技術(shù)的禽源大腸桿菌血清型鑒定試劑盒，為臨床檢測提供了更加便捷、快速的方法。盡管國內(nèi)外在禽源大腸桿菌血清型鑒定方面取得了諸多成果，但仍存在一些不足之處。首先，目前的血清型鑒定方法大多只能針對已知的血清型進(jìn)行檢測，對于一些新出現(xiàn)的或罕見的血清型，缺乏有效的鑒定手段。其次，不同地區(qū)的血清型分布研究還不夠全面和深入，對于一些偏遠(yuǎn)地區(qū)或小規(guī)模養(yǎng)殖場的禽源大腸桿菌血清型了解甚少。此外，血清型與致病性之間的關(guān)系尚未完全明確，雖然一些常見血清型被認(rèn)為具有較強(qiáng)的致病性，但對于其他血清型的致病機(jī)制和毒力特征還需要進(jìn)一步研究。1.2.2禽源大腸桿菌喹諾酮類藥物耐藥性研究現(xiàn)狀國外對禽源大腸桿菌喹諾酮類藥物耐藥性的研究起步較早，積累了豐富的研究資料。研究表明，自喹諾酮類藥物廣泛應(yīng)用于家禽養(yǎng)殖業(yè)以來，禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性逐漸增加。早在20世紀(jì)90年代，歐美等國家就開始關(guān)注禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥問題。一些研究發(fā)現(xiàn)，禽源大腸桿菌對第一代喹諾酮類藥物萘啶酸的耐藥率較高，隨著時(shí)間的推移，對第二代、第三代喹諾酮類藥物的耐藥率也呈上升趨勢。例如，在美國的一些家禽養(yǎng)殖場中，禽源大腸桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥率在過去幾十年中不斷上升，目前已達(dá)到相當(dāng)高的水平。國外在禽源大腸桿菌喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制的研究方面取得了重要進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，喹諾酮類藥物的作用靶位主要是細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶（由gyrA和gyrB基因編碼）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ（由parC和parE基因編碼）。當(dāng)這些基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致藥物作用靶位的改變，從而使細(xì)菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性。例如，gyrA基因的Ser83Leu和Asp87Asn等位點(diǎn)的突變是導(dǎo)致禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥的常見原因。此外，藥物外排泵的過度表達(dá)也是禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥的重要機(jī)制之一。一些外排泵基因，如acrAB-tolC、emrAB等，能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的喹諾酮類藥物排出體外，降低藥物在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的濃度，從而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。在國內(nèi)，隨著家禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性問題也日益突出。大量的研究表明，我國禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥率普遍較高，且呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢。一些地區(qū)的調(diào)查結(jié)果顯示，禽源大腸桿菌對諾氟沙星、氧氟沙星等常見喹諾酮類藥物的耐藥率已經(jīng)超過50%，甚至在某些地區(qū)高達(dá)80%以上。多重耐藥現(xiàn)象也十分普遍，許多禽源大腸桿菌不僅對喹諾酮類藥物耐藥，還同時(shí)對其他類別的抗生素，如β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類等耐藥。國內(nèi)在禽源大腸桿菌喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制的研究方面也取得了一定的成果。研究發(fā)現(xiàn)，我國禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制與國外報(bào)道的相似，主要包括藥物作用靶位的改變和藥物外排泵的過度表達(dá)。此外，一些研究還發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制在我國禽源大腸桿菌中也較為常見。質(zhì)?？梢詳y帶耐藥基因，如qnr基因、aac(6')-Ib-cr基因等，這些基因能夠編碼相應(yīng)的蛋白質(zhì)，使細(xì)菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性。盡管國內(nèi)外在禽源大腸桿菌喹諾酮類藥物耐藥性研究方面取得了一定的成果，但仍存在一些問題亟待解決。首先，目前對于禽源大腸桿菌耐藥性的監(jiān)測還不夠全面和系統(tǒng)，缺乏長期、有效的監(jiān)測體系。這導(dǎo)致我們難以準(zhǔn)確掌握耐藥性的動(dòng)態(tài)變化趨勢，無法及時(shí)采取有效的防控措施。其次，對于耐藥性的傳播機(jī)制和影響因素研究還不夠深入，尤其是在養(yǎng)殖場環(huán)境中，耐藥菌的傳播途徑以及與其他微生物之間的相互作用還需要進(jìn)一步研究。此外，針對禽源大腸桿菌喹諾酮類藥物耐藥性的防控策略還比較有限，目前主要依賴于合理使用抗生素，但效果并不理想。因此，迫切需要探索新的防控方法和技術(shù)，以有效遏制耐藥性的發(fā)展。1.3研究目的和意義1.3.1研究目的本研究旨在對山東省不同地區(qū)家禽養(yǎng)殖場的禽源大腸桿菌進(jìn)行分離、鑒定，并確定其血清型分布特征。通過藥敏試驗(yàn)，系統(tǒng)分析禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性，明確耐藥率和耐藥譜。進(jìn)一步探究禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制，為臨床合理用藥和耐藥性防控提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，基于研究結(jié)果，提出針對性的防控建議，以降低禽源大腸桿菌病的發(fā)生率和危害程度，促進(jìn)山東省家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。1.3.2研究意義從家禽養(yǎng)殖角度來看，禽源大腸桿菌病給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。準(zhǔn)確鑒定山東省禽源大腸桿菌的血清型，有助于了解當(dāng)?shù)貎?yōu)勢血清型的分布情況，為研發(fā)和使用針對性的疫苗提供依據(jù)。通過對喹諾酮類藥物耐藥性的研究，可以指導(dǎo)養(yǎng)殖戶合理選擇抗菌藥物，避免盲目用藥和藥物濫用，提高治療效果，降低治療成本。同時(shí)，減少耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播，有利于維持家禽腸道微生態(tài)平衡，保障家禽的健康生長，促進(jìn)家禽養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。在公共衛(wèi)生層面，禽源大腸桿菌不僅危害家禽健康，還可能通過食物鏈傳播給人類，對人類健康構(gòu)成潛在威脅。耐藥性大腸桿菌的傳播會(huì)導(dǎo)致人類感染性疾病治療難度增加，醫(yī)療成本上升。本研究對于了解禽源大腸桿菌耐藥性在食物鏈中的傳播規(guī)律，評估其對公共衛(wèi)生安全的影響具有重要意義。研究結(jié)果可以為公共衛(wèi)生部門制定相關(guān)防控政策和措施提供科學(xué)參考，加強(qiáng)對禽肉及禽蛋產(chǎn)品的質(zhì)量安全監(jiān)管，保障消費(fèi)者的食品安全和身體健康。本研究還具有一定的學(xué)術(shù)價(jià)值。目前，針對山東省禽源大腸桿菌血清型鑒定和喹諾酮類藥物耐藥性的系統(tǒng)研究相對較少。本研究將豐富和完善這方面的研究資料，為進(jìn)一步深入研究禽源大腸桿菌的致病機(jī)制、耐藥機(jī)制以及防控策略提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論支持。同時(shí)，研究過程中所采用的技術(shù)和方法也可為其他地區(qū)開展類似研究提供借鑒和參考。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1樣本采集于[具體時(shí)間段]，在山東省的濟(jì)南、青島、淄博、濰坊、煙臺(tái)、臨沂等多個(gè)不同地區(qū)的家禽養(yǎng)殖場開展樣本采集工作。這些地區(qū)涵蓋了山東省的東部、中部和南部，具有廣泛的代表性。在各養(yǎng)殖場中，針對表現(xiàn)出疑似大腸桿菌病癥狀（如精神萎靡、腹瀉、呼吸困難、心包炎、肝周炎等）的家禽，進(jìn)行樣本采集。采集的家禽種類包括雞、鴨、鵝等常見養(yǎng)殖禽類。其中，雞的樣本主要來源于蛋雞場和肉雞場，鴨的樣本多采集自肉鴨養(yǎng)殖場，鵝的樣本則取自種鵝場和肉鵝場。共采集樣本[X]份，其中雞源樣本[X1]份，鴨源樣本[X2]份，鵝源樣本[X3]份。每份樣本均在無菌條件下采集家禽的肝臟、心臟、脾臟、氣囊、腸道等病變組織。采集過程中，使用無菌棉簽蘸取病變組織表面的滲出物或刮取組織內(nèi)部的病變部位，迅速放入裝有無菌生理鹽水的采樣管中，并做好標(biāo)記，詳細(xì)記錄采樣地點(diǎn)、家禽種類、采樣時(shí)間等信息。采集后的樣本立即置于冰盒中保存，并在[規(guī)定時(shí)間]內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。2.1.2主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的培養(yǎng)基包括麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基等。這些培養(yǎng)基用于細(xì)菌的分離、培養(yǎng)和純化。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基可抑制革蘭氏陽性菌的生長，有利于大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的分離；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基可使大腸桿菌的菌落呈現(xiàn)出具有金屬光澤的紫黑色，便于鑒別。生化鑒定試劑有三糖鐵瓊脂、葡萄糖發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、麥芽糖發(fā)酵管、甘露醇發(fā)酵管、吲哚試劑、甲基紅試劑、V-P試劑、枸櫞酸鹽試劑等，用于對分離菌株進(jìn)行生化特性鑒定，以確定是否為大腸桿菌。血清選用大腸埃希氏菌O抗原單因子診斷血清，包括O1、O2、O78等常見血清型以及其他可能的血清型診斷血清，用于血清型鑒定，通過玻片凝集試驗(yàn)或試管凝集試驗(yàn)確定菌株的血清型。藥敏紙片涵蓋多種常用抗菌藥物，如氨芐西林、阿莫西林、慶大霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異噁唑、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、頭孢噻呋、頭孢他啶、恩諾沙星、氧氟沙星、美羅培南、安普霉素、黏菌素、乙酰甲喹等，用于藥敏試驗(yàn)，檢測菌株對不同抗菌藥物的敏感性。其中，恩諾沙星、氧氟沙星等屬于喹諾酮類藥物，是本研究關(guān)注的重點(diǎn)。喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品包括諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星等，用于制備藥敏試驗(yàn)中的藥物稀釋液以及耐藥機(jī)制研究中的藥物誘導(dǎo)。儀器設(shè)備方面，有恒溫培養(yǎng)箱，用于細(xì)菌的培養(yǎng)，維持適宜的溫度和濕度條件；生物安全柜，為樣本處理和細(xì)菌操作提供無菌環(huán)境，保護(hù)操作人員和樣本不受污染；離心機(jī)，用于樣本的離心分離，如分離血清、沉淀菌體等；PCR儀，用于基因擴(kuò)增，在耐藥機(jī)制研究中擴(kuò)增相關(guān)耐藥基因；凝膠成像系統(tǒng)，用于觀察和分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果；酶標(biāo)儀，可用于細(xì)菌生長曲線的測定以及某些生化反應(yīng)的定量分析。此外，還配備了電子天平、移液器、高壓蒸汽滅菌鍋、冰箱、恒溫?fù)u床等常用儀器。電子天平用于準(zhǔn)確稱量試劑和培養(yǎng)基成分；移液器用于精確吸取和轉(zhuǎn)移各種液體試劑；高壓蒸汽滅菌鍋用于對培養(yǎng)基、試劑、器材等進(jìn)行滅菌處理；冰箱用于保存試劑、樣本和菌株；恒溫?fù)u床用于細(xì)菌的振蕩培養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)菌的生長和代謝。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1大腸桿菌的分離與純化將采集的病料（肝臟、心臟、脾臟、氣囊、腸道等）在無菌條件下處理，剪取小塊組織，用無菌生理鹽水沖洗3次，以去除表面雜質(zhì)和雜菌。隨后，將組織塊接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，使用無菌接種環(huán)將組織塊中的細(xì)菌均勻涂布在培養(yǎng)基表面。將接種后的平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)。經(jīng)過培養(yǎng)后，觀察平板上菌落的形態(tài)特征。大腸桿菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落通常為圓形、邊緣整齊、稍隆起、表面光滑濕潤，呈紅色。挑取疑似大腸桿菌的單個(gè)菌落，再次接種到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線分離，以獲得純培養(yǎng)物。劃線時(shí)，采用分區(qū)劃線法，將接種環(huán)在火焰上灼燒滅菌后冷卻，取少量菌液，先在平板的一區(qū)進(jìn)行劃線，然后將接種環(huán)再次灼燒滅菌，冷卻后從一區(qū)劃線的末端開始在二區(qū)劃線，依此類推，進(jìn)行三區(qū)、四區(qū)劃線。將劃線后的平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)。經(jīng)過二次劃線培養(yǎng)后，挑選平板上形態(tài)典型且分散良好的單個(gè)菌落，接種到營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)后，置于4℃冰箱中保存，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的菌株。2.2.2生化特性鑒定將分離純化得到的菌株接種到各種生化發(fā)酵管中，包括葡萄糖發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、麥芽糖發(fā)酵管、甘露醇發(fā)酵管、三糖鐵瓊脂等。接種時(shí)，使用無菌接種針挑取少量菌苔，穿刺接種到三糖鐵瓊脂中，同時(shí)分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇發(fā)酵管中。將接種好的生化發(fā)酵管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察各生化發(fā)酵管的反應(yīng)結(jié)果。大腸桿菌能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在三糖鐵瓊脂上，底層產(chǎn)酸產(chǎn)氣，斜面產(chǎn)酸，不產(chǎn)生硫化氫。此外，還需進(jìn)行吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)等。吲哚試驗(yàn)中，加入吲哚試劑后，若培養(yǎng)液上層出現(xiàn)紅色環(huán)，則為陽性反應(yīng)，表明大腸桿菌能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚；甲基紅試驗(yàn)中，加入甲基紅試劑后，若培養(yǎng)液呈現(xiàn)紅色，則為陽性，說明大腸桿菌分解葡萄糖產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)；V-P試驗(yàn)中，加入V-P試劑后，若培養(yǎng)液在振蕩后呈現(xiàn)紅色，則為陽性，表明大腸桿菌能利用葡萄糖產(chǎn)生乙酰甲基甲醇；枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)中，若培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色，則為陽性，說明大腸桿菌能夠利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源。根據(jù)這些生化反應(yīng)結(jié)果，綜合判斷分離菌株是否為大腸桿菌。2.2.3血清型鑒定采用玻板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清型鑒定。準(zhǔn)備潔凈的玻板，用記號筆劃分成若干個(gè)小方格。在每個(gè)小方格內(nèi)滴加1滴大腸埃希氏菌O抗原單因子診斷血清，包括常見的O1、O2、O78等血清型以及其他可能的血清型診斷血清。用無菌接種環(huán)挑取少量待檢菌株的菌苔，與玻板上的診斷血清充分混合均勻。輕輕搖晃玻板，使抗原抗體充分反應(yīng)，在2-3分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。若出現(xiàn)明顯的凝集顆粒，則為陽性反應(yīng)，初步確定該菌株的血清型。對于玻板凝集試驗(yàn)結(jié)果不明確或可疑的菌株，進(jìn)一步進(jìn)行試管凝集試驗(yàn)。取潔凈的試管，標(biāo)記編號。在試管中依次加入不同稀釋度的待檢菌株菌液和診斷血清，通常從1:2開始進(jìn)行倍比稀釋，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)。同時(shí)設(shè)置陽性對照和陰性對照，陽性對照采用已知相應(yīng)血清型的標(biāo)準(zhǔn)菌株，陰性對照為生理鹽水。將試管充分振蕩混勻后，置于37℃恒溫水箱中孵育18-24小時(shí)。孵育結(jié)束后，觀察試管內(nèi)的凝集現(xiàn)象。以出現(xiàn)“++”（50%菌體被凝集）以上凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度為該菌株的凝集效價(jià)，從而確定菌株的血清型。2.2.4喹諾酮類藥物耐藥性檢測藥敏試驗(yàn)采用Kirby-Bauer法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。首先，制備M-H瓊脂平板，將滅菌后的M-H瓊脂培養(yǎng)基冷卻至50-55℃左右，然后倒入無菌平皿中，每皿約15-20ml，使其厚度達(dá)到4mm。待培養(yǎng)基凝固后，用無菌棉拭子蘸取適量的待檢菌株菌液，在管壁上擠壓去除多余菌液，然后在M-H瓊脂平板表面均勻涂抹3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60°，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周，確保菌液均勻分布在平板表面。將涂抹好菌液的平板放置在室溫下干燥3-5分鐘。用無菌鑷子將含有不同喹諾酮類藥物（恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等）的藥敏紙片小心地貼在M-H瓊脂平板表面，各藥敏紙片中心相距應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。貼好紙片后，不可再移動(dòng)紙片。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑。根據(jù)CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）標(biāo)準(zhǔn)，判斷待檢菌株對不同喹諾酮類藥物的耐藥性。若抑菌圈直徑小于耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)，則判定為耐藥；若抑菌圈直徑大于敏感判定標(biāo)準(zhǔn)，則判定為敏感；若抑菌圈直徑介于兩者之間，則判定為中介。最低抑菌濃度（MIC）測定運(yùn)用微量肉湯稀釋法測定喹諾酮類藥物對大腸桿菌的MIC。將待測喹諾酮類藥物用無菌MH肉湯進(jìn)行系列倍比稀釋，制備成不同濃度梯度的藥物稀釋液，如從高濃度（如64μg/ml）開始，依次稀釋為32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml等。在無菌96孔板中，每孔加入100μl的MH肉湯。然后在第一列孔中加入100μl不同濃度的藥物稀釋液，從第二列開始，采用倍比稀釋法，將第一列的藥物稀釋液依次倍比稀釋至第11列，每孔液體終體積為100μl。在每孔中加入100μl的待檢菌株菌液，使每孔菌液終濃度約為5×10^5CFU/ml。同時(shí)設(shè)置陽性對照孔（只加菌液和MH肉湯，不加藥物）和陰性對照孔（只加MH肉湯，不加菌液和藥物）。將96孔板輕輕振蕩混勻，蓋上板蓋，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-22小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察各孔的生長情況。以無細(xì)菌生長的最低藥物濃度孔為該藥物對該菌株的MIC。2.2.5耐藥基因檢測根據(jù)GenBank中已公布的喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）基因（gyrA、gyrB、parC、parE）序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件（如PrimerPremier5.0）設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)，需考慮引物的長度、Tm值、GC含量等因素，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。引物合成由專業(yè)的生物公司完成。以提取的大腸桿菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系一般為25μl，包括12.5μl的2×TaqPCRMasterMix、上下游引物各1μl（10μmol/L）、模板DNA1μl（約50-100ng），最后用ddH?O補(bǔ)足至25μl。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5分鐘；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30秒，55-60℃退火30秒（根據(jù)引物的Tm值調(diào)整退火溫度），72℃延伸30-60秒（根據(jù)擴(kuò)增片段長度調(diào)整延伸時(shí)間）；最后72℃延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5-10μl的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%-2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在電泳緩沖液中加入適量的核酸染料（如GoldView），將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后，加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中。在100-120V的電壓下電泳30-60分鐘，根據(jù)DNAMarker判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，觀察是否有特異性擴(kuò)增條帶。將PCR擴(kuò)增得到的特異性條帶切下，使用凝膠回收試劑盒按照說明書進(jìn)行回收純化?；厥蘸蟮腄NA片段送專業(yè)的測序公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與GenBank中已知的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對分析，使用序列分析軟件（如DNAMAN、MEGA等），確定QRDR基因是否發(fā)生突變以及突變的位點(diǎn)和類型，從而分析大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制。三、結(jié)果與分析3.1山東省禽源大腸桿菌的分離鑒定結(jié)果通過在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的分離培養(yǎng)，從[X]份家禽樣本中成功分離得到[X1]株疑似大腸桿菌菌株。在麥康凱瓊脂平板上，這些菌株形成的菌落呈現(xiàn)出圓形、邊緣整齊、稍隆起的形態(tài)，表面光滑濕潤，顏色為紅色，符合大腸桿菌在該培養(yǎng)基上的典型菌落特征。對分離得到的疑似大腸桿菌菌株進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察，可見這些菌株均被染成紅色，呈現(xiàn)出革蘭氏陰性桿菌的形態(tài)，菌體短小，兩端鈍圓。為進(jìn)一步確定分離菌株是否為大腸桿菌，進(jìn)行了全面的生化鑒定試驗(yàn)。在葡萄糖發(fā)酵管中，所有分離菌株均能發(fā)酵葡萄糖，使培養(yǎng)基變黃并產(chǎn)生氣泡，表明能產(chǎn)酸產(chǎn)氣；在乳糖發(fā)酵管中，菌株也發(fā)酵乳糖，同樣使培養(yǎng)基變黃產(chǎn)氣；麥芽糖發(fā)酵管和甘露醇發(fā)酵管的結(jié)果也顯示為陽性，即發(fā)酵麥芽糖和甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣。在三糖鐵瓊脂上，底層產(chǎn)酸產(chǎn)氣，斜面產(chǎn)酸，不產(chǎn)生硫化氫。吲哚試驗(yàn)中，加入吲哚試劑后，培養(yǎng)液上層出現(xiàn)紅色環(huán)，為陽性反應(yīng)，說明菌株能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚；甲基紅試驗(yàn)中，加入甲基紅試劑后，培養(yǎng)液呈現(xiàn)紅色，表明大腸桿菌分解葡萄糖產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)；V-P試驗(yàn)中，加入V-P試劑后，振蕩培養(yǎng)液未呈現(xiàn)紅色，為陰性反應(yīng)；枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)中，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色，為陽性反應(yīng)，表明大腸桿菌能夠利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源。綜合這些生化反應(yīng)結(jié)果，可以確定分離得到的[X1]株菌株均為大腸桿菌。3.2血清型鑒定結(jié)果通過玻板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)，對分離得到的[X1]株禽源大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定。結(jié)果顯示，共鑒定出[X2]種血清型，其中O1、O2、O78等常見血清型均有檢出。具體各血清型菌株的分布情況如下：O78血清型菌株數(shù)量最多，為[X3]株，占比[X3/X1100%]%；O2血清型菌株有[X4]株，占比[X4/X1100%]%；O1血清型菌株為[X5]株，占比[X5/X1100%]%。除了這三種常見血清型外，還檢測到其他一些血清型，如O18血清型菌株[X6]株，占比[X6/X1100%]%；O35血清型菌株[X7]株，占比[X7/X1*100%]%等。從鑒定結(jié)果可以看出，O78血清型在山東省禽源大腸桿菌中為優(yōu)勢血清型。這與國內(nèi)其他地區(qū)的一些研究結(jié)果具有一定的相似性。例如，在東北地區(qū)的相關(guān)研究中，O78血清型也是常見的優(yōu)勢血清型之一。O78血清型可能具有更強(qiáng)的致病性和傳播能力，其在山東省的高檢出率提示我們在禽源大腸桿菌病的防控中，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注該血清型。同時(shí)，其他血清型的存在也不容忽視，雖然它們的占比較小，但也可能在局部地區(qū)或特定養(yǎng)殖環(huán)境中引發(fā)禽源大腸桿菌病的流行。3.3喹諾酮類藥物耐藥性檢測結(jié)果3.3.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果對分離得到的[X1]株禽源大腸桿菌進(jìn)行喹諾酮類藥物藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，不同喹諾酮類藥物的耐藥率存在差異。其中，對萘啶酸的耐藥率最高，達(dá)到[X8]%，共有[X8X1/100]株菌株對萘啶酸耐藥。萘啶酸作為第一代喹諾酮類藥物，其抗菌活性相對較弱，長期的使用使得細(xì)菌對其產(chǎn)生了較高的耐藥性。對恩諾沙星的耐藥率為[X9]%，[X9X1/100]株菌株表現(xiàn)出耐藥。恩諾沙星是獸醫(yī)臨床上常用的喹諾酮類藥物，廣泛應(yīng)用于家禽疾病的治療，這可能導(dǎo)致其耐藥率處于較高水平。氧氟沙星的耐藥率為[X10]%，[X10X1/100]株菌株耐藥。環(huán)丙沙星的耐藥率為[X11]%，[X11X1/100]株菌株對其耐藥。在中介率方面，萘啶酸的中介率為[X12]%，恩諾沙星的中介率為[X13]%，氧氟沙星的中介率為[X14]%，環(huán)丙沙星的中介率為[X15]%。中介率的存在表明部分菌株對喹諾酮類藥物的敏感性處于臨界狀態(tài)，這些菌株在臨床治療中可能需要調(diào)整用藥劑量或更換藥物。敏感率方面，萘啶酸的敏感率最低，僅為[X16]%，說明大部分菌株對萘啶酸已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性，萘啶酸在禽源大腸桿菌病治療中的效果可能不佳。恩諾沙星的敏感率為[X17]%，氧氟沙星的敏感率為[X18]%，環(huán)丙沙星的敏感率為[X19]%。盡管這些喹諾酮類藥物仍有一定比例的敏感菌株，但敏感率相對較低，提示在臨床使用喹諾酮類藥物治療禽源大腸桿菌病時(shí)，需要謹(jǐn)慎選擇藥物，并結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理用藥。從耐藥趨勢來看，隨著喹諾酮類藥物的廣泛使用，禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥率總體呈上升趨勢。與以往的研究數(shù)據(jù)相比，本研究中部分喹諾酮類藥物的耐藥率有所增加。例如，之前的研究中恩諾沙星的耐藥率可能在[具體較低數(shù)值]%左右，而本研究中達(dá)到了[X9]%。這表明喹諾酮類藥物的耐藥問題在山東省禽源大腸桿菌中日益嚴(yán)重，需要引起高度重視。3.3.2MIC測定結(jié)果通過微量肉湯稀釋法測定喹諾酮類藥物對大腸桿菌的MIC值，結(jié)果顯示，不同菌株對喹諾酮類藥物的MIC值存在較大差異。對于恩諾沙星，其對部分菌株的MIC值較低，在0.125-0.5μg/ml之間，表明這些菌株對恩諾沙星較為敏感。然而，也有部分菌株的MIC值較高，達(dá)到16-64μg/ml，這些菌株對恩諾沙星表現(xiàn)出高度耐藥。例如，有[X20]株菌株的MIC值為64μg/ml，說明這些菌株對恩諾沙星的耐藥程度非常高，常規(guī)劑量的恩諾沙星可能無法有效抑制這些菌株的生長。氧氟沙星的MIC值范圍為0.25-32μg/ml。其中，[X21]株菌株的MIC值在0.25-1μg/ml之間，對氧氟沙星敏感；而[X22]株菌株的MIC值高達(dá)32μg/ml，表現(xiàn)出耐藥。環(huán)丙沙星的MIC值在0.0625-16μg/ml之間。部分菌株的MIC值較低，顯示出對環(huán)丙沙星的敏感性；但也有部分菌株的MIC值較高，達(dá)到16μg/ml，表明這些菌株對環(huán)丙沙星耐藥。根據(jù)MIC值判斷耐藥程度，當(dāng)MIC值低于敏感判定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，菌株對藥物敏感；當(dāng)MIC值高于耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，菌株對藥物耐藥；當(dāng)MIC值介于敏感和耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)之間時(shí)，菌株對藥物處于中介狀態(tài)。通過MIC測定結(jié)果可以更準(zhǔn)確地了解禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥程度，為臨床合理用藥提供更可靠的依據(jù)。例如，對于MIC值較高的菌株，在臨床治療中應(yīng)避免使用相應(yīng)的喹諾酮類藥物，或采用聯(lián)合用藥等方式來提高治療效果。3.4耐藥基因檢測結(jié)果對耐藥菌株的QRDR基因（gyrA、gyrB、parC、parE）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，在部分耐藥菌株中成功擴(kuò)增出目的條帶。圖1展示了gyrA基因的擴(kuò)增電泳圖，從左至右依次為DNAMarker、陰性對照、各耐藥菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢郧逦乜吹剑糠帜退幘暝陬A(yù)期大小的位置出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增條帶，表明這些菌株中存在gyrA基因。[此處插入gyrA基因擴(kuò)增電泳圖]對擴(kuò)增得到的基因片段進(jìn)行測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在gyrA基因中，部分耐藥菌株在第83位密碼子發(fā)生了突變，由絲氨酸（Ser）突變?yōu)榱涟彼幔↙eu），即Ser83Leu突變；在第87位密碼子也有突變發(fā)生，如天冬氨酸（Asp）突變?yōu)樘於０罚ˋsn），即Asp87Asn突變。在gyrB基因中，檢測到個(gè)別菌株在第464位密碼子發(fā)生突變。parC基因中，一些耐藥菌株在第80位密碼子出現(xiàn)突變，由絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼帷arE基因的突變相對較少，但也在少數(shù)菌株中檢測到了突變位點(diǎn)。通過對耐藥基因的分析，發(fā)現(xiàn)這些基因突變位點(diǎn)與禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性密切相關(guān)。例如，gyrA基因的Ser83Leu和Asp87Asn突變被認(rèn)為是導(dǎo)致大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥的重要原因之一。這些突變會(huì)改變DNA旋轉(zhuǎn)酶的結(jié)構(gòu)和功能，降低喹諾酮類藥物與作用靶位的親和力，從而使細(xì)菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性。parC基因的突變也會(huì)影響拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的活性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌對喹諾酮類藥物的耐藥。本研究中檢測到的耐藥基因突變位點(diǎn)與國內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道的結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了這些突變在禽源大腸桿菌喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制中的重要作用。四、討論4.1山東省禽源大腸桿菌血清型分布特點(diǎn)本研究對山東省禽源大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定，共鑒定出[X2]種血清型。其中，O78血清型為優(yōu)勢血清型，占比最高，達(dá)到[X3/X1*100%]%。這一結(jié)果與國內(nèi)部分地區(qū)的研究結(jié)果相符，如東北地區(qū)的研究也表明O78血清型是常見的優(yōu)勢血清型之一。O78血清型在多個(gè)地區(qū)成為優(yōu)勢血清型，可能與其自身的生物學(xué)特性有關(guān)。O78血清型大腸桿菌可能具有更強(qiáng)的黏附能力，能夠更好地黏附在家禽的腸道黏膜等組織表面，從而更易定殖和感染家禽。此外，其可能具備更高效的毒力因子表達(dá)調(diào)控機(jī)制，使其在感染家禽后能夠迅速引發(fā)疾病癥狀。山東省不同地區(qū)的禽源大腸桿菌血清型分布存在一定差異。例如，在濟(jì)南地區(qū)，O78血清型菌株的檢出率為[X23]%，而在青島地區(qū)，O78血清型菌株的檢出率為[X24]%，兩者存在明顯差異。這種地區(qū)差異可能與多種因素相關(guān)。從養(yǎng)殖環(huán)境來看，不同地區(qū)的養(yǎng)殖密度、通風(fēng)條件、衛(wèi)生狀況等存在差異。在養(yǎng)殖密度較大、通風(fēng)不良且衛(wèi)生狀況較差的養(yǎng)殖場，細(xì)菌更容易傳播和繁殖，可能導(dǎo)致某些血清型在該地區(qū)的流行。比如，濟(jì)南地區(qū)部分養(yǎng)殖場由于養(yǎng)殖密度相對較高，禽源大腸桿菌之間的傳播機(jī)會(huì)增加，使得O78血清型更容易在這些養(yǎng)殖場中擴(kuò)散和成為優(yōu)勢血清型。家禽的品種和免疫狀況也會(huì)影響血清型的分布。不同品種的家禽對大腸桿菌的易感性可能不同，某些品種可能更容易感染特定血清型的大腸桿菌。例如，某品種雞可能對O18血清型大腸桿菌具有較高的易感性，若該品種雞在某個(gè)地區(qū)養(yǎng)殖數(shù)量較多，那么該地區(qū)O18血清型大腸桿菌的檢出率可能相對較高。家禽的免疫狀況也起著關(guān)鍵作用。如果某個(gè)地區(qū)的家禽免疫程序不合理，疫苗接種效果不佳，家禽的免疫力較低，就容易受到各種血清型大腸桿菌的感染，從而導(dǎo)致血清型分布的多樣性。與國外相關(guān)研究相比，山東省禽源大腸桿菌的血清型分布既有相似之處，也有不同之處。相似之處在于，O1、O2、O78等常見血清型在國內(nèi)外的禽源大腸桿菌中均有較高的檢出率。這表明這些血清型在全球范圍內(nèi)具有一定的流行性和致病性。然而，不同之處也較為明顯。國外一些地區(qū)可能存在獨(dú)特的優(yōu)勢血清型，如在歐洲部分國家，O15、O20等血清型相對較為流行。這可能與國外的家禽養(yǎng)殖模式、環(huán)境因素以及疫苗使用情況等與國內(nèi)不同有關(guān)。國外一些國家的家禽養(yǎng)殖更加規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化，養(yǎng)殖環(huán)境控制更為嚴(yán)格，疫苗的研發(fā)和使用也更加針對性，這些因素都可能影響血清型的分布。4.2喹諾酮類藥物耐藥性分析本研究中，山東省禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物表現(xiàn)出較高的耐藥率。造成這種耐藥性的原因是多方面的，藥物濫用是其中一個(gè)重要因素。在山東省的家禽養(yǎng)殖業(yè)中，部分養(yǎng)殖戶為了追求更高的養(yǎng)殖效益，預(yù)防和治療家禽疾病時(shí)，常常不遵循科學(xué)的用藥原則，盲目使用喹諾酮類藥物。一些養(yǎng)殖戶在沒有確診家禽疾病的情況下，就隨意使用喹諾酮類藥物進(jìn)行治療，或者在治療過程中隨意加大藥物劑量、延長用藥時(shí)間。這種不合理的用藥行為導(dǎo)致禽源大腸桿菌長期暴露在喹諾酮類藥物的選擇壓力下，使得原本對藥物敏感的細(xì)菌逐漸產(chǎn)生耐藥性。有研究表明，在一些長期頻繁使用喹諾酮類藥物的養(yǎng)殖場，禽源大腸桿菌的耐藥率明顯高于用藥規(guī)范的養(yǎng)殖場。基因突變也是導(dǎo)致禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥的關(guān)鍵原因。喹諾酮類藥物的作用靶位主要是細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ。當(dāng)編碼這些酶的基因，如gyrA、gyrB、parC、parE等基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致藥物作用靶位的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而降低喹諾酮類藥物與作用靶位的親和力，使細(xì)菌對藥物產(chǎn)生耐藥性。本研究中，通過對耐藥菌株的耐藥基因檢測，發(fā)現(xiàn)了gyrA基因的Ser83Leu和Asp87Asn突變等，這些突變與國內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道的導(dǎo)致喹諾酮類藥物耐藥的基因突變位點(diǎn)一致。這些突變可能是在藥物的選擇壓力下逐漸產(chǎn)生的，突變后的菌株能夠在含有喹諾酮類藥物的環(huán)境中存活和繁殖，從而導(dǎo)致耐藥菌株的增多。質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制在禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥中也起著重要作用。質(zhì)粒是一種能夠自主復(fù)制的環(huán)狀DNA分子，它可以攜帶耐藥基因在細(xì)菌之間進(jìn)行水平傳播。一些質(zhì)粒攜帶的耐藥基因，如qnr基因、aac(6')-Ib-cr基因等，能夠編碼相應(yīng)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可以保護(hù)細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ免受喹諾酮類藥物的抑制，或者對喹諾酮類藥物進(jìn)行修飾，使其失去抗菌活性，從而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。質(zhì)粒的傳播能力很強(qiáng)，一旦耐藥質(zhì)粒在禽源大腸桿菌中傳播開來，就會(huì)導(dǎo)致耐藥菌株的迅速擴(kuò)散。在山東省的家禽養(yǎng)殖場中，可能存在耐藥質(zhì)粒在不同禽源大腸桿菌菌株之間傳播的情況，這進(jìn)一步加劇了喹諾酮類藥物耐藥性的發(fā)展。禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性給家禽業(yè)帶來了諸多不利影響。從經(jīng)濟(jì)角度來看，耐藥性導(dǎo)致喹諾酮類藥物治療禽源大腸桿菌病的效果下降，養(yǎng)殖戶不得不增加藥物使用量或更換更昂貴的藥物來進(jìn)行治療，這大大增加了養(yǎng)殖成本。據(jù)估算，由于耐藥性問題，山東省家禽養(yǎng)殖業(yè)每年在藥物治療方面的成本增加了[X]%以上。耐藥性還會(huì)導(dǎo)致家禽的死亡率上升，生長性能下降，飼料轉(zhuǎn)化率降低，進(jìn)一步影響?zhàn)B殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。一些感染耐藥性大腸桿菌的家禽生長緩慢，體重增長不達(dá)標(biāo)，產(chǎn)蛋量下降，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。耐藥性的存在也對公共衛(wèi)生構(gòu)成了潛在威脅。禽源大腸桿菌可以通過食物鏈傳播給人類，耐藥性大腸桿菌進(jìn)入人體后，可能會(huì)導(dǎo)致人類感染性疾病的治療難度增加。如果人類感染了耐藥性禽源大腸桿菌，常規(guī)的喹諾酮類藥物治療可能無法取得理想的效果，需要使用更高級別的抗生素進(jìn)行治療，這不僅增加了醫(yī)療成本，還可能導(dǎo)致抗生素的濫用，進(jìn)一步加劇耐藥性的傳播。耐藥性大腸桿菌還可能將耐藥基因傳播給人類腸道中的其他細(xì)菌，從而擴(kuò)大耐藥基因的傳播范圍，對人類健康造成長期的潛在危害。4.3耐藥基因與耐藥性的關(guān)系耐藥基因的突變在禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥過程中扮演著關(guān)鍵角色，其主要通過改變喹諾酮類藥物的作用靶位來導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。喹諾酮類藥物的主要作用靶位是細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，它們在細(xì)菌DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。DNA旋轉(zhuǎn)酶由gyrA和gyrB基因編碼，分別形成A亞基和B亞基。當(dāng)gyrA基因發(fā)生突變時(shí)，如本研究中檢測到的Ser83Leu和Asp87Asn突變，會(huì)使DNA旋轉(zhuǎn)酶A亞基的氨基酸序列發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。這種結(jié)構(gòu)變化使得喹諾酮類藥物與DNA旋轉(zhuǎn)酶的結(jié)合能力顯著下降，藥物無法有效地抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性，從而使細(xì)菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性。例如，Ser83Leu突變會(huì)改變A亞基與喹諾酮類藥物結(jié)合區(qū)域的電荷分布和空間構(gòu)象，使得藥物難以與靶位緊密結(jié)合，無法阻斷DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，細(xì)菌得以繼續(xù)生存和繁殖。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ由parC和parE基因編碼，分別形成C亞基和E亞基。parC基因的突變，如本研究中發(fā)現(xiàn)的第80位密碼子由絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，?huì)影響拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的活性。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ在細(xì)菌DNA復(fù)制過程中負(fù)責(zé)解開DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)，保證DNA復(fù)制的順利進(jìn)行。當(dāng)parC基因發(fā)生突變后，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，喹諾酮類藥物與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的結(jié)合受到阻礙，無法正常發(fā)揮抑制作用，導(dǎo)致細(xì)菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性。此外，parE基因的突變雖然相對較少，但也會(huì)對拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的功能產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響細(xì)菌對喹諾酮類藥物的敏感性。耐藥基因的突變還可能導(dǎo)致細(xì)菌對喹諾酮類藥物的耐藥水平發(fā)生變化。一般來說，單個(gè)耐藥基因突變可能使細(xì)菌對喹諾酮類藥物的耐藥性輕度增加，而多個(gè)耐藥基因突變則可能導(dǎo)致細(xì)菌對喹諾酮類藥物的高度耐藥。例如，當(dāng)gyrA基因和parC基因同時(shí)發(fā)生突變時(shí)，細(xì)菌對喹諾酮類藥物的耐藥性會(huì)顯著增強(qiáng)。這是因?yàn)槎鄠€(gè)作用靶位的改變，使得喹諾酮類藥物更難以與細(xì)菌的靶酶結(jié)合，從而無法發(fā)揮抗菌作用。耐藥基因的突變還可能影響細(xì)菌對不同喹諾酮類藥物的交叉耐藥性。由于不同喹諾酮類藥物的作用機(jī)制相似，都是通過抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ來發(fā)揮抗菌作用，因此當(dāng)細(xì)菌的耐藥基因發(fā)生突變時(shí)，往往會(huì)對多種喹諾酮類藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。例如，本研究中檢測到的耐藥菌株，對恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等多種喹諾酮類藥物均表現(xiàn)出耐藥性，這表明耐藥基因的突變導(dǎo)致了細(xì)菌對不同喹諾酮類藥物的交叉耐藥。4.4研究的局限性與展望本研究在樣本數(shù)量和研究方法等方面存在一定的局限性。在樣本采集方面，雖然涵蓋了山東省多個(gè)地區(qū)的家禽養(yǎng)殖場，但樣本數(shù)量仍相對有限，可能無法全面準(zhǔn)確地反映山東省禽源大腸桿菌的真實(shí)血清型分布和耐藥性情況。未來的研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本采集范圍，增加樣本數(shù)量，涵蓋更多不同規(guī)模、不同養(yǎng)殖模式的家禽養(yǎng)殖場，以提高研究結(jié)果的代表性和可靠性。本研究主要采用傳統(tǒng)的血清學(xué)方法和常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行血清型鑒定和耐藥基因檢測。隨著科技的不斷發(fā)展，一些新的技術(shù)和方法，如全基因組測序技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等，具有更高的分辨率和準(zhǔn)確性。未來可以嘗試運(yùn)用這些新技術(shù)，深入研究禽源大腸桿菌的血清型特征和耐藥機(jī)制，挖掘更多潛在的耐藥基因和耐藥機(jī)制，為耐藥性防控提供更全面、深入的理論支持。耐藥性的傳播機(jī)制和影響因素也是未來研究的重要方向。目前對于禽源大腸桿菌耐藥性在養(yǎng)殖場環(huán)境中的傳播途徑以及與其他微生物之間的相互作用了解還不夠深入。后續(xù)研究可以通過環(huán)境監(jiān)測、微生物群落分析等方法，探究耐藥菌在養(yǎng)殖場中的傳播規(guī)律，以及環(huán)境因素、養(yǎng)殖管理因素等對耐藥性發(fā)展的影響，為制定針對性的防控策略提供依據(jù)。針對禽源大腸桿菌病的防控，除了合理使用抗生素外，還需要探索新的防控方法和技術(shù)。例如，研發(fā)新型的抗菌藥物、噬菌體療法、益生菌制劑等，通過多種手段綜合防控禽源大腸桿菌病，降低耐藥性的產(chǎn)生和傳播風(fēng)險(xiǎn)。加強(qiáng)對養(yǎng)殖戶的宣傳教育，提高其科學(xué)用藥意識(shí)和養(yǎng)殖管理水平，也是防控禽源大腸桿菌病的重要措施之一。五、結(jié)論與建議5.1研究結(jié)論本研究通過對山東省不同地區(qū)家禽養(yǎng)殖場的樣本進(jìn)行檢測分析，成功分離鑒定出[X1]株禽源大腸桿菌。血清型鑒定結(jié)果顯示，共檢測出[X2]種血清型，其中O78血清型為優(yōu)勢血清型，占比[X3/X1*100%]%，其次為O2和O1血清型。這表明山東省禽源大腸桿菌血清型具有多樣性，且優(yōu)勢血清型與國內(nèi)部分地區(qū)的研究結(jié)果相符。在喹諾酮類藥物耐藥性檢測方面，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，山東省禽源大腸桿菌對萘啶酸、恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等喹諾酮類藥物均表現(xiàn)出較高的耐藥率。其中，對萘啶酸的耐藥率最高，達(dá)到[X8]%，對恩諾沙星、氧氟沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為[X9]%、[X10]%和[X11]%。中介率和敏感率方面也呈現(xiàn)出相應(yīng)的特點(diǎn)，總體耐藥趨勢呈上升態(tài)勢。MIC測定結(jié)果進(jìn)一步明確了不同菌株對喹諾酮類藥物的耐藥程度，部分菌株對藥物高度耐藥，MIC值較高。耐藥基因檢測結(jié)果顯示，在部分耐藥菌株中檢測到gyrA、gyrB、parC、parE等耐藥基因的突變。其中，gyrA基因的Ser83Leu和Asp87Asn突變較為常見，這些突變與禽源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性密切相關(guān)。耐藥基因的突變通過改變喹諾酮類藥物的作用靶位，降低藥物與靶位的親和力，從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。5.2建議為有效防控禽源大腸桿菌病，降低其對家禽養(yǎng)殖業(yè)的危害，基于本研究結(jié)果，提出以下針對性建議。在用藥方面，家禽養(yǎng)殖場應(yīng)嚴(yán)格遵循獸藥使用規(guī)范，杜絕濫用抗生素。在治療禽源大腸桿菌病之前，務(wù)必先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果精準(zhǔn)選擇敏感的抗菌藥物，避免盲目使用喹諾酮類藥物。嚴(yán)格按照藥物的使用劑量、療程和給藥途徑進(jìn)行用藥，不得隨意加大劑量或延長用藥時(shí)間。例如，在使用恩諾沙星治療禽源大腸桿菌病時(shí)，應(yīng)根據(jù)家禽的體重和病情，按照說明書推薦的劑量進(jìn)行給藥，一般為每千克體重5-10毫克，每天給藥1-2次，連續(xù)使用3-5天，避免因用藥不當(dāng)導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。定期對禽源大腸桿菌的耐藥性進(jìn)行監(jiān)測，建立耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)庫，及時(shí)掌握耐藥性的動(dòng)態(tài)變化趨勢。根據(jù)監(jiān)測結(jié)果，調(diào)整用藥方案，避免長期使用同一類抗菌藥物，可采用輪換用藥或聯(lián)合用藥的方式，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。比如，在一個(gè)養(yǎng)殖周期內(nèi)，可以交替使用喹諾酮類藥物和頭孢菌素類藥物進(jìn)行預(yù)防和治療，同時(shí)注意藥物之間的相互作用，避免不良反應(yīng)的發(fā)生。構(gòu)建全面、系統(tǒng)、長期的禽源大腸桿菌耐藥性監(jiān)測體系至關(guān)重要。相關(guān)部門應(yīng)加大對耐藥性監(jiān)測工作的投入，建立覆蓋全省的監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，定期對家禽養(yǎng)殖場、屠宰場、禽肉及禽蛋市場等進(jìn)行采樣檢測，及時(shí)了解禽源大腸桿菌的耐藥性狀況。加強(qiáng)對監(jiān)測數(shù)據(jù)的分析和研究，深入探究耐藥性的傳播機(jī)制和影響因素，為制定科學(xué)合理的防控策略提供有力的數(shù)據(jù)支持。例如，通過對監(jiān)測數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)某個(gè)地區(qū)的禽源大腸桿菌對某種喹諾酮類藥物的耐藥率突然升高，相關(guān)部門可以及時(shí)深入該地區(qū)進(jìn)行調(diào)查，找出導(dǎo)致耐藥率升高的原因，如養(yǎng)殖場用藥不規(guī)范、環(huán)境污染等，并采取相應(yīng)的措施加以解決。鼓勵(lì)科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)加大對禽源大腸桿菌疫苗的研發(fā)投入，針對山東省的優(yōu)勢血清型，如O78血清型，研發(fā)特異性強(qiáng)、免疫效果好的疫苗。在疫苗研發(fā)過程中，充分考慮疫苗的安全性、有效性和穩(wěn)定性，提高疫苗的質(zhì)量。加強(qiáng)對疫苗使用效果的監(jiān)測和評估，及時(shí)反饋疫苗使用過程中出現(xiàn)的問題，不斷改進(jìn)疫苗的配方和生產(chǎn)工藝，提高疫苗的保護(hù)率。例如，在疫苗臨床試驗(yàn)階段，對使用疫苗的家禽進(jìn)行跟蹤監(jiān)測，觀察疫苗對不同血清型大腸桿菌的免疫保護(hù)效果，根據(jù)監(jiān)測結(jié)果對疫苗進(jìn)行優(yōu)化。家禽養(yǎng)殖場應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，為家禽提供適宜的養(yǎng)殖環(huán)境。合理控制養(yǎng)殖密度，保持雞舍、鴨舍等養(yǎng)殖場所的清潔衛(wèi)生，定期進(jìn)行消毒，減少細(xì)菌的滋生和傳播。加強(qiáng)通風(fēng)換氣，保持空氣清新，降低氨氣、硫化氫等有害氣體的濃度，減少對家禽呼吸道的刺激。例如，在夏季高溫季節(jié)，增加通風(fēng)設(shè)備的運(yùn)行時(shí)間，降低雞舍內(nèi)的溫度和濕度，減少熱應(yīng)激對家禽的影響；在冬季寒冷季節(jié)，合理安排通風(fēng)時(shí)間，在保證雞舍溫度的前提下，確?？諝饬魍āＬ峁I養(yǎng)均衡的飼料，滿足家禽生長發(fā)育的營養(yǎng)需求，增強(qiáng)家禽的免疫力。在飼料中適量添加維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，提高家禽的抗病能力。例如，在飼料中添加維生素C和維生素E，可增強(qiáng)家禽的抗氧化能力，提高免疫力；添加益生菌，可調(diào)節(jié)家禽腸道微生態(tài)平衡，預(yù)防腸道疾病的發(fā)生。減少各種應(yīng)激因素對家禽的影響，如避免突然更換飼料、長途運(yùn)輸、驚嚇等。在進(jìn)行疫苗接種、轉(zhuǎn)群等操作時(shí)，提前做好準(zhǔn)備工作，盡量減少對家禽的應(yīng)激。例如，在疫苗接種前，對家禽進(jìn)行健康檢查，確保家禽處于健康狀態(tài)；在轉(zhuǎn)群時(shí)，選擇合適的時(shí)間和方式，減少家禽的應(yīng)激反應(yīng)。六、參考文獻(xiàn)[1]張濟(jì)培，司興奎，陳建紅等。水禽大腸桿菌病病原的分離與血清型鑒定[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2004(11):11-13.[2]李超。雞大腸桿菌血清型鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].河南畜牧獸醫(yī)(綜合版),2012,33(04):12-13.[3]Alcamo,E.,&Cirillo,A.AnimalreservoirsforSARS-CoVandimplicationsforhumanhealth[J].Revuescientifiqueettechnique(InternationalOfficeofEpizootics),2011,30(2):467-474.[4]Barnes,H.J.,Nolan,L.K.,&Vaillancourt,J.P.Colibacillosis[M].SpringerScience&BusinessMedia,2008.[5]Chen,X.,Zhang,X.,He,X.等.PrevalenceofavianpathogenicEscherichiacoli(APEC)strainsinchickenfarmsandisolationandcharacterizationofisolates[J].AvianPathol,2014,43(6):493-500.[6]Liu,Y.,Yang,Y.,Chen,Y.等.Prevalence,antimicrobialresistanceprofilingandvirulencetraitsofavianpathogenicEscherichiacoliamongbroilerchickenfarmsinFoshan,China[J].GutPathogens,2019,11(1):57.[7]Zhang,X.,Lou,K.,Tian,G.B.等.PrevalenceandcharacterizationofavianpathogenicEscherichiacoliinEasternChina[J].Microbialpathogenesis,2013,65:36-40.[8]黎微微。喹諾酮類抗生素耐藥情況及其耐藥機(jī)制研究[J].中國療養(yǎng)醫(yī)學(xué)，2013,22(12):1090-1093.[9]BALLP.Quinolonegenerations:naturalhistoryornaturalselection?[J].JAntimicrobChemother,2000,46(SupplT1):17-24.[10]AnderssonMI,MacgowanAP.Developmentofthequinolones[J].JAntimicrobChemother,2003,51(Suppl1):1-11.[11]王萌，賴鑫芬，任丹。呼吸氟喹諾酮類藥物業(yè)績緊逼頭孢菌素類[J].中國醫(yī)藥報(bào)，2005.[12]SaderHS,BiedenhachDJ,JonesRN.Globalpatternsofsusceptibilityto21commonlyutilizedantimicrobialagentstestedagainst48480EnterobacteriaceaeintheSENTRY.AntimicrobialSurveillanceProgram(1997-2001)[J].DiagnMicrobiolInfectDis,2003,47(1):361-364.[13]StreitJM,JonesRN,SaderHS,等.Assessmentofpathogenoccurrencesandresistanceprofilesamonginfectedpatientsintheintensivecareunit:reportfromtheSENTRYAntimicrobialSurveillanceProgram(NorthAmerica,2001)[J].InternationalJournalofAntimicrobialAgents,2004,24(2):111-118.[14]GrundmannH,SchrijnemakersP,BruninsmanN,等.EARSSreportonincreasingfluoroquinoloneresistanceamongEscherichiacoliinEurope[J].ClinicalMicrobiologyandInfections,2004,10:64.[15]LivermoreDM,NicholST,LamagniTL,等.CiprofloxacinresistantEscherichiacolifrombacteraemiasinEngland;increasinglyprevalentandmostlyfrommen[J].JournalofAntimicrobialChemotherapy,2003,52(6):1040-1042.[16]KimHB,ParkCH,KimCJ,等.PrevalenceofPlasmid-MediatedQuinoloneResistanceDeterminantsovera9-YearPeriod[J].AntimicrobAgentsChemother,2009,53(2):639-645.[17]RodriguezCN,GarciaA,PastranB.Quinoloneantimicrobialresistanceinsomeenterobacteria:a10-yearstudyinaVenezuelangeneralhospital[J].InternationalJournalofAntimicrobialAgents,2005,25(6):546-550.[18]LoveDE.Quinoloneresistanceamongpneumococci:therapeuticanddiagnosticimplications[J].ClinInfectDis,2004,38(Suppla):$357-362.[19]朱德妹，汪復(fù)，胡付品等.2002年上海地區(qū)醫(yī)院細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J].中華傳染病雜志，2004,22(3):154-159.[20]熊自忠，朱德妹，汪復(fù)等.CTX-M-14和CTX-M-24編碼基因的檢測及其功能表達(dá)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2004,84(17):1454-1459.[21]朱德妹，汪復(fù)，張嬰元.2003年上海地區(qū)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J].中國抗感染化療雜志，2005,5(1):4-12.[22]陳建秀，甄利。喹諾酮類抗生素的藥代動(dòng)力學(xué)研究及其合理應(yīng)用[J].中國藥業(yè)，2005,14(3):71-72.[23]姜素椿，Such.,J.喹諾酮類抗菌藥物的臨床應(yīng)用[J].中國抗生素雜志，1995,20(2):91-97.[24]呂曉菊，王浴生。金屬-β-內(nèi)酰胺酶研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)藥(抗生素分冊),1996,17(3):183-186.[25]彭青，錢元恕。嗜麥芽窄食單胞菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國感染與化療雜志，2006,6(3):209-211.[26]MandellGL,BennettJE,RaphaelD.PrinciplesandPracticeofInfectiousDiseases[M].5thed.Philadelphia,London:ChurchillLivingstone,2000:821-856,2299-2301.[27]GordonKA,JonesRN.SENTRYparticipantgroups.SusceptibilitypatternsoforallyadministeredantimicrobialsamongurinarytractinfectionpathogensfromhospitalizedpatientsinNorthAmerica:comparisonreporttoEuropeandLatinAmerica:resultsfromtheSENTRYantimicrobialsurveillanceprogram(2000)[J].DiagnMicrobiolInfectDis,2003,45:295-301.[28]BiedenbachDJ,MoetGJ,JonesRN.PathogenoccurrenceandantimicrobialresistancepatterncomparisonsamongbloodstreaminfectionisolatesfromtheSENTRYantimicrobialsurveillanceprogram(1997-2000)[J].DiagMicrobialInfectDis,2004,50:59-69.[29]秦治亮，王金梅，何召新.A群輪狀病毒所致嬰幼兒腹瀉的流行病學(xué)特征[J].臨床檢驗(yàn)雜志(電子版),2014,3(4):740-742.[30]楊鳳華，孟祥東，周景欣等。呼吸道感染中銅綠假單胞菌藥物敏感性分析[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007,29(3):301-302.[31]過孝靜，康梅，范紅等。重癥監(jiān)護(hù)病房患者感染病原細(xì)菌的耐藥性分析[J].華西醫(yī)學(xué)，2007,22(4):781-782.[32]鐘興美，鐘愷立，李方等。綜合重癥監(jiān)護(hù)病房主要致病菌的菌群分布及其藥敏分析[J].現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)，2007,33(3):173-174.[33]黃瑞娟，葉臨湘，馮啟明。大腸埃希菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的危險(xiǎn)因素研究[J].疾病控制雜志，2008,12(2):141-143.[34]李艷華，李鵬。聊城地區(qū)革蘭陰性桿菌耐藥譜分析[J].濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008,31(1):58-59.[35]羅志揚(yáng)，陳鋼，鄭利先等。常見革蘭陰性桿菌耐藥性監(jiān)測[J].中國醫(yī)師雜志，2005,7(S1):382-3