PAGE1生物技術(shù)藥品分析方法研究現(xiàn)狀生物制藥包括通過(guò)直接分離和純化生物獲得的生化藥物，以及通過(guò)基因重組技術(shù)或其他生物技術(shù)開(kāi)發(fā)的生物技術(shù)藥物和生物制品。由于生物制藥具有毒性低，副作用小，易吸收，以及多種生物活性和功能，因此在疾病預(yù)防，診斷和治療方面具有突出的作用。隨著人們對(duì)生命和身體健康的關(guān)注度的提高，生物制藥的研究和開(kāi)發(fā)不斷增加，生物制藥的質(zhì)量得到控制，藥物分析和檢測(cè)技術(shù)也越來(lái)越受到關(guān)注。本文將分析和比較生物制藥鑒定，測(cè)試和含量測(cè)定方法，并討論近年來(lái)新方法，新技術(shù)和生物技術(shù)的進(jìn)展和應(yīng)用前景。一、生物藥物分析方法生物制藥分析主要包括化學(xué)方法，儀器分析方法和生物測(cè)定。1、化學(xué)方法化學(xué)方法可分為重量法和滴定法兩種。重量法是通過(guò)稱取一定重量的供試品，根據(jù)待測(cè)物經(jīng)處理后分離出的與待測(cè)組相關(guān)的單質(zhì)或化合物的重量，計(jì)算出該物質(zhì)在供試品中含量的定量方法。而滴定法是實(shí)驗(yàn)室中用來(lái)對(duì)藥物進(jìn)行滴定分析的一種常用方法。目前，氨基酸類藥物和糖類藥物多應(yīng)用滴定法進(jìn)行含量測(cè)定。用化學(xué)方法對(duì)藥物進(jìn)行含量測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確度較高，缺點(diǎn)是操作相對(duì)復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。2、儀器分析方法儀器分析方法用于高靈敏度痕量和痕量分析。主要包括光學(xué)法，電化學(xué)法，色譜法，電泳法，酶法，免疫分析法。（1）光學(xué)法通常用于生物藥物分析的光學(xué)分析方法包括紫外/可見(jiàn)分光光度法，熒光法，紅外吸收分光光度法，核磁共振法和質(zhì)譜法。紫外/可見(jiàn)分光光度法：主要使用一組特定的生物聚合物吸收特定波長(zhǎng)的光，或者特定的特殊基團(tuán)與特定的化學(xué)試劑反應(yīng)形成穩(wěn)定的顏色，以吸收光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度為特征。并進(jìn)行定量分析。物質(zhì)。紫外/可見(jiàn)分光光度法因其設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低，操作簡(jiǎn)單，易于涂抹而廣泛應(yīng)用于藥物分析。測(cè)量的藥物包括蛋白質(zhì)多肽類、維生素類酶類、抗生素類、和卟啉類。然而，UV/Vis分光光度法的靈敏度不高，通常為10-4至10-7g/mL。熒光：在吸收能量，定性和定量分析物質(zhì)后，使用特定波長(zhǎng)發(fā)出特定波長(zhǎng)的特定基團(tuán)。近年來(lái)，使鑭系元素光敏化的方法已廣泛用于氨基酸，肽，蛋白質(zhì)，核酸，核苷酸，脫氧核苷酸等的分析和藥代動(dòng)力學(xué)。熒光是靈敏，準(zhǔn)確，選擇性的，并且具有許多熒光特征參數(shù)。動(dòng)態(tài)線性范圍寬，靈敏度比分光光度法高2到4個(gè)數(shù)量級(jí)。敏感和準(zhǔn)確的藥物測(cè)試具有顯著的優(yōu)勢(shì)。激光誘導(dǎo)熒光光譜的靈敏度已達(dá)到10-22g，可以檢測(cè)單個(gè)分子和癌癥的早期診斷。熒光法作為一種結(jié)合其他技術(shù)的高靈敏度分析方法具有更廣闊的發(fā)展前景。紅外光譜主要用于鑒定生物制藥和分析中國(guó)藥典中的有效成分。近紅外光譜是目前紅外分析的熱點(diǎn)。大光譜信息，出色的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，無(wú)需樣品制備。沒(méi)有化學(xué)廢物污染或其他好處。在制藥生產(chǎn)過(guò)程中，產(chǎn)品質(zhì)量可以在整個(gè)生產(chǎn)周期中進(jìn)行監(jiān)控，但21世紀(jì)具有極好的應(yīng)用前景。核磁共振光譜法是確定生物聚合物結(jié)構(gòu)的有效方法。二維和三維核磁共振光譜應(yīng)用于生物技術(shù)中蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)分析。質(zhì)譜法用于確定基因工程藥物多肽，蛋白質(zhì)和核酸的分子量和結(jié)構(gòu)和序列。（2）色譜法色譜法是使用物理或物理化學(xué)性質(zhì)分離和分析混合物的方法。薄層色譜是藥物色譜領(lǐng)域的關(guān)鍵領(lǐng)域之一，這是一種定性和半定量方法，在自動(dòng)化，分辨率和再現(xiàn)性方面不如氣體和高效液相色譜法。薄層色譜主要用于藥物的鑒定和雜質(zhì)檢測(cè)，如氨基酸藥物（絲氨酸，亮氨酸，甘氨酸），酶（抑肽酶），蛋白質(zhì)肽（bac細(xì)菌），萜類化合物（硫唑嘌呤）等。近年來(lái)，薄層色譜技術(shù)引入了重要的流動(dòng)技術(shù)，可以再現(xiàn)薄層，為標(biāo)準(zhǔn)化，測(cè)量和自動(dòng)化帶來(lái)顯著改進(jìn)，包括自動(dòng)點(diǎn)樣設(shè)備，自動(dòng)可編程多擴(kuò)展設(shè)備和薄層掃描儀等應(yīng)用，準(zhǔn)確性得到了很大提高。氣相色譜（GC）：氣相色譜是一種常用的分析工具，用于含有揮發(fā)性成分的藥物。在美國(guó)藥典中檢測(cè)諸如氨基酸的藥物中的有機(jī)揮發(fā)性雜質(zhì)是通過(guò)氣相色譜法進(jìn)行的。人們?cè)絹?lái)越關(guān)注殘留在藥物中的有機(jī)溶劑的毒性和致癌作用。用于測(cè)量藥物中殘留有機(jī)溶劑的氣相色譜法也是一個(gè)顯著的研究方向。GC-MS-SIM可用于測(cè)量藥物濃度在10-9和10-12g/mL之間的體液樣本。這在藥物分析和體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究中具有重要的優(yōu)點(diǎn)。高效液相色譜（HPLC）：HPLC具有高壓，高速，高效和高靈敏度。它在生物制藥鑒定，檢測(cè)和內(nèi)容分析中發(fā)揮著重要作用。衍生化技術(shù)的發(fā)展提高了測(cè)試物質(zhì)的檢測(cè)特性，提高了檢測(cè)靈敏度。HPLC廣泛用于氨基酸分析。HPLC也是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和純度分析，英國(guó)藥典和美國(guó)藥典胰島素的重要工具。通過(guò)HPLC方法鑒定相關(guān)蛋白質(zhì)和滴度測(cè)量和極限測(cè)定。HPLC僅用于鑒定中國(guó)藥典。對(duì)于類固醇藥物甲氨蝶呤，葉酸和糖，HPLC用于內(nèi)容分析。近年來(lái)，使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的檢測(cè)器的發(fā)展擴(kuò)展了對(duì)不吸收近紫外光的藥物的分析。二極管陣列和熒光檢測(cè)器應(yīng)用提供了靈敏，快速和有效的方法。HPLC用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器直接檢測(cè)衍生的氨基酸。分離和定量HPLC檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)到ng水平，回收率為94％。液相色譜和質(zhì)譜越來(lái)越多地用于生物聚合物，體內(nèi)藥物代謝和臨床藥物測(cè)試。多維色譜LC-LC-MS，LC-LC-LC-LC-MS-MS等用于藥物和蛋白質(zhì)。肽結(jié)構(gòu)測(cè)定和整體操作的完全自動(dòng)化是21世紀(jì)色譜分析的發(fā)展方向之一。由于樣品和流動(dòng)相的消耗，微柱液相色譜顯著降低了檢測(cè)靈敏度，具有廣闊的發(fā)展前景。超臨界流體色譜（SFC）：用于分析超臨界流體作為流動(dòng)相的色譜技術(shù)。適用于低熱穩(wěn)定性，高極性和低揮發(fā)性的藥物分析。它是補(bǔ)充GC和HPLC的重要技術(shù)。對(duì)于激素，抗生素和成癮藥物的分析，SFC僅使用CO2作為物質(zhì)，例如流動(dòng)相分離結(jié)構(gòu)，并用于測(cè)量含有多個(gè)極性基團(tuán)的分子組的尿液中的咖啡因和激素，在分析分子量高達(dá)440的抗菌素時(shí)不需要衍生化，可以直接注入樣品中。使用諸如Bagman的SFC研究了一系列光選擇性抗蝕劑的分離和分析?；诜肿幽Ｐ?，提出了手性識(shí)別機(jī)制。超臨界流體色譜是一種環(huán)境友好的分析方法，使用很少或不使用有機(jī)溶劑。（3）電泳法電泳法是基于物理和化學(xué)分離分析的基本方法，以及生物材料分離的常規(guī)分析方法。醋酸纖維薄膜電泳用于常規(guī)血清蛋白、脂蛋白的分離和定量測(cè)定；聚丙稀酰胺凝膠電泳用于胰島素有關(guān)蛋白質(zhì)的檢查、基因工程藥物DNA的分離回收；瓊脂糖凝膠電泳具有較大的凝膠孔徑，特別適合于分離和鑒別核酸和核蛋白。高效毛細(xì)管電泳（HPCE）是近年來(lái)發(fā)展迅速的新型分離分析方法，在生物大分子的分析方面具有許多優(yōu)勢(shì)。根據(jù)分離模式分為：毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）基于各被分離物質(zhì)的凈電荷與質(zhì)量比之間的差異，不同離子按各自表面電荷密度的差異，以不同的速度在電解質(zhì)中移動(dòng)而致分離。適用于蛋白質(zhì)、氨基酸、肽、對(duì)映體的分析，膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC）通過(guò)將離子表面活性劑加入電解質(zhì)溶液，形成膠束，使溶質(zhì)在膠束相和水相之間分配，將分配與電動(dòng)相結(jié)合，不僅能分離離子型物質(zhì)，也能分離電中性物質(zhì)；毛細(xì)管等電聚焦電泳（CIEF）將傳統(tǒng)的等電聚焦過(guò)程移到毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行，多用于蛋白質(zhì)，肽類物質(zhì)的分析。毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)是以凝膠作支持物進(jìn)行的區(qū)帶電泳可分離測(cè)定蛋白質(zhì)和DNA等大分子化合物。毛細(xì)管電色譜(CEC)，多用于水溶性差的物質(zhì)和水中難進(jìn)行反應(yīng)的物質(zhì)的分析。高效毛細(xì)管電泳兼有電泳和色譜技術(shù)的雙重優(yōu)點(diǎn)，對(duì)基因工程藥物的分析具有高效、低耗、快速、靈敏等特點(diǎn)，隨著各種不同的預(yù)濃縮技術(shù)、堆積技術(shù)、場(chǎng)放大技術(shù)、固相預(yù)柱等技術(shù)以及新分離模式毛細(xì)管電色譜等的應(yīng)用，儀器的不斷改進(jìn)，高效毛細(xì)管電泳將成為生物藥物分析的重要工具。（4）電化學(xué)法電化學(xué)法是利用物質(zhì)電化學(xué)性質(zhì)根據(jù)電參量的大小確定待測(cè)物含量的分析方法。電位滴定法仍是氨基酸和嘌啉類藥物的常用分析方法。目前微電極、超微電極、化學(xué)修飾電極的研究和應(yīng)用是電化學(xué)分析領(lǐng)域中較為活躍的研究方向，如用聚吲哚乙酸修飾電極測(cè)定腎上腺素等。電化學(xué)檢測(cè)器因靈敏度高，選擇性好，應(yīng)用于毛細(xì)管電泳和微柱液相色譜。（5）酶法分析利用酶試劑作為工具測(cè)定物質(zhì)量的方法。酶法分析具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，與其它紫外、熒光、電化學(xué)或免疫方法聯(lián)用可用于酶的活性分析以及與酶作用的底物或產(chǎn)物的分析以及抗體藥物的效價(jià)測(cè)定。（6）免疫分析免疫分析方法是以特異性抗原－抗體的反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法。免疫分析技術(shù)和放射性核素示蹤技術(shù)、酶促反應(yīng)或熒光分析等高靈敏度的分析技術(shù)相結(jié)合，具有高特異性和高靈敏度的特點(diǎn)，特別適合測(cè)定復(fù)雜體系中的微量組分，以及藥物生產(chǎn)中發(fā)酵液或細(xì)胞培養(yǎng)液中有效成分的快速測(cè)定。如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)用于基因工程藥品中微量致敏性雜質(zhì)青霉噻唑蛋白的測(cè)定，胰島素有關(guān)蛋白的檢查等。免疫分析技術(shù)與色譜的聯(lián)用，利用色譜技術(shù)對(duì)藥物、激素等分子間微小差別的高識(shí)別性，可提高免疫分析的選擇性與靈敏度。3、生物檢定法利用藥物對(duì)生物體或離體器官所起的生物活性作用的強(qiáng)弱而進(jìn)行定量分析的一種方法，可用于藥物的雜質(zhì)檢查、有害物的毒性測(cè)定和藥物的效價(jià)測(cè)定。我國(guó)藥典（1995）對(duì)肝素、絨促性素、縮宮素、胰島素等均采用生物檢定法進(jìn)行效價(jià)的測(cè)定。生物檢定法一般與藥物的活性、藥效密切相關(guān)，結(jié)果較為直觀，但使用動(dòng)物量較多，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，影響因素多，精密度差，現(xiàn)正逐步被理化方法所取代。二、新方法和新技術(shù)應(yīng)用最近幾年,單克隆抗體免疫分析技術(shù)及基因分析技術(shù)等現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用于生物藥物的分析,大大提高了方法的檢測(cè)限度和靈敏度。如用基因雜交技術(shù),可以分析藥品中1PG水平的外源DNA,從而保證了用藥的安全可靠。隨著生物藥物研究的不斷深入,分析技術(shù)也在不斷更新,高效毛細(xì)管電泳等現(xiàn)代分析技術(shù)的應(yīng)用更加廣泛。1、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)隨著任技術(shù)的不斷發(fā)展,逐漸出現(xiàn)了非水毛細(xì)管電泳(NACE)、毛細(xì)管陳列電泳(CAE)等分支。HPLC是一種高效的分離分析方法,但HPCE的理論塔板數(shù)比HPLC高1-2個(gè)數(shù)量級(jí),分離效果高2-3倍。任的靈敏度很高,所需樣品極少,分析時(shí)間短,只需少量緩沖液。從分離機(jī)理上看,CE和RP-HPI無(wú)是互補(bǔ)的兩項(xiàng)技術(shù)。HPCE用于蛋白質(zhì)類生物藥物的分離,分離效果好且具有更高的自動(dòng)化程度并使樣品分析微量化。親和毛細(xì)管電泳(ACE)既可用于藥物手性體的分離,也可用于藥物篩選。2、生物傳感器生物傳感器(Biosensors)又稱生物電極,現(xiàn)己開(kāi)發(fā)出如酶?jìng)鞲衅?、免疫傳感器等多種,利用發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光免疫傳感器正在開(kāi)發(fā)和試驗(yàn)中。該分析技術(shù)已在生物藥物分析中應(yīng)用的有應(yīng)用特異性反應(yīng)的測(cè)定、應(yīng)用生物催化反應(yīng)的測(cè)定等。3、二維核磁共振譜(2D-NMR)利用2D-NM嘆技術(shù),結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬,可以測(cè)定生物大分子在溶液中的三維空間結(jié)構(gòu)、研究蛋白質(zhì)折疊機(jī)制及動(dòng)力學(xué)過(guò)程、酶催化過(guò)程、蛋白質(zhì)和核酸的相互作用、藥物同受體的相互作用等。近年來(lái)ZD-NMR還用于研究系列定位突變體的結(jié)構(gòu)和功能變化等。4、基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜(MALDI)20世紀(jì)80年代末期,MALDI作為一種新的質(zhì)譜軟電離技術(shù),解決了非揮發(fā)性熱不穩(wěn)定的生物大分子的質(zhì)譜離子化問(wèn)題,使質(zhì)譜法伍侶)在測(cè)定生物大分子方面成為最有發(fā)展前途的工具之一。MALDI技術(shù)不僅能在低于10-12mol的樣品條件下和復(fù)雜混合物中準(zhǔn)確測(cè)定大分子化合物,而且與生物化學(xué)方法結(jié)合,通過(guò)對(duì)酶解或化學(xué)降解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析,提供結(jié)構(gòu)信息,確證多膚與蛋白質(zhì)等的一級(jí)結(jié)構(gòu);隨著研究的不斷深入,MALDI-MS在多膚與蛋白質(zhì)、低聚核昔酸、寡糖、糖結(jié)合物及合成高分子等方面獲得了廣泛應(yīng)用,其靈敏度和測(cè)量準(zhǔn)確度遠(yuǎn)高于常規(guī)的生化方法。5、新色譜分析法主要的有超壓薄層色譜法(OPLC)、膠束色譜（MC）及微柱液相色譜等。微柱液相色譜很容易和其它儀器一起使用,在多方面得到應(yīng)用,但目前主要應(yīng)用于生物分析、神經(jīng)科學(xué)和膚及蛋白質(zhì)的分析。生物樣品和膚及蛋白質(zhì)的分析大多把微柱液相色譜和質(zhì)譜甚至與串聯(lián)質(zhì)譜一起使用。三、發(fā)展趨勢(shì)目前,國(guó)外對(duì)生物技術(shù)藥物的分析,由于其來(lái)源的特殊性、復(fù)雜性以及異軍突起的驚人速度,到目前為止,還沒(méi)有形成一種較為理想的分析方法,但主要的分析方法有酶分析法、電泳分析法、免疫分析法等近20種。而體內(nèi)藥物分析研究,趨向于采用在線的聯(lián)用微透析分析技術(shù),如在線微透析一毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(on-lineMD/CE)、液相色譜一質(zhì)譜(LC/MS)聯(lián)用等。我國(guó)在實(shí)現(xiàn)了“八五”和“九五”期間的基礎(chǔ)研究發(fā)展戰(zhàn)略目標(biāo)后,生物藥物分析學(xué)科整體水平較以往有長(zhǎng)足的進(jìn)步,用于生物藥物分析的現(xiàn)代技術(shù)和方法日益增多,所用儀器類型日趨先進(jìn)。尤其是色譜及其各種聯(lián)用分析技術(shù)的應(yīng)用在生物藥物分析中所占比例愈來(lái)愈大,使常規(guī)生物藥物分析方法更加準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便和自動(dòng)化;對(duì)生物藥物的體內(nèi)分析方法更加趨向于靈敏、微量、專屬和快速;應(yīng)用研究水平發(fā)展迅速。目前,高效液相色譜(HPLC)、毛細(xì)管電泳(CE)、免疫分析法已成為體內(nèi)藥物分析的主要手段,與世界先進(jìn)水平相近。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDITOFMS)對(duì)大分子藥物特別是當(dāng)前基因工程藥物的應(yīng)用,迅速有效。從近年來(lái)生物藥物分析的研究報(bào)道來(lái)看，HPLC已經(jīng)成為大部分的生物藥物的常規(guī)分析方法，而CE因其本身不可比擬的優(yōu)勢(shì)，在生物藥物分析方面的應(yīng)用日益增多，是未來(lái)生物藥物發(fā)展的新趨勢(shì)。目前，生物藥物分析與檢測(cè)技術(shù)仍屬處于發(fā)展中的新技術(shù)，在實(shí)踐操作中仍存在諸多問(wèn)題，需要不斷地進(jìn)行完善和改進(jìn)，有待于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和探索。從近年來(lái)關(guān)于生物藥物分析的研究報(bào)道中可以看出，高效液相色譜法（HPLC）在生物藥物分析等方面的應(yīng)用日益增多，已逐漸成為大部分生物藥物的常規(guī)檢測(cè)分析方法。生物藥物分析與檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)主要有以下幾個(gè)方面：①通過(guò)應(yīng)用基因工程技術(shù)，制取天然來(lái)源較少或過(guò)去難以獲得的生物活性物質(zhì)。②應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)研制新型蛋白質(zhì)類藥物。③通過(guò)應(yīng)用生物工程技術(shù)，制取大分子物質(zhì)活性片段。④發(fā)展新劑型大分子藥物。四、結(jié)論近年來(lái)，隨著人