ICS65.020.20DB12Techniquestandardforliquidspawnproductionofediblemushroom天津市市場監(jiān)督管理委員會發(fā)布IDB12/T1012—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市林業(yè)果樹研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：羅瑩、周永斌、錢磊、劉連強、王文治、李鳳美、訾惠君、李淑芳。DB12/T1012—20201食用菌液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食用菌液體菌種的生產(chǎn)場地、設(shè)備設(shè)施、工藝流程、生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程、使用方法以及標(biāo)簽、貯存。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食用菌液體菌種的生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T12728食用菌術(shù)語GB50073潔凈廠房設(shè)計規(guī)范NY5099無公害食品食用菌栽培基質(zhì)安全技術(shù)要求NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義GB/T12728界定的術(shù)語以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1罐壓jar-pressure食用菌液體菌種培養(yǎng)過程中培養(yǎng)器保持的空氣壓力，單位：Mpa。3.2通風(fēng)量quantityofaeration液體菌種培養(yǎng)過程中每分鐘通入培養(yǎng)基中的無菌空氣的量。用V/V（培養(yǎng)基體積/通入空氣體積）標(biāo)示。3.3接入培養(yǎng)器中的菌種的數(shù)量，以菌種體積與培養(yǎng)基體積的百分比標(biāo)示。3.4液體菌種菌齡ageofliquidspawn菌種接入培養(yǎng)基開始計算的液體菌種生長發(fā)育時間。3.5空消sterilizingfermentor利用蒸汽對無物料的發(fā)酵罐及附屬設(shè)備進(jìn)行加熱滅菌的過程。3.6實消intermittentsterilizationDB12/T1012—20202將蒸汽通入裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行加熱滅菌的過程。3.7搖瓶液體種liquidspawnin裝在玻璃三角瓶內(nèi)在搖床上恒溫振蕩培養(yǎng)的液體菌種。4要求4.1生產(chǎn)場地4.1.1基本要求環(huán)境應(yīng)干凈整潔、空氣優(yōu)良、通風(fēng)良好、水源充足且符合GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)、排水暢通、電源充足、交通便利。4.1.2環(huán)境衛(wèi)生要求應(yīng)符合NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程的規(guī)定。4.2生產(chǎn)設(shè)備設(shè)施4.2.1廠房設(shè)置和布局應(yīng)符合NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程要求。4.2.2發(fā)酵間應(yīng)按照GB50073潔凈廠房設(shè)計規(guī)范執(zhí)行，地面應(yīng)能防水、防腐蝕、防滲漏、防滑，易清洗，排水坡度1.0%～1.5%，排水溝必須是圓弧式不銹鋼的明溝；墻角為圓角，墻壁和天花板應(yīng)能防潮、防霉、防水、易清洗。4.2.3接種間應(yīng)按照GB50073潔凈廠房設(shè)計規(guī)范執(zhí)行，液體菌種接種間設(shè)置緩沖間；入口處設(shè)置洗手、消毒和干手設(shè)施；車間設(shè)封閉式廢物桶，安裝排氣管道或者排風(fēng)設(shè)備，門窗應(yīng)設(shè)置防蚊蠅紗網(wǎng)。4.2.4主要儀器設(shè)備應(yīng)配備水處理設(shè)備、液體菌種培養(yǎng)器、空氣壓縮機、空氣過濾器、液體菌種接種器、高壓蒸汽滅菌鍋、蒸汽鍋爐、凈化工作臺、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、顯微鏡、磁力攪拌機、磅秤、天平、酸度計等。在經(jīng)常停電的地方應(yīng)有自備電源（發(fā)電機）。4.2.5主要生產(chǎn)用具應(yīng)配備玻璃三角瓶、接種器、試管、量杯量瓶、玻璃漏斗、定量定性濾紙、精密pH試紙等生物實驗室常規(guī)用品。4.3培養(yǎng)基質(zhì)原材料應(yīng)符合NY5099無公害食品食用菌栽培基質(zhì)安全技術(shù)要求的規(guī)定。4.4生產(chǎn)品種4.4.1選用高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強、商品性好的食用菌品種，使用經(jīng)省級以上農(nóng)作物品種審定委員會登記的品種，并且從具有相應(yīng)技術(shù)資質(zhì)的供種單位引種且種性清楚。4.4.2菌種生產(chǎn)過程應(yīng)符合NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程的要求。5液體菌種生產(chǎn)工藝5.1工藝流程見圖1。DB12/T1012—20203搖瓶菌種←活化←母種↓原料→培養(yǎng)基配制→空消→實消→冷卻→種子罐→發(fā)酵培養(yǎng)→液體菌種↑無菌空氣圖1液體菌種生產(chǎn)工藝流程5.2制備母種5.2.1容器使用18mm×180mm或20mm×200mm玻璃試管,試管應(yīng)保持清潔、干燥。5.2.2培養(yǎng)基根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基，常用的配方參見附錄A。5.2.3滅菌高壓蒸汽滅菌，在121℃,0.11MPa～0.12MPa的壓力下，維持30min。5.2.4接種在超凈工作臺上嚴(yán)格按無菌操作接種。接種完成后，在試管上注明菌種名稱、接種時間。5.2.5培養(yǎng)根據(jù)食用菌菌種的生長要求，給予其適宜的培養(yǎng)溫度22℃~28℃,保持空氣相對濕度在65%～75%，避光培養(yǎng)。5.2.6留樣菌種應(yīng)留樣備查，留樣的數(shù)量應(yīng)以每個批次母種3支～5支。草菇在13℃~16℃貯存，其他種類母種于4℃~6℃下貯存，貯存至該批菌種出第一潮菇。5.3制備搖瓶液體種5.3.1容器采用1000ml的常規(guī)三角瓶，三角瓶應(yīng)保持清潔、干燥。5.3.2裝液量每瓶裝量為400ml，用通氧砂芯硅膠塞封口。5.3.3培養(yǎng)基根據(jù)食用菌品種的營養(yǎng)需要配制不同的搖瓶培養(yǎng)基，常用的配方參見附錄B。5.3.4滅菌同5.2.3高壓蒸汽滅菌法。5.3.5接種DB12/T1012—20204將滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至30℃以下進(jìn)行接種，每瓶接入0.5cm2的瓊脂斜面母種3塊～5塊。5.3.6培養(yǎng)將接種后的三角瓶放到搖床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，根據(jù)食用菌品種的不同生長要求，給予其適宜的培養(yǎng)溫度22℃~28℃,保持空氣相對濕度在65%～75%，避光培養(yǎng)。頻率隨具體品種而定。5.4發(fā)酵罐檢查與清洗5.4.1檢查檢查罐上全部閥門、安全閥、壓力表，要求完好，工作正常。5.4.2清洗對罐體內(nèi)、外和全部閥門用流水進(jìn)行沖洗，達(dá)到無死角、內(nèi)壁無任何培養(yǎng)料殘余物的潔凈程度。5.5煮罐和空消培養(yǎng)器初次使用、出現(xiàn)染菌、長期放置、更換品種時，都要求煮罐和空消進(jìn)行滅菌。有內(nèi)置電加熱棒的培養(yǎng)器加水至容積的80%加熱至121℃,滅菌40min。用外源蒸汽滅菌的培養(yǎng)器，蒸汽壓力達(dá)到0.11Mpa～0.12Mpa、溫度121℃~124℃、滅菌40min。5.6液體菌種培養(yǎng)基配方具體配方根據(jù)原料資源和生產(chǎn)品種的營養(yǎng)需求，使用適宜的配方，準(zhǔn)確掌握加水量，加入適量的消泡劑。用水應(yīng)符合GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。常用的配方見附錄B。5.7投料與定容將配制好的培養(yǎng)基，加適量的水，攪拌均勻，放入培養(yǎng)器中，加水定容，培養(yǎng)基投料量為罐體總?cè)莘e的70%～80%，然后擰緊上料口蓋。5.8培養(yǎng)器實消和培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)器內(nèi)蒸汽壓力達(dá)到0.11Mpa～0.12Mpa，培養(yǎng)基溫度達(dá)到121℃~124℃、保持時間40min。5.9冷卻降溫滅菌結(jié)束通過冷卻系統(tǒng)，使培養(yǎng)基降溫至24℃~28℃。保持壓力平穩(wěn)，防止罐壓回零。5.10接種菌種罐接種處設(shè)置百級層流罩，用帶有手柄的內(nèi)徑略大于接種口的鐵絲圈纏繞紗布，蘸上95%的酒精，套在接種口上點燃。打開液體搖瓶種瓶塞，用火焰灼燒瓶口30～40秒，打開接種口蓋，將液體搖瓶種迅速倒入罐中，迅速蓋好接種口，擰緊。5.11液體菌種培養(yǎng)條件5.11.1通風(fēng)量通過進(jìn)氣閥和排氣閥將通風(fēng)量調(diào)節(jié)至1：0.5V／V～1：1.2V／V(料液體積／空氣體積)。5.11.2罐壓DB12/T1012—20205罐壓保持在0.02Mpa～0.04Mpa。5.11.3溫度常見品種培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)在24℃~28℃,少數(shù)品種根據(jù)特殊需求具體設(shè)定。5.11.4培養(yǎng)時間菌種培養(yǎng)時間由品種而定。5.12留樣與檢測5.12.1留樣搖瓶液體菌種樣品；培養(yǎng)器滅菌后的空白培養(yǎng)基樣品；培養(yǎng)過程中定期從培養(yǎng)器中取出的樣品，用作鏡檢和其它理化指標(biāo)測定。上述樣品放4℃冰箱內(nèi)保存一周以上。5.12.2無菌檢測對上述留存樣品應(yīng)在無菌檢測瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，在28℃恒溫培養(yǎng)2d～5d，每天觀察菌落生長情況，若劃痕上沒有細(xì)菌、霉菌、酵母菌菌落生長，則表明該樣品無雜菌。對留樣樣品應(yīng)在取樣后及時鏡檢，確定菌絲生長發(fā)育狀態(tài)和有無雜菌污染。5.12.3pH值采用酸度計測定，應(yīng)在正常發(fā)酵液PH值范圍之內(nèi)。5.12.4菌絲濕重采用Φ15cm的定量濾紙，將100ml液體菌液，過濾至無水滴滴下，稱重后減去濾紙濕重。5.12.5鏡檢觀察菌絲生長狀況和有無雜菌污染。5.13液體菌種放罐指標(biāo)5.13.1經(jīng)鏡檢和其它理化指標(biāo)等方法檢驗質(zhì)量合格即可放罐接種。5.13.2感官指標(biāo)見表1。表1感官指標(biāo)5.13.3理化指標(biāo)見表2表2理化指標(biāo)6>8可見食用菌菌種液體培養(yǎng)中特有的菌絲形態(tài)，球狀和叢狀菌絲體大量分布，菌絲粗壯，菌絲內(nèi)原生質(zhì)分布均勻、染有食用菌菌絲生長，劃痕處無霉菌、酵母菌、細(xì)菌菌落生6使用方法將待接種的食用菌三級固體種袋（瓶）或栽培袋放置在輸送帶，輸入至無菌接種區(qū)。在接種區(qū)用接種器將液體菌種注入，每個接種點15ml～30ml。移至發(fā)菌室培養(yǎng)。7標(biāo)簽、貯存7.1標(biāo)志注明菌種種類、級別、品種、生產(chǎn)單位、接種日期。7.2貯存7.2.1搖瓶種保存方法搖瓶培養(yǎng)的液體菌種用牛皮紙包好，放在4℃的溫度下可保存5天～7天。7.2.2種子罐液體菌種保存方法15℃~20℃室溫可保存1天～2天。DB12/T1012—20207常用母種培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(簡稱PDA培養(yǎng)基)馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂(凝固劑)20g，水1000mL，pH值依據(jù)菌種調(diào)配。綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂