2025年上海市醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)人員PCR上崗證考試題含答案一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共30分）1.以下哪種物質(zhì)最易導(dǎo)致PCR擴(kuò)增污染？A.基因組DNAB.質(zhì)粒DNAC.擴(kuò)增產(chǎn)物（PCR產(chǎn)物）D.總RNA答案：C解析：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（尤其是單鏈產(chǎn)物）拷貝數(shù)極高（10^12拷貝/μl），極微量即可造成污染，是PCR實(shí)驗(yàn)室最主要的污染源。2.熒光定量PCR中，內(nèi)參基因的主要作用是？A.監(jiān)測(cè)擴(kuò)增效率B.校正加樣誤差C.判斷擴(kuò)增特異性D.區(qū)分陽(yáng)性與陰性答案：B解析：內(nèi)參基因（如GAPDH、βactin）通常為樣本中穩(wěn)定表達(dá)的管家基因，用于校正不同樣本間的加樣量差異及核酸提取效率差異，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.PCR反應(yīng)體系中，dNTP的最佳濃度范圍是？A.50200μmol/LB.200500μmol/LC.500800μmol/LD.8001000μmol/L答案：A解析：dNTP濃度過(guò)高會(huì)螯合Mg2+，抑制Taq酶活性；過(guò)低則影響擴(kuò)增效率。常規(guī)PCR推薦濃度為50200μmol/L，熒光定量PCR因需要更高靈敏度，通常使用100200μmol/L。4.以下哪項(xiàng)是PCR實(shí)驗(yàn)室“三區(qū)兩緩”中的核心區(qū)域？A.試劑準(zhǔn)備區(qū)B.標(biāo)本處理區(qū)C.擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)D.緩沖區(qū)1（試劑準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本處理區(qū)）答案：B解析：標(biāo)本處理區(qū)（核酸提取區(qū)）是最易發(fā)生交叉污染的區(qū)域，需嚴(yán)格控制人員流動(dòng)及物品傳遞，是實(shí)驗(yàn)室分區(qū)管理的核心區(qū)域。5.若PCR擴(kuò)增曲線出現(xiàn)“平臺(tái)期延遲”，最可能的原因是？A.引物二聚體B.模板濃度過(guò)高C.酶量不足D.Mg2+濃度過(guò)高答案：C解析：酶量不足會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低，達(dá)到平臺(tái)期所需循環(huán)數(shù)增加（平臺(tái)期延遲）；模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致平臺(tái)期提前；引物二聚體表現(xiàn)為非特異性擴(kuò)增曲線；Mg2+過(guò)高可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。二、多項(xiàng)選擇題（每題3分，共15分，多選、少選均不得分）1.以下屬于PCR實(shí)驗(yàn)室污染防控措施的是？A.各區(qū)域?qū)Ｓ靡埔浩骷拔^（帶濾芯）B.每日工作后用10%次氯酸鈉擦拭臺(tái)面C.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)使用紫外線照射30分鐘D.不同區(qū)域工作服不得交叉使用答案：ABD解析：擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)（產(chǎn)物區(qū)）嚴(yán)禁使用紫外線照射，因PCR產(chǎn)物經(jīng)紫外線照射后可能形成嘧啶二聚體，但仍可作為模板被擴(kuò)增（尤其使用熱啟動(dòng)酶時(shí)），反而導(dǎo)致假陽(yáng)性。2.熒光定量PCR中，Ct值的影響因素包括？A.初始模板拷貝數(shù)B.擴(kuò)增效率C.熒光閾值設(shè)定D.反應(yīng)體系體積答案：ABCD解析：Ct值（循環(huán)閾值）與初始模板拷貝數(shù)成反比（模板越多，Ct越?。粩U(kuò)增效率降低（如酶活性下降）會(huì)導(dǎo)致Ct值增大；熒光閾值設(shè)定過(guò)高會(huì)使Ct值后移；反應(yīng)體系體積變化（如加樣誤差）會(huì)影響熒光信號(hào)強(qiáng)度，間接影響Ct值。3.核酸提取過(guò)程中，導(dǎo)致DNA降解的可能原因有？A.樣本保存溫度過(guò)高（如4℃放置超過(guò)24小時(shí)）B.提取緩沖液中EDTA濃度不足C.離心速度過(guò)低D.使用RNase處理樣本答案：AB解析：DNA降解主要由核酸酶（如DNase）活性未被抑制或樣本保存不當(dāng)引起。EDTA可螯合DNase所需的Mg2+，抑制其活性；樣本在4℃長(zhǎng)期放置會(huì)激活內(nèi)源性DNase；離心速度過(guò)低影響核酸與磁珠/硅膠膜結(jié)合效率，但不會(huì)直接導(dǎo)致降解；RNase處理樣本主要降解RNA，不影響DNA。三、判斷題（每題2分，共10分，正確打√，錯(cuò)誤打×）1.PCR實(shí)驗(yàn)室空氣流向應(yīng)為“產(chǎn)物分析區(qū)→標(biāo)本處理區(qū)→試劑準(zhǔn)備區(qū)”。（×）解析：空氣流向應(yīng)遵循“清潔區(qū)→污染區(qū)”，即試劑準(zhǔn)備區(qū)（最清潔）→標(biāo)本處理區(qū)→擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)（污染區(qū)），需通過(guò)壓差控制（如負(fù)壓）實(shí)現(xiàn)。2.熒光定量PCR中，熔解曲線出現(xiàn)單峰可完全排除非特異性擴(kuò)增。（×）解析：熔解曲線單峰僅說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值一致，但可能存在引物二聚體與目標(biāo)片段Tm值相近的情況（如短片段目標(biāo)產(chǎn)物與引物二聚體Tm值重疊），需結(jié)合擴(kuò)增曲線形態(tài)（如指數(shù)期是否明顯）綜合判斷。3.臨床樣本核酸提取時(shí)，陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，可能原因?yàn)樘崛∵^(guò)程中交叉污染。（√）解析：陰性對(duì)照（無(wú)模板對(duì)照）應(yīng)無(wú)擴(kuò)增，若出現(xiàn)信號(hào)，提示在核酸提取或加樣過(guò)程中發(fā)生了樣本交叉污染（如吸頭飛濺、臺(tái)面污染）。四、案例分析題（共25分）某實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展新冠病毒核酸檢測(cè)，連續(xù)3天出現(xiàn)“弱陽(yáng)性樣本Ct值重復(fù)性差（同一標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)Ct值波動(dòng)＞3）”，且室內(nèi)質(zhì)控品（低濃度陽(yáng)性）Ct值逐漸增大。請(qǐng)分析可能原因及解決措施。答案要點(diǎn)：可能原因：（1）試劑因素：檢測(cè)試劑盒效期臨近或保存不當(dāng)（如反復(fù)凍融），導(dǎo)致引物/探針降解、Taq酶活性下降；（2）儀器因素：PCR儀模塊溫度不均勻（如熱蓋溫度不足導(dǎo)致蒸發(fā)）、熒光檢測(cè)通道靈敏度下降（如光學(xué)元件老化）；（3）操作因素：加樣誤差（移液器校準(zhǔn)不準(zhǔn)、吸頭未完全浸潤(rùn)）、核酸提取效率不穩(wěn)定（如磁珠分散不均、洗滌不徹底）；（4）樣本因素：樣本保存不當(dāng)（如反復(fù)凍融導(dǎo)致核酸降解）、抑制物殘留（如血紅蛋白、胍鹽未洗凈）。解決措施：（1）核查試劑有效期及保存條件，更換新批次試劑并做平行驗(yàn)證；（2）對(duì)PCR儀進(jìn)行溫度校準(zhǔn)（使用溫度驗(yàn)證模塊）、熒光校準(zhǔn)（使用標(biāo)準(zhǔn)熒光品）；（3）校準(zhǔn)移液器（包括單道及多道），規(guī)范加樣操作（如慢吸慢放）；（4）優(yōu)化核酸提取流程（如增加洗滌次數(shù)、延長(zhǎng)結(jié)合時(shí)間），檢測(cè)提取后核酸濃度/純度（OD260/280應(yīng)在1.82.0）；（5）對(duì)弱陽(yáng)性樣本進(jìn)行重復(fù)提取檢測(cè)，排除樣本抑制物影響（可添加內(nèi)標(biāo)監(jiān)測(cè)提取效率）。五、簡(jiǎn)答題（共20分）簡(jiǎn)述PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及具體要求。答案要點(diǎn)：1.人員資質(zhì)：操作人員需經(jīng)培訓(xùn)并考核合格，掌握PCR原理、污染防控、結(jié)果判讀等技能；2.環(huán)境控制：分區(qū)明確（試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)），各區(qū)域物品專(zhuān)用，空氣壓力梯度為試劑準(zhǔn)備區(qū)＞標(biāo)本處理區(qū)＞擴(kuò)增區(qū)＞產(chǎn)物分析區(qū)（≥5Pa）；3.試劑管理：使用經(jīng)國(guó)家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的試劑盒，保存條件符合要求（如20℃保存的試劑避免反復(fù)凍融），使用前做陰陽(yáng)性對(duì)照驗(yàn)證；4.儀器設(shè)備：PCR儀需定期校準(zhǔn)（溫度準(zhǔn)確性±0.5℃，溫度均勻性±0.3℃），熒光定量PCR儀需進(jìn)行熒光通道校準(zhǔn)；5.