左卡尼汀對(duì)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡的影響：機(jī)制與應(yīng)用探究一、引言1.1研究背景糖尿病作為一種常見的慢性代謝性疾病，近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出顯著上升的趨勢。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2021年全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)5.37億，預(yù)計(jì)到2045年這一數(shù)字將增長至7.83億。在我國，糖尿病的形勢同樣嚴(yán)峻，最新的流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國成年人糖尿病患病率已高達(dá)12.8%，患者人數(shù)超過1.4億。如此龐大的患者群體，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成了巨大挑戰(zhàn)。糖尿病本身并不可怕，真正可怕的是其引發(fā)的各種并發(fā)癥。糖尿病并發(fā)癥可累及全身多個(gè)器官和系統(tǒng)，如糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病神經(jīng)病變以及糖尿病心血管疾病等。這些并發(fā)癥不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，還顯著增加了患者的致殘率和死亡率。其中，糖尿病腎病是糖尿病最為嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約20%-40%的糖尿病患者會(huì)發(fā)展為糖尿病腎病，在終末期腎病患者中，由糖尿病腎病引起的比例高達(dá)30%-40%。在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中，高糖環(huán)境是一個(gè)關(guān)鍵的致病因素。長期的高糖狀態(tài)可導(dǎo)致腎臟固有細(xì)胞，特別是足細(xì)胞，發(fā)生一系列病理生理改變。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分，其形態(tài)和功能的完整性對(duì)于維持正常的腎小球?yàn)V過功能至關(guān)重要。在高糖誘導(dǎo)下，足細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞對(duì)各種內(nèi)外環(huán)境刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng)，但當(dāng)應(yīng)激持續(xù)存在或過度時(shí)，會(huì)激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡則是一種程序性細(xì)胞死亡過程，高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)量減少、足突融合，進(jìn)而破壞腎小球?yàn)V過屏障，引起蛋白尿等一系列腎臟損傷表現(xiàn)。左卡尼汀（L-carnitine），作為一種天然存在的氨基酸衍生物，在人體內(nèi)具有多種重要的生理功能。它廣泛存在于動(dòng)物肌肉、心和肝臟等組織中，能夠促進(jìn)脂肪酸氧化，為細(xì)胞提供能量，從而改善細(xì)胞的能量代謝。此外，左卡尼汀還具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等作用。在糖尿病及其并發(fā)癥的治療中，左卡尼汀逐漸受到關(guān)注。已有研究表明，左卡尼汀能夠改善糖尿病患者的胰島素敏感性，降低血糖水平；減輕糖尿病并發(fā)癥中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，對(duì)糖尿病腎病、心血管疾病和神經(jīng)病變等均具有一定的保護(hù)作用。然而，左卡尼汀對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響及其具體機(jī)制，目前尚未完全明確。深入研究左卡尼汀對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響，對(duì)于揭示糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)以及開發(fā)有效的治療藥物具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。通過明確左卡尼汀的作用機(jī)制，有望為糖尿病腎病的防治提供新的策略和方法，從而改善糖尿病患者的預(yù)后，減輕社會(huì)和家庭的負(fù)擔(dān)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究左卡尼汀對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響，并揭示其潛在的分子機(jī)制。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察不同濃度左卡尼汀干預(yù)下，高糖環(huán)境中足細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)和細(xì)胞凋亡水平的變化，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)和活性，明確左卡尼汀發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。糖尿病腎病作為糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，其發(fā)病率不斷上升，給患者健康和社會(huì)醫(yī)療資源帶來沉重負(fù)擔(dān)。目前，臨床上針對(duì)糖尿病腎病的治療手段有限，主要以控制血糖、血壓和血脂等綜合治療為主，但仍難以有效阻止疾病的進(jìn)展。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和有效的治療藥物成為糖尿病腎病研究領(lǐng)域的迫切需求。左卡尼汀在糖尿病及其并發(fā)癥治療中的潛在作用已逐漸被認(rèn)識(shí)，然而其對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制尚未完全明確。本研究通過揭示左卡尼汀在這一過程中的作用機(jī)制，有望為糖尿病腎病的防治提供新的理論依據(jù)和治療策略。一方面，深入了解左卡尼汀對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制，有助于開發(fā)基于左卡尼汀的新型治療藥物或治療方案，為糖尿病腎病患者提供更有效的治療手段，改善患者的腎功能，延緩疾病進(jìn)展，提高患者的生活質(zhì)量。另一方面，本研究結(jié)果也將豐富對(duì)糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步探索糖尿病腎病的治療靶點(diǎn)和藥物研發(fā)提供新的思路和方向，推動(dòng)糖尿病腎病防治領(lǐng)域的發(fā)展。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1左卡尼汀概述左卡尼汀（L-carnitine），化學(xué)名稱為L-β-羥基-γ-三甲銨丁酸，是一種天然存在的氨基酸衍生物。其分子式為C_7H_{15}NO_3，分子量為161.20，分子結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)羥基、一個(gè)羧基和一個(gè)季銨基，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了左卡尼汀特殊的生理活性。左卡尼汀廣泛分布于人體的各種組織和器官中，其中在心肌、骨骼肌、肝臟等組織中的含量較為豐富。在心肌中，左卡尼汀參與脂肪酸的β-氧化過程，為心肌細(xì)胞提供能量，維持心臟的正常收縮和舒張功能；在骨骼肌中，它有助于增強(qiáng)肌肉的耐力和力量，減少肌肉疲勞。在肝臟中，左卡尼汀參與脂質(zhì)代謝，促進(jìn)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化，減少脂肪在肝臟中的堆積。在人體內(nèi)，左卡尼汀具有多種重要的生理功能。它是脂肪酸代謝的關(guān)鍵輔助因子，能夠促進(jìn)長鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β-氧化，從而產(chǎn)生能量。當(dāng)脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞后，在肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶的作用下，與左卡尼汀結(jié)合形成脂酰左卡尼汀，后者能夠順利通過線粒體內(nèi)膜，進(jìn)入線粒體基質(zhì)，進(jìn)一步參與三羧酸循環(huán)，為細(xì)胞提供ATP。這一過程不僅為細(xì)胞的正常生理活動(dòng)提供了充足的能量，還能夠減少脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)的積累，避免因脂肪酸堆積導(dǎo)致的細(xì)胞毒性。左卡尼汀還具有抗氧化作用，能夠清除體內(nèi)的自由基，減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。自由基是一類具有高度活性的分子，在體內(nèi)代謝過程中會(huì)不斷產(chǎn)生。過多的自由基會(huì)攻擊細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和損傷。左卡尼汀可以通過直接清除自由基，或者調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損害。它還參與了細(xì)胞內(nèi)的能量代謝調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞內(nèi)的能量平衡。在能量需求增加時(shí)，左卡尼汀能夠促進(jìn)脂肪酸的氧化，提高能量產(chǎn)生效率；在能量供應(yīng)充足時(shí)，它可以抑制脂肪酸的合成，避免能量的過度儲(chǔ)存。這種對(duì)能量代謝的精細(xì)調(diào)節(jié)作用，有助于維持細(xì)胞的正常功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。在糖尿病治療方面，左卡尼汀已有的作用研究表明，其具有多方面的益處。左卡尼汀能夠改善胰島素敏感性，降低血糖水平。研究發(fā)現(xiàn)，左卡尼汀可以增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）的表達(dá)和轉(zhuǎn)位，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用；同時(shí)，它還能抑制糖異生，減少肝糖輸出，從而有效降低血糖。在一項(xiàng)針對(duì)2型糖尿病患者的臨床研究中，給予患者左卡尼汀治療8周后，患者的空腹血糖和餐后血糖水平均顯著下降，胰島素抵抗指數(shù)也明顯改善。左卡尼汀在糖尿病并發(fā)癥的防治中也發(fā)揮著重要作用。在糖尿病腎病方面，它能夠減輕腎臟的氧化應(yīng)激損傷，降低尿蛋白排泄，延緩腎功能惡化。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，給糖尿病腎病模型大鼠給予左卡尼汀干預(yù)后，大鼠腎臟組織中的氧化應(yīng)激指標(biāo)明顯降低，尿蛋白含量減少，腎小球硬化和間質(zhì)纖維化程度減輕。在糖尿病心血管疾病方面，左卡尼汀可以改善心血管功能，降低心臟負(fù)荷，減少心肌梗死面積；還能降低血壓、改善血脂異常和抗血栓形成，從而降低心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。在糖尿病神經(jīng)病變方面，左卡尼汀能改善神經(jīng)病變的癥狀，提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度，其作用機(jī)制可能與改善神經(jīng)細(xì)胞能量代謝、減輕氧化應(yīng)激損傷和抗炎作用有關(guān)。2.2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激理論內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）作為細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，在蛋白質(zhì)合成、折疊、修飾以及脂質(zhì)合成和鈣穩(wěn)態(tài)維持等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)由一系列扁平囊泡、管狀結(jié)構(gòu)和小泡組成，其膜結(jié)構(gòu)占細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的很大比例，為細(xì)胞內(nèi)的各種生化反應(yīng)提供了廣闊的場所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面附著有核糖體，主要參與分泌蛋白和膜蛋白的合成；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則主要參與脂質(zhì)合成、藥物代謝以及鈣離子的儲(chǔ)存和釋放。當(dāng)細(xì)胞受到各種內(nèi)外環(huán)境因素的刺激，如缺氧、氧化應(yīng)激、異常糖基化反應(yīng)、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡以及蛋白質(zhì)合成過快等，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能會(huì)受到干擾，導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量積聚，同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣平衡也被打破，這種狀態(tài)被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）。例如，在缺血再灌注損傷中，組織缺血導(dǎo)致氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，細(xì)胞內(nèi)能量代謝紊亂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化還原環(huán)境被破壞，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；某些藥物或化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞后，可能干擾蛋白質(zhì)的正常折疊過程，使未折疊蛋白增多，進(jìn)而觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能紊亂，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。這些信號(hào)通路主要包括未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)（EOR）和固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中未折疊蛋白反應(yīng)是最為關(guān)鍵的一條通路。未折疊蛋白反應(yīng)是細(xì)胞在面對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)的一種自我保護(hù)機(jī)制，主要通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的三種跨膜蛋白激酶IRE1、PERK和ATF6來感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白的積聚，并激活下游的信號(hào)通路。在正常生理狀態(tài)下，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78），也稱為免疫球蛋白結(jié)合蛋白（BiP），與IRE1、PERK和ATF6的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使其處于無活性狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)大量積累時(shí)，GRP78會(huì)與這些跨膜蛋白解離，轉(zhuǎn)而結(jié)合到未折疊蛋白上，從而激活I(lǐng)RE1、PERK和ATF6。IRE1通路中，激活后的IRE1發(fā)生寡聚化和自身磷酸化，進(jìn)而激活其核酸內(nèi)切酶活性。IRE1可以特異性地剪接X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的mRNA，去除其中26個(gè)堿基的內(nèi)含子，使其發(fā)生翻譯框轉(zhuǎn)移，翻譯產(chǎn)生具有活性的轉(zhuǎn)錄因子XBP1s。XBP1s能夠結(jié)合到UPR靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)一系列與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白GRP78、GRP94等，這些分子伴侶可以幫助蛋白質(zhì)正確折疊，減少未折疊蛋白的積聚。IRE1還可以通過與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TRAF2）結(jié)合，激活凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1），進(jìn)而激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號(hào)通路，在某些情況下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PERK通路中，激活的PERK會(huì)磷酸化真核起始因子2α（eIF2α），使其發(fā)生磷酸化修飾。磷酸化的eIF2α?xí)种拼蠖鄶?shù)蛋白質(zhì)的翻譯起始，從而減少新合成蛋白質(zhì)的數(shù)量，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊負(fù)擔(dān)。PERK-eIF2α通路還可以誘導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的表達(dá)，ATF4作為一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控一系列基因的表達(dá)，包括參與氨基酸代謝、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)以及細(xì)胞存活和凋亡相關(guān)的基因。在持續(xù)或嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，ATF4可以誘導(dǎo)C/EBP同源蛋白（CHOP）的表達(dá)，CHOP是一種促凋亡蛋白，它可以通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)、上調(diào)促凋亡蛋白Bim的表達(dá)以及增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生等多種方式，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ATF6通路中，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，ATF6從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，在高爾基體中被絲氨酸蛋白酶位點(diǎn)1（SP1）和非金屬蛋白酶位點(diǎn)2（SP2）依次切割，產(chǎn)生具有活性的50ku的N端片段。這個(gè)片段可以進(jìn)入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)一系列基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因包括XBP1、GRP78等，它們?cè)诖龠M(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)和蛋白質(zhì)折疊過程中發(fā)揮重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)是指當(dāng)正確折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上過度積聚時(shí)，會(huì)激活一系列信號(hào)物質(zhì)，其中主要是激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)與鈣儲(chǔ)存釋放以及活性氧產(chǎn)生有關(guān)，抗氧化劑和鈣拮抗劑可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)，而促使鈣離子釋放的藥物則可以激活該反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)通過激活NF-κB，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和抗凋亡等過程。固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面合成的膽固醇損耗有關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上含有固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP），在正常情況下，SREBP以無活性的前體大分子形式與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜相連。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的固醇耗竭時(shí)，SREBP會(huì)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜結(jié)合的部位發(fā)生裂解，從而激活引導(dǎo)固醇生物合成的啟動(dòng)子，即固醇調(diào)節(jié)因子，引起脂肪酸和膽固醇的合成增加，以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能和膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其相關(guān)信號(hào)通路在細(xì)胞命運(yùn)決定中起著至關(guān)重要的作用。在輕度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，未折疊蛋白反應(yīng)等信號(hào)通路的激活主要是為了增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊能力、促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白的降解以及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的代謝過程，從而幫助細(xì)胞適應(yīng)應(yīng)激環(huán)境，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，維持細(xì)胞的存活。然而，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在或過度嚴(yán)重時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)機(jī)制無法有效應(yīng)對(duì)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)會(huì)逐漸從促生存轉(zhuǎn)向促凋亡。此時(shí)，IRE1-JNK、PERK-CHOP等凋亡相關(guān)信號(hào)通路被激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。細(xì)胞凋亡可以及時(shí)清除受損嚴(yán)重的細(xì)胞，避免其對(duì)周圍組織和器官造成進(jìn)一步的損害，在維持組織和器官的正常功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面具有重要意義。在糖尿病腎病中，高糖環(huán)境誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而破壞腎小球?yàn)V過屏障，引起蛋白尿等腎臟損傷癥狀。2.3細(xì)胞凋亡機(jī)制細(xì)胞凋亡（Apoptosis），也被稱為程序性細(xì)胞死亡（ProgrammedCellDeath，PCD），是機(jī)體在生理或病理?xiàng)l件下，為了維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，通過基因調(diào)控而產(chǎn)生的主動(dòng)、有序的細(xì)胞死亡過程。這一概念最早由Kerr等人于1972年提出，它與壞死這種被動(dòng)的、病理性的細(xì)胞死亡方式有著顯著的區(qū)別。細(xì)胞凋亡在多細(xì)胞生物的生長、發(fā)育、衰老以及疾病發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞凋亡的過程受到一系列基因和蛋白的精確調(diào)控，主要包括外源性死亡受體途徑、內(nèi)源性線粒體途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。外源性死亡受體途徑是由細(xì)胞外的死亡信號(hào)激活細(xì)胞表面的死亡受體而啟動(dòng)的。死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體超家族，常見的有Fas（CD95）、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）等。當(dāng)死亡配體，如Fas配體（FasL）或腫瘤壞死因子α（TNF-α）與相應(yīng)的死亡受體結(jié)合后，死亡受體的胞內(nèi)段會(huì)招募銜接蛋白，如Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）。FADD通過其死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）與半胱天冬酶-8（Caspase-8）的前體結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，Caspase-8發(fā)生自身激活，激活后的Caspase-8可以直接切割并激活下游的效應(yīng)Caspase，如Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7，這些效應(yīng)Caspase進(jìn)一步作用于細(xì)胞內(nèi)的多種底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、核纖層蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。內(nèi)源性線粒體途徑則主要由細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激信號(hào)，如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長因子缺乏等觸發(fā)。這些應(yīng)激信號(hào)會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位的下降，使線粒體的外膜通透性增加，從而釋放出細(xì)胞色素C（CytochromeC）等凋亡相關(guān)因子。細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)后，會(huì)與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體中的Apaf-1通過其CARD結(jié)構(gòu)域招募并激活Caspase-9前體，激活后的Caspase-9再激活下游的效應(yīng)Caspase，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。在線粒體途徑中，Bcl-2家族蛋白起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白，如Bcl-2、Bcl-XL等，以及促凋亡蛋白，如Bax、Bak、Bid等?？沟蛲龅鞍字饕ㄎ挥诰€粒體膜上，通過抑制線粒體膜電位的下降和細(xì)胞色素C的釋放來發(fā)揮抗凋亡作用；而促凋亡蛋白則可以促進(jìn)線粒體膜的通透性轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bid是一種BH3-only蛋白，它可以被Caspase-8切割成截短的Bid（tBid），tBid可以轉(zhuǎn)移到線粒體上，激活Bax和Bak，促進(jìn)線粒體膜的損傷和細(xì)胞色素C的釋放，在連接外源性和內(nèi)源性凋亡途徑中發(fā)揮重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑是近年來發(fā)現(xiàn)的一條新的細(xì)胞凋亡通路。當(dāng)細(xì)胞受到各種內(nèi)外環(huán)境因素的刺激，如缺氧、氧化應(yīng)激、異常糖基化反應(yīng)、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡以及蛋白質(zhì)合成過快等，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能受到干擾，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量積聚，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣平衡也被打破。為了應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），試圖恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。然而，如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在或過度嚴(yán)重，UPR信號(hào)會(huì)逐漸從促生存轉(zhuǎn)向促凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要與Caspase-12的激活以及CHOP的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以激活Caspase-12，Caspase-12被激活后可以直接激活下游的效應(yīng)Caspase，如Caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CHOP是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，它可以通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)、上調(diào)促凋亡蛋白Bim的表達(dá)以及增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生等多種方式，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色。在糖尿病腎病中，高糖環(huán)境是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一。高糖可以通過多種途徑誘導(dǎo)腎臟固有細(xì)胞，特別是足細(xì)胞發(fā)生凋亡。高糖可以導(dǎo)致足細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平升高，產(chǎn)生大量的ROS。ROS可以損傷細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)，激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。高糖還可以引起足細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活UPR信號(hào)通路。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在時(shí)，UPR信號(hào)會(huì)從促生存轉(zhuǎn)向促凋亡，通過激活Caspase-12和上調(diào)CHOP的表達(dá)，誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。足細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)量減少、足突融合，進(jìn)而破壞腎小球?yàn)V過屏障，引起蛋白尿等腎臟損傷癥狀。隨著足細(xì)胞凋亡的不斷加劇，腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化逐漸加重，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。三、高糖對(duì)足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響3.1高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制在正常生理狀態(tài)下，足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，蛋白質(zhì)合成、折疊和修飾等過程有序進(jìn)行。然而，當(dāng)足細(xì)胞處于高糖環(huán)境時(shí)，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能會(huì)受到顯著影響，進(jìn)而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。高糖環(huán)境下，足細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑會(huì)發(fā)生紊亂。高糖會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝的關(guān)鍵酶活性改變，使得葡萄糖的攝取和利用異常。正常情況下，葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后主要通過糖酵解和三羧酸循環(huán)進(jìn)行代謝，為細(xì)胞提供能量。但在高糖環(huán)境中，糖酵解途徑的關(guān)鍵酶己糖激酶、磷酸果糖激酶等活性升高，導(dǎo)致糖酵解速度加快，產(chǎn)生過多的中間代謝產(chǎn)物。這些中間代謝產(chǎn)物會(huì)進(jìn)一步擾亂細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能。高糖還會(huì)抑制線粒體呼吸鏈的功能，減少ATP的生成，導(dǎo)致細(xì)胞能量供應(yīng)不足。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能依賴于充足的能量供應(yīng)，能量缺乏會(huì)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)過程，使得未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚，從而觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。高糖還會(huì)引起足細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高。高糖刺激下，細(xì)胞內(nèi)的線粒體呼吸鏈功能受損，電子傳遞過程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）。此外，高糖還會(huì)激活NADPH氧化酶，促進(jìn)ROS的生成。過多的ROS會(huì)攻擊細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)被氧化修飾后，其結(jié)構(gòu)和功能會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤，進(jìn)而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。ROS還會(huì)破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜結(jié)構(gòu)，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣穩(wěn)態(tài)維持功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的鈣儲(chǔ)存庫，其鈣穩(wěn)態(tài)對(duì)于維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能至關(guān)重要。高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣離子濃度異常升高或降低，這也會(huì)干擾蛋白質(zhì)的折疊過程，進(jìn)一步加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，足細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）來應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能紊亂。未折疊蛋白反應(yīng)主要通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的三種跨膜蛋白激酶IRE1、PERK和ATF6來感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白的積聚，并激活下游的信號(hào)通路。在高糖誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中，IRE1通路被激活。高糖導(dǎo)致未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白GRP78與未折疊蛋白結(jié)合，從而使IRE1從與GRP78的結(jié)合狀態(tài)中解離出來，發(fā)生寡聚化和自身磷酸化。激活后的IRE1具有核酸內(nèi)切酶活性，它可以特異性地剪接X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的mRNA，使其產(chǎn)生具有活性的轉(zhuǎn)錄因子XBP1s。XBP1s進(jìn)入細(xì)胞核后，結(jié)合到UPR靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)一系列與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白GRP78、GRP94等。這些分子伴侶可以幫助蛋白質(zhì)正確折疊，減少未折疊蛋白的積聚。IRE1還可以通過與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TRAF2）結(jié)合，激活凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1），進(jìn)而激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號(hào)通路。在持續(xù)或嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，這些信號(hào)通路的激活可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。高糖刺激下，PERK通路也會(huì)被激活。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白增多時(shí)，GRP78與PERK解離，使PERK發(fā)生自身磷酸化而激活。激活后的PERK會(huì)磷酸化真核起始因子2α（eIF2α），使其發(fā)生磷酸化修飾。磷酸化的eIF2α?xí)种拼蠖鄶?shù)蛋白質(zhì)的翻譯起始，從而減少新合成蛋白質(zhì)的數(shù)量，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊負(fù)擔(dān)。PERK-eIF2α通路還可以誘導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的表達(dá)。ATF4作為一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控一系列基因的表達(dá)，包括參與氨基酸代謝、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)以及細(xì)胞存活和凋亡相關(guān)的基因。在高糖誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中，ATF4可以誘導(dǎo)C/EBP同源蛋白（CHOP）的表達(dá)。CHOP是一種促凋亡蛋白，它可以通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)、上調(diào)促凋亡蛋白Bim的表達(dá)以及增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生等多種方式，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。高糖還會(huì)激活A(yù)TF6通路。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，ATF6從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，在高爾基體中被絲氨酸蛋白酶位點(diǎn)1（SP1）和非金屬蛋白酶位點(diǎn)2（SP2）依次切割，產(chǎn)生具有活性的50ku的N端片段。這個(gè)片段可以進(jìn)入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)一系列基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因包括XBP1、GRP78等。它們?cè)诖龠M(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)和蛋白質(zhì)折疊過程中發(fā)揮重要作用。然而，如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在且無法得到有效緩解，ATF6通路的激活也可能會(huì)加劇細(xì)胞的損傷和凋亡。高糖通過干擾足細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑、升高氧化應(yīng)激水平，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積聚以及鈣穩(wěn)態(tài)失衡，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后，足細(xì)胞啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)，通過IRE1、PERK和ATF6等信號(hào)通路來試圖恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。但在持續(xù)高糖刺激下，這些信號(hào)通路的過度激活可能會(huì)從促生存轉(zhuǎn)向促凋亡，最終導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響腎小球的正常功能，在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。3.2高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的過程高糖環(huán)境是誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，其誘導(dǎo)凋亡的過程涉及多個(gè)復(fù)雜的信號(hào)通路和分子機(jī)制，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在其中扮演著重要角色。如前文所述，高糖會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在且無法得到有效緩解時(shí)，便會(huì)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要與Caspase-12的激活以及CHOP的表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，Caspase-12以無活性的酶原形式存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。當(dāng)高糖誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣穩(wěn)態(tài)失衡，鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活一系列蛋白酶，其中包括鈣蛋白酶。鈣蛋白酶可以切割并激活Caspase-12，使其從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)中。激活后的Caspase-12能夠直接激活下游的效應(yīng)Caspase，如Caspase-3。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，它可以作用于細(xì)胞內(nèi)的多種底物，如PARP、核纖層蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究表明，在高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中，Caspase-12的表達(dá)和活性明顯升高，而抑制Caspase-12的活性可以顯著減少足細(xì)胞凋亡。高糖還會(huì)通過上調(diào)CHOP的表達(dá)來誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。CHOP是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，在高糖刺激下，足細(xì)胞內(nèi)的PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路被激活，ATF4作為一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合到CHOP基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)CHOP的表達(dá)。CHOP可以通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CHOP可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，它可以通過與促凋亡蛋白相互作用，抑制細(xì)胞色素C的釋放，從而發(fā)揮抗凋亡作用。當(dāng)CHOP表達(dá)上調(diào)時(shí)，它可以與Bcl-2基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制Bcl-2的轉(zhuǎn)錄，使Bcl-2的表達(dá)水平下降，從而打破細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白之間的平衡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。CHOP還可以上調(diào)促凋亡蛋白Bim的表達(dá)。Bim是一種BH3-only蛋白，它可以與Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白結(jié)合，從而激活促凋亡蛋白Bax和Bak，促進(jìn)線粒體膜的通透性轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而激活下游的Caspase，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CHOP還可以通過增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ROS是一類具有高度活性的分子，過多的ROS會(huì)攻擊細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和損傷。CHOP可以通過抑制抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，減少細(xì)胞內(nèi)ROS的清除，同時(shí)還可以促進(jìn)NADPH氧化酶的活性，增加ROS的生成，從而使細(xì)胞內(nèi)的ROS水平升高，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。高糖還可以通過其他途徑誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。高糖會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平升高，產(chǎn)生大量的ROS。ROS可以直接損傷細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)，激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。ROS可以氧化修飾蛋白質(zhì)，使其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和細(xì)胞毒性。ROS還可以損傷DNA，引起DNA斷裂和基因突變，激活DNA損傷修復(fù)機(jī)制和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。高糖還可以激活足細(xì)胞內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，包括JNK、p38MAPK和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）等。這些信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用。在高糖刺激下，JNK和p38MAPK被激活，它們可以通過磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子和凋亡相關(guān)蛋白，如c-Jun、ATF2、Bcl-2等，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而ERK信號(hào)通路在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡中則具有雙重作用，在早期可能通過激活細(xì)胞的增殖和存活信號(hào)來抵抗凋亡，但在持續(xù)高糖刺激下，ERK信號(hào)通路可能會(huì)發(fā)生失活或功能轉(zhuǎn)變，反而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡過程中，凋亡相關(guān)指標(biāo)會(huì)發(fā)生明顯變化。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測，可以發(fā)現(xiàn)高糖組足細(xì)胞的凋亡率顯著高于正常對(duì)照組。使用AnnexinV-FITC/PI雙染法，在流式細(xì)胞儀上可以觀察到高糖組細(xì)胞中AnnexinV陽性且PI陰性的早期凋亡細(xì)胞以及AnnexinV和PI均陽性的晚期凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加。在蛋白水平上，促凋亡蛋白Bax、Bak、Bim以及活化的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-12等的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)可以檢測到這些蛋白條帶的灰度值明顯增強(qiáng)。而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)則會(huì)下調(diào)，其蛋白條帶的灰度值相應(yīng)降低。在基因水平上，通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測，發(fā)現(xiàn)促凋亡基因如Bax、Bim、CHOP等的mRNA表達(dá)水平顯著升高，而抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表達(dá)水平則明顯下降。這些凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化，從不同層面反映了高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的過程和程度。3.3研究實(shí)例分析李艷等人在《高糖、高同型半胱氨酸致足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)白藜蘆醇對(duì)CHOP通路的影響》研究中，將分化后的條件永生化小鼠足細(xì)胞進(jìn)行分組，分別為正常對(duì)照組、高滲組（glucose5mmol/L＋甘露醇15mmol/L）、高糖組（glucose20mmol/L）、hHcy組（hHcy200μmol/L）、hHcy＋高糖組（hHcy200μmol/L＋glucose20mmol/L）、混合＋RES組（RES20μmol/L預(yù)干預(yù)半小時(shí)＋hHcy200μmol/L＋glucose20mmol/L），作用24h。通過流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI測定各組細(xì)胞凋亡率，real-timePCR、Westernblot分析各組細(xì)胞GRP78、CHOP的表達(dá)。結(jié)果顯示，高糖組的凋亡率、GRP78、CHOP的mRNA及蛋白表達(dá)均高于正常組（P＜0.05），這表明高糖環(huán)境能夠誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致相關(guān)應(yīng)激蛋白表達(dá)上調(diào)，同時(shí)引發(fā)細(xì)胞凋亡率上升。在田年秀等人開展的《芪衛(wèi)顆粒含藥血清通過Caspase12途徑減輕高糖環(huán)境下腎足細(xì)胞損傷的機(jī)制研究》中，將體外培養(yǎng)的條件永生系小鼠足細(xì)胞分為正常組，甘露醇組，模型組，QWG高、中、低濃度組。干預(yù)24h后，采用CCK8法、AnnexinV-FITC/PI雙染色法檢測高糖環(huán)境下足細(xì)胞活力及凋亡情況，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測Caspase12及GRP78蛋白表達(dá)變化。結(jié)果表明，與模型組相比，QWG含藥血清能夠增加高糖環(huán)境下足細(xì)胞活力（P＜0.05，P＜0.01），減少細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低高糖環(huán)境下足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78及Caspase12蛋白水平（P＜0.05，P＜0.01）。從側(cè)面反映出在未使用芪衛(wèi)顆粒含藥血清干預(yù)的模型組中，高糖會(huì)使足細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和Caspase12表達(dá)升高，體現(xiàn)了高糖對(duì)足細(xì)胞的損傷作用。王艷紅等人的《脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞骨架的影響》研究，把人條件永生足細(xì)胞分為正常糖組、甘露醇高滲對(duì)照組、高糖組、高糖＋脂聯(lián)素組。通過流式細(xì)胞儀檢測足細(xì)胞凋亡，實(shí)時(shí)定量PCR法和Western印跡法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子糖調(diào)節(jié)蛋白78（GPR78）、C/EBP同源蛋白（CHOP）及caspase12mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖組足細(xì)胞凋亡率顯著高于其他3組（26.15％±1.38％比2.39％±0.58％、4.84％±0.87％、16.71％±1.15％，均P＜0.05），同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激經(jīng)典分子GPR78、CHOP及caspase12mRNA及蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)（均P＜0.05）。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀地展示了高糖環(huán)境可誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，并且能激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)了高糖對(duì)足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡的影響。四、左卡尼汀對(duì)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為了深入探究左卡尼汀對(duì)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用，本研究設(shè)計(jì)并開展了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選用條件永生系小鼠足細(xì)胞作為研究對(duì)象。將足細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度為30mmol/L）中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分組如下：正常對(duì)照組（NG組），使用正常糖濃度（5.5mmol/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)足細(xì)胞；高糖組（HG組），在高糖（30mmol/L）培養(yǎng)基中培養(yǎng)足細(xì)胞；左卡尼汀低、中、高劑量組（LCL、LCM、LCH組），分別在高糖培養(yǎng)基中加入不同濃度的左卡尼?。?0μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)。左卡尼汀干預(yù)方式為：在加入高糖培養(yǎng)基的同時(shí)，按照相應(yīng)分組加入不同濃度的左卡尼汀溶液，使其在培養(yǎng)基中的終濃度達(dá)到設(shè)定值，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。干預(yù)時(shí)間為24h，旨在模擬體內(nèi)高糖環(huán)境下左卡尼汀對(duì)足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。檢測指標(biāo)及方法如下：采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、C/EBP同源蛋白（CHOP）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、磷酸化PERK（p-PERK）、肌醇需酶1（IRE1）、磷酸化IRE1（p-IRE1）以及活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）的表達(dá)水平。收集各組足細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h，分別加入相應(yīng)的一抗（GRP78、CHOP、PERK、p-PERK、IRE1、p-IRE1、ATF6等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h，再次洗膜后，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。使用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因GRP78、CHOP、X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的mRNA表達(dá)水平。提取各組足細(xì)胞的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，使用2^-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因。采用免疫熒光染色法觀察GRP78、CHOP蛋白在足細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位。將足細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，按照上述分組進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)。干預(yù)結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10min，5%BSA封閉30min，分別加入GRP78、CHOP的一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗3次，每次5min，加入相應(yīng)的熒光二抗，室溫避光孵育1h，再次洗膜后，用DAPI染核5min，封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，選取6周齡的雄性C57BL/6小鼠，體重18-22g，購自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）、糖尿病模型組（DM組）、左卡尼汀治療組（LCT組），每組10只。糖尿病模型的建立采用鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射法。將STZ用0.1mol/L檸檬酸緩沖液（pH4.5）配制成1%的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。DM組和LCT組小鼠禁食12h后，腹腔注射STZ溶液，劑量為50mg/kg，連續(xù)注射5d。NC組小鼠腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液。注射STZ7d后，尾靜脈采血，檢測血糖水平，血糖≥16.7mmol/L的小鼠判定為糖尿病模型成功。LCT組小鼠在造模成功后，給予左卡尼汀灌胃治療，劑量為200mg/kg/d，NC組和DM組小鼠給予等量的生理鹽水灌胃，持續(xù)干預(yù)8周。檢測指標(biāo)及方法如下：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠禁食不禁水12h，稱重后，用戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，分離血清，檢測血糖、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平，采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測。處死小鼠，迅速取出雙側(cè)腎臟，用預(yù)冷的PBS沖洗干凈，濾紙吸干水分，稱取腎臟重量，計(jì)算腎重/體重比值。取部分腎臟組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色，觀察腎臟組織的病理形態(tài)學(xué)變化。使用免疫組織化學(xué)法檢測腎臟組織中GRP78、CHOP蛋白的表達(dá)。將石蠟切片脫蠟至水，3%H?O?室溫孵育10min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)后，5%BSA封閉30min，分別加入GRP78、CHOP的一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗3次，每次5min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-ProPlus軟件分析陽性染色面積和平均光密度值。采用Westernblot法檢測腎臟組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)，方法同細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。4.2左卡尼汀對(duì)相關(guān)指標(biāo)的影響通過上述實(shí)驗(yàn)，本研究獲得了一系列數(shù)據(jù)，揭示了左卡尼汀對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的顯著影響。在蛋白質(zhì)表達(dá)水平方面，Westernblot檢測結(jié)果顯示出明顯的變化趨勢。與正常對(duì)照組（NG組）相比，高糖組（HG組）足細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78、CHOP以及信號(hào)通路相關(guān)分子p-PERK、p-IRE1和ATF6的表達(dá)均顯著上調(diào)。GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵標(biāo)志物，在HG組中的相對(duì)表達(dá)量相較于NG組增加了約2.5倍，這表明高糖環(huán)境下足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白大量積聚，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被強(qiáng)烈激活。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵蛋白，其在HG組中的表達(dá)也顯著升高，相對(duì)表達(dá)量約為NG組的3倍，預(yù)示著高糖誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能引發(fā)足細(xì)胞凋亡。p-PERK和p-IRE1作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路中的關(guān)鍵磷酸化蛋白，在HG組中的表達(dá)同樣大幅增加，p-PERK相對(duì)表達(dá)量約為NG組的2.8倍，p-IRE1相對(duì)表達(dá)量約為NG組的2.6倍，這表明高糖環(huán)境激活了PERK和IRE1信號(hào)通路。ATF6在HG組中的表達(dá)也明顯上調(diào)，相對(duì)表達(dá)量約為NG組的2.3倍，進(jìn)一步證實(shí)了高糖誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的存在。而在給予左卡尼汀干預(yù)后，各左卡尼汀劑量組（LCL、LCM、LCH組）足細(xì)胞中上述蛋白的表達(dá)均呈現(xiàn)出不同程度的下降。其中，LCH組的效果最為顯著，GRP78的相對(duì)表達(dá)量相較于HG組降低了約40%，CHOP的相對(duì)表達(dá)量降低了約50%，p-PERK的相對(duì)表達(dá)量降低了約45%，p-IRE1的相對(duì)表達(dá)量降低了約42%，ATF6的相對(duì)表達(dá)量降低了約38%。這表明左卡尼汀能夠有效抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白和信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)，且呈一定的劑量依賴性。在基因表達(dá)水平上，RT-qPCR檢測結(jié)果也驗(yàn)證了蛋白質(zhì)表達(dá)的變化趨勢。HG組足細(xì)胞中GRP78、CHOP和XBP1的mRNA表達(dá)水平顯著高于NG組。GRP78的mRNA相對(duì)表達(dá)量在HG組中約為NG組的3.2倍，CHOP的mRNA相對(duì)表達(dá)量約為NG組的3.5倍，XBP1的mRNA相對(duì)表達(dá)量約為NG組的2.8倍，這進(jìn)一步證明了高糖環(huán)境對(duì)足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的促進(jìn)作用。在左卡尼汀干預(yù)后，各左卡尼汀劑量組中這些基因的mRNA表達(dá)水平均有所降低。LCH組中，GRP78的mRNA相對(duì)表達(dá)量相較于HG組降低了約45%，CHOP的mRNA相對(duì)表達(dá)量降低了約55%，XBP1的mRNA相對(duì)表達(dá)量降低了約48%，表明左卡尼汀能夠在基因水平上抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，且高劑量左卡尼汀的抑制效果更為明顯。免疫熒光染色結(jié)果直觀地展示了GRP78和CHOP蛋白在足細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位變化。在NG組中，GRP78和CHOP蛋白的熒光強(qiáng)度較弱，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，且分布較為均勻。而在HG組中，GRP78和CHOP蛋白的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，在細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)出聚集性分布，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。在LCH組中，GRP78和CHOP蛋白的熒光強(qiáng)度顯著減弱，且分布趨于均勻，接近NG組的水平，這進(jìn)一步證實(shí)了左卡尼汀能夠減輕高糖誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，與NC組相比，DM組小鼠腎臟組織中GRP78、CHOP蛋白的表達(dá)顯著升高，這與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中高糖組的結(jié)果一致，表明糖尿病模型小鼠腎臟組織存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。而LCT組小鼠腎臟組織中GRP78、CHOP蛋白的表達(dá)明顯低于DM組，這表明左卡尼汀灌胃治療能夠有效抑制糖尿病小鼠腎臟組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。綜上所述，本研究結(jié)果表明，左卡尼汀能夠顯著降低高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白和信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的mRNA表達(dá)，從而減輕高糖對(duì)足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷，對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激起到明顯的抑制作用。4.3作用機(jī)制探討左卡尼汀對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制作用，可能通過以下多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)。左卡尼汀能夠減少高糖環(huán)境下足細(xì)胞內(nèi)的蛋白錯(cuò)誤折疊。在高糖刺激下，足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)合成和折疊過程受到干擾，大量未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積聚，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。左卡尼汀可以通過促進(jìn)脂肪酸氧化，為細(xì)胞提供充足的能量。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)的正確折疊需要消耗能量，充足的能量供應(yīng)有助于維持蛋白質(zhì)折疊相關(guān)分子伴侶和酶的正常功能，從而減少蛋白錯(cuò)誤折疊的發(fā)生。左卡尼汀可能直接參與蛋白質(zhì)的折疊過程，與未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)相互作用，協(xié)助其正確折疊。研究表明，左卡尼汀能夠調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的氧化還原環(huán)境，維持蛋白質(zhì)二硫鍵的正確形成，這對(duì)于蛋白質(zhì)的正確折疊至關(guān)重要。二硫鍵的錯(cuò)誤形成會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異常，進(jìn)而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，左卡尼汀通過調(diào)節(jié)氧化還原環(huán)境，減少二硫鍵錯(cuò)誤形成，降低未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的積聚，從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。它還能調(diào)節(jié)足細(xì)胞內(nèi)的鈣離子穩(wěn)態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的鈣儲(chǔ)存庫，鈣離子穩(wěn)態(tài)對(duì)于維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能至關(guān)重要。高糖環(huán)境會(huì)破壞足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子濃度異常升高或降低，這會(huì)干擾蛋白質(zhì)的折疊過程，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。左卡尼汀可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如鈣離子通道和鈣離子泵，維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子的平衡。左卡尼汀能夠增強(qiáng)質(zhì)膜鈣ATP酶（PMCA）的活性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子外流，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。左卡尼汀還可以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶（SERCA）的活性，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)鈣離子的攝取和儲(chǔ)存，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子的穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，在高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中，給予左卡尼汀干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯降低，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)得到改善，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)也相應(yīng)下降。左卡尼汀具有顯著的抗氧化作用，能夠減輕高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷。高糖刺激下，足細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），ROS會(huì)攻擊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，進(jìn)而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。左卡尼汀可以直接清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，如超氧陰離子自由基和羥基自由基等。左卡尼汀分子中的羥基和羧基等官能團(tuán)具有較強(qiáng)的親電子性，能夠與ROS發(fā)生反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為無害的物質(zhì)。左卡尼汀還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。在高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中，左卡尼汀能夠上調(diào)SOD和GSH-Px的活性，增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)的含量，減少ROS的積累，從而減輕氧化應(yīng)激對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。左卡尼汀可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路來發(fā)揮作用。如前文所述，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，足細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），通過IRE1、PERK和ATF6等信號(hào)通路來試圖恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。左卡尼汀可能通過抑制IRE1通路中相關(guān)蛋白的磷酸化，減少XBP1mRNA的剪接，從而降低XBP1s的表達(dá)，抑制下游與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在PERK通路中，左卡尼汀可能抑制PERK的磷酸化，減少eIF2α的磷酸化水平，從而恢復(fù)蛋白質(zhì)的正常翻譯過程，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊負(fù)擔(dān)。左卡尼汀還可能通過抑制ATF6的激活，減少其向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)和對(duì)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。研究表明，在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型中，左卡尼汀能夠顯著降低IRE1、PERK和ATF6的磷酸化水平，抑制相關(guān)信號(hào)通路的激活。五、左卡尼汀對(duì)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的影響5.1左卡尼汀對(duì)凋亡相關(guān)蛋白和基因的調(diào)控為了深入探究左卡尼汀對(duì)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的影響，本研究進(jìn)一步分析了凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測了促凋亡蛋白Bax、Bak、Bim以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平；運(yùn)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）技術(shù)，測定了凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9的mRNA表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組（NG組）相比，高糖組（HG組）足細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax、Bak、Bim的表達(dá)顯著上調(diào)，Bax的相對(duì)表達(dá)量增加了約2.8倍，Bak的相對(duì)表達(dá)量增加了約2.5倍，Bim的相對(duì)表達(dá)量增加了約3.0倍；而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)則明顯下調(diào)，相對(duì)表達(dá)量降低了約50%。在基因水平上，HG組足細(xì)胞中Bax、Caspase-3和Caspase-9的mRNA表達(dá)水平顯著升高，分別為NG組的3.5倍、3.2倍和3.0倍，Bcl-2的mRNA表達(dá)水平則降低了約60%。這些結(jié)果表明，高糖環(huán)境能夠顯著誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化，促進(jìn)足細(xì)胞凋亡。當(dāng)給予左卡尼汀干預(yù)后，各左卡尼汀劑量組（LCL、LCM、LCH組）足細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax、Bak、Bim的表達(dá)均呈現(xiàn)出不同程度的下降，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)則有所上調(diào)。其中，LCH組的作用最為顯著，Bax的相對(duì)表達(dá)量相較于HG組降低了約45%，Bak的相對(duì)表達(dá)量降低了約40%，Bim的相對(duì)表達(dá)量降低了約50%，Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量增加了約80%。在基因水平上，LCH組中Bax、Caspase-3和Caspase-9的mRNA表達(dá)水平相較于HG組分別降低了約50%、45%和40%，Bcl-2的mRNA表達(dá)水平則增加了約1.2倍。這表明左卡尼汀能夠有效調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，抑制足細(xì)胞凋亡，且呈一定的劑量依賴性。左卡尼汀對(duì)凋亡相關(guān)蛋白和基因的調(diào)控作用可能與多種機(jī)制有關(guān)。左卡尼汀可以通過減少高糖誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，降低CHOP的表達(dá)，從而抑制Bax的上調(diào)和Bcl-2的下調(diào)，維持細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡。左卡尼汀還具有抗氧化作用，能夠減少高糖刺激下足細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧（ROS），降低ROS對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子的損傷，抑制凋亡相關(guān)信號(hào)通路的激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)。研究表明，左卡尼汀可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，減少ROS的積累，從而抑制足細(xì)胞凋亡。左卡尼汀可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，為細(xì)胞提供充足的能量，維持細(xì)胞的正常生理功能，減少凋亡的發(fā)生。在高糖環(huán)境下，細(xì)胞能量代謝紊亂，左卡尼汀能夠促進(jìn)脂肪酸氧化，提高細(xì)胞內(nèi)ATP的水平，改善細(xì)胞的能量狀態(tài)，從而抑制凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，保護(hù)足細(xì)胞免受凋亡的影響。5.2阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑左卡尼汀對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的抑制作用，在很大程度上是通過阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的過程中扮演著關(guān)鍵角色，而左卡尼汀能夠針對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù)，從而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。高糖環(huán)境下，足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活后，會(huì)通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中PERK-CHOP通路和IRE1-JNK通路是兩條重要的凋亡信號(hào)通路。在PERK-CHOP通路中，高糖刺激導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白積聚，激活PERK，使其磷酸化eIF2α。磷酸化的eIF2α抑制大多數(shù)蛋白質(zhì)的翻譯起始，但選擇性地促進(jìn)ATF4的翻譯。ATF4作為一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合到CHOP基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)CHOP的表達(dá)。CHOP的上調(diào)會(huì)抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)促凋亡蛋白Bim的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡被打破，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在IRE1-JNK通路中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活I(lǐng)RE1，使其發(fā)生寡聚化和自身磷酸化，激活的IRE1招募TRAF2，形成IRE1-TRAF2復(fù)合物。該復(fù)合物進(jìn)一步激活A(yù)SK1，ASK1進(jìn)而激活JNK，JNK通過磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子和凋亡相關(guān)蛋白，如c-Jun、ATF2等，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。左卡尼汀能夠有效抑制PERK-CHOP通路的激活。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，給予左卡尼汀干預(yù)后，檢測發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的PERK磷酸化水平顯著降低，eIF2α的磷酸化水平也隨之下降。這表明左卡尼汀能夠抑制PERK的激活，從而減少eIF2α的磷酸化，恢復(fù)蛋白質(zhì)的正常翻譯過程，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊負(fù)擔(dān)。左卡尼汀還能夠降低ATF4和CHOP的表達(dá)。通過Westernblot和RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，在左卡尼汀處理組中，ATF4和CHOP的蛋白和mRNA表達(dá)水平相較于高糖組明顯降低。這說明左卡尼汀可以抑制PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路的激活，減少CHOP的表達(dá)，從而抑制促凋亡蛋白Bim的上調(diào)和抗凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)，維持細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，抑制細(xì)胞凋亡。研究表明，在高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中，加入左卡尼汀后，Bcl-2的表達(dá)顯著增加，Bim的表達(dá)明顯減少，細(xì)胞凋亡率顯著降低。左卡尼汀還能阻斷IRE1-JNK通路的激活。在左卡尼汀干預(yù)下，高糖誘導(dǎo)的IRE1磷酸化水平明顯下降，IRE1與TRAF2的結(jié)合減少，從而抑制了ASK1的激活。JNK的磷酸化水平也顯著降低，下游凋亡相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制。通過免疫熒光染色和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，左卡尼汀處理組中，JNK的磷酸化水平相較于高糖組降低了約50%，c-Jun和ATF2的磷酸化水平也明顯下降。這表明左卡尼汀能夠抑制IRE1-JNK信號(hào)通路的激活，減少凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抗凋亡作用。除了對(duì)PERK-CHOP和IRE1-JNK通路的抑制作用外，左卡尼汀還可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的其他分子和信號(hào)通路來阻斷凋亡途徑。左卡尼汀可以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放，從而抑制鈣蛋白酶的激活，減少Caspase-12的切割和激活，阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的Caspase-12依賴的凋亡途徑。研究發(fā)現(xiàn)，在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型中，左卡尼汀能夠降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，抑制Caspase-12的活性，減少細(xì)胞凋亡。左卡尼汀還可能通過調(diào)節(jié)線粒體功能，減少線粒體膜電位的下降和細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制內(nèi)源性線粒體凋亡途徑的激活。左卡尼汀可以促進(jìn)線粒體的脂肪酸氧化，提高線粒體的能量產(chǎn)生，增強(qiáng)線粒體的穩(wěn)定性，減少線粒體膜的通透性轉(zhuǎn)換，從而抑制細(xì)胞色素C的釋放，降低Caspase-9和Caspase-3的激活，發(fā)揮抗凋亡作用。5.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床意義通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，本研究明確了左卡尼汀對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡具有顯著的抑制作用。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組（NG組）相比，高糖組（HG組）足細(xì)胞凋亡率顯著升高，達(dá)到（35.6±3.2）%，而給予左卡尼汀干預(yù)后，各左卡尼汀劑量組（LCL、LCM、LCH組）足細(xì)胞凋亡率均明顯降低，LCH組足細(xì)胞凋亡率降至（15.8±2.1）%，與HG組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。這一結(jié)果直觀地表明左卡尼汀能夠有效減少高糖環(huán)境下足細(xì)胞的凋亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了左卡尼汀的抗凋亡作用。在糖尿病模型小鼠中，糖尿病模型組（DM組）腎臟組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而左卡尼汀治療組（LCT組）腎臟組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著減少。通過TUNEL染色觀察發(fā)現(xiàn)，DM組腎臟組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例為（25.3±2.5）%，而LCT組該比例降至（10.5±1.8）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明左卡尼汀在體內(nèi)也能夠抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，對(duì)糖尿病腎病起到一定的保護(hù)作用。左卡尼汀抑制高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的作用具有重要的臨床意義。在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中，足細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障損傷和腎功能惡化的關(guān)鍵因素之一。隨著足細(xì)胞凋亡的不斷加劇，足細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，足突融合，腎小球?yàn)V過屏障的完整性遭到破壞，大量蛋白質(zhì)從尿液中丟失，進(jìn)而引發(fā)蛋白尿、腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化等一系列病理改變，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。而左卡尼汀能夠抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，減少足細(xì)胞的丟失，維持腎小球?yàn)V過屏障的完整性，從而延緩糖尿病腎病的進(jìn)展。在臨床治療中，目前針對(duì)糖尿病腎病的治療手段有限，主要以控制血糖、血壓和血脂等綜合治療為主，但仍難以有效阻止疾病的進(jìn)