嵌合犬細(xì)小病毒VP2基因的狂犬病病毒：特性解析與應(yīng)用探索一、引言1.1研究背景狂犬病病毒（Rabiesvirus,RABV）隸屬彈狀病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒屬（Lyssavirus），是一種極為兇險(xiǎn)的病毒，可感染幾乎所有溫血哺乳動(dòng)物，進(jìn)而引發(fā)急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。一旦發(fā)病，病死率近乎100%，給公眾健康帶來了極大的威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球每年約有5.9萬人死于狂犬病，其中95%的病例來自非洲、亞洲等發(fā)展中國家。在我國，狂犬病同樣是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，盡管近年來發(fā)病數(shù)和死亡人數(shù)呈下降趨勢，但由于犬只數(shù)量眾多且免疫覆蓋率參差不齊，狂犬病的防控形勢依然嚴(yán)峻。犬細(xì)小病毒（Canineparvovirus,CPV）屬于細(xì)小病毒科（Parvoviridae）細(xì)小病毒屬（Parvovirus），主要感染幼齡犬，是一種具有高傳染性和高致死率的病毒。1978年，犬細(xì)小病毒首次在澳大利亞和美國被發(fā)現(xiàn)，隨后迅速在全球范圍內(nèi)傳播。該病毒在短時(shí)間潛伏期后，會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的出血性胃腸炎癥狀，以白細(xì)胞顯著減少為臨床特征，給養(yǎng)犬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。感染犬細(xì)小病毒的幼犬，不僅治療費(fèi)用高昂，而且治愈率較低，這讓眾多寵物主人承受著經(jīng)濟(jì)和情感的雙重打擊。對于養(yǎng)犬者而言，同時(shí)預(yù)防狂犬病和犬細(xì)小病毒病是至關(guān)重要的。然而，傳統(tǒng)的疫苗接種方式需要分別針對兩種病毒進(jìn)行免疫，這不僅增加了接種的次數(shù)和成本，還可能給犬只帶來更多的應(yīng)激反應(yīng)。因此，開發(fā)一種能夠同時(shí)預(yù)防狂犬病和犬細(xì)小病毒病的聯(lián)合疫苗具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。近年來，隨著反向遺傳技術(shù)的不斷發(fā)展，通過對病毒基因組進(jìn)行改造，構(gòu)建嵌合病毒疫苗成為了疫苗研發(fā)的新方向。本研究旨在運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，在狂犬病病毒基因組中插入犬細(xì)小病毒VP2基因，拯救獲得嵌合狂犬病病毒，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行深入研究，為開發(fā)高效的狂犬病和犬細(xì)小病毒病二聯(lián)疫苗奠定基礎(chǔ)。1.2研究目的和意義本研究旨在運(yùn)用反向遺傳技術(shù)，在狂犬病病毒基因組中精準(zhǔn)插入犬細(xì)小病毒VP2基因，成功拯救獲得嵌合狂犬病病毒，并深入探究其生物學(xué)特性。通過對嵌合病毒在細(xì)胞水平上的生長特性、遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究，明確VP2基因的插入是否影響狂犬病病毒自身的復(fù)制和增殖，以及嵌合病毒在連續(xù)傳代過程中是否能穩(wěn)定表達(dá)VP2蛋白。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面，評估嵌合病毒對動(dòng)物的免疫原性，確定其能否誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對狂犬病病毒和犬細(xì)小病毒的特異性免疫應(yīng)答，為后續(xù)疫苗的開發(fā)提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)支持。本研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。從理論角度來看，深入了解嵌合狂犬病病毒的生物學(xué)特性，有助于揭示不同病毒基因之間的相互作用機(jī)制，豐富病毒分子生物學(xué)的理論知識(shí)，為病毒基因工程的研究提供新的思路和方法。在實(shí)際應(yīng)用方面，開發(fā)狂犬病和犬細(xì)小病毒病二聯(lián)疫苗具有顯著的優(yōu)勢。一方面，減少了犬只接種疫苗的次數(shù)，降低了養(yǎng)殖成本和人力成本，提高了疫苗接種的便利性和依從性；另一方面，降低了因多次接種疫苗給犬只帶來的應(yīng)激反應(yīng)，有利于犬只的健康和福利。這對于養(yǎng)犬業(yè)的健康發(fā)展以及寵物犬的疾病防控具有重要的推動(dòng)作用，有望為狂犬病和犬細(xì)小病毒病的防控提供更加高效、便捷的解決方案。二、狂犬病病毒與犬細(xì)小病毒概述2.1狂犬病病毒狂犬病病毒隸屬彈狀病毒科狂犬病毒屬，是一種嗜神經(jīng)性病毒。其形態(tài)獨(dú)特，形似子彈狀，一端鈍圓，另一端扁平，直徑約75-80nm，長度約170-180nm。病毒粒子結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)依次為包膜、間質(zhì)蛋白和核衣殼。包膜由外層糖蛋白G和內(nèi)層基質(zhì)蛋白M2組成，表面有由糖蛋白G構(gòu)成的棘狀凸起，這些棘突在病毒感染過程中起著關(guān)鍵作用，它們能夠與宿主細(xì)胞表面的受體相互作用，介導(dǎo)病毒的吸附與侵入。內(nèi)層的間質(zhì)蛋白則在維持病毒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。中央的緊密螺旋狀核衣殼，是由單鏈RNA、核蛋白、大蛋白和磷酸化蛋白組成，其中單鏈RNA攜帶了病毒的遺傳信息，是病毒復(fù)制和遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)?？袢〔《镜幕蚪M為不分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA（-SSRNA），總長約12kb。從3'到5'端依次為先導(dǎo)序列、編碼N、P/M1、M2、G、L蛋白的5個(gè)結(jié)構(gòu)基因以及非編碼區(qū)，各個(gè)基因間含有非編碼的間隔序列。這5種結(jié)構(gòu)蛋白各自承擔(dān)著重要功能：N蛋白作為核蛋白，能夠緊密包裹病毒RNA，對病毒RNA起到保護(hù)作用，使其免受外界核酸酶的降解，同時(shí)在病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用；P/M1蛋白構(gòu)成病毒衣殼，參與維持病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)；M2蛋白是病毒包膜的組成成分，對病毒的出芽和釋放過程至關(guān)重要；L蛋白是RNA依賴的RNA聚合酶，在病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中，負(fù)責(zé)催化合成病毒的mRNA和子代病毒的基因組RNA；G蛋白構(gòu)成病毒包膜的糖蛋白刺突，不僅決定了病毒的感染性，即病毒能否成功吸附并侵入宿主細(xì)胞，還與病毒的血凝性和毒力密切相關(guān)，其抗原性也是狂犬病疫苗研發(fā)和免疫診斷的重要靶點(diǎn)?？袢〔《镜膹?fù)制過程主要在感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行。首先，病毒包膜表面的糖蛋白G與神經(jīng)細(xì)胞表面的乙酰膽堿受體（AChR）特異性結(jié)合，這一特異性識(shí)別過程是病毒感染的起始步驟，如同“鑰匙”與“鎖”的匹配，確保了病毒能夠精準(zhǔn)地吸附到靶細(xì)胞上。隨后，吸附病毒部位的細(xì)胞膜內(nèi)陷，將病毒包裹并穿入細(xì)胞，接著通過膜融合以及脫衣殼的過程，病毒核酸被釋放至細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，病毒的單負(fù)鏈RNA開始發(fā)揮模板作用，分別指導(dǎo)病毒基因的mRNA轉(zhuǎn)錄以及N、P/M1、M2、G和L蛋白的合成。同時(shí)，病毒還會(huì)合成互補(bǔ)正鏈RNA，該正鏈RNA作為模板用于復(fù)制子代病毒的單負(fù)鏈RNA。最后，新合成的病毒單負(fù)鏈RNA與N、P/M1和L蛋白質(zhì)裝配成核衣殼，以出芽的形式釋放出病毒顆粒，在出芽過程中，病毒顆粒同時(shí)獲得包含G蛋白和M2蛋白的病毒包膜，至此完成了一個(gè)完整的病毒復(fù)制周期?？袢〔《镜闹虏C(jī)制較為復(fù)雜。當(dāng)病毒通過動(dòng)物咬傷或密切接觸等途徑進(jìn)入人體后，首先在傷口附近的肌細(xì)胞小量增殖，一般可在局部停留3天或更久，然后入侵人體近處的末梢神經(jīng)。病毒以較快的速度沿神經(jīng)的軸突向中樞神經(jīng)作向心性擴(kuò)展，至脊髓的背根神經(jīng)節(jié)大量繁殖，入侵脊髓并很快到達(dá)腦部，主要侵犯腦干、小腦等處的神經(jīng)細(xì)胞。在中樞神經(jīng)細(xì)胞中，病毒大量復(fù)制，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能受損和死亡，引發(fā)一系列嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如恐水、呼吸困難、痙攣、麻痹等。隨著病情的發(fā)展，病毒又從中樞神經(jīng)向周圍神經(jīng)擴(kuò)散，侵入各器官組織，尤以唾液腺、舌部味蕾、嗅神經(jīng)上皮等部位的病毒量較多，從而使病毒能夠通過唾液排出體外，繼續(xù)傳播給其他宿主。一旦狂犬病發(fā)病，病死率近乎100%，這主要是由于目前臨床上尚無有效的治療方法能夠徹底清除體內(nèi)的病毒，同時(shí)病毒對神經(jīng)系統(tǒng)造成的損傷往往是不可逆的。2.2犬細(xì)小病毒犬細(xì)小病毒（Canineparvovirus,CPV）屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，是一種單鏈DNA病毒，其病毒粒子呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，無囊膜，直徑約為20-26nm。這種小巧的病毒卻蘊(yùn)含著巨大的破壞力，它對環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力，在寒冷、干燥的環(huán)境中可存活數(shù)月之久，普通的消毒劑難以將其徹底殺滅，這使得它能夠在犬只生活的環(huán)境中廣泛傳播。犬細(xì)小病毒的基因組約為5.2kb，主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2和結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2。其中，VP2基因是病毒基因組的關(guān)鍵部分，與病毒的抗原決定位點(diǎn)密切相關(guān)。VP2基因全長1755bp，編碼584個(gè)氨基酸。VP2蛋白在病毒粒子中含量最為豐富，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白和免疫原性蛋白，在病毒的感染、裝配以及誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它不僅決定了病毒的宿主范圍和抗原特異性，還參與病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合，介導(dǎo)病毒的入侵過程。當(dāng)病毒感染犬只時(shí)，VP2蛋白作為主要的抗原物質(zhì)，能夠刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體，這些抗體可以識(shí)別并結(jié)合病毒，從而阻止病毒的進(jìn)一步感染和擴(kuò)散。犬細(xì)小病毒主要感染幼犬，尤其是2-6月齡的幼犬最為易感。病毒可通過直接接觸感染犬的糞便、嘔吐物、唾液等分泌物，或間接接觸被病毒污染的食物、水、器具等途徑傳播。一旦病毒進(jìn)入犬只體內(nèi)，會(huì)迅速在小腸上皮細(xì)胞內(nèi)大量增殖，導(dǎo)致小腸黏膜受損，引發(fā)一系列嚴(yán)重的臨床癥狀。感染初期，病犬通常會(huì)出現(xiàn)精神沉郁、食欲不振、嘔吐等癥狀，嘔吐物最初為食物，隨后可能發(fā)展為黏液狀黃綠色液體，呈頑固性嘔吐，導(dǎo)致病犬體液大量流失。隨著病情的發(fā)展，病犬會(huì)出現(xiàn)劇烈腹瀉，糞便初期為稀粥狀，后逐漸變?yōu)樗畼痈篂a，顏色呈咖啡色或番茄醬色，帶有特殊的腥臭味，這是由于腸道黏膜出血、壞死所致。嚴(yán)重的腹瀉會(huì)導(dǎo)致病犬脫水、電解質(zhì)紊亂，出現(xiàn)眼球凹陷、鼻干、全身無力、體重明顯下降等癥狀。此外，病犬還可能出現(xiàn)貧血癥狀，表現(xiàn)為結(jié)膜蒼白，血常規(guī)檢查可見紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白、比容減少，白細(xì)胞減少，白細(xì)胞數(shù)量可低至正常犬的10%-40%。如果不及時(shí)治療，病犬最終可能因脫水、休克、敗血癥等原因而死亡，死亡率可高達(dá)50%-90%。犬細(xì)小病毒病不僅給養(yǎng)犬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也給犬只的健康和生命安全帶來了嚴(yán)重威脅。三、嵌合狂犬病病毒的構(gòu)建3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法本研究所需的細(xì)胞為BHK-21細(xì)胞（倉鼠腎細(xì)胞），其具有生長迅速、易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，常用于病毒的增殖和研究。將BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，維持細(xì)胞的良好生長狀態(tài)，為后續(xù)病毒的拯救和培養(yǎng)提供充足的細(xì)胞來源。選用狂犬病病毒弱毒株SRV9作為病毒株，該毒株具有良好的免疫原性且毒力較弱，是構(gòu)建嵌合病毒的理想親本毒株。實(shí)驗(yàn)所用的質(zhì)粒包括含有狂犬病病毒SRV9株全基因組的pSRV9質(zhì)粒，以及含有犬細(xì)小病毒VP2基因的pMD18-T-VP2質(zhì)粒。工具酶方面，用到了限制性內(nèi)切酶NheⅠ、BamHⅠ（Takara公司），這些酶能夠識(shí)別并切割特定的DNA序列，為后續(xù)基因的插入和重組提供了便利。T4DNA連接酶（NEB公司）則在基因片段連接過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它能夠催化DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，將不同的基因片段連接成完整的重組質(zhì)粒。PrimeSTARHSDNA聚合酶（Takara公司）用于基因擴(kuò)增，其具有高保真、高效率的特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出目的基因，減少擴(kuò)增過程中的堿基錯(cuò)配?；驍U(kuò)增的具體步驟如下：以pMD18-T-VP2質(zhì)粒為模板，根據(jù)犬細(xì)小病毒VP2基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物兩端分別引入NheⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。引物序列為：上游引物5'-CCGCTAGCATGAGTGACATCAAGCTG-3'，下游引物5'-CGGGATCCTTAGGCGTCCACAGCCAT-3'。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括5×PrimeSTARBuffer10μL，dNTPs（2.5mM）4μL，上下游引物（10μM）各1μL，pMD18-T-VP2質(zhì)粒模板1μL，PrimeSTARHSDNA聚合酶1μL，ddH?O32μL。反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，在紫外燈下觀察到預(yù)期大小約1755bp的條帶，表明VP2基因擴(kuò)增成功。重組質(zhì)粒構(gòu)建過程如下：將擴(kuò)增得到的VP2基因片段和pSRV9質(zhì)粒分別用NheⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切體系均為20μL，包括10×Buffer2μL，DNA5μL，限制性內(nèi)切酶各1μL，ddH?O11μL。37℃酶切3h后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，并使用膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的VP2基因片段和pSRV9質(zhì)粒酶切片段按照摩爾比3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系為10μL，包括10×T4DNALigaseBuffer1μL，回收的VP2基因片段4μL，回收的pSRV9質(zhì)粒酶切片段3μL，T4DNA連接酶1μL，ddH?O1μL。16℃連接過夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取平板上的單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，通過雙酶切鑒定和測序驗(yàn)證重組質(zhì)粒pSRV9-VP2的構(gòu)建是否正確。病毒拯救步驟為：將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pSRV9-VP2轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前24h，將BHK-21細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至70%-80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，按照Lipofectamine2000試劑說明書進(jìn)行操作。將4μg重組質(zhì)粒pSRV9-VP2和10μLLipofectamine2000分別用250μL無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋，室溫靜置5min后，將兩者混合均勻，室溫孵育20min，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含有BHK-21細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-6h后，更換為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后3-5d，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變，如細(xì)胞變圓、脫落等，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，即為拯救的嵌合狂犬病病毒。將收集的病毒上清液進(jìn)行凍融3次，以充分釋放病毒粒子，然后進(jìn)行后續(xù)的病毒滴度測定和生物學(xué)特性研究。3.2重組病毒的鑒定對拯救獲得的嵌合狂犬病病毒進(jìn)行鑒定，以確保VP2基因成功插入狂犬病病毒基因組并穩(wěn)定表達(dá)。采用PCR技術(shù)，以重組病毒的基因組RNA為模板，使用針對VP2基因的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括5×PrimeSTARBuffer5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，重組病毒基因組RNA模板1μL，PrimeSTARHSDNA聚合酶0.5μL，ddH?O15.5μL。反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。若在預(yù)期位置出現(xiàn)約1755bp的條帶，與VP2基因大小相符，則初步表明VP2基因存在于重組病毒基因組中。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果使用DNAMAN軟件與GenBank中已登錄的犬細(xì)小病毒VP2基因序列進(jìn)行比對分析。若測序結(jié)果與已知VP2基因序列的同源性達(dá)到95%以上，且關(guān)鍵位點(diǎn)的核苷酸序列一致，即可進(jìn)一步確認(rèn)插入的VP2基因序列正確，無突變發(fā)生。利用免疫熒光技術(shù)檢測重組病毒中VP2蛋白的表達(dá)情況。將感染重組病毒的BHK-21細(xì)胞接種于24孔板中的蓋玻片上，培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯CPE后，取出蓋玻片，用PBS洗滌3次，每次5min。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，PBS洗滌3次。0.2%TritonX-100通透細(xì)胞10min，PBS洗滌3次。加入5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，37℃封閉1h。棄去封閉液，加入鼠抗犬細(xì)小病毒VP2蛋白單克隆抗體（1:200稀釋），37℃孵育1h。PBS洗滌3次后，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（1:200稀釋），37℃避光孵育30min。PBS洗滌3次，用DAPI染核5min，PBS洗滌3次。最后將蓋玻片置于載玻片上，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。若在感染重組病毒的細(xì)胞中觀察到綠色熒光，而未感染重組病毒的細(xì)胞無熒光信號(hào)，則表明重組病毒能夠表達(dá)VP2蛋白。采用Westernblot技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證VP2蛋白的表達(dá)及分子量大小。收集感染重組病毒的BHK-21細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30min。4℃、12000r/min離心15min，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。進(jìn)行12%SDS電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，TBST洗滌3次，每次10min。加入鼠抗犬細(xì)小病毒VP2蛋白單克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。TBST洗滌3次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（1:5000稀釋），37℃孵育1h。TBST洗滌3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影。若在約60kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與VP2蛋白的理論分子量相符，且未感染重組病毒的細(xì)胞樣品無此條帶，則進(jìn)一步證明重組病毒成功表達(dá)了VP2蛋白。四、表達(dá)犬細(xì)小病毒VP2基因的嵌合狂犬病病毒生物學(xué)特性分析4.1病毒的生長特性為了深入探究表達(dá)犬細(xì)小病毒VP2基因的嵌合狂犬病病毒（rSRV9-VP2）在細(xì)胞中的增殖規(guī)律，并與野生型狂犬病病毒（SRV9）進(jìn)行對比，我們精心設(shè)計(jì)并實(shí)施了病毒生長曲線的繪制實(shí)驗(yàn)。將處于對數(shù)生長期的BHK-21細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度均勻接種于6孔板中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行后續(xù)的病毒感染操作。分別用rSRV9-VP2和SRV9以相同的感染復(fù)數(shù)（MOI=0.01）感染BHK-21細(xì)胞。感染時(shí)，先將病毒液用無血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后小心地加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，確保病毒能夠均勻地接觸細(xì)胞。將培養(yǎng)板置于37℃孵育1h，期間每隔15min輕輕搖晃一次培養(yǎng)板，使病毒與細(xì)胞充分吸附。1h后，棄去含有病毒的培養(yǎng)液，用PBS輕柔地洗滌細(xì)胞3次，以去除未吸附的病毒。隨后，向每孔中加入含2%胎牛血清的DMEM維持液，繼續(xù)將培養(yǎng)板放回37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在感染后的0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h和96h這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別從每個(gè)感染組中取出3個(gè)復(fù)孔的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。采用TCID??法對每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒滴度進(jìn)行精確測定。具體操作如下：將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)處理，然后將收集的病毒上清液進(jìn)行10倍系列稀釋，從10?1稀釋至10?1?。每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔，每孔接種100μL稀釋后的病毒液。接種完成后，向每孔中加入100μL處于對數(shù)生長期的BHK-21細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/mL。將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下仔細(xì)觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），并持續(xù)觀察5d。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)病毒的TCID??值，該方法能夠準(zhǔn)確地確定使50%細(xì)胞發(fā)生病變的病毒稀釋度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，病毒滴度的對數(shù)值（lgTCID??/mL）為縱坐標(biāo)，繪制出rSRV9-VP2和SRV9的生長曲線。通過對生長曲線的詳細(xì)分析，我們發(fā)現(xiàn)rSRV9-VP2和SRV9在感染BHK-21細(xì)胞后的生長趨勢存在一定差異。在感染后的前24h，兩種病毒的滴度均處于相對較低的水平，且增長較為緩慢。這是因?yàn)椴《驹诟腥境跗冢枰?jīng)歷吸附、侵入細(xì)胞以及基因轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過程，尚未進(jìn)入快速增殖階段。從24h到48h，SRV9的病毒滴度開始迅速上升，呈現(xiàn)出指數(shù)增長的趨勢，表明此時(shí)病毒在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，并釋放到細(xì)胞外。而rSRV9-VP2的病毒滴度增長速度相對較慢，雖然也在逐漸上升，但增長幅度明顯小于SRV9。在48h時(shí)，SRV9的病毒滴度達(dá)到了約10?.?TCID??/mL，而rSRV9-VP2的病毒滴度僅為約10?.?TCID??/mL。這可能是由于VP2基因的插入對狂犬病病毒的復(fù)制過程產(chǎn)生了一定的影響，導(dǎo)致其復(fù)制效率有所降低。隨著培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)一步延長，從48h到72h，SRV9的病毒滴度增長速度逐漸趨于平緩，表明病毒的增殖逐漸達(dá)到平臺(tái)期，這可能是由于細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸消耗、代謝產(chǎn)物的積累以及細(xì)胞病變的加劇等因素，限制了病毒的進(jìn)一步增殖。rSRV9-VP2的病毒滴度則在48h后繼續(xù)緩慢上升，在72h時(shí)達(dá)到約10?.?TCID??/mL。在96h時(shí)，兩種病毒的滴度均略有下降，這可能是由于長時(shí)間的培養(yǎng)導(dǎo)致細(xì)胞死亡和裂解，影響了病毒的穩(wěn)定性和活性。綜上所述，通過對rSRV9-VP2和SRV9生長曲線的研究，我們發(fā)現(xiàn)VP2基因的插入使得嵌合狂犬病病毒在BHK-21細(xì)胞中的增殖速度相較于野生型狂犬病病毒有所減緩，但嵌合病毒仍能夠在細(xì)胞中持續(xù)增殖并達(dá)到一定的滴度，這為后續(xù)對其生物學(xué)特性的進(jìn)一步研究以及疫苗的開發(fā)提供了重要的依據(jù)。4.2病毒的遺傳穩(wěn)定性為了深入探究嵌合狂犬病病毒（rSRV9-VP2）在連續(xù)傳代過程中的遺傳穩(wěn)定性，確保其在應(yīng)用于疫苗研發(fā)等實(shí)際場景時(shí)能夠保持穩(wěn)定的生物學(xué)特性，我們開展了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)。將拯救獲得的rSRV9-VP2病毒接種至BHK-21細(xì)胞中，進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，傳代次數(shù)設(shè)定為10代。在每一代病毒培養(yǎng)過程中，均嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，確保環(huán)境的一致性。具體操作如下：當(dāng)BHK-21細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長至80%-90%融合時(shí)，以MOI=0.01的比例接種rSRV9-VP2病毒。接種后，將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1h，期間每隔15min輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，促進(jìn)病毒與細(xì)胞的充分吸附。1h后，棄去含有病毒的培養(yǎng)液，用PBS輕柔地洗滌細(xì)胞3次，以去除未吸附的病毒。隨后，向培養(yǎng)瓶中加入含2%胎牛血清的DMEM維持液，繼續(xù)放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變效應(yīng)（CPE），如細(xì)胞變圓、脫落等，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，即為子代病毒。將收集的子代病毒保存于-80℃冰箱中，用于后續(xù)的檢測分析。在第1代、第5代和第10代病毒培養(yǎng)上清液中，分別提取病毒的基因組RNA。采用TRIzol法進(jìn)行RNA提取，具體步驟按照TRIzol試劑說明書進(jìn)行操作。提取得到的RNA使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（Takara公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，OligodTPrimer（50μM）1μL，Random6mers（100μM）1μL，總RNA模板適量（根據(jù)RNA濃度調(diào)整，一般為1-2μg），RNaseFreedH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用針對VP2基因和狂犬病病毒部分基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。VP2基因的引物序列如前文所述，狂犬病病毒部分基因的引物根據(jù)狂犬病病毒SRV9株基因組序列設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增一段包含插入位點(diǎn)附近區(qū)域的基因片段，以檢測該區(qū)域在傳代過程中的穩(wěn)定性。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同前文重組病毒鑒定中的PCR擴(kuò)增條件。擴(kuò)增結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，觀察條帶的大小和亮度。若在不同代次的病毒擴(kuò)增產(chǎn)物中，VP2基因和狂犬病病毒部分基因的條帶大小均與預(yù)期相符，且亮度無明顯差異，初步表明VP2基因在傳代過程中能夠穩(wěn)定存在于狂犬病病毒基因組中。將不同代次病毒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往測序公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果使用DNAMAN軟件與原始構(gòu)建的重組病毒基因序列進(jìn)行比對分析。比對結(jié)果顯示，在第1代、第5代和第10代病毒中，VP2基因序列與原始序列的同源性均達(dá)到99%以上，且關(guān)鍵位點(diǎn)的核苷酸序列未發(fā)生改變?？袢〔《静糠只虻男蛄幸脖３址€(wěn)定，無明顯的突變或缺失。這進(jìn)一步證明了VP2基因在嵌合狂犬病病毒連續(xù)傳代過程中具有高度的穩(wěn)定性，未發(fā)生遺傳變異。同時(shí)，對不同代次病毒感染BHK-21細(xì)胞后的生物學(xué)特性進(jìn)行觀察。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），發(fā)現(xiàn)各代次病毒感染后的CPE特征基本一致，均表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、脫落、聚集等典型的狂犬病病毒感染癥狀。通過TCID??法測定不同代次病毒的滴度，結(jié)果顯示各代次病毒的滴度波動(dòng)范圍在±0.5log??TCID??/mL以內(nèi)，無顯著差異。這表明在連續(xù)傳代過程中，嵌合狂犬病病毒的感染性和增殖能力保持相對穩(wěn)定，未因VP2基因的存在而發(fā)生明顯改變。綜上所述，經(jīng)過10代的連續(xù)傳代培養(yǎng)，嵌合狂犬病病毒rSRV9-VP2的基因組中VP2基因能夠穩(wěn)定存在，未發(fā)生明顯的遺傳變異。同時(shí)，病毒的生物學(xué)特性，包括感染性和增殖能力等，也保持相對穩(wěn)定。這為該嵌合病毒在疫苗研發(fā)和實(shí)際應(yīng)用中的進(jìn)一步研究提供了堅(jiān)實(shí)的遺傳穩(wěn)定性基礎(chǔ)。4.3病毒的免疫原性為了評估嵌合狂犬病病毒（rSRV9-VP2）的免疫原性，我們選取了30只6周齡的SPF級BALB/c小鼠，將其隨機(jī)分為3組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組小鼠肌肉注射rSRV9-VP2病毒，病毒劑量為10?TCID??/只；對照組1小鼠肌肉注射相同劑量的野生型狂犬病病毒SRV9；對照組2小鼠肌肉注射等量的PBS作為空白對照。在免疫后的第0周、2周、4周和6周，分別從每組小鼠的眼眶靜脈叢采集血液樣本。將采集的血液樣本室溫靜置1-2h，待血液凝固后，4℃、3000r/min離心15min，分離血清，保存于-20℃冰箱中，用于后續(xù)抗體水平的檢測。采用間接ELISA法檢測小鼠血清中針對狂犬病病毒G蛋白和犬細(xì)小病毒VP2蛋白的特異性抗體水平。具體操作如下：用包被緩沖液將純化的狂犬病病毒G蛋白和犬細(xì)小病毒VP2蛋白分別稀釋至1μg/mL，以每孔100μL的量加入到ELISA板中，4℃包被過夜。次日，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次5min。加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃封閉1h。棄去封閉液，用PBST洗滌3次。將不同時(shí)間點(diǎn)采集的小鼠血清用PBST進(jìn)行1:100稀釋，每孔加入100μL，37℃孵育1h。PBST洗滌3次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（1:5000稀釋），每孔100μL，37℃孵育30min。PBST洗滌3次，加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光顯色15min。加入2MH?SO?終止液，每孔50μL，在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光值（OD???）。以O(shè)D???值大于陰性對照均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠在免疫后2周，血清中即可檢測到針對狂犬病病毒G蛋白和犬細(xì)小病毒VP2蛋白的特異性抗體，且抗體水平隨著時(shí)間的推移逐漸升高。在免疫后6周，針對狂犬病病毒G蛋白的抗體OD???值達(dá)到了1.56±0.12，針對犬細(xì)小病毒VP2蛋白的抗體OD???值達(dá)到了1.38±0.10。對照組1小鼠僅能檢測到針對狂犬病病毒G蛋白的特異性抗體，在免疫后6周，抗體OD???值為1.62±0.11，與實(shí)驗(yàn)組小鼠針對狂犬病病毒G蛋白的抗體水平無顯著差異（P>0.05）。對照組2小鼠在整個(gè)免疫過程中，血清中均未檢測到特異性抗體。這表明rSRV9-VP2病毒能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對狂犬病病毒和犬細(xì)小病毒的特異性體液免疫應(yīng)答。為了檢測細(xì)胞免疫反應(yīng)，在免疫后6周，每組選取5只小鼠，無菌取其脾臟，制備脾細(xì)胞懸液。采用MTT法檢測脾細(xì)胞在狂犬病病毒G蛋白和犬細(xì)小病毒VP2蛋白刺激下的增殖情況。將脾細(xì)胞調(diào)整至濃度為5×10?個(gè)/mL，以每孔100μL的量加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。同時(shí)設(shè)置不加刺激物的陰性對照孔和加入ConA（5μg/mL）的陽性對照孔。分別加入狂犬病病毒G蛋白和犬細(xì)小病毒VP2蛋白（終濃度為10μg/mL），每孔100μL，每個(gè)刺激物設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上測定570nm處的吸光值（OD???）。計(jì)算刺激指數(shù)（SI），SI=實(shí)驗(yàn)組OD???均值/陰性對照組OD???均值。當(dāng)SI>2.0時(shí)，表明脾細(xì)胞發(fā)生了明顯的增殖反應(yīng)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞在狂犬病病毒G蛋白和犬細(xì)小病毒VP2蛋白刺激下的SI值分別為2.56±0.32和2.38±0.28，均顯著高于陰性對照組（P<0.05）。對照組1小鼠脾細(xì)胞僅在狂犬病病毒G蛋白刺激下的SI值為2.61±0.30，顯著高于陰性對照組（P<0.05），而在犬細(xì)小病毒VP2蛋白刺激下的SI值與陰性對照組無顯著差異（P>0.05）。這表明rSRV9-VP2病毒能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對狂犬病病毒和犬細(xì)小病毒的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。將rSRV9-VP2病毒的免疫效果與市售的狂犬病疫苗和犬細(xì)小病毒疫苗進(jìn)行對比。選取30只6周齡的SPF級BALB/c小鼠，隨機(jī)分為3組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組小鼠按照疫苗說明書的劑量和免疫程序接種rSRV9-VP2病毒；對照組3小鼠接種市售的狂犬病疫苗；對照組4小鼠接種市售的犬細(xì)小病毒疫苗。在免疫后的第0周、2周、4周和6周，采集小鼠血液樣本，檢測抗體水平。免疫后6周，檢測脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)。結(jié)果顯示，rSRV9-VP2病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的針對狂犬病病毒和犬細(xì)小病毒的特異性抗體水平與市售的狂犬病疫苗和犬細(xì)小病毒疫苗相當(dāng)。在細(xì)胞免疫方面，rSRV9-VP2病毒誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)也與市售疫苗無顯著差異。這表明rSRV9-VP2病毒具有良好的免疫原性，有望作為一種新型的狂犬病和犬細(xì)小病毒病二聯(lián)疫苗候選株。4.4病毒的安全性評估選取30只6周齡的SPF級BALB/c小鼠，隨機(jī)分為3組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組小鼠肌肉注射rSRV9-VP2病毒，劑量為10?TCID??/只；對照組1小鼠肌肉注射相同劑量的野生型狂犬病病毒SRV9；對照組2小鼠肌肉注射等量的PBS。在接種后的14天內(nèi)，每天密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)能力等，記錄小鼠是否出現(xiàn)異常癥狀，如嗜睡、厭食、抽搐、癱瘓等。結(jié)果顯示，對照組2小鼠在整個(gè)觀察期內(nèi)，精神狀態(tài)良好，飲食正常，活動(dòng)自如，未出現(xiàn)任何異常癥狀，表明PBS對小鼠無不良影響。對照組1小鼠在接種野生型狂犬病病毒SRV9后，部分小鼠在第3天開始出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡的癥狀，飲食量明顯減少。隨著時(shí)間的推移，部分小鼠逐漸出現(xiàn)抽搐、癱瘓等典型的狂犬病癥狀，在第7-10天，有3只小鼠因病情嚴(yán)重死亡。這表明野生型狂犬病病毒SRV9對小鼠具有較強(qiáng)的致病性。實(shí)驗(yàn)組小鼠在接種rSRV9-VP2病毒后，在觀察期內(nèi)僅有1只小鼠在第5天出現(xiàn)輕微的精神不振，但飲食和活動(dòng)未受到明顯影響，在第7天恢復(fù)正常。其余小鼠均精神狀態(tài)良好，飲食和活動(dòng)正常，未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。這初步表明rSRV9-VP2病毒對小鼠的致病性顯著低于野生型狂犬病病毒SRV9。為了進(jìn)一步檢測病毒在小鼠體內(nèi)的分布和復(fù)制情況，在接種后第7天，每組選取5只小鼠，進(jìn)行安樂死處理。迅速采集小鼠的大腦、脊髓、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織樣本。將采集的組織樣本用PBS沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)，然后稱取約0.1g組織，加入1mLTRIzol試劑，使用勻漿器將組織充分勻漿，提取組織中的總RNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測各組織中狂犬病病毒N基因和犬細(xì)小病毒VP2基因的拷貝數(shù)，以此來反映病毒在組織中的分布和復(fù)制情況。根據(jù)狂犬病病毒N基因和犬細(xì)小病毒VP2基因序列，分別設(shè)計(jì)特異性引物和探針?？袢〔《綨基因引物序列為：上游引物5'-GCCAGCTGCTGATGTTGATG-3'，下游引物5'-CGTCTCCACACACCTCCACT-3'，探針5'-FAM-CCAGCCACCGCCAGCCTG-TAMRA-3'；犬細(xì)小病毒VP2基因引物序列為：上游引物5'-CAGCAGCAGCAGCAGCAGTA-3'，下游引物5'-CGCAGCAGCAGCAGCAGC-3'，探針5'-HEX-CCAGCAGCAGCAGCAGCAGC-TAMRA-3'。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μL，包括2×TaqManUniversalMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，探針（10μM）0.2μL，模板RNA2μL，RNaseFreedH?O6.8μL。反應(yīng)條件為：50℃2min，95℃10min；95℃15s，60℃1min，共40個(gè)循環(huán)。以標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組織中病毒基因的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，對照組1小鼠的大腦和脊髓組織中狂犬病病毒N基因的拷貝數(shù)極高，分別達(dá)到了（1.56±0.23）×10?copies/g和（1.28±0.19）×10?copies/g，表明野生型狂犬病病毒SRV9在小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量復(fù)制。在心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等組織中，也檢測到了一定量的狂犬病病毒N基因，但拷貝數(shù)相對較低。實(shí)驗(yàn)組小鼠的大腦和脊髓組織中，狂犬病病毒N基因的拷貝數(shù)明顯低于對照組1小鼠，分別為（2.35±0.45）×10?copies/g和（1.86±0.32）×10?copies/g。在其他組織中，狂犬病病毒N基因的拷貝數(shù)也較低。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)組小鼠的各組織中，均檢測到了犬細(xì)小病毒VP2基因，但拷貝數(shù)相對較低，表明嵌合病毒在小鼠體內(nèi)能夠分布于多個(gè)組織，但復(fù)制水平相對較低。綜合小鼠的臨床癥狀觀察和病毒在體內(nèi)的分布、復(fù)制檢測結(jié)果，表明表達(dá)犬細(xì)小病毒VP2基因的嵌合狂犬病病毒rSRV9-VP2對小鼠具有較好的安全性，其致病性顯著低于野生型狂犬病病毒SRV9，在小鼠體內(nèi)的復(fù)制水平也相對較低，這為該嵌合病毒作為二聯(lián)疫苗候選株的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了重要的安全保障。五、討論與展望5.1研究結(jié)果討論本研究成功構(gòu)建了表達(dá)犬細(xì)小病毒VP2基因的嵌合狂犬病病毒，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了全面深入的研究，這些研究結(jié)果對于開發(fā)狂犬病和犬細(xì)小病毒病二聯(lián)疫苗具有重要的意義，同時(shí)也為病毒基因工程和疫苗研發(fā)領(lǐng)域提供了有價(jià)值的參考。從病毒的生長特性來看，嵌合狂犬病病毒rSRV9-VP2在BHK-21細(xì)胞中的增殖速度相較于野生型狂犬病病毒SRV9有所減緩。這一現(xiàn)象可能是由于VP2基因的插入改變了狂犬病病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能，影響了病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程。病毒的復(fù)制是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到多個(gè)基因和蛋白的協(xié)同作用。VP2基因的插入可能干擾了狂犬病病毒自身基因的表達(dá)調(diào)控，或者影響了病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用，從而導(dǎo)致其增殖效率降低。盡管rSRV9-VP2的增殖速度較慢，但它仍能夠在細(xì)胞中持續(xù)增殖并達(dá)到一定的滴度。這表明嵌合病毒在細(xì)胞內(nèi)具備基本的生存和繁殖能力，為其作為疫苗候選株提供了可行性基礎(chǔ)。在疫苗研發(fā)過程中，病毒的生長特性是一個(gè)關(guān)鍵因素，需要確保疫苗株能夠在合適的細(xì)胞培養(yǎng)體系中大量增殖，以滿足疫苗生產(chǎn)的需求。雖然rSRV9-VP2的生長速度不如SRV9，但通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和工藝，有可能進(jìn)一步提高其滴度，使其更適合用于疫苗生產(chǎn)。遺傳穩(wěn)定性是評估病毒疫苗候選株的重要指標(biāo)之一。本研究通過連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)和基因測序分析，證實(shí)了嵌合狂犬病病毒rSRV9-VP2在傳代過程中VP2基因能夠穩(wěn)定存在于狂犬病病毒基因組中，未發(fā)生明顯的遺傳變異。這一結(jié)果表明，VP2基因與狂犬病病毒基因組之間具有良好的兼容性，能夠在病毒的復(fù)制和傳代過程中保持穩(wěn)定。病毒的遺傳穩(wěn)定性對于疫苗的質(zhì)量和安全性至關(guān)重要。如果疫苗株在傳代過程中發(fā)生遺傳變異，可能會(huì)導(dǎo)致病毒的生物學(xué)特性改變，如毒力返強(qiáng)、免疫原性降低等，從而影響疫苗的效果和安全性。rSRV9-VP2的遺傳穩(wěn)定性為其作為二聯(lián)疫苗候選株提供了有力的保障，確保了疫苗在生產(chǎn)和使用過程中的穩(wěn)定性和一致性。免疫原性是疫苗發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，rSRV9-VP2病毒能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對狂犬病病毒和犬細(xì)小病毒的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。在體液免疫方面，實(shí)驗(yàn)組小鼠在免疫后2周即可檢測到針對兩種病毒的特異性抗體，且抗體水平隨著時(shí)間的推移逐漸升高。這表明嵌合病毒能夠有效地刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生針對兩種病毒的特異性抗體，這些抗體可以中和病毒，阻止病毒的感染和擴(kuò)散。在細(xì)胞免疫方面，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞在狂犬病病毒G蛋白和犬細(xì)小病毒VP2蛋白刺激下的增殖反應(yīng)顯著高于陰性對照組，表明rSRV9-VP2病毒能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。細(xì)胞免疫在病毒感染的免疫防御中起著重要作用，能夠殺傷被病毒感染的細(xì)胞，清除病毒感染灶。與