摘要單克隆抗體技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)研究與臨床應(yīng)用的核心工具之一，雜交瘤細(xì)胞的高效篩選與穩(wěn)定培養(yǎng)是獲得高特異性、高親和力單抗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文系統(tǒng)闡述單克隆抗體制備中雜交瘤細(xì)胞融合、選擇性培養(yǎng)、抗體篩選、克隆化及細(xì)胞擴(kuò)增的優(yōu)化方法，結(jié)合實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)分析常見問(wèn)題的解決方案，為單抗研發(fā)提供兼具理論指導(dǎo)與實(shí)操價(jià)值的技術(shù)參考。引言1975年Kohler與Milstein創(chuàng)立的雜交瘤技術(shù)，通過(guò)將免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，開創(chuàng)了單克隆抗體（mAb）規(guī)?；苽涞男录o(jì)元。單抗憑借其特異性強(qiáng)、批間一致性高的優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、靶向治療及基礎(chǔ)研究。然而，雜交瘤細(xì)胞的篩選效率與培養(yǎng)穩(wěn)定性直接決定單抗的質(zhì)量與產(chǎn)量，因此優(yōu)化篩選策略與培養(yǎng)體系是單抗研發(fā)的核心挑戰(zhàn)。本文從細(xì)胞準(zhǔn)備、融合、篩選到克隆化培養(yǎng)的全流程入手，解析關(guān)鍵技術(shù)節(jié)點(diǎn)的優(yōu)化方案，助力研究者高效獲得穩(wěn)定分泌目標(biāo)抗體的雜交瘤細(xì)胞株。材料與方法1.細(xì)胞與試劑準(zhǔn)備免疫脾細(xì)胞：選擇6-8周齡Balb/c小鼠，采用多輪免疫策略（基礎(chǔ)免疫+2-3次加強(qiáng)免疫），末次免疫后3天處死，無(wú)菌分離脾臟，經(jīng)200目篩網(wǎng)研磨獲得單細(xì)胞懸液，紅細(xì)胞裂解液（如ACK裂解液）處理后，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，確保細(xì)胞活力＞95%。骨髓瘤細(xì)胞：選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0或NS-1細(xì)胞，融合前12-24小時(shí)傳代，調(diào)整密度至5×10?cells/mL，保證融合時(shí)細(xì)胞活力＞90%。試劑與培養(yǎng)基：聚乙二醇（PEG，分子量____）、HAT選擇培養(yǎng)基（含次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶）、完全培養(yǎng)基（RPMI1640+10-20%胎牛血清+1%雙抗）、無(wú)血清培養(yǎng)基（如HyCloneSFM4MAb）、凍存液（10%DMSO+40%FBS+50%完全培養(yǎng)基）。2.細(xì)胞融合1.細(xì)胞混合：按脾細(xì)胞:骨髓瘤細(xì)胞=5:1~10:1的比例混合，500g離心5分鐘，棄上清后輕彈管底使細(xì)胞松散。2.PEG介導(dǎo)融合：37℃水浴預(yù)熱PEG溶液，逐滴加入細(xì)胞沉淀（1mLPEG/1×10?細(xì)胞），邊加邊輕柔旋轉(zhuǎn)，作用1分鐘后，逐滴加入20mL無(wú)血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)，全程控制溫度在37℃。3.接種與培養(yǎng)：500g離心5分鐘，棄上清后用HAT選擇培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整密度至1×10?cells/mL，接種于96孔板（每孔200μL），37℃、5%CO?培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。3.雜交瘤篩選選擇性培養(yǎng)：融合后第5天更換半量HAT培養(yǎng)基（或全量，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)密度），第10-14天觀察到雜交瘤克隆（直徑＞1mm）時(shí)，取上清進(jìn)行抗體檢測(cè)。抗體檢測(cè)：采用ELISA法篩選陽(yáng)性克?。孩倏乖幻笜?biāo)板（1-10μg/mL，4℃過(guò)夜）；②封閉后加入雜交瘤上清（1:1稀釋），37℃孵育1小時(shí)；③洗滌后加HRP標(biāo)記的二抗，顯色后酶標(biāo)儀讀取OD值，陽(yáng)性孔OD值需為陰性孔的2.1倍以上。特異性驗(yàn)證：陽(yáng)性克隆需進(jìn)一步通過(guò)Westernblot、免疫熒光或競(jìng)爭(zhēng)ELISA驗(yàn)證抗體與目標(biāo)抗原的特異性結(jié)合，排除交叉反應(yīng)。4.克隆化培養(yǎng)有限稀釋法：將陽(yáng)性孔細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，1×10?cells/孔）的完全培養(yǎng)基稀釋至0.5-1cell/孔，接種于96孔板，培養(yǎng)7-10天后檢測(cè)抗體，重復(fù)克隆化2-3次，直至100%克隆陽(yáng)性。軟瓊脂法：底層瓊脂（0.5%瓊脂糖+完全培養(yǎng)基）鋪板，上層細(xì)胞懸液（0.3%瓊脂糖+細(xì)胞）鋪于底層，37℃培養(yǎng)10-14天，挑取單克隆至24孔板擴(kuò)增，檢測(cè)抗體活性。5.雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)增與凍存規(guī)模化培養(yǎng)：陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)至24孔板或T25培養(yǎng)瓶，使用完全培養(yǎng)基（含10%FBS），當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%匯合時(shí)傳代，或收集上清用于抗體純化。無(wú)血清培養(yǎng)時(shí)，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，減少血清批次差異對(duì)抗體產(chǎn)量的影響。細(xì)胞凍存與復(fù)蘇：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用凍存液重懸（1×10?cells/mL），梯度降溫（4℃30min→-20℃1h→-80℃過(guò)夜→液氮）；復(fù)蘇時(shí)37℃水浴快速融化，離心去凍存液，重懸于完全培養(yǎng)基，24小時(shí)內(nèi)更換培養(yǎng)基以去除DMSO。結(jié)果與討論1.融合效率的影響因素PEG的分子量、作用時(shí)間及溫度是融合效率的核心變量。實(shí)踐中，PEG1500（濃度50%）作用1分鐘、37℃條件下，融合率可達(dá)30-50%。若融合率偏低，需檢查細(xì)胞活力（尤其是骨髓瘤細(xì)胞）或PEG的新鮮度（PEG易氧化，建議現(xiàn)配現(xiàn)用）。2.雜交瘤生長(zhǎng)與抗體分泌的優(yōu)化飼養(yǎng)細(xì)胞的作用：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞可分泌IL-6等生長(zhǎng)因子，顯著提高雜交瘤克隆形成率（無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)克隆形成率降低40-60%）。培養(yǎng)基優(yōu)化：無(wú)血清培養(yǎng)基（如SFM4MAb）可使抗體產(chǎn)量提升2-3倍，且避免血清蛋白對(duì)抗體純化的干擾，適合大規(guī)模生產(chǎn)。3.常見問(wèn)題及解決方案克隆化失敗：若多次克隆化后仍存在多克隆混合，需延長(zhǎng)有限稀釋的間隔時(shí)間（如每輪克隆化間隔7天），或采用顯微操作法挑取單克隆?？贵w效價(jià)低：可通過(guò)調(diào)整免疫方案（如增加免疫次數(shù)、更換佐劑）或優(yōu)化抗原表位（如使用重組抗原替代天然抗原）提高抗體親和力。注意事項(xiàng)1.無(wú)菌操作：所有試劑、耗材需經(jīng)高壓滅菌或過(guò)濾除菌，操作全程在超凈臺(tái)內(nèi)完成，避免真菌或細(xì)菌污染。2.細(xì)胞活力監(jiān)控：融合前需確保脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞活力＞90%，臺(tái)盼藍(lán)染色時(shí)死細(xì)胞呈藍(lán)色，活細(xì)胞透明。3.HAT培養(yǎng)基使用：氨基蝶呤對(duì)光敏感，需避光保存，培養(yǎng)基配制后2周內(nèi)使用，否則需補(bǔ)加新鮮氨基蝶呤。4.篩選時(shí)機(jī)把握：雜交瘤克隆長(zhǎng)至孔底1/3大小時(shí)（約融合后10-14天）檢測(cè)抗體，過(guò)早檢測(cè)易漏檢低分泌克隆，過(guò)晚則孔間污染風(fēng)險(xiǎn)增加。結(jié)語(yǔ)單克隆抗體篩選與雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)兼具技術(shù)精度與經(jīng)驗(yàn)依賴性的工作，從細(xì)胞融合到克隆化的每一步優(yōu)化都直接影響單抗的質(zhì)量與