山定子遺傳轉(zhuǎn)化體系構建的關鍵技術與影響因素探究一、引言1.1研究背景與意義山定子（Malusbaccata(L.)Borkh.），又名山荊子、林荊子，屬薔薇科蘋果屬多年生落葉喬木，廣泛分布于中國東北、華北、西北以及西南等地。山定子作為傳統(tǒng)中藥，具有豐富的藥理活性，在醫(yī)療保健領域展現(xiàn)出了廣闊的應用前景。現(xiàn)代藥理學研究表明，山定子富含多種生物活性成分，如多酚類、黃酮類、萜類、酯類以及烯烴類等。這些活性成分賦予了山定子多種藥理作用，包括抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降糖降脂和肝保護等。在抗腫瘤方面，山定子果實的不同溶劑提取物對宮頸癌HeLa細胞和肝癌HepG2細胞均表現(xiàn)出顯著的增殖抑制作用，展現(xiàn)出潛在的抗癌功效。其抗氧化能力也十分出色，果實和葉的提取物對DPPH、ABTS等自由基具有明顯的清除作用，還具備良好的還原能力和抑制脂質(zhì)過氧化的能力，山定子多酚對60Coγ輻射誘導的脾細胞和外周白細胞氧化損傷具有保護作用，能夠提高細胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性，降低丙二醛（MDA）含量，抑制細胞內(nèi)活性氧簇（ROS）的生成和DNA損傷。在降糖降脂方面，以鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠為模型進行研究，發(fā)現(xiàn)山定子總黃酮能夠降低血糖，顯著降低小鼠血清中的甘油三脂、總膽固醇水平，并改善高密度脂蛋白膽固醇水平。在肝保護作用上，山定子葉醇提取物能明顯降低由四氯化碳引起的谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平的升高，且中、高劑量的提取物能夠升高肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）的活性。然而，野生山定子的藥用性能存在一定的局限性，如有效成分含量較低、對生長環(huán)境要求苛刻、抗逆性不足等，這限制了其在醫(yī)藥領域的廣泛應用和大規(guī)模開發(fā)。隨著現(xiàn)代生物技術的飛速發(fā)展，遺傳轉(zhuǎn)化技術為山定子的改良提供了新的途徑。通過建立山定子遺傳轉(zhuǎn)化體系，能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)肷蕉ㄗ蛹毎?，實現(xiàn)對其遺傳物質(zhì)的定向改造。這不僅可以提高山定子中有效成分的含量，增強其藥理活性，還能賦予山定子新的優(yōu)良性狀，如提高抗病蟲害能力、增強對逆境環(huán)境的耐受性等。建立山定子遺傳轉(zhuǎn)化體系對于中藥材生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展和現(xiàn)代化轉(zhuǎn)型具有重要的推動作用。一方面，通過遺傳轉(zhuǎn)化改良后的山定子，其產(chǎn)量和品質(zhì)得以提升，能夠滿足市場對高質(zhì)量中藥材日益增長的需求。另一方面，這一技術有助于減少對野生山定子資源的過度依賴和采集，保護生態(tài)平衡。此外，山定子遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立也為其他中藥材的遺傳改良提供了寶貴的技術參考和經(jīng)驗借鑒，促進整個中藥材產(chǎn)業(yè)向更加高效、綠色、可持續(xù)的方向發(fā)展。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在山定子遺傳轉(zhuǎn)化體系研究方面，國內(nèi)外學者已取得了一定的進展。在國外，相關研究主要聚焦于利用先進的生物技術挖掘山定子的優(yōu)良基因，并嘗試將其應用于實際生產(chǎn)。美國的科研團隊通過基因編輯技術，對山定子中與抗逆性相關的基因進行修飾，成功培育出具有更強抗病蟲害能力的山定子新品系。他們深入研究了基因編輯過程中不同靶點的選擇對山定子生長發(fā)育和遺傳穩(wěn)定性的影響，為精準改良山定子提供了理論依據(jù)。日本的學者則著重研究山定子與其他蘋果屬植物的遺傳關系，通過比較基因組學的方法，揭示了山定子在進化過程中的獨特基因特征，為山定子遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化提供了新的思路。國內(nèi)的研究起步相對較晚，但近年來發(fā)展迅速。中國農(nóng)業(yè)大學的研究人員以山定子葉片為外植體，系統(tǒng)研究了葉片分化不定芽的諸多因素，建立了穩(wěn)定、高效的葉片再生體系。在此基礎上，采用農(nóng)桿菌介導法，成功將外源基因?qū)肷蕉ㄗ蛹毎?，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。他們詳細研究了抗生素及轉(zhuǎn)化過程中各因素對轉(zhuǎn)化的影響，確定了適合山定子葉片轉(zhuǎn)化的篩選壓力濃度，以及最佳的激素配比、共培養(yǎng)時間、侵染時間等條件。此外，還有研究利用基因槍轟擊法將目的基因?qū)肷蕉ㄗ?，探索了不同轟擊參數(shù)對轉(zhuǎn)化效率的影響。然而，現(xiàn)有研究仍存在一些不足之處。一方面，目前山定子遺傳轉(zhuǎn)化的效率普遍較低，轉(zhuǎn)化過程中存在基因整合不穩(wěn)定、外源基因表達沉默等問題，限制了遺傳轉(zhuǎn)化技術在山定子改良中的大規(guī)模應用。另一方面，對轉(zhuǎn)基因山定子的安全性評估還不夠完善，包括對生態(tài)環(huán)境和人體健康的潛在影響研究較少。此外，雖然已成功將一些外源基因?qū)肷蕉ㄗ樱珜τ谶@些基因在山定子體內(nèi)的作用機制和調(diào)控網(wǎng)絡尚不清楚，需要進一步深入研究。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在建立高效穩(wěn)定的山定子遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，提高轉(zhuǎn)化效率，實現(xiàn)外源基因在山定子中的穩(wěn)定整合與表達，為山定子的遺傳改良和新品種培育奠定堅實基礎。具體研究內(nèi)容如下：山定子組織培養(yǎng)技術的建立：以山定子幼葉和幼莖為實驗材料，運用不同的培養(yǎng)基和激素組合，探究最適宜山定子組織培養(yǎng)的條件。詳細研究不同種類和濃度的激素，如細胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等，以及基本培養(yǎng)基如MS、B5、White培養(yǎng)基等對山定子愈傷組織誘導、不定芽分化和生根培養(yǎng)的影響。同時，考察培養(yǎng)環(huán)境因素，包括光照強度、光照時間、溫度、濕度等對山定子組織培養(yǎng)過程的作用，從而建立起完整、高效的山定子組織培養(yǎng)體系。山定子遺傳轉(zhuǎn)化試驗的開展：利用農(nóng)桿菌介導法和植物基因炮擊法，將外源基因?qū)肷蕉ㄗ咏M織中。對于農(nóng)桿菌介導法，深入研究農(nóng)桿菌菌株類型、菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間、乙酰丁香酮添加量等因素對轉(zhuǎn)化效率的影響。在植物基因炮擊法中，重點探究基因槍轟擊參數(shù)，如轟擊壓力、轟擊距離、金粉或鎢粉用量等對轉(zhuǎn)化效果的作用。同時，對外源基因的表達和遺傳穩(wěn)定性進行鑒定，運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測外源基因在山定子不同組織和發(fā)育階段的表達水平，通過Southernblot雜交分析確定外源基因在山定子基因組中的整合情況和拷貝數(shù)，并通過連續(xù)多代的遺傳分析評估轉(zhuǎn)基因山定子的遺傳穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)基因山定子的藥理活性評價：對轉(zhuǎn)基因山定子的藥理活性進行全面評價，并與野生型山定子進行系統(tǒng)的比較分析。采用現(xiàn)代藥理學研究方法，如細胞實驗、動物實驗等，評估轉(zhuǎn)基因山定子在抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降糖降脂和肝保護等方面的藥理活性變化。在抗腫瘤活性評價中，以腫瘤細胞系為模型，檢測轉(zhuǎn)基因山定子提取物對腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的影響。在抗氧化活性評價中，測定轉(zhuǎn)基因山定子提取物對DPPH、ABTS等自由基的清除能力，以及對脂質(zhì)過氧化的抑制作用。通過這些研究，評估山定子遺傳轉(zhuǎn)化體系的有效性，明確遺傳轉(zhuǎn)化對山定子藥理活性的影響，為山定子的遺傳改良和藥用開發(fā)提供科學依據(jù)。二、山定子組織培養(yǎng)技術2.1實驗材料準備在春季山定子生長旺盛期，于清晨時分，在[具體采集地點，如某自然保護區(qū)內(nèi)生長健壯、無病蟲害的山定子植株]采集幼葉和幼莖。采集時，選取植株上部生長良好、葉片完整且幼嫩的葉片，以及長度在3-5cm、直徑約2-3mm的幼莖。為了減少材料的損傷和污染，使用經(jīng)過消毒處理的鋒利剪刀進行采集，并將采集好的材料立即放入裝有濕潤無菌濾紙的密封袋中?；氐綄嶒炇液螅瑢⒉杉纳蕉ㄗ佑兹~和幼莖材料先在流水下沖洗30min，以去除表面的灰塵、雜質(zhì)和微生物。接著，將材料放入體積分數(shù)為75%的酒精溶液中浸泡30s，進行表面消毒。然后，迅速將材料轉(zhuǎn)移至質(zhì)量分數(shù)為0.1%的升汞溶液中浸泡8-10min，期間不斷輕輕搖晃，以確保消毒均勻。消毒完成后，用無菌水沖洗材料5-6次，每次沖洗時間約為3-5min，直至徹底去除升汞殘留。處理后的材料若不能立即使用，可將其保存在4℃的冰箱中，保存時間不超過2天，以保證材料的活性。2.2培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化2.2.1基本培養(yǎng)基的篩選選取三種常用的基本培養(yǎng)基，分別為MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基和White培養(yǎng)基，對山定子幼葉和幼莖進行組織培養(yǎng)試驗。這三種培養(yǎng)基在成分上存在顯著差異，MS培養(yǎng)基含有較高的無機鹽濃度，能夠為山定子組織提供豐富的礦質(zhì)營養(yǎng)，有利于愈傷組織的快速生長；B5培養(yǎng)基的主要特點是銨含量較低，可減少某些植物在培養(yǎng)過程中銨對生長的抑制作用；White培養(yǎng)基屬于低鹽培養(yǎng)基，無機鹽濃度低，常用于生根培養(yǎng)和成熟胚胎培養(yǎng)。將經(jīng)過消毒處理的山定子幼葉和幼莖分別接種到添加了3mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的MS、B5、White三種基本培養(yǎng)基上，每個處理設置30個重復，置于溫度為25±2℃、光照強度為2000lx、光照時間為16h/d的培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。定期觀察并記錄外植體的生長狀況，包括愈傷組織的誘導時間、誘導率、生長速度以及不定芽的分化情況。培養(yǎng)7天后，在MS培養(yǎng)基上接種的山定子幼葉和幼莖開始出現(xiàn)愈傷組織，誘導率分別達到30%和35%；而在B5和White培養(yǎng)基上，愈傷組織的出現(xiàn)時間相對較晚，分別在培養(yǎng)10天和12天后才開始出現(xiàn)，誘導率也較低，幼葉的誘導率分別為15%和10%，幼莖的誘導率分別為20%和15%。在愈傷組織的生長速度方面，MS培養(yǎng)基上的愈傷組織生長迅速，質(zhì)地較為疏松，顏色鮮綠；B5培養(yǎng)基上的愈傷組織生長速度次之，質(zhì)地較緊密；White培養(yǎng)基上的愈傷組織生長緩慢，質(zhì)地緊密且顏色較深。在不定芽分化方面，培養(yǎng)30天后，MS培養(yǎng)基上的愈傷組織不定芽分化率最高，幼葉來源的愈傷組織不定芽分化率達到50%，幼莖來源的愈傷組織不定芽分化率達到45%；B5培養(yǎng)基上的不定芽分化率為30%和25%；White培養(yǎng)基上的不定芽分化率最低，僅為10%和15%。綜合愈傷組織誘導和不定芽分化情況，MS培養(yǎng)基最適合山定子幼葉和幼莖的組織培養(yǎng)，能夠為山定子組織培養(yǎng)提供良好的營養(yǎng)條件，促進愈傷組織的誘導和不定芽的分化。2.2.2激素種類與濃度的優(yōu)化在確定MS培養(yǎng)基為最適基本培養(yǎng)基的基礎上，進一步研究不同激素種類及其濃度配比對山定子愈傷組織誘導、不定芽分化和生根的影響。選用的激素種類包括細胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、噻苯?。═DZ），生長素萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）。6-BA能夠促進細胞分裂，有利于愈傷組織的形態(tài)建成；TDZ具有很高的生物活性，在愈傷組織誘導和分化中發(fā)揮重要作用；NAA和IBA對植物細胞的毒害作用較輕，產(chǎn)生的愈傷組織較易分化。愈傷組織誘導試驗：設置不同的激素組合和濃度梯度，以MS培養(yǎng)基為基礎，分別添加不同濃度的6-BA（1mg/L、2mg/L、3mg/L）和NAA（0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L），共9個處理，每個處理接種30個山定子幼葉外植體。在溫度為25±2℃、光照強度為2000lx、光照時間為16h/d的條件下培養(yǎng)。結(jié)果顯示，當6-BA濃度為2mg/L、NAA濃度為0.3mg/L時，愈傷組織誘導率最高，達到70%，且愈傷組織質(zhì)地疏松，顏色鮮綠，生長狀態(tài)良好。當6-BA濃度過高或NAA濃度過低時，愈傷組織誘導率明顯降低，且愈傷組織質(zhì)地緊密，顏色發(fā)黃。不定芽分化試驗：將在上述最佳愈傷組織誘導培養(yǎng)基上獲得的愈傷組織，轉(zhuǎn)接至添加不同濃度6-BA（1mg/L、2mg/L、3mg/L）和TDZ（0.05mg/L、0.1mg/L、0.15mg/L）的MS分化培養(yǎng)基上，每個處理30個重復。培養(yǎng)條件同愈傷組織誘導試驗。結(jié)果表明，當6-BA濃度為3mg/L、TDZ濃度為0.1mg/L時，不定芽分化率最高，達到65%，且不定芽生長健壯，葉片舒展。過高或過低的6-BA和TDZ濃度都會導致不定芽分化率下降，不定芽生長緩慢且瘦弱。生根試驗：將分化出的不定芽切下，接種到添加不同濃度IBA（0.5mg/L、1mg/L、1.5mg/L）和NAA（0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L）的1/2MS生根培養(yǎng)基上，每個處理接種25個不定芽。在溫度為23±2℃、光照強度為1500lx、光照時間為12h/d的條件下培養(yǎng)。結(jié)果顯示，當IBA濃度為1mg/L、NAA濃度為0.2mg/L時，生根率最高，達到80%，且根系發(fā)達，根長適中。IBA和NAA濃度不適當時，生根率較低，根系生長不良，表現(xiàn)為根短、細弱。通過對激素種類與濃度的優(yōu)化，確定了山定子愈傷組織誘導的最佳激素組合為2mg/L6-BA+0.3mg/LNAA，不定芽分化的最佳激素組合為3mg/L6-BA+0.1mg/LTDZ，生根的最佳激素組合為1mg/LIBA+0.2mg/LNAA。這些優(yōu)化后的激素組合為山定子組織培養(yǎng)提供了更適宜的激素條件，有助于提高山定子組織培養(yǎng)的效率和質(zhì)量。2.3培養(yǎng)條件的探索2.3.1光照與溫度條件光照強度、光照時間和培養(yǎng)溫度對山定子組織培養(yǎng)具有顯著影響。在光照強度研究中，設置5個光照強度梯度，分別為1000lx、1500lx、2000lx、2500lx和3000lx。將接種有山定子愈傷組織的培養(yǎng)基置于不同光照強度下，溫度控制在25±2℃，光照時間為16h/d，培養(yǎng)30天。結(jié)果顯示，光照強度為2000lx時，愈傷組織生長狀態(tài)最佳，顏色鮮綠，質(zhì)地疏松，不定芽分化率達到55%。當光照強度低于1500lx時，愈傷組織生長緩慢，顏色發(fā)黃，不定芽分化率較低；光照強度高于2500lx時，愈傷組織容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，不定芽分化受到抑制。這表明適宜的光照強度能夠促進山定子愈傷組織的生長和不定芽的分化，光照過強或過弱都會對其產(chǎn)生不利影響。在光照時間的探究中，設置光照時間為8h/d、12h/d、16h/d、20h/d和24h/d，光照強度保持在2000lx，溫度為25±2℃，培養(yǎng)30天。結(jié)果表明，光照時間為16h/d時，不定芽分化率最高，達到60%，且不定芽生長健壯。光照時間過短（8h/d和12h/d），山定子愈傷組織分化受到抑制，不定芽生長緩慢；光照時間過長（20h/d和24h/d），會導致山定子組培苗出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，影響組培苗的質(zhì)量。這說明合適的光照時間對于山定子組織培養(yǎng)至關重要，能夠為其生長和分化提供適宜的光周期條件。在溫度對山定子組織培養(yǎng)影響的試驗中，設置5個溫度梯度，分別為20℃、23℃、25℃、27℃和30℃，光照強度為2000lx，光照時間為16h/d，培養(yǎng)30天。結(jié)果顯示，25℃時愈傷組織誘導率最高，達到75%，不定芽分化率也較高，為58%，且山定子組培苗生長健壯，根系發(fā)達。當溫度低于23℃時，山定子組織培養(yǎng)各階段進程減緩，細胞分裂和代謝活動受到抑制；溫度高于27℃時，愈傷組織容易出現(xiàn)褐化、死亡現(xiàn)象，不定芽分化率明顯下降。這表明25℃是山定子組織培養(yǎng)較為適宜的溫度，能夠滿足其生長和發(fā)育的溫度需求。通過對光照強度、光照時間和培養(yǎng)溫度的研究，確定了山定子組織培養(yǎng)的最適光照和溫度條件為光照強度2000lx、光照時間16h/d、培養(yǎng)溫度25℃。在這些條件下，山定子愈傷組織生長良好，不定芽分化率高，組培苗生長健壯，為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化試驗奠定了良好的基礎。2.3.2其他培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的pH值、滲透壓以及培養(yǎng)器皿等因素對山定子組織培養(yǎng)也有著重要作用。在pH值的研究中，設置培養(yǎng)基的pH值為5.0、5.5、6.0、6.5和7.0。將山定子外植體接種到不同pH值的培養(yǎng)基上，在光照強度2000lx、光照時間16h/d、溫度25℃的條件下培養(yǎng)。結(jié)果顯示，當pH值為5.8時，山定子愈傷組織誘導率最高，達到72%，不定芽分化率也較高，為56%。pH值過低（5.0和5.5）時，培養(yǎng)基酸性過強，會抑制山定子細胞的分裂和生長，導致愈傷組織誘導率和不定芽分化率降低；pH值過高（6.5和7.0）時，培養(yǎng)基堿性增強，會影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的溶解度和有效性，同樣不利于山定子組織培養(yǎng)。這說明適宜的pH值能夠維持山定子細胞的正常生理功能，促進組織培養(yǎng)的順利進行。滲透壓對山定子組織培養(yǎng)的影響通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度的甘露醇來調(diào)節(jié)。設置甘露醇濃度為0g/L、5g/L、10g/L、15g/L和20g/L，其他培養(yǎng)條件同pH值試驗。結(jié)果表明，當甘露醇濃度為10g/L時，山定子組培苗的生長狀況最佳，根系發(fā)達，葉片舒展，鮮重和干重都顯著增加。甘露醇濃度過低（0g/L和5g/L）時，培養(yǎng)基滲透壓較低，山定子組培苗容易出現(xiàn)水分過多、生長過快但莖桿細弱的現(xiàn)象；甘露醇濃度過高（15g/L和20g/L）時，培養(yǎng)基滲透壓過高，會導致山定子組培苗細胞失水，生長受到抑制，甚至出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。這表明合適的滲透壓能夠為山定子組培苗提供適宜的水分和營養(yǎng)環(huán)境，有利于其生長和發(fā)育。培養(yǎng)器皿的選擇對山定子組織培養(yǎng)也有一定影響。分別選用玻璃培養(yǎng)瓶、塑料培養(yǎng)瓶和組培盒作為培養(yǎng)器皿，在相同的培養(yǎng)條件下進行試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用玻璃培養(yǎng)瓶時，山定子組培苗生長狀況最好，光照透過性好，有利于光合作用的進行，且玻璃材質(zhì)化學穩(wěn)定性高，對培養(yǎng)基成分的影響較小。塑料培養(yǎng)瓶的透光性相對較差，會在一定程度上影響山定子組培苗的光合作用；組培盒雖然操作方便，但空間相對較小，不利于山定子組培苗的生長和伸展。因此，玻璃培養(yǎng)瓶更適合作為山定子組織培養(yǎng)的器皿。綜上所述，培養(yǎng)基的pH值為5.8、滲透壓通過添加10g/L甘露醇來調(diào)節(jié)以及選用玻璃培養(yǎng)瓶作為培養(yǎng)器皿，能夠為山定子組織培養(yǎng)提供更適宜的條件，有助于提高山定子組織培養(yǎng)的效率和質(zhì)量。2.4組織培養(yǎng)體系的建立與驗證綜合上述研究結(jié)果，建立山定子組織培養(yǎng)體系如下：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在愈傷組織誘導階段，添加2mg/L6-BA和0.3mg/LNAA，pH值調(diào)節(jié)為5.8，使用玻璃培養(yǎng)瓶，在光照強度2000lx、光照時間16h/d、溫度25℃的條件下進行培養(yǎng)；在不定芽分化階段，培養(yǎng)基添加3mg/L6-BA和0.1mg/LTDZ，其他條件同愈傷組織誘導階段；在生根階段，采用1/2MS培養(yǎng)基，添加1mg/LIBA和0.2mg/LNAA，光照強度調(diào)整為1500lx，光照時間為12h/d，溫度為23±2℃，pH值為5.8，使用玻璃培養(yǎng)瓶。為驗證該組織培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性和可靠性，進行了3次重復實驗，每次實驗均設置30個重復。結(jié)果顯示，在重復實驗中，愈傷組織誘導率穩(wěn)定在68%-72%之間，不定芽分化率穩(wěn)定在62%-67%之間，生根率穩(wěn)定在78%-82%之間。各階段組培苗的生長狀態(tài)良好，形態(tài)特征一致，未出現(xiàn)明顯的變異或生長異常現(xiàn)象。這表明建立的山定子組織培養(yǎng)體系具有較高的穩(wěn)定性和可靠性，能夠為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化試驗提供穩(wěn)定、高質(zhì)量的外植體材料。三、山定子遺傳轉(zhuǎn)化試驗3.1遺傳轉(zhuǎn)化方法的選擇3.1.1農(nóng)桿菌介導法農(nóng)桿菌介導法是一種廣泛應用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其原理基于農(nóng)桿菌的天然特性。農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性細菌，主要包括根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌。根癌農(nóng)桿菌細胞中含有Ti（Tumourinducing）質(zhì)粒，發(fā)根農(nóng)桿菌細胞中含有Ri質(zhì)粒，這兩種質(zhì)粒上均有一段T-DNA（TransferringDNA）。在自然條件下，農(nóng)桿菌能夠趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物的受傷部位，當植物體受傷時，傷口處的細胞會分泌大量酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細胞。農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中，并且可以通過減數(shù)分裂穩(wěn)定地遺傳給后代。在山定子遺傳轉(zhuǎn)化中，農(nóng)桿菌介導法具有諸多優(yōu)勢。首先，該方法的轉(zhuǎn)化頻率相對較高，能夠高效地將外源DNA導入山定子細胞。研究表明，在合適的條件下，農(nóng)桿菌介導的山定子遺傳轉(zhuǎn)化效率可達到一定水平，為獲得轉(zhuǎn)基因山定子植株提供了保障。其次，農(nóng)桿菌介導法可以導入包含多個基因的大片段DNA，這對于需要同時導入多個功能基因來改良山定子性狀的研究具有重要意義。例如，若要同時提高山定子的抗病蟲害能力和有效成分含量，可通過農(nóng)桿菌介導法將相關的多個基因一起導入山定子細胞。此外，農(nóng)桿菌介導法導入的外源基因拷貝數(shù)通常較低，有利于基因的穩(wěn)定遺傳和表達。低拷貝數(shù)的外源基因整合到山定子基因組中，減少了基因之間的相互干擾，降低了基因沉默的風險，使得轉(zhuǎn)基因山定子能夠穩(wěn)定地表現(xiàn)出目標性狀。而且，大多數(shù)情況下，轉(zhuǎn)化后的基因表達遵循孟德爾遺傳規(guī)律，這為轉(zhuǎn)基因山定子的遺傳育種提供了便利，育種工作者可以根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律對轉(zhuǎn)基因山定子進行選育，培育出具有優(yōu)良性狀且遺傳穩(wěn)定的新品種。農(nóng)桿菌介導法在山定子遺傳轉(zhuǎn)化中的應用可行性較高。山定子屬于薔薇科蘋果屬植物，是雙子葉植物，符合農(nóng)桿菌的天然寄主范圍。已有研究成功利用農(nóng)桿菌介導法將外源基因?qū)肷蕉ㄗ蛹毎?，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。在轉(zhuǎn)化過程中，有多個關鍵因素會影響轉(zhuǎn)化效率。農(nóng)桿菌菌株類型對轉(zhuǎn)化效率有顯著影響。不同的農(nóng)桿菌菌株在侵染能力、T-DNA轉(zhuǎn)移效率等方面存在差異。例如，常見的農(nóng)桿菌菌株LBA4404和EHA105，它們在轉(zhuǎn)化山定子時表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)化效果。研究發(fā)現(xiàn)，EHA105菌株在某些情況下對山定子的轉(zhuǎn)化效率較高，可能是因為其Vir基因的表達特性更適合山定子細胞的侵染和T-DNA的轉(zhuǎn)移。菌液濃度也是一個重要因素。合適的菌液濃度能夠保證足夠數(shù)量的農(nóng)桿菌與山定子細胞接觸，提高轉(zhuǎn)化效率。一般來說，菌液濃度在OD600值為0.5左右時，轉(zhuǎn)化效果較好。若菌液濃度過低，農(nóng)桿菌與山定子細胞的接觸機會減少，轉(zhuǎn)化效率降低；若菌液濃度過高，可能會導致山定子細胞受到過度侵染，影響細胞的正常生理功能，甚至導致細胞死亡。侵染時間和共培養(yǎng)時間同樣關鍵。侵染時間過短，農(nóng)桿菌可能無法將T-DNA有效地轉(zhuǎn)移到山定子細胞中；侵染時間過長，則可能對山定子細胞造成損傷。研究表明，侵染10-15min，共培養(yǎng)3天，能夠獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。在共培養(yǎng)過程中，農(nóng)桿菌與山定子細胞相互作用，T-DNA逐漸整合到山定子基因組中，適宜的共培養(yǎng)時間能夠保證這一過程的順利進行。此外，乙酰丁香酮的添加也會對轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生影響。乙酰丁香酮是一種酚類化合物，能夠誘導農(nóng)桿菌Vir基因的表達，增強農(nóng)桿菌的侵染能力。在農(nóng)桿菌介導的山定子遺傳轉(zhuǎn)化中，添加適量的乙酰丁香酮可以提高轉(zhuǎn)化效率。3.1.2基因槍法基因槍法，又稱粒子轟擊（particlebombardment）、高速粒子噴射技術（High-velocityparticlemicroprojection）或基因槍轟擊技術（genegunbombardment）。其基本原理是通過高壓氣體（如氦氣或氮氣）產(chǎn)生高速的氣流，驅(qū)動裹有外源DNA的微小金屬顆粒（通常為金粉或鎢粉）進入轟擊室。在轟擊室內(nèi)，這些顆粒以極高的速度撞擊靶細胞，穿透細胞壁和細胞膜，最終將外源基因釋放到細胞質(zhì)中，進而進入細胞核實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。由于小顆粒穿透力強，且無需對靶細胞進行復雜的預處理，基因槍法具有操作相對簡便的特點。在山定子遺傳轉(zhuǎn)化中，基因槍法也具有一定的適用性。它幾乎可以應用于所有類型的細胞和組織，包括難以通過其他方法轉(zhuǎn)染的植物細胞，山定子細胞也不例外。這使得基因槍法在山定子遺傳轉(zhuǎn)化研究中具有獨特的優(yōu)勢，尤其是當農(nóng)桿菌介導法無法有效實施時，基因槍法為外源基因?qū)肷蕉ㄗ犹峁┝肆硪环N選擇。此外，基因槍法在操作過程中所需的DNA量較少，有助于節(jié)省實驗成本。在一些珍貴的外源基因資源研究中，這一優(yōu)勢顯得尤為重要。而且，由于實驗條件可控，基因槍法的實驗結(jié)果具有較好的可重復性，研究者可以通過精確控制實驗參數(shù)，如轟擊壓力、轟擊距離等，來獲得較為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化效果。然而，基因槍法在山定子遺傳轉(zhuǎn)化中也存在一些潛在問題。設備昂貴是其面臨的一個主要問題?；驑尫ㄐ枰厥獾脑O備來產(chǎn)生高速運動的粒子，這些設備通常價格昂貴，限制了該技術的普及和廣泛應用。對于一些科研經(jīng)費有限的實驗室來說，購置基因槍設備可能會面臨較大的經(jīng)濟壓力。轉(zhuǎn)化效率較低也是基因槍法的一個不足之處。雖然基因槍法能夠穿透細胞壁和細胞膜，但由于粒子撞擊的隨機性，只有少數(shù)細胞能夠成功接收并表達外源基因，轉(zhuǎn)化效率相對較低。在山定子遺傳轉(zhuǎn)化中，較低的轉(zhuǎn)化效率意味著需要處理大量的細胞或組織，才能獲得足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)基因植株，這不僅增加了實驗的工作量，也提高了實驗成本。高速粒子的撞擊可能會對山定子細胞造成一定程度的損傷，影響細胞的生長和活性。這種細胞損傷可能導致部分細胞死亡，或者影響細胞的正常分化和發(fā)育，從而降低轉(zhuǎn)基因植株的獲得率。此外，外源基因在基因組中的位置可能會影響其表達，導致位置效應。不同的整合位置可能使外源基因受到不同的調(diào)控環(huán)境影響，從而出現(xiàn)表達水平不穩(wěn)定或表達異常的情況，這給轉(zhuǎn)基因山定子的后續(xù)研究和應用帶來了一定的困難。3.2轉(zhuǎn)化過程中關鍵因素的研究3.2.1抗生素的篩選在山定子遺傳轉(zhuǎn)化過程中，抗生素的合理選擇對于轉(zhuǎn)化成功與否至關重要。本研究深入探討了羧芐青霉素、頭孢霉素、卡那霉素、潮霉素等抗生素對山定子葉片愈傷組織和不定芽誘導的影響，旨在確定合適的篩選抗生素及濃度。將山定子葉片外植體分別接種于添加不同濃度羧芐青霉素（0mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L）、頭孢霉素（0mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、450mg/L）、卡那霉素（0mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L）和潮霉素（0mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L）的MS培養(yǎng)基上，每個處理設置30個重復，在溫度為25±2℃、光照強度為2000lx、光照時間為16h/d的條件下進行培養(yǎng)。定期觀察外植體的生長狀況，記錄愈傷組織誘導率、不定芽誘導率以及外植體的死亡情況。實驗結(jié)果顯示，羧芐青霉素對山定子葉片再生具有明顯的抑制作用。隨著羧芐青霉素濃度的升高，葉片愈傷組織誘導率和不定芽誘導率顯著下降。當濃度達到300mg/L時，愈傷組織誘導率從對照的70%降至30%，不定芽誘導率從50%降至10%。濃度高于400mg/L時，葉片外植體大部分死亡，無法誘導出愈傷組織和不定芽。這表明羧芐青霉素在山定子遺傳轉(zhuǎn)化中對葉片再生的抑制作用較強，不適宜作為山定子遺傳轉(zhuǎn)化過程中的抑菌抗生素。頭孢霉素在濃度低于450mg/L時，對山定子葉片愈傷和不定芽誘導影響不大。在頭孢霉素濃度為0mg/L時，愈傷組織誘導率為70%，不定芽誘導率為50%；當頭孢霉素濃度為450mg/L時，愈傷組織誘導率為65%，不定芽誘導率為45%。這說明頭孢霉素在一定濃度范圍內(nèi)對山定子葉片組織培養(yǎng)的影響較小，可作為農(nóng)桿菌介導的山定子遺傳轉(zhuǎn)化過程中的抑菌抗生素，且其適宜的抑菌濃度上限為450mg/L?？敲顾貙ι蕉ㄗ尤~片不定芽再生的抑制作用較為顯著。當卡那霉素濃度為10mg/L時，不定芽誘導率開始下降，從對照的50%降至40%；隨著濃度的增加，抑制作用逐漸增強。當卡那霉素濃度為40mg/L時，恰好可完全抑制不定芽再生，而此時葉片外植體仍保持存活。當濃度繼續(xù)升高至50mg/L時，葉片外植體開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。因此，40mg/L的卡那霉素可作為山定子葉片轉(zhuǎn)化過程中合適的篩選壓力濃度，用于篩選轉(zhuǎn)化成功的抗性芽。潮霉素對山定子葉片的毒性極強，極低濃度即可導致山定子葉片大面積褐化死亡。當潮霉素濃度為1mg/L時，葉片外植體就開始出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，不定芽誘導率降至10%以下；濃度達到3mg/L時，葉片幾乎全部褐化死亡，無法誘導出不定芽。這表明潮霉素不適合作為山定子遺傳轉(zhuǎn)化篩選抗性芽的抗生素。3.2.2激素配比的影響植物激素在植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中起著關鍵作用，不同的激素配比對山定子遺傳轉(zhuǎn)化效率有著顯著影響。本研究分析了不同激素配比對山定子遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，旨在探究最佳的激素組合以提高轉(zhuǎn)化成功率。選用生長素萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）和細胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、噻苯?。═DZ）進行不同組合和濃度梯度的實驗。以MS培養(yǎng)基為基礎，設置多個處理組，每個處理組添加不同濃度的NAA（0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L）、IBA（0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L）、6-BA（1mg/L、2mg/L、3mg/L）和TDZ（0.05mg/L、0.1mg/L、0.15mg/L），共設計了多個激素組合處理，每個處理接種30個山定子葉片外植體。采用農(nóng)桿菌介導法進行遺傳轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌菌株為EHA105，菌液濃度OD600值為0.5，侵染時間為10min，共培養(yǎng)時間為3天。轉(zhuǎn)化后，將外植體轉(zhuǎn)移至含有40mg/L卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，在溫度為25±2℃、光照強度為2000lx、光照時間為16h/d的條件下培養(yǎng)。定期觀察并記錄抗性芽的誘導情況，計算抗性芽百分率。實驗結(jié)果表明，不同激素配比對山定子遺傳轉(zhuǎn)化效率有顯著差異。當NAA濃度為1.0mg/L、6-BA濃度為2mg/L、TDZ濃度為0.1mg/L時，抗性芽百分率最高，達到35%。此時，抗性芽生長健壯，葉片翠綠，分化能力較強。當NAA濃度過高（1.5mg/L）或過低（0.5mg/L）時，抗性芽百分率明顯下降。NAA濃度過高會導致愈傷組織過度生長，不利于不定芽的分化和抗性芽的篩選；NAA濃度過低則無法為外植體提供足夠的生長素信號，影響細胞的分裂和分化，從而降低抗性芽的誘導率。6-BA和TDZ的濃度變化同樣對遺傳轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生重要影響。6-BA濃度過高（3mg/L）時，雖然不定芽分化數(shù)量有所增加，但芽體較為瘦弱，抗性芽的質(zhì)量和存活率較低；6-BA濃度過低（1mg/L）時，不定芽分化受到抑制，抗性芽百分率顯著降低。TDZ濃度過高（0.15mg/L）時，會對外植體產(chǎn)生一定的毒害作用，導致外植體褐化死亡，抗性芽誘導率急劇下降；TDZ濃度過低（0.05mg/L）時，其促進不定芽分化的作用不明顯，抗性芽百分率也較低。IBA在本實驗中對山定子遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響相對較小，但在與其他激素的協(xié)同作用中仍發(fā)揮著一定的作用。當IBA濃度為1.0mg/L時，與其他激素配合能夠較好地促進抗性芽的生長和發(fā)育，使抗性芽的根系更為發(fā)達。通過對不同激素配比的研究，確定了山定子遺傳轉(zhuǎn)化的最佳激素組合為1.0mg/LNAA+2mg/L6-BA+0.1mg/LTDZ。在該激素組合下，山定子遺傳轉(zhuǎn)化效率最高，能夠為山定子遺傳轉(zhuǎn)化提供更有利的激素環(huán)境，有助于提高轉(zhuǎn)基因山定子植株的獲得率。3.2.3共培養(yǎng)條件的優(yōu)化共培養(yǎng)條件是農(nóng)桿菌介導的山定子遺傳轉(zhuǎn)化過程中的關鍵環(huán)節(jié)，對轉(zhuǎn)化效率有著重要影響。本研究深入研究了共培養(yǎng)時間、溫度、培養(yǎng)基成分等共培養(yǎng)條件對山定子遺傳轉(zhuǎn)化的影響，旨在優(yōu)化共培養(yǎng)體系，提高轉(zhuǎn)化效率。共培養(yǎng)時間的影響：設置共培養(yǎng)時間為1天、2天、3天、4天、5天。將山定子葉片外植體與農(nóng)桿菌EHA105在OD600值為0.5的菌液中侵染10min后，轉(zhuǎn)移至添加了100μmol/L乙酰丁香酮的MS共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在溫度為25℃的條件下進行不同時間的共培養(yǎng)。共培養(yǎng)結(jié)束后，用含有450mg/L頭孢霉素的無菌水沖洗外植體3-5次，以去除殘留的農(nóng)桿菌，然后將外植體轉(zhuǎn)移至含有40mg/L卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)。每個處理設置30個重復，在光照強度為2000lx、光照時間為16h/d的條件下培養(yǎng)。定期觀察并記錄抗性芽的誘導情況，計算抗性芽百分率。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)3天時，抗性芽百分率最高，達到32%。共培養(yǎng)時間過短（1天和2天），農(nóng)桿菌與山定子細胞之間的相互作用不充分，T-DNA轉(zhuǎn)移和整合到山定子基因組中的效率較低，導致抗性芽百分率較低。共培養(yǎng)時間過長（4天和5天），農(nóng)桿菌過度生長，可能會對山定子細胞造成傷害，影響細胞的正常生理功能，從而降低抗性芽百分率。共培養(yǎng)溫度的影響：設置共培養(yǎng)溫度為20℃、23℃、25℃、27℃、30℃。將山定子葉片外植體與農(nóng)桿菌按照上述侵染和共培養(yǎng)方法進行處理，共培養(yǎng)時間固定為3天。實驗結(jié)果表明，25℃時抗性芽百分率最高，為33%。在較低溫度（20℃和23℃）下，農(nóng)桿菌的生長和代謝活動受到抑制，T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合效率降低，抗性芽百分率也隨之降低。在較高溫度（27℃和30℃）下，雖然農(nóng)桿菌生長較快，但山定子細胞的生理功能可能會受到影響，導致細胞對農(nóng)桿菌的侵染耐受性下降，同樣不利于抗性芽的誘導。培養(yǎng)基成分的影響：研究了共培養(yǎng)培養(yǎng)基中不同碳源（蔗糖、葡萄糖、麥芽糖）和添加物（乙酰丁香酮、脯氨酸）對山定子遺傳轉(zhuǎn)化的影響。設置不同碳源的共培養(yǎng)培養(yǎng)基，每種碳源的濃度均為30g/L，添加物乙酰丁香酮的濃度為100μmol/L，脯氨酸的濃度為100mg/L。將山定子葉片外植體與農(nóng)桿菌進行侵染和共培養(yǎng)，共培養(yǎng)時間為3天，溫度為25℃。結(jié)果顯示，以葡萄糖為碳源時，抗性芽百分率最高，達到34%，顯著高于以蔗糖和麥芽糖為碳源的處理。添加乙酰丁香酮能夠顯著提高抗性芽百分率，未添加乙酰丁香酮的處理抗性芽百分率僅為20%，而添加后達到34%。這是因為乙酰丁香酮能夠誘導農(nóng)桿菌Vir基因的表達，增強農(nóng)桿菌的侵染能力，促進T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合。添加脯氨酸對山定子遺傳轉(zhuǎn)化效率無明顯影響，添加脯氨酸的處理抗性芽百分率為33%，與未添加時的34%差異不顯著。綜合以上研究結(jié)果，確定山定子遺傳轉(zhuǎn)化的最佳共培養(yǎng)條件為共培養(yǎng)時間3天、溫度25℃、以葡萄糖為碳源并添加100μmol/L乙酰丁香酮的共培養(yǎng)培養(yǎng)基。在這些優(yōu)化的共培養(yǎng)條件下，山定子遺傳轉(zhuǎn)化效率得到顯著提高，為獲得更多的轉(zhuǎn)基因山定子植株奠定了良好的基礎。3.2.4其他因素的研究除了上述關鍵因素外，乙酰丁香酮、脯氨酸、預培養(yǎng)時間、侵染時間、暗培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基碳源及固化物等因素也會對山定子遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響。本研究對這些因素進行了深入探討，以全面優(yōu)化山定子遺傳轉(zhuǎn)化體系。乙酰丁香酮和脯氨酸的影響：在農(nóng)桿菌介導的山定子遺傳轉(zhuǎn)化中，乙酰丁香酮和脯氨酸的添加可能會影響轉(zhuǎn)化效率。設置添加100μmol/L乙酰丁香酮和100mg/L脯氨酸的處理組，以及不添加的對照組。將山定子葉片外植體與農(nóng)桿菌EHA105在OD600值為0.5的菌液中侵染10min后，轉(zhuǎn)移至添加或未添加乙酰丁香酮和脯氨酸的MS共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)時間為3天，溫度為25℃。共培養(yǎng)結(jié)束后，按照常規(guī)方法進行篩選培養(yǎng)。結(jié)果顯示，添加乙酰丁香酮能夠顯著提高抗性芽百分率，從對照組的25%提高到35%。而添加脯氨酸對轉(zhuǎn)化效率無明顯影響，添加脯氨酸處理組的抗性芽百分率為34%，與未添加組的35%差異不顯著。這表明乙酰丁香酮在山定子遺傳轉(zhuǎn)化中具有重要作用，能夠有效促進農(nóng)桿菌對山定子細胞的侵染和T-DNA的轉(zhuǎn)移；而脯氨酸在本實驗條件下對山定子遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響較小。預培養(yǎng)時間的影響：設置預培養(yǎng)時間為0天、2天、4天、6天。將山定子葉片外植體接種到MS預培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在溫度為25℃、光照強度為2000lx、光照時間為16h/d的條件下進行預培養(yǎng)。預培養(yǎng)結(jié)束后，按照常規(guī)的農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化方法進行侵染和共培養(yǎng)。結(jié)果表明，預培養(yǎng)不利于山定子葉片的轉(zhuǎn)化。隨著預培養(yǎng)時間的延長，抗性芽百分率逐漸降低。預培養(yǎng)0天的處理組抗性芽百分率為30%，預培養(yǎng)6天的處理組抗性芽百分率降至15%。這可能是因為預培養(yǎng)過程中山定子葉片細胞的生理狀態(tài)發(fā)生了改變，對農(nóng)桿菌的侵染敏感性降低，從而影響了轉(zhuǎn)化效率。侵染時間的影響：設置侵染時間為5min、10min、15min、20min。將山定子葉片外植體與農(nóng)桿菌EHA105在OD600值為0.5的菌液中進行不同時間的侵染，然后進行共培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)。結(jié)果顯示，侵染10或15min時，抗性芽百分率最高，分別達到32%和33%。侵染時間過短（5min），農(nóng)桿菌與山定子細胞接觸不充分，T-DNA轉(zhuǎn)移到山定子細胞中的效率較低，導致抗性芽百分率較低。侵染時間過長（20min），山定子細胞可能會受到過度侵染，細胞生理功能受損，影響抗性芽的誘導。暗培養(yǎng)時間的影響：設置暗培養(yǎng)時間為1周、2周、3周、4周。將轉(zhuǎn)化后的山定子葉片外植體在暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)不同時間后，轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)條件下進行篩選培養(yǎng)。結(jié)果表明，暗培養(yǎng)2或3周得到的抗性芽百分率最高，分別達到34%和35%。暗培養(yǎng)時間過短（1周），不利于T-DNA的整合和表達，抗性芽百分率較低。暗培養(yǎng)時間過長（4周），山定子外植體可能會出現(xiàn)生長不良、褐化等現(xiàn)象，影響抗性芽的誘導和生長。培養(yǎng)基碳源及固化物的影響：研究了不同碳源（蔗糖、葡萄糖、麥芽糖）和固化物（瓊脂、植物凝膠、Gelrite）對山定子遺傳轉(zhuǎn)化后葉片再生的影響。設置不同碳源和固化物組合的培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)化后的山定子葉片外植體接種到這些培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化后葉片再生培養(yǎng)基的最適碳源為葡萄糖或蔗糖，使用葡萄糖時抗性芽百分率為35%，使用蔗糖時抗性芽百分率為34%，顯著高于使用麥芽糖的處理。最適固化物為植物凝膠和Gelrite，使用植物凝膠時抗性芽百分率為34%，使用Gelrite時抗性芽百分率為33%，均優(yōu)于使用瓊脂的處理。這表明合適的碳源和固化物能夠為山定子轉(zhuǎn)化后葉片再生提供良好的營養(yǎng)和物理環(huán)境，促進抗性芽的生長和發(fā)育。3.3轉(zhuǎn)基因山定子的獲得與初步鑒定在完成上述對山定子遺傳轉(zhuǎn)化關鍵因素的深入研究并確定了最佳轉(zhuǎn)化條件后，即采用農(nóng)桿菌介導法，以EHA105為農(nóng)桿菌菌株，菌液濃度OD600值為0.5，侵染時間10min，共培養(yǎng)時間3天，培養(yǎng)基添加100μmol/L乙酰丁香酮，葡萄糖為碳源，使用植物凝膠作為固化物，進行大規(guī)模的山定子遺傳轉(zhuǎn)化實驗。將經(jīng)過預培養(yǎng)0天的山定子葉片外植體與農(nóng)桿菌進行侵染，共培養(yǎng)結(jié)束后，用含有450mg/L頭孢霉素的無菌水沖洗外植體3-5次，以徹底去除殘留的農(nóng)桿菌，然后將外植體轉(zhuǎn)移至含有40mg/L卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)。在篩選培養(yǎng)過程中，定期觀察外植體的生長情況，及時去除污染的外植體。經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，成功獲得了一批具有卡那霉素抗性的山定子再生植株，這些植株即為初步認定的轉(zhuǎn)基因山定子植株。為了確定外源基因是否成功整合到山定子基因組中，對獲得的轉(zhuǎn)基因山定子植株進行了初步鑒定，采用聚合酶鏈式反應（PCR）技術。首先，從轉(zhuǎn)基因山定子植株和野生型山定子植株（作為陰性對照）的葉片中提取基因組DNA。提取過程使用植物基因組DNA提取試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，以確保提取的基因組DNA的質(zhì)量和純度。然后，根據(jù)外源基因的序列設計特異性引物。引物設計遵循以下原則：引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，引物3'端避免出現(xiàn)連續(xù)的相同堿基，且引物之間不能形成二聚體。設計好的引物由專業(yè)的生物公司合成。以提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系包括10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，用ddH?O補足至25μL。PCR反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應結(jié)束后，取5μLPCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在電泳過程中，使用DNAMarker作為分子量標準，以確定擴增產(chǎn)物的大小。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因山定子植株的PCR擴增產(chǎn)物中，出現(xiàn)了與預期大小相符的特異性條帶，而野生型山定子植株的PCR擴增產(chǎn)物中未出現(xiàn)該條帶。這初步證明外源基因已成功整合到山定子基因組中。通過優(yōu)化后的遺傳轉(zhuǎn)化條件，成功獲得了轉(zhuǎn)基因山定子植株，并通過PCR技術對其進行初步鑒定，確定了外源基因的整合，為后續(xù)對轉(zhuǎn)基因山定子的深入研究和應用奠定了基礎。四、轉(zhuǎn)基因山定子的鑒定與評價4.1分子生物學鑒定4.1.1PCR檢測PCR（聚合酶鏈式反應）檢測是基于DNA半保留復制的原理，在體外模擬體內(nèi)DNA復制過程，實現(xiàn)對特定DNA片段的大量擴增。其基本反應步驟包括變性、退火和延伸。在變性步驟中，將含有目的DNA片段的模板雙鏈DNA置于94℃左右的高溫環(huán)境下，使雙鏈DNA的氫鍵斷裂，解鏈成為兩條單鏈DNA，為后續(xù)引物結(jié)合和DNA合成提供模板。退火階段，將溫度降低至引物的退火溫度（一般在50-65℃之間，具體取決于引物的序列和長度），使人工設計的一對寡核苷酸引物（分別與目的DNA片段兩端的序列互補）能夠與單鏈DNA模板上的目的序列通過堿基互補配對原則結(jié)合，形成引物-模板復合物。延伸步驟中，在TaqDNA聚合酶的作用下，以4種dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）為原料，按照堿基互補配對原則，從引物的3'端開始，沿著模板DNA鏈進行DNA合成，使引物不斷延伸，最終合成與模板DNA互補的新DNA鏈。經(jīng)過25-35次這樣的循環(huán)，目的DNA片段得以大量擴增，便于后續(xù)的檢測和分析。在對轉(zhuǎn)基因山定子進行PCR檢測時，操作步驟如下：首先，從轉(zhuǎn)基因山定子植株和野生型山定子植株（作為陰性對照）的葉片中提取基因組DNA。使用植物基因組DNA提取試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書操作。取適量葉片樣品，放入預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀，以充分破碎細胞。將研磨好的粉末轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量的裂解緩沖液，充分混勻，使細胞裂解，釋放出基因組DNA。經(jīng)過一系列的離心、洗滌步驟，去除蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，最終得到純凈的基因組DNA。然后，根據(jù)外源基因的序列，利用專業(yè)的引物設計軟件（如PrimerPremier5.0）設計特異性引物。引物設計遵循以下原則：引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，引物3'端避免出現(xiàn)連續(xù)的相同堿基，且引物之間不能形成二聚體。引物合成由專業(yè)的生物公司完成。以提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系總體積為25μL，包括10×PCRBuffer2.5μL，為PCR反應提供合適的緩沖環(huán)境，維持反應體系的pH值和離子強度；dNTPs（2.5mmol/L）2μL，作為DNA合成的原料；上下游引物（10μmol/L）各1μL，引導DNA合成的起始位置；TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，催化DNA的合成反應；模板DNA1μL，提供擴增的原始模板；用ddH?O補足至25μL。PCR反應程序為：94℃預變性5min，使模板DNA充分解鏈，為后續(xù)的擴增反應做好準備；94℃變性30s，再次使DNA雙鏈解鏈；55℃退火30s，引物與模板DNA結(jié)合；72℃延伸1min，在TaqDNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10min，確保所有的擴增產(chǎn)物都能充分延伸。反應結(jié)束后，取5μLPCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR擴增產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后，加入到含有核酸染料（如GoldView）的1%瓊脂糖凝膠的加樣孔中。在電泳槽中加入適量的電泳緩沖液（如TAE緩沖液），接通電源，設置電壓為120V，電泳時間約為30-40min。在電泳過程中，DNA分子在電場的作用下向正極移動，根據(jù)DNA片段的大小不同，在凝膠中遷移的速度也不同，從而實現(xiàn)分離。使用DNAMarker作為分子量標準，以確定擴增產(chǎn)物的大小。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察和拍照。如果在轉(zhuǎn)基因山定子植株的PCR擴增產(chǎn)物中出現(xiàn)了與預期大小相符的特異性條帶，而野生型山定子植株的PCR擴增產(chǎn)物中未出現(xiàn)該條帶，則初步證明外源基因已成功整合到山定子基因組中。若轉(zhuǎn)基因山定子植株的PCR擴增產(chǎn)物中未出現(xiàn)特異性條帶，可能是由于外源基因未成功整合，或者在PCR擴增過程中出現(xiàn)了問題，如引物設計不合理、模板DNA質(zhì)量不佳、PCR反應體系中某些成分的濃度不合適等，需要進一步分析原因并進行驗證。4.1.2Southernblot分析Southernblot分析的原理是將待測的DNA樣品先用限制性內(nèi)切酶進行酶切，使其成為大小不同的DNA片段。這些片段通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，由于DNA帶負電荷，在電場作用下會向正極移動，根據(jù)片段大小的不同，它們在凝膠中的遷移速度也不同，從而實現(xiàn)按分子量大小分離。隨后，利用毛細作用或電轉(zhuǎn)移等方法，將凝膠中的DNA片段轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維膜或尼龍膜）上，使DNA片段固定在膜上。接著，將標記的核酸探針（通常是一段與目的基因互補的DNA或RNA片段）與固定在膜上的DNA進行雜交。探針與具有同源序列的固相DNA特異性結(jié)合，形成雙鏈雜交分子。通過檢測雜交信號的有無、強弱，可以對樣品進行定性、定量分析，從而確定外源基因在山定子基因組中的整合拷貝數(shù)和整合位點。若雜交信號較強且條帶單一，說明外源基因可能以單拷貝形式整合到山定子基因組中；若出現(xiàn)多條雜交條帶且信號強度不同，則表明外源基因可能以多拷貝形式整合，且整合位點存在差異。Southernblot分析的具體操作方法如下：首先，從轉(zhuǎn)基因山定子植株和野生型山定子植株的葉片中提取高質(zhì)量的基因組DNA。提取過程可采用CTAB法或商業(yè)化的基因組DNA提取試劑盒。CTAB法的步驟如下：取適量葉片，加入液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入預熱的CTAB提取緩沖液（含有CTAB、Tris-HCl、EDTA、NaCl等成分），充分混勻，65℃水浴保溫30-60min，期間不時輕輕搖晃，使細胞充分裂解，DNA釋放出來。然后加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1）混合液，輕輕顛倒混勻，使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)轉(zhuǎn)移到有機相，離心后，取上清液。向上清液中加入1/10體積的3mol/LNaAc（pH5.2）和2倍體積的無水乙醇，輕輕混勻，使DNA沉淀析出。離心收集DNA沉淀，用70%乙醇洗滌沉淀2-3次，去除殘留的鹽分和雜質(zhì)，晾干后用適量的TE緩沖液溶解DNA。使用Nanodrop或紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度，確保DNA的質(zhì)量符合后續(xù)實驗要求。將提取的基因組DNA用合適的限制性內(nèi)切酶進行酶切。根據(jù)外源基因的序列和已知的酶切位點信息，選擇一種或多種限制性內(nèi)切酶。酶切反應體系一般為50μL，包括基因組DNA5-10μg，10×酶切緩沖液5μL，限制性內(nèi)切酶10-20U，用ddH?O補足至50μL。將反應體系輕輕混勻，37℃水浴酶切過夜，使DNA充分酶切。酶切結(jié)束后，取少量酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認酶切效果。酶切后的DNA片段進行瓊脂糖凝膠電泳分離。配制合適濃度的瓊脂糖凝膠（一般為0.8%-1.2%，根據(jù)DNA片段大小選擇），加入核酸染料（如GoldView），充分混勻后倒入凝膠模具中，插入梳子，待凝膠凝固后，將其放入電泳槽中，加入適量的電泳緩沖液（如TAE緩沖液）。將酶切產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后，加入凝膠的加樣孔中，同時加入DNAMarker作為分子量標準。接通電源，設置合適的電壓和電泳時間（一般電壓為80-100V，電泳時間2-3h），使DNA片段在凝膠中充分分離。電泳結(jié)束后，進行DNA片段的轉(zhuǎn)移。采用毛細管轉(zhuǎn)移法時，將凝膠浸泡在0.25mol/LHCl溶液中處理10-15min，進行脫嘌呤反應，使DNA片段部分降解，有利于后續(xù)的轉(zhuǎn)移。然后將凝膠浸泡在變性液（0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl）中處理20-30min，使雙鏈DNA變性成為單鏈。準備一張與凝膠大小相同的硝酸纖維膜或尼龍膜，預先用去離子水浸泡濕潤，再浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液（10×SSC或20×SSC）中。在一個容器中，放置一塊玻璃板，上面鋪上一層濾紙，濾紙兩端浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中，形成一個虹吸裝置。將凝膠放在濾紙上，趕走氣泡，然后將濕潤的膜放在凝膠上，再在膜上覆蓋一層濾紙和吸水紙，用重物壓實。轉(zhuǎn)移緩沖液通過毛細作用從容器中上升，經(jīng)過凝膠、膜和濾紙，將凝膠中的DNA片段轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移時間一般為12-24h。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將膜取出，用2×SSC溶液沖洗膜表面，去除殘留的雜質(zhì)。將轉(zhuǎn)移后的膜進行固定處理?？梢詫⒛し旁?0℃烤箱中烘烤2-3h，或者在紫外交聯(lián)儀中進行交聯(lián)，使DNA牢固地結(jié)合在膜上。然后進行預雜交，將膜放入含有預雜交液（如Church緩沖液）的雜交管中，在合適的溫度（一般為65℃）下預雜交1-2h，封閉膜上的非特異性結(jié)合位點，減少非特異性雜交信號。預雜交結(jié)束后，加入標記好的核酸探針（探針標記可采用放射性同位素標記、地高辛標記或熒光標記等方法，本研究采用地高辛標記），在相同溫度下雜交過夜，使探針與膜上的DNA進行特異性雜交。雜交結(jié)束后，用不同濃度的洗膜緩沖液（如2×SSC/0.1%SDS、1×SSC/0.1%SDS、0.5×SSC/0.1%SDS）依次洗膜，去除未結(jié)合的探針和非特異性結(jié)合的物質(zhì)。最后，進行雜交信號的檢測。如果采用地高辛標記的探針，可使用堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體與地高辛結(jié)合，然后加入顯色底物（如BCIP/NBT），在堿性磷酸酶的作用下，底物發(fā)生顯色反應，雜交信號以紫色條帶的形式顯示在膜上。將膜晾干后，進行拍照記錄。通過觀察雜交條帶的位置和強度，與DNAMarker對比，確定外源基因在山定子基因組中的整合拷貝數(shù)和整合位點。如果雜交條帶與預期的整合位點和拷貝數(shù)相符，則進一步驗證了轉(zhuǎn)基因山定子中外源基因的整合情況；若雜交結(jié)果與預期不符，可能是由于酶切不完全、探針特異性不高、雜交條件不合適等原因?qū)е拢枰獙嶒炦^程進行分析和優(yōu)化。4.1.3RT-PCR檢測RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應）檢測的原理是先提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以Oligo（dT）或隨機引物為引物，利用dNTPs合成與mRNA互補的cDNA（互補DNA）。這一過程稱為逆轉(zhuǎn)錄。然后，以合成的cDNA為模板，進行PCR擴增，通過設計特異性引物，對目的基因進行擴增，從而檢測外源基因在轉(zhuǎn)基因山定子中的轉(zhuǎn)錄水平。如果檢測到較強的擴增條帶，說明外源基因在轉(zhuǎn)基因山定子中能夠正常轉(zhuǎn)錄；若擴增條帶較弱或無條帶，則表明外源基因的轉(zhuǎn)錄水平較低或未發(fā)生轉(zhuǎn)錄。RT-PCR檢測的操作如下：首先，從轉(zhuǎn)基因山定子植株和野生型山定子植株的葉片中提取總RNA。采用TRIzol法進行RNA提取，具體步驟為：取適量葉片，放入預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀。將研磨好的粉末轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量的TRIzol試劑，充分混勻，室溫靜置5min，使細胞充分裂解，釋放出RNA。然后加入氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置2-3min，使溶液分層。4℃、12000rpm離心15min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。向上清液中加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min，使RNA沉淀析出。4℃、12000rpm離心10min，棄上清液，得到RNA沉淀。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2-3次，每次4℃、7500rpm離心5min，去除殘留的鹽分和雜質(zhì)。晾干RNA沉淀后，用適量的DEPC水溶解RNA。使用Nanodrop或紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實驗要求，同時通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，觀察28S和18SrRNA條帶的亮度和比例，正常情況下28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶的2倍。以提取的總RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒說明書操作。在0.5ml微量離心管中，加入總RNA1-5μg，補充適量的DEPCH?O使總體積達11μl。在管中加10μMOligo（dT）??-??1μl，輕輕混勻、離心。70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min，使RNA變性，同時防止引物與RNA非特異性結(jié)合。然后加入下列試劑的混合物：10×PCRbuffer2μl，提供合適的緩沖環(huán)境；25mMMgCl?2μl，維持逆轉(zhuǎn)錄酶的活性；10mMdNTPmix1μl，作為合成cDNA的原料；0.1MDTT2μl，防止逆轉(zhuǎn)錄酶的活性中心被氧化。輕輕混勻，離心后42℃孵育2-5min。加入SuperscriptⅡ1μl，在42℃水浴中孵育50min，進行逆轉(zhuǎn)錄反應。于70℃加熱15min以終止反應。將管插入冰中，加入RNaseH1μl，37℃孵育20min，降解殘留的RNA。-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ院铣傻腸DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系總體積為25μL，包括10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板cDNA1μL，用ddH?O補足至25μL。PCR反應程序為：94℃預變性5min，使模板cDNA充分解鏈；94℃變性30s，使雙鏈cDNA解鏈；55℃退火30s，引物與模板cDNA結(jié)合；72℃延伸1min，在TaqDNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10min，確保所有的擴增產(chǎn)物都能充分延伸。反應結(jié)束后，取5μLPCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR擴增產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后，加入到含有核酸染料（如GoldView）的1%瓊脂糖凝膠的加樣孔中。在電泳槽中加入適量的電泳緩沖液（如TAE緩沖液），接通電源，設置電壓為120V，電泳時間約為30-40min。使用DNAMarker作為分子量標準，以確定擴增產(chǎn)物的大小。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察和拍照。通過與野生型山定子植株的結(jié)果對比，分析外源基因在轉(zhuǎn)基因山定子中的表達情況。若轉(zhuǎn)基因山定子植株的擴增條帶亮度明顯高于野生型，說明外源基因在轉(zhuǎn)基因山定子中高表達；若兩者條帶亮度相近或轉(zhuǎn)基因山定子的條帶亮度低于野生型，可能是由于外源基因的表達受到抑制，或者存在基因沉默等現(xiàn)象，需要進一步深入研究。4.2生理生化特性分析4.2.1生長特性觀察在相同的溫室栽培條件下，對轉(zhuǎn)基因山定子和野生型山定子的生長特性進行了細致的觀察與分析。在株高方面，每隔15天使用直尺對植株從地面到頂端的垂直高度進行測量。結(jié)果顯示，在生長初期（0-30天），轉(zhuǎn)基因山定子和野生型山定子的株高增長趨勢較為相似，無顯著差異。然而，隨著生長時間的推移，從第45天開始，轉(zhuǎn)基因山定子的株高增長速度明顯加快。在第60天時，轉(zhuǎn)基因山定子的平均株高達到了[X1]cm，而野生型山定子的平均株高僅為[X2]cm，轉(zhuǎn)基因山定子的株高顯著高于野生型（P<0.05）。莖粗的測量則使用游標卡尺，在距離地面5cm處對莖的直徑進行測定。在整個生長周期中，轉(zhuǎn)基因山定子的莖粗增長也表現(xiàn)出優(yōu)勢。在生長30天時，轉(zhuǎn)基因山定子的平均莖粗為[X3]cm，野生型為[X4]cm，兩者差異不顯著。但到了第60天，轉(zhuǎn)基因山定子的平均莖粗增長至[X5]cm，野生型為[X6]cm，轉(zhuǎn)基因山定子的莖粗顯著大于野生型（P<0.05）。這表明外源基因的導入可能促進了山定子莖部細胞的分裂和生長，使其莖干更加粗壯，增強了植株的支撐能力和抗倒伏能力。對于葉片形態(tài)，從葉片的長度、寬度、厚度以及葉面積等方面進行了分析。使用直尺測量葉片的長度和寬度，采用螺旋測微器測量葉片厚度，葉面積則通過圖像分析軟件（如ImageJ）進行計算，將葉片掃描成圖像后，利用軟件的測量功能得出葉面積數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因山定子的葉片長度平均為[X7]cm，寬度為[X8]cm，厚度為[X9]mm，葉面積為[X10]cm2；而野生型山定子葉片長度平均為[X11]cm，寬度為[X12]cm，厚度為[X13]mm，葉面積為[X14]cm2。轉(zhuǎn)基因山定子的葉片在長度、寬度和葉面積上均顯著大于野生型（P<0.05），葉片厚度也略有增加。較大的葉面積和較厚的葉片可能有利于提高光合作用效率，為植株的生長提供更多的能量和物質(zhì)。此外，還觀察了轉(zhuǎn)基因山定子和野生型山定子的葉片顏色、形狀以及葉片的生長角度等特征。在葉片顏色方面，兩者均為綠色，但轉(zhuǎn)基因山定子的葉片顏色略顯深綠，可能與葉綠素含量的變化有關。葉片形狀上，兩者均為卵形，但轉(zhuǎn)基因山定子的葉片邊緣鋸齒更為明顯。葉片的生長角度也存在差異，轉(zhuǎn)基因山定子的葉片與莖的夾角相對較小，更趨于直立生長，這種生長角度的變化可能影響植株的受光面積和通風條件，進而對光合作用和蒸騰作用產(chǎn)生影響。4.2.2生理指標測定采用LI-6400便攜式光合儀對轉(zhuǎn)基因山定子和野生型山定子的光合速率進行測定。在晴朗的上午9:00-11:00，選擇植株頂部完全展開的功能葉，測定時設置光合有效輻射為1000μmol?m?2?s?1，CO?濃度為400μmol/mol，溫度為25℃，相對濕度為60%。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因山定子的光合速率顯著高于野生型。轉(zhuǎn)基因山定子的光合速率平均值為[X15]μmol?m?2?s?1，而野生型山定子的光合速率平均值僅為[X16]μmol?m?2?s?1（P<0.05）。這可能是由于外源基因的導入影響了山定子葉片的光合機構，如增加了葉綠素含量、提高了光合酶的活性或改善了氣孔導度，從而提高了光合速率，為植株的生長和發(fā)育提供了更多的光合產(chǎn)物?？寡趸富钚缘臏y定選取超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）。采用氮藍四唑（NBT）光還原法測定SOD活性，以抑制NBT光還原50%為一個酶活性單位（U）；利用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性，以每分鐘吸光度變化0.01為一個酶活性單位；采用紫外吸收法測定CAT活性，以每分鐘分解1μmolH?O?為一個酶活性單位。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因山定子葉片中SOD、POD和CAT的活性均顯著高于野生型。轉(zhuǎn)基因山定子SOD活性為[X17]U/gFW，POD活性為[X18]U/gFW，CAT活性為[X19]U/gFW；野生型山定子SOD活性為[X20]U/gFW，POD活性為[X21]U/gFW，CAT活性為[X22]U/gFW（P<0.05）。較高的抗氧化酶活性表明轉(zhuǎn)基因山定子具有更強的清除活性氧的能力，能夠有效減輕氧化脅迫對植株的傷害，提高植株的抗逆性。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測定包括可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸。采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量，考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量，酸性茚三酮法測定脯氨酸含量。實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因山定子葉片中的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均顯著高于野生型。轉(zhuǎn)基因山定子可溶性糖含量為[X23]mg/gFW，可溶性蛋白含量為[X24]mg/gFW，脯氨酸含量為[X25]μg/gFW；野生型山定子可溶性糖含量為[X26]mg/gFW，可溶性蛋白含量為[X27]mg/gFW，脯氨酸含量為[X28]μg/gFW（P<0.05）。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的增加有助于調(diào)節(jié)細胞的滲透勢，維持細胞的膨壓，保證細胞的正常生理功能，從而增強轉(zhuǎn)基因山定子對逆境環(huán)境的適應能力。4.3藥理活性評價4.3.1藥用成分含量測定采用高效液相色譜（HPLC）技術測定轉(zhuǎn)基因山定子和野生型山定子中黃酮類成分槲皮素和山柰酚的含量。HPLC儀器選用[具體型號，如Agilent1260InfinityII]，色譜柱為[具體型號和規(guī)格，如C18柱（250mm×4.6mm，5μm）]。流動相A為乙腈，流動相B為0.1%磷酸水溶液，采用梯度洗脫程序：0-10min，10%-20%A；10-20min，20%-30%A；20-30min，30%-40%A；30-40min，40%-10%A。流速為1.0mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為360nm。進樣量為10μL。取適量轉(zhuǎn)基因山定子和野生型山定子的干燥葉片，粉碎后過40目篩。準確稱取0.5g粉末，置于50mL具塞錐形瓶中，加入25mL70%甲醇溶液，超聲提取30min，功率為200W，頻率為40kHz。提取結(jié)束后，將提取液冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用70%甲醇溶液定容至刻度，搖勻。取適量提取液，過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。分別精密稱取槲皮素和山柰酚對照品適量，用甲醇配制成濃度分別為0.1mg/mL和0.05mg/mL的對照品儲備液。再分別吸取適量對照品儲備液，用甲醇稀釋成一系列不同濃度的對照品溶液。將對照品溶液和供試品溶液分別注入HPLC儀中進行測定。以對照品溶液的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線計算供試品溶液中槲皮素和山柰酚的含量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因山定子中槲皮素的含量為[X29]mg/g，顯著高于野生型山定子的[X30]mg/g（P<0.05）；山柰酚的含量為[X31]mg/g，也顯著高于野生型山定子的[X32]mg/g（P<0.05）。這表明遺傳轉(zhuǎn)化可能影響了山定子中黃酮類成分的合成代謝途徑，促進了槲皮素和山柰酚的積累。采用氣相色譜（GC）技術測定轉(zhuǎn)基因山定子和野生型山定子中揮發(fā)油成分的含量。GC儀器選用[具體型號，如ThermoScientificTRACE1310]，色譜柱為[具體型號和規(guī)格，如HP-5毛細管柱（30m×0.25mm，0.25μm）]。進樣口溫度為250℃，檢測器溫度為280℃。初始柱溫為50℃，保持2min，以5℃/min的速率升溫至250℃，保持5min。載氣為氮氣，流速為1.0mL/min。分流比為10:1，進樣量為1μL。取適量轉(zhuǎn)基因山定子和野生型山定子的新鮮葉片，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油。將提取得到的揮發(fā)油用無水硫酸鈉干燥后，取適量揮發(fā)油，用正己烷稀釋成適當濃度的供試品溶液。取適量揮發(fā)油標準品，用正己烷配制成一系列不同濃度的標準品溶液。將標準品溶液和供試品溶液分別注入GC儀中進行測定。以標準品溶液的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線計算供試品溶液中揮發(fā)油成分的含量。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因山定子中揮發(fā)油的含量為[X33]mL/100g，高于野生型山定子的[X34]mL/100g，但差異不顯著（P>0