藥物制劑08、中藥制劑08實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1.進(jìn)入實(shí)習(xí)室實(shí)驗(yàn)要穿白大衣.2.除實(shí)驗(yàn)中必用的學(xué)習(xí)用品外,其他物品不要放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上.書包放桌屜內(nèi).3.實(shí)習(xí)室內(nèi)不允許吃食物或飲料.4.實(shí)驗(yàn)中一定要保持實(shí)習(xí)室安靜,彼此討論問(wèn)題時(shí)不要大聲喧嘩,嚴(yán)禁打鬧.5.實(shí)驗(yàn)過(guò)程要按照教師要求進(jìn)行操作,如有疑問(wèn)要請(qǐng)教指導(dǎo)教師.6.愛(ài)護(hù)實(shí)驗(yàn)器材,如有損壞應(yīng)及時(shí)報(bào)告教師,需賠償者按規(guī)定辦理.7.實(shí)驗(yàn)完畢,要清理臺(tái)面.需沖洗的物品按要求沖洗,需收回的物品按要求擺放整齊送回教學(xué)準(zhǔn)備室.8.值日生要做好值日,離開(kāi)實(shí)習(xí)室時(shí),一定要有專人負(fù)責(zé)關(guān)好門窗,水源及照明設(shè)備.實(shí)驗(yàn)一免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)（4學(xué)時(shí)，w14）【需帶顯微鏡】

一、凝集試驗(yàn)

1．人類ABO血型鑒定------學(xué)生操作 每人做二、沉淀試驗(yàn)1．雙向擴(kuò)散------學(xué)生操作 每人做三、普通光學(xué)顯微鏡（油鏡）使用和維護(hù)

教師示講 1架/人四、大小吞噬試驗(yàn)---發(fā)片觀察 2片/臺(tái)五、E花環(huán)試驗(yàn)---發(fā)片觀察 2片/臺(tái)六、淋轉(zhuǎn)試驗(yàn)----發(fā)片觀察 2片/臺(tái)

血清學(xué)反應(yīng)1含義:抗原和抗體的體外反應(yīng)2

特性:(1)特異性結(jié)合(2)可逆性結(jié)合(3)需一定條件:生理鹽水;溫度;pH值;

合適的抗原抗體比例3種類凝集反應(yīng)：玻片凝集試驗(yàn)，試管凝集試驗(yàn)等沉淀反應(yīng):

補(bǔ)體參加的試驗(yàn)：用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的反應(yīng)：

一，凝集試驗(yàn)-玻片凝集試驗(yàn)人類ABO血型鑒定-學(xué)生操作每人做

1原理：

2材料

抗體：抗A血清，抗B血清

抗原：自身紅細(xì)胞

器材：無(wú)菌采血針，加生理鹽水的潔凈小試管等。凝集試驗(yàn)的原理電解質(zhì)顆粒性Ag(細(xì)菌、細(xì)胞等)特異性Ab

Ag/Ab-IC（肉眼可見(jiàn)的凝集塊）抗A標(biāo)準(zhǔn)血清抗B標(biāo)準(zhǔn)血清血型＋—＋——＋＋—ABABO“＋”表示紅細(xì)胞凝集，“－”表示紅細(xì)胞未凝集ABO血型鑒定表

3方法步驟：

采手指血混合于生理鹽水于載玻片滴加抗A血清或抗B血清滴加紅細(xì)胞懸液混勻室溫靜置數(shù)分鐘，觀察結(jié)果二，雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)雙向擴(kuò)散-學(xué)生操作每人做（檢測(cè)甲胎蛋白AFP）

1原理:

可溶性抗原可和抗體在瓊脂凝膠中同時(shí)向四周自由擴(kuò)散(形成濃度梯度),在抗原和抗體合適比例處形成白色沉淀線,每一抗原抗體系統(tǒng)只能形成一條沉淀線,因此能對(duì)抗原成分進(jìn)行精細(xì)分析.沉淀試驗(yàn)的原理電解質(zhì)特異性Ab可溶性Ag(蛋白質(zhì)等)Ag/Ab-IC（肉眼可見(jiàn)的沉淀物）

2材料

樣品:待檢人血清(抗原),臍帶血清(AFP陽(yáng)性對(duì)照),健康人正常血清(AFP陰性對(duì)照)

試劑:AFP診斷血清(抗體)

1.2%瓊脂:

玻璃板:

玻璃平皿:

打孔器：

微量加樣器:

3方法:1制備瓊脂板:2打孔:3將抗體加入7號(hào)孔,1,4號(hào)孔加入陽(yáng)性對(duì)照,6號(hào)為陰性對(duì)照,2,3,5號(hào)為待檢樣品,將瓊脂板置濕盒于37℃過(guò)夜,觀察結(jié)果

4結(jié)果：1)1、4孔與7孔間應(yīng)出現(xiàn)白色沉淀線(陽(yáng)性對(duì)照),6與7孔間應(yīng)不出現(xiàn)白色沉淀線(陰性對(duì)照);2)若2、3、5孔與7孔間出現(xiàn)白色沉淀線而且與陽(yáng)性對(duì)照沉淀線吻合,表明待檢血清中含有AFP;如出現(xiàn)沉淀線,但不與陽(yáng)性對(duì)照吻合，則判定AFP陰性；如無(wú)沉淀線，也判定為AFP陰性。12345671234567132476127345617234561237456三，普通光學(xué)顯微鏡（油鏡）的使用和維護(hù)--教師示講 1架/人

油鏡的使用:100X,HI,oil等香柏油增加照明亮度：增加分辯率：透鏡透鏡玻片玻片香柏油加油前加油后顯微鏡油鏡的原理使用注意事項(xiàng)：使用油鏡觀察樣品后，隨即用二甲苯將油鏡鏡頭和載波片擦凈，以防其他的物鏡玻璃上沾上香柏油。二甲苯有毒，使用后馬上洗手。四，大小吞噬試驗(yàn)---發(fā)片觀察 2片/臺(tái)

1原理：

中性粒細(xì)胞：核分葉，細(xì)菌染成藍(lán)紫色（小吞噬）單核巨噬細(xì)胞：紫色或不規(guī)則形巨噬細(xì)胞，雞紅細(xì)胞核呈淡紫色（大吞噬）2材料：（1）樣品：表皮葡萄球菌；1%雞紅細(xì)胞（2）吞噬細(xì)胞：人外周靜脈血；小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（3）試劑：Wright-Giemsa染色液等3方法：（1）小吞噬：人外周靜脈血+表皮葡萄球菌懸液（2）大吞噬：小鼠腹腔注射1%雞紅細(xì)胞中性粒細(xì)胞大吞噬細(xì)胞10×100雞紅細(xì)胞巨噬細(xì)胞球菌雞紅細(xì)胞巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞五，E花環(huán)形成試驗(yàn)-發(fā)片觀察2片/臺(tái)

1原理：

人T淋巴細(xì)胞表面具有綿羊紅細(xì)胞（SRBC）受體（E受體，CD2），故在一定條件下，SRBC能結(jié)合在淋巴細(xì)胞表面，形似玫瑰花環(huán)（E-花環(huán)），常用于測(cè)定T細(xì)胞數(shù)量。

Erythrocyte,紅細(xì)胞

2材料：

1）樣品：人靜脈血

2）試劑：1%SRBC懸液等

3）器材：試管等

3方法（微量法）

1）粗制淋巴細(xì)胞懸液：雙蒸水去除紅細(xì)胞，用Hank’s液懸浮

2）加入小牛血清,水浴10~15分鐘,加入1%SRBC混合,置37℃水浴5分鐘,低速離心5分鐘,滴片或涂片觀察,計(jì)算E花環(huán)形成細(xì)胞數(shù)量E花環(huán)形成細(xì)胞數(shù)量=花環(huán)數(shù)/淋巴細(xì)胞數(shù)E花環(huán)T細(xì)胞sRBC4結(jié)果：結(jié)合3個(gè)以上SRBC的淋巴細(xì)胞為E花環(huán)細(xì)胞六，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（淋轉(zhuǎn)）---發(fā)片觀察，2片/臺(tái)

1原理：

T淋巴細(xì)胞表面具絲裂原(PHA等)受體及TCR,在PHA作用下發(fā)生活化,進(jìn)入有絲分裂期從而增殖(淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化,形成淋巴母細(xì)胞):DNA倍增,染色質(zhì)疏松,核仁明顯,核增大;細(xì)胞體積增大,胞漿豐富等?？闪私鈾C(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)

檢測(cè)方法:形態(tài)學(xué)法;同位素法(3H-TdR)

2材料

1）樣品:人靜脈血

2）RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基（含PHA）

3）其他器材等

3方法步驟(形態(tài)學(xué)法-全血法)

取人靜脈血0.2ml加入到2ml細(xì)胞培養(yǎng)基中,1瓶加入PHA(終濃度1%),另一瓶為對(duì)照(等量細(xì)胞培養(yǎng)基),于37℃培養(yǎng)72小時(shí),涂片,Wright-Giemsa染色，計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞數(shù)/淋巴細(xì)胞總數(shù)4結(jié)果：轉(zhuǎn)化細(xì)胞細(xì)胞形體變大、細(xì)胞漿量大大增加并出現(xiàn)空泡、核仁明顯、核染色質(zhì)疏松等靜止的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋轉(zhuǎn)試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二綜合性實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌形態(tài)觀察與分離培養(yǎng)（一）（4學(xué)時(shí)）一、普通肉湯培養(yǎng)基的制備---教師操作并講解二、細(xì)菌的接種和培養(yǎng)：平板、斜面、半固體和肉湯---學(xué)生操作 1套/人三、細(xì)菌的培養(yǎng)技術(shù)---教師示講四、細(xì)菌的生化反應(yīng)（糖發(fā)酵、IMViC、H2S）---結(jié)果示教 1套/室五、消毒與滅菌---示范與講解

培養(yǎng)基1含義：人工配制的能滿足細(xì)菌及其他微生物生長(zhǎng)繁殖或累積代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。2分類：

天然培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源合成培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：無(wú)瓊脂

物理狀態(tài)半固體培養(yǎng)基：0.3~0.7%瓊脂固體培養(yǎng)基：1.5~2.5%瓊脂

基礎(chǔ)培養(yǎng)基

用途營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基一，普通肉湯培養(yǎng)基的制備：示教

1材料:牛肉膏,蛋白胨，氯化鈉，蒸餾水等；

2器材：pH試紙，燒瓶，量筒，漏斗，濾紙，試管，棉塞，平皿,高壓蒸汽滅菌器等

3配方:牛肉膏（0.3～0.5g),蛋白胨(1g)，氯化(0.5g)，蒸餾水(100ml);調(diào)pH為7.44制備過(guò)程:A稱量:B溶解:C調(diào)pH值:D過(guò)濾:E分裝:F高壓滅菌：121℃,20分鐘以上

G無(wú)菌檢測(cè):二，固體或半固體普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基的制備：講解

配方及制備過(guò)程:

在前面所制備普通肉湯培養(yǎng)基中加入瓊脂:濃度為0.3～0.7%可制備成半固體培養(yǎng)基,濃度為1.5～2.5%可制備成固體培養(yǎng)基；高壓滅菌：121℃,20分鐘以上待培養(yǎng)基冷至50～60℃時(shí)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌操作：①斜面培養(yǎng)基：斜置試管冷卻即可（瓊脂濃度：1.5～2.5%）。②半固體培養(yǎng)基：直立試管冷卻即可（瓊脂濃度：0.3～0.7%）。③平板培養(yǎng)基：將固體培養(yǎng)液（瓊脂濃度：1.5～2.5%）傾注入無(wú)菌空平皿，使培養(yǎng)基均勻鋪滿皿底，蓋好皿蓋冷卻即可。三，細(xì)菌的接種和培養(yǎng)----平板、斜面、半固體和肉湯

細(xì)菌的分離方法：

稀釋法、平板分區(qū)劃線法。

細(xì)菌的接種方法：

斜面培養(yǎng)基接種法、液體培養(yǎng)基接種法、穿刺接種法、傾注平板法、平板涂布法。

細(xì)菌的培養(yǎng)方法：需氧培養(yǎng)法

CO2培養(yǎng)法厭氧培養(yǎng)法（一）平板分區(qū)劃線法：學(xué)生操作

1原理:

采用在普通肉湯瓊脂平板培養(yǎng)基上劃線，將標(biāo)本中的細(xì)菌盡量分散生長(zhǎng)以獲得較多的單個(gè)菌落。

2菌種:

混合菌（大腸桿菌、葡萄球菌）

3培養(yǎng)基:

普通平板，練習(xí)平板

4器材:

接種環(huán),酒精燈等

5步驟:(1)接種環(huán)的火焰滅菌:(2)劃線:四區(qū)（每劃一區(qū)，需灼燒接種環(huán)?。?/p>

(3)培養(yǎng):37℃,18-24小時(shí)1區(qū)2區(qū)3區(qū)4區(qū)1234平板分區(qū)劃線法（學(xué)生操作）（二）斜面培養(yǎng)基接種法：學(xué)生操作

1目的:在肉湯斜面培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)細(xì)菌

2菌種:葡萄球菌、大腸桿菌、志賀菌、沙門菌疑似菌落等

3培養(yǎng)基:肉湯斜面培養(yǎng)基

4器材:接種環(huán),酒精燈等

5步驟:(1)接種環(huán)的火焰滅菌:(2)劃線:(3)培養(yǎng):37℃,18-24小時(shí)（三）半固體培養(yǎng)基穿刺接種法學(xué)生操作

1目的:在肉湯半固體培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)細(xì)菌以觀察細(xì)菌有無(wú)動(dòng)力等。

2菌種:大腸桿菌,葡萄球菌等

3培養(yǎng)基:肉湯半固體培養(yǎng)基

4器材:接種針,酒精燈等

5步驟:(1)接種針的火焰滅菌:(2)穿刺:(3)培養(yǎng):37℃,18-24小時(shí)（四）液體培養(yǎng)基接種法學(xué)生操作

1目的:

在肉湯培養(yǎng)基接種培養(yǎng)細(xì)菌

2菌種:

金黃色葡萄球菌等

3培養(yǎng)基:

肉湯培養(yǎng)基

4器材:

接種環(huán),酒精燈等

5步驟:(1)接種環(huán)的火焰滅菌:(2)接種細(xì)菌:(3)培養(yǎng):37℃,18-24小時(shí)液體培養(yǎng)基沉淀生長(zhǎng)混濁生長(zhǎng)表面生長(zhǎng)四，細(xì)菌的生化反應(yīng)（糖發(fā)酵，IMVIC，H2S）結(jié)果示教 1套/室（一）糖發(fā)酵試驗(yàn):原理：將某種糖或醇加入蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)，同時(shí)加入指示劑[溴甲酚紫pH5.2(黃色)-pH6.8(紫色)]和一只杜氏管；如細(xì)菌能利用該糖，則可產(chǎn)酸或/和產(chǎn)氣。材料:大腸埃希菌，傷寒沙門菌；糖發(fā)酵管（葡、乳、麥等）方法：將細(xì)菌接種于各發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)后觀察。結(jié)果：培養(yǎng)液要變混濁：紫色：糖發(fā)酵為陰性（-）黃色，小管有氣泡（產(chǎn)酸，產(chǎn)氣）糖發(fā)酵為陽(yáng)（+）黃色，小管無(wú)氣泡（產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣）大腸埃希菌：（+）；傷寒沙門菌：+Carbohydratefermentation-（+）+大腸埃希菌：I：+；傷寒沙門菌：I：-+-大腸埃希菌：M：+；產(chǎn)氣腸桿菌：M：-+-VP試驗(yàn):Vi原理：產(chǎn)氣桿菌具丙酮酸脫羧酶,可將葡萄糖分解產(chǎn)生的丙酮酸脫羧生成乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在堿性條件下可被氧化成二乙酰,二乙?？膳c蛋白胨中精氨酸的胍基作用生成紅色化合物(α-萘酚可催化此反應(yīng))。材料：大腸埃希菌，產(chǎn)氣腸桿菌；葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基；V-P試劑（α-萘酚酒精液，KOH液）方法：取細(xì)菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，沿管壁先加入1毫升α-萘酚酒精液，再加入0.4毫升KOH液,充分振蕩,室溫靜置5～30分鐘觀察。結(jié)果：紅色為V-P陽(yáng)性。大腸埃希菌：Vi：-；產(chǎn)氣腸桿菌：Vi：++-枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)(Citrateutilization)：C原理：產(chǎn)氣腸桿菌利用枸櫞酸鹽為碳源,能將枸櫞酸鹽分解產(chǎn)生CO2,CO2再轉(zhuǎn)變成碳酸鹽,使培養(yǎng)基成堿性,加入溴麝香草酚藍(lán)作為指示劑,可由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色。材料：大腸埃希菌，產(chǎn)氣腸桿菌；西蒙氏枸櫞酸鹽培養(yǎng)基（斜面）。方法：將細(xì)菌接種于西蒙氏枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)后觀察結(jié)果。結(jié)果：斜面上有菌苔，且變成深藍(lán)色，為陽(yáng)性；斜面上無(wú)菌苔，仍是綠色為陰性。大腸埃希菌：C：-；產(chǎn)氣腸桿菌：C：+++--硫化氫試驗(yàn)：原理：有些細(xì)菌能分解含硫氨基酸，產(chǎn)生H2S，H2S遇鉛或亞鐵離子可形成黑色硫化鉛或硫化亞鐵沉淀材料：大腸埃希菌，肖氏沙門菌；醋酸鉛半固體培養(yǎng)基方法：將細(xì)菌接種于醋酸鉛半固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)后觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基為黑色沉淀，即為產(chǎn)硫化氫陽(yáng)性大腸埃希菌：H2S

：-；肖氏沙門菌：H2S

：+克氏雙糖鐵培養(yǎng)基：

（1）原理：

克氏雙糖鐵(KIA)培養(yǎng)基制成高層和短的斜面，其中葡萄糖含量?jī)H為乳糖或蔗糖的十分之一，若細(xì)菌只分解葡萄糖而不分解乳糖和蔗糖，分解葡萄糖產(chǎn)酸使pH降低，因此斜面和底層均先呈黃色，但因葡萄糖量較少，所生成的少量酸可因接觸空氣而氧化，并因細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖利用含氮物質(zhì)生成堿性化合物，使斜面部分又變成紅色；底層由于處于缺氧狀態(tài)，細(xì)菌分解葡萄糖所生成的酸類一時(shí)不被氧化而仍保持黃色。細(xì)菌分解葡萄糖、乳糖或蔗糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使斜面與底層均呈黃色，且有氣泡。細(xì)菌產(chǎn)生硫化氫時(shí)與培養(yǎng)基中的硫酸亞鐵作用，形成黑色的硫化鐵。

（2）方法：

用接種針挑取待檢菌的菌落，先穿刺接種到KIA或TSI深層，距管底3～5mm為止，再?gòu)脑吠嘶?，在斜面上自下而上劃線，置35℃孵育18～24h，觀察結(jié)果。

五、微生物的控制

（一）高壓蒸汽滅菌：

注入適量蒸餾水等放入需高壓滅菌物品，加蓋打開(kāi)排氣閥，加熱排氣數(shù)分鐘（排出空氣），關(guān)閉排氣閥

繼續(xù)加熱，待121℃時(shí)，計(jì)時(shí)，20分鐘后，停止加熱壓力降為零時(shí)，開(kāi)蓋取出物品

（二）紫外線殺菌實(shí)驗(yàn)

1

原理：DNA鏈上相鄰T在紫外線作用下可形成

T=T，可使DNA斷裂或不能復(fù)制。

2

材料

細(xì)菌：葡萄球菌或大腸桿菌菌液無(wú)菌普通平板：無(wú)菌棉簽：

3

方法：將用無(wú)菌棉簽沾取葡萄球菌或大腸桿菌菌液，均勻涂布于普通平板表面，置于超凈工作臺(tái)紫外燈下（皿蓋打開(kāi)約1/3），紫外照射30分鐘后，蓋上皿蓋于37℃培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果。一、革蘭染色---上次實(shí)驗(yàn)的分離平板培養(yǎng)物 學(xué)生操作 每人做

不染色:

暗視野觀察法

細(xì)菌觀察

單染色法:

染色

復(fù)染色法:革蘭染色(Gramstain)、抗酸染色特殊染色法:芽胞染色、莢膜