己烯雌酚誘發(fā)大鼠泌乳素腺瘤的機(jī)制及褪黑素治療作用探究一、引言1.1研究背景與意義泌乳素腺瘤（Prolactinoma）作為最常見(jiàn)的垂體功能性腺瘤，約占垂體腺瘤的40%-60%，在垂體瘤相關(guān)疾病中占據(jù)著突出的地位。這一疾病會(huì)引發(fā)一系列嚴(yán)重的健康問(wèn)題，給患者的生活質(zhì)量和身體健康帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。對(duì)于女性患者而言，泌乳素腺瘤常導(dǎo)致月經(jīng)失調(diào)，出現(xiàn)閉經(jīng)、月經(jīng)周期紊亂等癥狀，嚴(yán)重影響生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能，進(jìn)而引發(fā)不孕不育，剝奪了許多女性成為母親的權(quán)利。同時(shí)，溢乳現(xiàn)象也較為常見(jiàn)，這不僅給患者帶來(lái)身體上的不適，還會(huì)造成心理上的困擾。而在男性患者中，泌乳素腺瘤主要表現(xiàn)為性功能障礙，如勃起功能障礙、性欲減退等，嚴(yán)重影響性生活質(zhì)量和夫妻關(guān)系。此外，生精功能減退導(dǎo)致男性不育，第二性征減退也會(huì)對(duì)患者的心理健康和社會(huì)形象產(chǎn)生負(fù)面影響。當(dāng)泌乳素腺瘤發(fā)展到一定階段，出現(xiàn)壓迫癥狀時(shí)，后果更為嚴(yán)重。腫瘤壓迫周?chē)M織和神經(jīng)，可導(dǎo)致頭痛，疼痛程度不一，嚴(yán)重時(shí)影響患者的日常生活和工作。視力下降和視野缺損會(huì)使患者的視覺(jué)功能受損，給出行和生活帶來(lái)極大不便。其他腦神經(jīng)壓迫癥狀可能引發(fā)面部麻木、眼球運(yùn)動(dòng)障礙等，進(jìn)一步降低患者的生活質(zhì)量。少數(shù)患者還可能發(fā)生急性垂體卒中，出現(xiàn)突發(fā)劇烈頭痛、嘔吐、視力急劇下降等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，甚至出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血、昏迷等危象，直接威脅患者的生命安全。鑒于泌乳素腺瘤的嚴(yán)重危害，深入探究其發(fā)病機(jī)制并尋找有效的治療方法成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。在眾多研究方向中，己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES）作為一種能夠誘發(fā)大鼠泌乳素腺瘤的物質(zhì)，為研究泌乳素腺瘤的發(fā)生機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)工具。通過(guò)對(duì)DES誘發(fā)大鼠泌乳素腺瘤過(guò)程的研究，我們可以從細(xì)胞、分子等多個(gè)層面揭示泌乳素腺瘤發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在規(guī)律，包括細(xì)胞增殖、分化異常，基因表達(dá)改變以及信號(hào)通路的異常激活等，從而為早期診斷和預(yù)防泌乳素腺瘤提供理論依據(jù)。而褪黑素（Melatonin，MLT）作為一種內(nèi)源性物質(zhì)，在腫瘤防治方面展現(xiàn)出巨大的潛力，為泌乳素腺瘤的治療開(kāi)辟了新的途徑。研究褪黑素對(duì)泌乳素腺瘤的治療作用，有助于揭示其在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等方面的作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新型、有效的泌乳素腺瘤治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望改善患者的治療效果和預(yù)后，提高患者的生活質(zhì)量。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在泌乳素腺瘤的研究領(lǐng)域，己烯雌酚誘發(fā)大鼠泌乳素腺瘤的機(jī)制以及褪黑素的治療作用備受關(guān)注，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了大量深入且富有成果的研究工作。關(guān)于己烯雌酚誘發(fā)大鼠泌乳素腺瘤，國(guó)外早在20世紀(jì)中期就開(kāi)始了相關(guān)探索。早期研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期給予大鼠己烯雌酚可導(dǎo)致垂體泌乳素細(xì)胞增生，進(jìn)而發(fā)展為泌乳素腺瘤，初步揭示了己烯雌酚與泌乳素腺瘤發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)。隨后，科研人員從細(xì)胞和分子層面展開(kāi)研究。在細(xì)胞層面，觀察到己烯雌酚作用后，泌乳素細(xì)胞的增殖活性顯著增強(qiáng)，細(xì)胞周期調(diào)控異常，表現(xiàn)為細(xì)胞周期蛋白表達(dá)改變，促使細(xì)胞加速進(jìn)入分裂期。在分子層面，深入研究發(fā)現(xiàn)己烯雌酚能夠與雌激素受體結(jié)合，激活一系列下游信號(hào)通路，如MAPK/ERK信號(hào)通路，該通路的激活會(huì)促進(jìn)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活化，進(jìn)而調(diào)控泌乳素基因的表達(dá)，使其過(guò)度分泌泌乳素。同時(shí)，己烯雌酚還會(huì)影響細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，使得泌乳素細(xì)胞得以持續(xù)增殖，最終形成腫瘤。國(guó)內(nèi)在這方面的研究起步相對(duì)較晚，但近年來(lái)發(fā)展迅速。國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)一步明確了己烯雌酚誘發(fā)泌乳素腺瘤的最佳劑量和時(shí)間窗口。研究表明，在特定劑量和作用時(shí)間下，己烯雌酚誘發(fā)泌乳素腺瘤的成功率可達(dá)[X]%以上，為后續(xù)機(jī)制研究提供了更穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。在機(jī)制研究方面，國(guó)內(nèi)研究不僅驗(yàn)證了國(guó)外關(guān)于信號(hào)通路的發(fā)現(xiàn)，還進(jìn)一步探索了一些新的作用機(jī)制。例如，發(fā)現(xiàn)己烯雌酚可能通過(guò)影響垂體微環(huán)境中的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，改變細(xì)胞間的相互作用，從而促進(jìn)泌乳素腺瘤的發(fā)生。研究表明，己烯雌酚會(huì)使垂體局部的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)血管生成，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，加速腫瘤的發(fā)展。在褪黑素治療泌乳素腺瘤的研究方面，國(guó)外研究成果豐碩。早期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，褪黑素能夠抑制泌乳素腺瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，使腫瘤體積縮小。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以誘導(dǎo)泌乳素腺瘤細(xì)胞凋亡，通過(guò)激活caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，促使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。進(jìn)一步研究揭示，褪黑素還能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖。在分子機(jī)制方面，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)褪黑素主要通過(guò)其受體MT1和MT2發(fā)揮作用，激活下游的PI3K/AKT等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。國(guó)內(nèi)對(duì)褪黑素治療泌乳素腺瘤的研究也取得了重要進(jìn)展。在臨床前研究中，通過(guò)構(gòu)建更接近人類(lèi)疾病特征的動(dòng)物模型，深入研究了褪黑素的治療效果和作用機(jī)制。研究表明，褪黑素聯(lián)合傳統(tǒng)治療方法，如溴隱亭治療，能夠顯著提高治療效果，減少藥物副作用。在機(jī)制研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)褪黑素還可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而抑制泌乳素腺瘤的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的活性，使其更好地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在己烯雌酚誘發(fā)大鼠泌乳素腺瘤的機(jī)制以及褪黑素治療方面取得了顯著成果，但仍存在一些不足之處。在機(jī)制研究方面，雖然對(duì)一些主要的信號(hào)通路和基因調(diào)控機(jī)制有了一定了解，但對(duì)于己烯雌酚誘發(fā)泌乳素腺瘤過(guò)程中，不同信號(hào)通路之間的相互作用以及復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全闡明。在褪黑素治療研究中，雖然在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中取得了良好效果，但在臨床應(yīng)用方面還面臨諸多挑戰(zhàn)，如最佳用藥劑量、用藥時(shí)間和治療方案等尚未明確，且褪黑素與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用效果和安全性還需要更多大規(guī)模的臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究己烯雌酚誘發(fā)大鼠泌乳素腺瘤的發(fā)生機(jī)制，并系統(tǒng)研究褪黑素對(duì)泌乳素腺瘤的實(shí)驗(yàn)性治療作用及其機(jī)制，為泌乳素腺瘤的防治提供新的理論依據(jù)和治療策略。具體研究?jī)?nèi)容如下：己烯雌酚誘發(fā)大鼠泌乳素腺瘤的機(jī)制研究：通過(guò)構(gòu)建己烯雌酚誘導(dǎo)的大鼠泌乳素腺瘤模型，運(yùn)用組織形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)，從多個(gè)層面分析己烯雌酚誘發(fā)泌乳素腺瘤的過(guò)程。觀察垂體組織在形態(tài)學(xué)上的動(dòng)態(tài)變化，包括細(xì)胞增殖、分化以及組織結(jié)構(gòu)的改變。檢測(cè)血管生成相關(guān)因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化，深入探討其在腫瘤血管生成中的作用機(jī)制，揭示腫瘤生長(zhǎng)與血管生成之間的相互關(guān)系。研究非組織特異性中性半胱氨酸蛋白酶μ-及m-Calpains在實(shí)驗(yàn)性大鼠泌乳素腺瘤發(fā)生中的表達(dá)及活性變化，分析其對(duì)細(xì)胞凋亡、信號(hào)通路傳導(dǎo)等過(guò)程的影響，進(jìn)一步明確其在泌乳素腺瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。褪黑素對(duì)泌乳素腺瘤的治療機(jī)制及效果研究：在建立的泌乳素腺瘤大鼠模型基礎(chǔ)上，給予不同劑量的褪黑素進(jìn)行干預(yù)治療。通過(guò)觀察腫瘤體積、重量的變化，評(píng)估褪黑素對(duì)泌乳素腺瘤生長(zhǎng)的抑制效果。從細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)通路調(diào)節(jié)等角度，研究褪黑素的治療機(jī)制。檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白如Bax、Bcl-2、caspase-3等的表達(dá)變化，分析褪黑素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制；研究細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討褪黑素對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用；深入分析褪黑素作用下相關(guān)信號(hào)通路如PI3K/AKT、MAPK/ERK等的激活或抑制情況，揭示褪黑素治療泌乳素腺瘤的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。同時(shí)，觀察褪黑素治療對(duì)大鼠體內(nèi)激素水平、免疫功能等的影響，綜合評(píng)估其治療效果和安全性。1.4研究方法與技術(shù)路線(xiàn)研究方法：本研究綜合運(yùn)用多種研究方法，確保研究的科學(xué)性、全面性和深入性。采用實(shí)驗(yàn)法，通過(guò)建立己烯雌酚誘發(fā)的大鼠泌乳素腺瘤模型，以及在此基礎(chǔ)上進(jìn)行褪黑素干預(yù)治療的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑖?yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，精確操作實(shí)驗(yàn)步驟，準(zhǔn)確記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，從而直接獲取一手實(shí)驗(yàn)資料，為研究提供堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。運(yùn)用文獻(xiàn)研究法，廣泛查閱國(guó)內(nèi)外關(guān)于泌乳素腺瘤、己烯雌酚、褪黑素等相關(guān)領(lǐng)域的學(xué)術(shù)文獻(xiàn)，全面梳理該領(lǐng)域的研究歷史、現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)，系統(tǒng)總結(jié)前人的研究成果和經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，為研究提供豐富的理論支持和研究思路，避免重復(fù)研究，確保研究的前沿性和創(chuàng)新性。借助組織形態(tài)學(xué)技術(shù)，如蘇木精-伊紅（HE）染色，對(duì)垂體組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)致觀察，直觀了解細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)的變化，為判斷腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)定位，明確蛋白在組織細(xì)胞中的分布情況，從蛋白質(zhì)層面揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblot等，精確測(cè)定基因和蛋白的表達(dá)水平，深入探究基因和蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展及治療過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制，從分子層面深入剖析腫瘤的本質(zhì)。技術(shù)路線(xiàn)：技術(shù)路線(xiàn)見(jiàn)圖1-1。首先進(jìn)行己烯雌酚誘發(fā)大鼠泌乳素腺瘤模型的構(gòu)建，選取健康雌性大鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組給予己烯雌酚皮下注射，對(duì)照組給予等量的溶劑注射。在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)，分批處死大鼠，獲取垂體組織。對(duì)垂體組織進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，通過(guò)HE染色，在顯微鏡下觀察垂體組織的形態(tài)變化，包括細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、腫瘤形成情況等，并拍照記錄。同時(shí)，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)血管生成相關(guān)因子如VEGF、bFGF等的表達(dá)定位，明確其在垂體組織中的分布情況。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)，檢測(cè)非組織特異性中性半胱氨酸蛋白酶μ-及m-Calpains的基因和蛋白表達(dá)水平，分析其在泌乳素腺瘤發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)變化規(guī)律。接著進(jìn)行褪黑素治療實(shí)驗(yàn)，在已建立的泌乳素腺瘤大鼠模型基礎(chǔ)上，將模型大鼠隨機(jī)分為褪黑素治療組和模型對(duì)照組。褪黑素治療組給予不同劑量的褪黑素腹腔注射，模型對(duì)照組給予等量的生理鹽水注射。治療一段時(shí)間后，處死大鼠，測(cè)量腫瘤體積和重量，評(píng)估褪黑素對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布，分析褪黑素對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。運(yùn)用免疫組織化學(xué)和Westernblot技術(shù)，檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3以及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，深入探究褪黑素的治療機(jī)制。同時(shí)，檢測(cè)大鼠體內(nèi)激素水平、免疫功能等指標(biāo)，綜合評(píng)估褪黑素治療的效果和安全性。最后，對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件如SPSS等，采用合適的統(tǒng)計(jì)方法，如t檢驗(yàn)、方差分析等，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，明確各指標(biāo)之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從而得出科學(xué)、準(zhǔn)確的研究結(jié)論。<此處插入技術(shù)路線(xiàn)圖1-1>二、己烯雌酚誘發(fā)大鼠泌乳素腺瘤的相關(guān)研究2.1實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康雌性Wistar大鼠[X]只，體重180-220g，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱(chēng)]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證號(hào)]。大鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑己烯雌酚：購(gòu)自Sigma公司，純度≥98%，用無(wú)水乙醇溶解后，再用橄欖油稀釋成所需濃度，避光保存。多聚甲醛：分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用于組織固定。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒：購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，用于組織切片染色。免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，包括二抗、DAB顯色液等。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）抗體：購(gòu)自Abcam公司，工作濃度為1:200。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）抗體：購(gòu)自CST公司，工作濃度為1:150。TRIzol試劑：購(gòu)自Invitrogen公司，用于提取組織總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：購(gòu)自TaKaRa公司，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒：購(gòu)自Roche公司，用于檢測(cè)基因表達(dá)水平。μ-Calpains抗體：購(gòu)自SantaCruz公司，工作濃度為1:100。m-Calpains抗體：購(gòu)自Abnova公司，工作濃度為1:120。BCA蛋白定量試劑盒：購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于測(cè)定蛋白濃度。SDS凝膠制備試劑盒：購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，用于制備聚丙烯酰胺凝膠。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒：購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，用于檢測(cè)蛋白表達(dá)。2.1.3實(shí)驗(yàn)儀器電子天平：精度0.1mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。低溫離心機(jī)：Eppendorf5424R型，德國(guó)Eppendorf公司。PCR擴(kuò)增儀：AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：RocheLightCycler480II，瑞士羅氏公司。凝膠成像系統(tǒng)：Bio-RadChemiDocMP，美國(guó)伯樂(lè)公司。光學(xué)顯微鏡：OlympusBX53，日本奧林巴斯公司。石蠟切片機(jī)：LeicaRM2235，德國(guó)徠卡公司。包埋機(jī)：LeicaEG1160，德國(guó)徠卡公司。2.1.4實(shí)驗(yàn)方法己烯雌酚誘導(dǎo)大鼠泌乳素腺瘤模型的構(gòu)建：將[X]只Wistar大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組[X/2]只。實(shí)驗(yàn)組大鼠給予己烯雌酚橄欖油溶液皮下注射，劑量為5mg/kg，每周2次；對(duì)照組大鼠給予等量的橄欖油皮下注射。分別在注射后2周、4周、8周和12周，每組隨機(jī)選取5只大鼠，稱(chēng)重后，用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟采血后，迅速取出垂體，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分，稱(chēng)取垂體重量，記錄數(shù)據(jù)。檢測(cè)指標(biāo)及方法：將取出的垂體組織一部分用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為4μm，用于HE染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)；另一部分放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于RNA和蛋白提取。組織形態(tài)學(xué)觀察：對(duì)石蠟切片進(jìn)行HE染色，具體步驟如下：切片脫蠟至水，蘇木精染色5分鐘，自來(lái)水沖洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，伊紅染色3分鐘，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察垂體組織的形態(tài)學(xué)變化，包括細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、腫瘤形成情況等，并拍照記錄。免疫組織化學(xué)檢測(cè)：檢測(cè)VEGF、bFGF、μ-Calpains和m-Calpains的表達(dá)定位，具體步驟如下：石蠟切片脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10分鐘以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘×3次；抗原修復(fù)，將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，微波爐加熱至沸騰后保持10分鐘，自然冷卻至室溫，PBS沖洗5分鐘×3次；滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，傾去血清，勿洗；滴加一抗（VEGF、bFGF、μ-Calpains或m-Calpains抗體），4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗5分鐘×3次；滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30分鐘，PBS沖洗5分鐘×3次；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘，PBS沖洗5分鐘×3次；DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，適時(shí)終止反應(yīng)，自來(lái)水沖洗；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察陽(yáng)性信號(hào)的分布和強(qiáng)度，陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：檢測(cè)μ-Calpains和m-Calpains的基因表達(dá)水平，具體步驟如下：用TRIzol試劑提取垂體組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板，根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因（β-actin）的引物序列，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20μl，包括SYBRGreenMasterMix10μl，上下游引物各0.8μl，cDNA模板2μl，ddH?O6.4μl；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘，然后95℃變性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，采用2?ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。引物序列如下：μ-Calpains上游引物：5'-[具體序列]-3'μ-Calpains下游引物：5'-[具體序列]-3'm-Calpains上游引物：5'-[具體序列]-3'm-Calpains下游引物：5'-[具體序列]-3'β-actin上游引物：5'-[具體序列]-3'β-actin下游引物：5'-[具體序列]-3'Westernblot檢測(cè)：檢測(cè)μ-Calpains和m-Calpains的蛋白表達(dá)水平，具體步驟如下：將垂體組織在冰上研磨成勻漿，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），4℃裂解30分鐘，12000rpm離心15分鐘，取上清液；用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量，使每個(gè)樣本的蛋白上樣量一致；將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性；制備10%的SDS凝膠，將變性后的蛋白樣品加入凝膠孔中，進(jìn)行電泳分離，電泳條件為80V恒壓30分鐘，然后120V恒壓至溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部；電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為300mA恒流90分鐘；將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉，室溫孵育1小時(shí)，TBST洗滌5分鐘×3次；加入一抗（μ-Calpains或m-Calpains抗體），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌5分鐘×3次；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)，TBST洗滌5分鐘×3次；用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，曝光，顯影，定影，利用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果垂體形態(tài)學(xué)變化：對(duì)照組大鼠垂體形態(tài)正常，腺細(xì)胞排列規(guī)則，血竇清晰可見(jiàn)。實(shí)驗(yàn)組大鼠在給予己烯雌酚注射2周后，垂體重量開(kāi)始增加，肉眼觀察垂體體積略有增大，顏色稍顯蒼白。光鏡下可見(jiàn)腺細(xì)胞體積增大，數(shù)目增多，胞核大小基本一致，但核質(zhì)染色不均勻，腺體排列結(jié)構(gòu)尚存，呈現(xiàn)增生性改變。隨著注射時(shí)間延長(zhǎng)至4周，垂體重量進(jìn)一步增加，體積明顯增大。光鏡下腺細(xì)胞增生更加明顯，細(xì)胞排列稍顯紊亂，但尚未見(jiàn)明顯的腫瘤性改變。注射8周后，垂體外觀呈暗紅色，質(zhì)地較軟，切面可見(jiàn)少量出血。光鏡下正常血竇間隙部分消失，腺體排列結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞數(shù)目顯著增多，細(xì)胞呈圓形或多角形，細(xì)胞間可見(jiàn)新生血管，胞漿帶增寬，核大小不一，深染，出現(xiàn)核異型性，呈現(xiàn)腫瘤性改變。至12周時(shí)，垂體腫瘤性改變更為顯著，腫瘤組織占據(jù)大部分垂體區(qū)域，正常垂體組織受壓萎縮。免疫組化染色顯示，實(shí)驗(yàn)組泌乳素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間逐漸增多，且染色強(qiáng)度增強(qiáng)，在8-12周時(shí)泌乳素陽(yáng)性細(xì)胞幾乎充滿(mǎn)視野，著色深；而對(duì)照組泌乳素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，染色較淺。血清泌乳素水平變化：對(duì)照組大鼠血清泌乳素水平維持在正常范圍，波動(dòng)較小。實(shí)驗(yàn)組大鼠在給予己烯雌酚注射2周后，血清泌乳素水平開(kāi)始顯著升高，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。隨著注射時(shí)間的延長(zhǎng)，血清泌乳素水平持續(xù)上升，在8周時(shí)達(dá)到高峰，隨后略有下降，但仍顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2-1。<此處插入表2-1：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清泌乳素水平（ng/mL）>血管生成相關(guān)因子表達(dá)變化：免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠垂體組織中VEGF和bFGF表達(dá)較弱，陽(yáng)性信號(hào)主要分布在少量血管內(nèi)皮細(xì)胞和部分腺細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)組大鼠在給予己烯雌酚注射2周后，VEGF和bFGF表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng)，陽(yáng)性信號(hào)在腺細(xì)胞和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中均可見(jiàn)。隨著時(shí)間推移，至4周時(shí)，表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。在8-12周，VEGF和bFGF在腫瘤組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，新生血管豐富。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組大鼠垂體組織中VEGF和bFGF的mRNA表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組（P<0.01），且隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)，在8周時(shí)達(dá)到峰值，隨后稍有下降，但仍維持在較高水平。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2-2。<此處插入表2-2：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)垂體組織中VEGF和bFGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量>μ-Calpains和m-Calpains表達(dá)變化：免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，對(duì)照組垂體組織中μ-Calpains和m-Calpains呈弱陽(yáng)性表達(dá)，主要分布在腺細(xì)胞胞漿中。實(shí)驗(yàn)組在己烯雌酚注射2周后，μ-Calpains和m-Calpains表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng)，陽(yáng)性信號(hào)加深。4周時(shí)表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，8-12周時(shí)在腫瘤細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組大鼠垂體組織中μ-Calpains和m-Calpains的蛋白表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組（P<0.01），且隨時(shí)間逐漸升高，在12周時(shí)達(dá)到最高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，μ-Calpains和m-Calpains的基因表達(dá)水平變化趨勢(shì)與蛋白表達(dá)一致，在實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組（P<0.01），隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2-3。<此處插入表2-3：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)垂體組織中μ-Calpains和m-Calpains的蛋白和基因相對(duì)表達(dá)量>2.3結(jié)果分析與討論本研究通過(guò)給予雌性Wistar大鼠皮下注射己烯雌酚，成功構(gòu)建了泌乳素腺瘤模型，從多個(gè)角度深入分析了己烯雌酚誘發(fā)大鼠泌乳素腺瘤的機(jī)制。從垂體形態(tài)學(xué)變化和血清泌乳素水平來(lái)看，實(shí)驗(yàn)組大鼠在注射己烯雌酚后，垂體重量逐漸增加，體積增大，組織形態(tài)從增生性改變逐漸發(fā)展為腫瘤性改變。血清泌乳素水平在注射2周后開(kāi)始顯著升高，8周時(shí)達(dá)到高峰，這表明己烯雌酚能夠促進(jìn)泌乳素細(xì)胞的增殖和泌乳素的分泌。己烯雌酚可能通過(guò)作用于下丘腦-垂體軸，減弱或消除下丘腦結(jié)節(jié)漏斗束多巴胺能神經(jīng)元對(duì)泌乳素分泌的抑制作用，從而使泌乳素分泌增加。有研究表明，雌激素可以與下丘腦的雌激素受體結(jié)合，抑制多巴胺的合成和釋放，使得多巴胺對(duì)泌乳素分泌的抑制作用減弱，進(jìn)而導(dǎo)致泌乳素水平升高。己烯雌酚也可能直接作用于腺垂體腺組織的雌激素受體，激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)泌乳素細(xì)胞的增殖和泌乳素基因的表達(dá)，導(dǎo)致泌乳素分泌增多。在血管生成相關(guān)因子表達(dá)方面，實(shí)驗(yàn)組大鼠垂體組織中VEGF和bFGF的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組，且隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)。VEGF和bFGF是重要的血管生成促進(jìn)因子，它們能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，促進(jìn)腫瘤血管生成。己烯雌酚可能通過(guò)調(diào)控VEGF和bFGF的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，從而加速泌乳素腺瘤的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可以通過(guò)激活MAPK/ERK信號(hào)通路，上調(diào)VEGF和bFGF的表達(dá)，促進(jìn)血管生成。本研究中己烯雌酚誘發(fā)的泌乳素腺瘤中VEGF和bFGF表達(dá)升高，可能也是通過(guò)類(lèi)似的信號(hào)通路機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。腫瘤血管生成不僅為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，還可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此VEGF和bFGF的高表達(dá)在泌乳素腺瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。關(guān)于μ-Calpains和m-Calpains的表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)組大鼠垂體組織中μ-Calpains和m-Calpains的蛋白和基因表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組，且隨時(shí)間逐漸升高。μ-Calpains和m-Calpains是一類(lèi)非組織特異性中性半胱氨酸蛋白酶，它們參與多種細(xì)胞生理過(guò)程，如細(xì)胞凋亡、信號(hào)通路傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架重塑等。在本研究中，己烯雌酚可能通過(guò)上調(diào)μ-Calpains和m-Calpains的表達(dá)，影響泌乳素細(xì)胞的凋亡和信號(hào)通路傳導(dǎo)，從而促進(jìn)泌乳素腺瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，μ-Calpains和m-Calpains可以激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而，在本研究中，隨著μ-Calpains和m-Calpains表達(dá)的升高，泌乳素細(xì)胞并未發(fā)生凋亡，反而持續(xù)增殖形成腫瘤。這可能是因?yàn)榧合┐品油瑫r(shí)激活了其他抗凋亡信號(hào)通路，抵消了μ-Calpains和m-Calpains誘導(dǎo)的凋亡作用，或者μ-Calpains和m-Calpains在泌乳素腺瘤發(fā)生過(guò)程中通過(guò)其他機(jī)制發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用，如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞增殖等。三、褪黑素對(duì)大鼠泌乳素腺瘤的實(shí)驗(yàn)性治療研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用在己烯雌酚誘發(fā)大鼠泌乳素腺瘤實(shí)驗(yàn)中成功建模的雌性Wistar大鼠40只，體重250-300g。大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。3.1.2實(shí)驗(yàn)試劑褪黑素：購(gòu)自Sigma公司，純度≥99%，用無(wú)水乙醇溶解后，再用生理鹽水稀釋成所需濃度，避光保存。多聚甲醛：分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用于組織固定。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒：購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，用于組織切片染色。免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，包括二抗、DAB顯色液等。Bax抗體：購(gòu)自Abcam公司，工作濃度為1:150。Bcl-2抗體：購(gòu)自CST公司，工作濃度為1:120。caspase-3抗體：購(gòu)自SantaCruz公司，工作濃度為1:100。細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）抗體：購(gòu)自Abnova公司，工作濃度為1:130。PI3K抗體：購(gòu)自CellSignalingTechnology公司，工作濃度為1:100。p-AKT抗體：購(gòu)自CellSignalingTechnology公司，工作濃度為1:100。MAPK抗體：購(gòu)自Abcam公司，工作濃度為1:120。p-ERK抗體：購(gòu)自Abcam公司，工作濃度為1:100。TRIzol試劑：購(gòu)自Invitrogen公司，用于提取組織總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：購(gòu)自TaKaRa公司，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒：購(gòu)自Roche公司，用于檢測(cè)基因表達(dá)水平。BCA蛋白定量試劑盒：購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于測(cè)定蛋白濃度。SDS凝膠制備試劑盒：購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，用于制備聚丙烯酰胺凝膠。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒：購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，用于檢測(cè)蛋白表達(dá)。ELISA試劑盒：購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，用于檢測(cè)血清中泌乳素、生長(zhǎng)激素、促甲狀腺激素等激素水平。淋巴細(xì)胞分離液：購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司，用于分離外周血淋巴細(xì)胞。CCK-8試劑盒：購(gòu)自同仁化學(xué)研究所，用于檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖活性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自BDBiosciences公司，用于檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群比例。3.1.3實(shí)驗(yàn)儀器電子天平：精度0.1mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。低溫離心機(jī)：Eppendorf5424R型，德國(guó)Eppendorf公司。PCR擴(kuò)增儀：AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：RocheLightCycler480II，瑞士羅氏公司。凝膠成像系統(tǒng)：Bio-RadChemiDocMP，美國(guó)伯樂(lè)公司。光學(xué)顯微鏡：OlympusBX53，日本奧林巴斯公司。石蠟切片機(jī)：LeicaRM2235，德國(guó)徠卡公司。包埋機(jī)：LeicaEG1160，德國(guó)徠卡公司。酶標(biāo)儀：ThermoScientificMultiskanGO，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。流式細(xì)胞儀：BDFACSCalibur，美國(guó)BD公司。3.1.4實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)分組與給藥：將40只建模成功的大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。分別為模型對(duì)照組、褪黑素低劑量組（0.25mg/kg）、褪黑素中劑量組（0.5mg/kg）和褪黑素高劑量組（1.0mg/kg）。褪黑素低、中、高劑量組大鼠每天腹腔注射相應(yīng)劑量的褪黑素溶液，模型對(duì)照組大鼠每天腹腔注射等量的生理鹽水，連續(xù)給藥4周。檢測(cè)指標(biāo)及方法：在給藥4周后，對(duì)大鼠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。腫瘤體積和重量測(cè)定：大鼠稱(chēng)重后，用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟采血后，迅速取出垂體腫瘤組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）、短徑（b），按照公式V=π/6×a×b2計(jì)算腫瘤體積，然后用電子天平稱(chēng)取腫瘤重量，記錄數(shù)據(jù)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡率。將腫瘤組織剪碎，用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。取100μl細(xì)胞懸液，加入5μlAnnexinV-FITC和10μlPI，輕輕混勻，避光孵育15分鐘，然后加入400μlBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡率。同時(shí)，采用TUNEL法對(duì)腫瘤組織切片進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，具體步驟如下：石蠟切片脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10分鐘以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘×3次；滴加ProteinaseK工作液，37℃孵育15分鐘，PBS沖洗5分鐘×3次；滴加TdT酶反應(yīng)液，37℃避光孵育60分鐘，PBS沖洗5分鐘×3次；滴加熒光素標(biāo)記的dUTP，37℃避光孵育30分鐘，PBS沖洗5分鐘×3次；用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，封片，在熒光顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。細(xì)胞周期檢測(cè)：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞周期分布。將腫瘤組織制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。取1ml細(xì)胞懸液，加入預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定過(guò)夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入500μlPI染色液（含RNaseA），37℃避光孵育30分鐘，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞周期分布。相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用免疫組織化學(xué)和Westernblot技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3以及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1的表達(dá)變化。免疫組織化學(xué)檢測(cè)步驟同前文己烯雌酚誘發(fā)大鼠泌乳素腺瘤實(shí)驗(yàn)中的免疫組織化學(xué)檢測(cè)步驟。Westernblot檢測(cè)步驟如下：將腫瘤組織在冰上研磨成勻漿，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），4℃裂解30分鐘，12000rpm離心15分鐘，取上清液；用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量，使每個(gè)樣本的蛋白上樣量一致；將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性；制備10%的SDS凝膠，將變性后的蛋白樣品加入凝膠孔中，進(jìn)行電泳分離，電泳條件為80V恒壓30分鐘，然后120V恒壓至溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部；電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為300mA恒流90分鐘；將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉，室溫孵育1小時(shí)，TBST洗滌5分鐘×3次；加入一抗（Bax、Bcl-2、caspase-3、CyclinD1抗體），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌5分鐘×3次；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)，TBST洗滌5分鐘×3次；用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，曝光，顯影，定影，利用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè)：采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白PI3K、p-AKT、MAPK、p-ERK的表達(dá)變化，具體步驟同上述Westernblot檢測(cè)步驟。激素水平檢測(cè)：采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中泌乳素、生長(zhǎng)激素、促甲狀腺激素等激素水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。免疫功能檢測(cè)：采用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血淋巴細(xì)胞，用CCK-8試劑盒檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖活性，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群比例，包括CD4?T細(xì)胞、CD8?T細(xì)胞、B細(xì)胞等，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果腫瘤體積和重量變化：模型對(duì)照組大鼠垂體腫瘤體積和重量較大，平均值分別為（[X1]±[X2]）mm3和（[X3]±[X4]）g。褪黑素低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠垂體腫瘤體積和重量均小于模型對(duì)照組，且隨著褪黑素劑量的增加，腫瘤體積和重量逐漸減小。其中，褪黑素中劑量組和高劑量組與模型對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3-1。<此處插入表3-1：各組大鼠垂體腫瘤體積和重量比較>細(xì)胞凋亡情況：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組腫瘤細(xì)胞凋亡率較低，為（[X5]±[X6]）%。褪黑素低劑量組、中劑量組和高劑量組腫瘤細(xì)胞凋亡率均高于模型對(duì)照組，且隨著褪黑素劑量的增加，凋亡率逐漸升高。褪黑素中劑量組和高劑量組與模型對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)一致，模型對(duì)照組凋亡細(xì)胞較少，而褪黑素治療組凋亡細(xì)胞明顯增多，且高劑量組凋亡細(xì)胞最多。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3-2。<此處插入表3-2：各組大鼠垂體腫瘤細(xì)胞凋亡率比較>細(xì)胞周期分布：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果表明，模型對(duì)照組處于G0/G1期的細(xì)胞比例為（[X7]±[X8]）%，S期細(xì)胞比例為（[X9]±[X10]）%，G2/M期細(xì)胞比例為（[X11]±[X12]）%。褪黑素低劑量組、中劑量組和高劑量組G0/G1期細(xì)胞比例均高于模型對(duì)照組，S期和G2/M期細(xì)胞比例均低于模型對(duì)照組，且隨著褪黑素劑量的增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低。褪黑素中劑量組和高劑量組與模型對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3-3。<此處插入表3-3：各組大鼠垂體腫瘤細(xì)胞周期分布比較>相關(guān)蛋白表達(dá)變化：免疫組織化學(xué)和Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組中Bcl-2和CyclinD1蛋白表達(dá)較強(qiáng)，Bax和caspase-3蛋白表達(dá)較弱。褪黑素低劑量組、中劑量組和高劑量組中Bcl-2和CyclinD1蛋白表達(dá)逐漸減弱，Bax和caspase-3蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，且與模型對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3-4。<此處插入表3-4：各組大鼠垂體腫瘤組織中相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較>信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化：Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明，模型對(duì)照組中PI3K、p-AKT、MAPK、p-ERK蛋白表達(dá)水平較高。褪黑素低劑量組、中劑量組和高劑量組中PI3K、p-AKT、MAPK、p-ERK蛋白表達(dá)水平逐漸降低，且與模型對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3-5。<此處插入表3-5：各組大鼠垂體腫瘤組織中信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較>激素水平變化：ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組大鼠血清泌乳素水平較高，為（[X13]±[X14]）ng/mL。褪黑素低劑量組、中劑量組和高劑量組血清泌乳素水平均低于模型對(duì)照組，且隨著褪黑素劑量的增加，血清泌乳素水平逐漸降低。褪黑素中劑量組和高劑量組與模型對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)于生長(zhǎng)激素和促甲狀腺激素水平，各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3-6。<此處插入表3-6：各組大鼠血清激素水平比較>免疫功能變化：CCK-8試劑盒檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖活性結(jié)果顯示，模型對(duì)照組淋巴細(xì)胞增殖活性較低，OD值為（[X15]±[X16]）。褪黑素低劑量組、中劑量組和高劑量組淋巴細(xì)胞增殖活性均高于模型對(duì)照組，且隨著褪黑素劑量的增加，增殖活性逐漸增強(qiáng)。褪黑素中劑量組和高劑量組與模型對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群比例結(jié)果表明，模型對(duì)照組CD4?T細(xì)胞比例為（[X17]±[X18]）%，CD8?T細(xì)胞比例為（[X19]±[X20]）%，CD4?/CD8?比值為（[X21]±[X22]）。褪黑素低劑量組、中劑量組和高劑量組CD4?T細(xì)胞比例逐漸升高，CD8?T細(xì)胞比例逐漸降低，CD4?/CD8?比值逐漸增大，且與模型對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。B細(xì)胞比例在各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3-7。<此處插入表3-7：各組大鼠免疫功能指標(biāo)比較>3.3結(jié)果分析與討論本研究通過(guò)對(duì)己烯雌酚誘發(fā)的泌乳素腺瘤大鼠模型給予不同劑量的褪黑素進(jìn)行治療，從多個(gè)方面深入探究了褪黑素的治療效果及作用機(jī)制。在腫瘤體積和重量方面，褪黑素中劑量組和高劑量組大鼠垂體腫瘤體積和重量顯著小于模型對(duì)照組，且隨著褪黑素劑量的增加，腫瘤體積和重量逐漸減小，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴(lài)性。這表明褪黑素能夠有效抑制泌乳素腺瘤的生長(zhǎng)，減少腫瘤負(fù)荷。相關(guān)研究也證實(shí)了褪黑素對(duì)多種腫瘤具有抑制生長(zhǎng)的作用，如在乳腺癌模型中，褪黑素能夠降低腫瘤細(xì)胞的增殖活性，使腫瘤體積縮小。在本研究中，褪黑素抑制泌乳素腺瘤生長(zhǎng)的機(jī)制可能與以下因素有關(guān)。從細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控角度來(lái)看，褪黑素能夠顯著誘導(dǎo)泌乳素腺瘤細(xì)胞凋亡，使凋亡率升高，同時(shí)使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，減少S期和G2/M期細(xì)胞比例。這一結(jié)果與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)變化一致。Bax是一種促凋亡蛋白，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，褪黑素治療后，Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2蛋白表達(dá)減弱，導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值升高，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，其表達(dá)增強(qiáng)進(jìn)一步證實(shí)了褪黑素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白，在細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，褪黑素降低CyclinD1蛋白表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖。有研究表明，褪黑素可以通過(guò)激活線(xiàn)粒體凋亡途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，線(xiàn)粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素c，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在本研究中，褪黑素可能也是通過(guò)類(lèi)似的機(jī)制誘導(dǎo)泌乳素腺瘤細(xì)胞凋亡和調(diào)控細(xì)胞周期。關(guān)于信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化，褪黑素能夠顯著降低PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白PI3K、p-AKT、MAPK、p-ERK的表達(dá)水平。PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、存活、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。PI3K被激活后，能夠磷酸化AKT，激活的AKT可以調(diào)節(jié)下游多種底物的活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。MAPK/ERK信號(hào)通路被激活后，ERK磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。褪黑素抑制這兩條信號(hào)通路的激活，可能是其抑制泌乳素腺瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要分子機(jī)制之一。有研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，褪黑素通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，降低細(xì)胞增殖活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在本研究中，褪黑素可能通過(guò)與泌乳素腺瘤細(xì)胞表面的褪黑素受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路的激活，從而發(fā)揮治療作用。在激素水平方面，褪黑素能夠顯著降低血清泌乳素水平，且隨著劑量增加，降低作用更明顯，而對(duì)生長(zhǎng)激素和促甲狀腺激素水平無(wú)顯著影響。這表明褪黑素對(duì)泌乳素腺瘤患者的高泌乳素血癥具有針對(duì)性的治療作用，能夠調(diào)節(jié)異常的激素水平。血清泌乳素水平的降低可能與褪黑素抑制泌乳素腺瘤細(xì)胞的增殖和泌乳素的合成與分泌有關(guān)。研究表明，褪黑素可以通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦-垂體軸，影響多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，進(jìn)而抑制泌乳素的釋放。在本研究中，褪黑素可能通過(guò)作用于下丘腦或垂體，調(diào)節(jié)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)和激素的分泌，從而降低血清泌乳素水平。從免疫功能變化來(lái)看，褪黑素能夠顯著提高淋巴細(xì)胞增殖活性，增加CD4?T細(xì)胞比例，降低CD8?T細(xì)胞比例，使CD4?/CD8?比值增大，而對(duì)B細(xì)胞比例無(wú)顯著影響。這表明褪黑素能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，調(diào)節(jié)免疫平衡。CD4?T細(xì)胞在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的輔助作用，能夠促進(jìn)B細(xì)胞的活化、增殖和抗體分泌，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫。CD8?T細(xì)胞是細(xì)胞毒性T細(xì)胞，能夠直接殺傷靶細(xì)胞。褪黑素調(diào)節(jié)CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞的比例，可能有助于增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞表面的受體表達(dá)和細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性。在本研究中，褪黑素可能通過(guò)作用于免疫細(xì)胞，調(diào)節(jié)其功能，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，抑制泌乳素腺瘤的生長(zhǎng)。四、對(duì)比分析與綜合討論4.1己烯雌酚誘發(fā)與褪黑素治療的對(duì)比在本研究中，己烯雌酚誘發(fā)大鼠泌乳素腺瘤與褪黑素治療泌乳素腺瘤的過(guò)程呈現(xiàn)出明顯的對(duì)比，從多個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)的變化中能夠清晰地觀察到兩者截然不同的作用效果和機(jī)制。從泌乳素水平來(lái)看，己烯雌酚誘發(fā)階段，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清泌乳素水平在注射2周后就開(kāi)始顯著升高，8周時(shí)達(dá)到高峰，隨后雖略有下降但仍維持在高位。這表明己烯雌酚能夠強(qiáng)烈刺激泌乳素細(xì)胞，促使其大量分泌泌乳素，這與己烯雌酚作用于下丘腦-垂體軸，削弱多巴胺對(duì)泌乳素分泌的抑制作用，以及直接作用于垂體腺組織促進(jìn)泌乳素細(xì)胞增殖和泌乳素基因表達(dá)有關(guān)。而在褪黑素治療階段，模型對(duì)照組大鼠血清泌乳素水平較高，給予褪黑素治療后，血清泌乳素水平隨著劑量的增加逐漸降低，中劑量組和高劑量組與模型對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明褪黑素能夠有效抑制泌乳素的分泌，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦-垂體軸，影響神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，進(jìn)而抑制泌乳素的釋放，也可能直接作用于泌乳素腺瘤細(xì)胞，抑制其增殖和泌乳素的合成。在細(xì)胞增殖與凋亡方面，己烯雌酚誘發(fā)過(guò)程中，垂體組織呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞增殖活躍狀態(tài)。從垂體形態(tài)學(xué)變化可見(jiàn)，腺細(xì)胞數(shù)目不斷增多，體積增大，從增生性改變逐漸發(fā)展為腫瘤性改變。這是因?yàn)榧合┐品蛹せ盍讼嚓P(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，使得泌乳素細(xì)胞得以持續(xù)增殖形成腫瘤。而在褪黑素治療時(shí)，呈現(xiàn)出完全相反的結(jié)果。褪黑素能夠顯著誘導(dǎo)泌乳素腺瘤細(xì)胞凋亡，使凋亡率升高，同時(shí)使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，減少S期和G2/M期細(xì)胞比例。從相關(guān)蛋白表達(dá)變化來(lái)看，Bax促凋亡蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2抗凋亡蛋白表達(dá)減弱，caspase-3凋亡關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶表達(dá)增強(qiáng)，CyclinD1細(xì)胞周期蛋白表達(dá)降低，這些都表明褪黑素通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在血管生成相關(guān)因子表達(dá)上，己烯雌酚誘發(fā)階段，垂體組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）表達(dá)顯著升高，且隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)，在8-12周時(shí)達(dá)到高峰。這表明己烯雌酚能夠促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，加速腫瘤的發(fā)展。而在褪黑素治療階段，雖然本研究未直接檢測(cè)血管生成相關(guān)因子在褪黑素作用下的變化，但從腫瘤生長(zhǎng)受到抑制的結(jié)果可以推測(cè)，褪黑素可能通過(guò)抑制相關(guān)信號(hào)通路，減少VEGF和bFGF等血管生成因子的表達(dá)或活性，從而抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。關(guān)于信號(hào)通路方面，己烯雌酚誘發(fā)泌乳素腺瘤過(guò)程中，激活了PI3K/AKT和MAPK/ERK等信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，上調(diào)VEGF和bFGF等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，從而推動(dòng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。而褪黑素治療時(shí)，顯著降低了PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白PI3K、p-AKT、MAPK、p-ERK的表達(dá)水平，抑制了這兩條信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮治療作用。4.2綜合討論己烯雌酚誘發(fā)大鼠泌乳素腺瘤的機(jī)制與褪黑素的治療機(jī)制之間存在著緊密的關(guān)聯(lián)，深入剖析這種關(guān)聯(lián)對(duì)于理解泌乳素腺瘤的發(fā)病與治療具有重要意義。己烯雌酚誘發(fā)泌乳素腺瘤的過(guò)程中，通過(guò)作用于下丘腦-垂體軸以及直接作用于垂體腺組織，激活了一系列信號(hào)通路，如PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路。這些信號(hào)通路的激活促進(jìn)了細(xì)胞增殖、抑制了細(xì)胞凋亡，同時(shí)上調(diào)了血管生成相關(guān)因子VEGF和bFGF的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤血管生成增加，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，最終促使泌乳素腺瘤的形成和發(fā)展。而褪黑素的治療機(jī)制則是針對(duì)己烯雌酚誘發(fā)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行反向調(diào)節(jié)。褪黑素能夠抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路的激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2、caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及CyclinD1等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，減少S期和G2/M期細(xì)胞比例，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在激素調(diào)節(jié)方面，己烯雌酚導(dǎo)致泌乳素大量分泌，而褪黑素則能夠調(diào)節(jié)下丘腦-垂體軸，降低血清泌乳素水平，恢復(fù)激素平衡。在免疫調(diào)節(jié)方面，己烯雌酚誘發(fā)的泌乳素腺瘤可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能異常，而褪黑素能夠增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖活性，調(diào)節(jié)CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞的比例，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。褪黑素治療泌乳素腺瘤具有諸多優(yōu)勢(shì)。它是一種內(nèi)源性物質(zhì)，具有良好的生物安全性，相比一些傳統(tǒng)的化學(xué)合成藥物，副作用較小，對(duì)機(jī)體的整體影響相對(duì)較輕。在本研究中，未觀察到褪黑素治療對(duì)大鼠其他生理指標(biāo)產(chǎn)生明顯的不良影響。褪黑素的作用機(jī)制較為多樣，不僅能夠直接作用于腫瘤細(xì)胞，抑制其增殖、誘導(dǎo)其凋亡，還能調(diào)節(jié)機(jī)體的激素水平和免疫功能，從多個(gè)層面發(fā)揮治療作用。在激素水平調(diào)節(jié)方面，能夠特異性地降低血清泌乳素水平，改善患者的高泌乳素血癥；在免疫調(diào)節(jié)方面，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，有助于提高機(jī)體自身對(duì)腫瘤的抵抗能力。而且，褪黑素的治療效果呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，可根據(jù)患者的具體情況調(diào)整劑量，以達(dá)到最佳的治療效果。在本研究中，隨著褪黑素劑量的增加，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用、對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用以及對(duì)免疫功能的增強(qiáng)作用均更加明顯。然而，褪黑素治療也存在一些不足之處。目前對(duì)于褪黑素治療泌乳素腺瘤的最佳劑量、用藥時(shí)間和治療方案等尚未完全明確，還需要更多的研究來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化。在本研究中，雖然設(shè)置了不同的劑量組，但仍無(wú)法確定最適合臨床應(yīng)用的劑量，不同個(gè)體對(duì)褪黑素的反應(yīng)可能存在差異，也增加了確定最佳治療方案的難度。在臨床應(yīng)用方面，褪黑素與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用效果和安全性還需要更多大規(guī)模的臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。雖然理論上褪黑素與其他治療方法如藥物治療、手術(shù)治療等聯(lián)合應(yīng)用可能會(huì)提高治療效果，但實(shí)際應(yīng)用中的相互作用和不良反應(yīng)等還需要深入研究。而且，褪黑素的作用機(jī)制雖然已取得一定的研究進(jìn)展，但仍有一些細(xì)節(jié)尚未完全闡明，例如褪黑素與其他內(nèi)源性物質(zhì)之間的相互作用，以及在不同個(gè)體生理狀態(tài)下的作用差異等，這些都限制了褪黑素在臨床上的廣泛應(yīng)用。五、結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論本研究通過(guò)構(gòu)建己烯雌酚誘發(fā)的大鼠泌乳素腺瘤模型，深入探究了泌乳素腺瘤的發(fā)生機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上研究了褪黑素對(duì)泌乳素腺瘤的實(shí)驗(yàn)性治療作用及其機(jī)制，取得了以下主要研究結(jié)論：己烯雌酚誘發(fā)大鼠泌乳素腺瘤的機(jī)制：己烯雌酚能夠成功誘發(fā)雌性Wistar大鼠泌乳素腺瘤。在誘發(fā)過(guò)程中，大鼠垂體組織呈現(xiàn)出明顯的動(dòng)態(tài)變化。從形態(tài)學(xué)上看，垂體重量逐漸增加，組織形態(tài)從增生性改變逐漸發(fā)展為腫瘤性改變，泌乳素陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間逐漸增多且染色強(qiáng)度增強(qiáng)。血清泌乳素水平在注射己烯雌酚2周后開(kāi)始顯著升高，8周時(shí)達(dá)到高峰，隨后略有下降但仍維持在較高水平。血管生成相關(guān)因子VEGF和bFGF的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組，且隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)，在8-12周達(dá)到高峰，表明己烯雌酚通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫