平滑肌細(xì)胞內(nèi)源性CSE/H?S體系在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病中的機(jī)制探究：從分子通路到病理進(jìn)程一、引言1.1研究背景與意義腹主動(dòng)脈瘤（AbdominalAorticAneurysm，AAA）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的血管疾病，其主要特征為腹主動(dòng)脈局部異常擴(kuò)張。當(dāng)腹主動(dòng)脈某段直徑擴(kuò)張至正常直徑的1.5倍以上時(shí)，即可診斷為腹主動(dòng)脈瘤。AAA的危害極大，一旦破裂，高速、高壓的動(dòng)脈血會(huì)迅速噴射入腹腔，短時(shí)間內(nèi)患者就會(huì)大量失血，隨即出現(xiàn)休克、大出血，死亡率高達(dá)85%-90%，因此被臨床醫(yī)生形象地稱為“不定時(shí)炸彈”。近年來，AAA的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。在我國(guó)，隨著人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)改變和檢測(cè)手段的增多，AAA發(fā)病率有所增加。有數(shù)據(jù)稱，我國(guó)腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病率為36.2/10萬，《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2020概要》顯示，中部地區(qū)40歲以上具有危險(xiǎn)因素的人群中腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病率為0.33％。在歐美國(guó)家，AAA同樣是一個(gè)不容忽視的健康問題，在美國(guó)每年約有15000人死于腹主動(dòng)脈瘤，占死因的第13位。目前認(rèn)為AAA的致病原因較為復(fù)雜，動(dòng)脈粥樣硬化被視為最重要的病因，粥樣斑塊的進(jìn)展會(huì)破壞血管內(nèi)膜，并侵蝕動(dòng)脈壁中層。此外，高血壓、抽煙、創(chuàng)傷、年齡、性別、高脂血癥或家族史等均是其常見危險(xiǎn)因素。盡管對(duì)AAA的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究，但目前其發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，這也導(dǎo)致治療藥物相對(duì)匱乏。硫化氫（HydrogenSulfide，H?S）作為一種新型氣體信號(hào)分子，與一氧化碳、一氧化氮等氣體分子一樣，在生物體內(nèi)參與了眾多生理功能的調(diào)節(jié)。在心血管系統(tǒng)中，H?S能調(diào)節(jié)血管張力，維持血管的正常舒張和收縮功能。研究表明，適量的H?S可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，從而預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生。在生物體內(nèi)，H?S主要由胱硫醚-γ-裂解酶（Cystathionineγ-Lyase，CSE）催化合成，CSE在諸多生理和病理過程中扮演著不可或缺的角色，當(dāng)CSE的活性異常改變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致H?S生成量的失衡，進(jìn)而引發(fā)一系列病理變化。然而，CSE/H?S體系在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)制中的作用尚未完全闡明。探究平滑肌細(xì)胞內(nèi)源性CSE/H?S在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病中的機(jī)制，有助于深入理解AAA的發(fā)病過程，為AAA的防治提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的本研究旨在深入探究平滑肌細(xì)胞內(nèi)源性CSE/H?S在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病中的具體機(jī)制。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察CSE/H?S體系功能改變對(duì)平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，如增殖、遷移、凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)代謝等。分析CSE/H?S體系與腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病過程中關(guān)鍵信號(hào)通路的相互作用關(guān)系，明確其在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，研究還期望基于所揭示的機(jī)制，為腹主動(dòng)脈瘤的防治提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)，為開發(fā)更加有效的治療策略奠定基礎(chǔ)，最終降低腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病率和死亡率，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)制的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了諸多成果。動(dòng)脈粥樣硬化被公認(rèn)為是腹主動(dòng)脈瘤最重要的病因，其過程中粥樣斑塊的進(jìn)展會(huì)破壞血管內(nèi)膜，并侵蝕動(dòng)脈壁中層。相關(guān)研究表明，動(dòng)脈壁血管細(xì)胞外基質(zhì)的損壞在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病中扮演重要角色，基質(zhì)金屬蛋白酶家族（matrixmetalloproteinases，MMPs）參與其中，如在主動(dòng)脈瘤病變區(qū)域，MMP的重要抑制酶TIM－P2含量降低。同時(shí)，腹主動(dòng)脈瘤被證實(shí)為炎癥性疾病，病變區(qū)域存在大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、各種T細(xì)胞等參與其中，巨噬細(xì)胞可分泌MMPs、ILs、TNFα等導(dǎo)致局部細(xì)胞外基質(zhì)破壞；肥大細(xì)胞分泌組胺、蛋白酶等細(xì)胞因子，引發(fā)平滑肌細(xì)胞（SMCs）凋亡與細(xì)胞外基質(zhì)損傷；T細(xì)胞則通過Fas－FasL途徑使SMCs凋亡，不過Treg細(xì)胞可通過分泌IL－10發(fā)揮動(dòng)脈保護(hù)作用，抑制腹主動(dòng)脈瘤的進(jìn)展。高血壓是夾層腹主動(dòng)脈瘤的重要危險(xiǎn)因素，我國(guó)夾層主動(dòng)脈瘤患者中具有高血壓病史的比例大于80％，可能與高血壓導(dǎo)致的血管壁長(zhǎng)期代償性變化相關(guān)，當(dāng)超出代償能力時(shí)，會(huì)引起動(dòng)脈壁的損害。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）不僅可升高血壓，還可通過強(qiáng)化SMCs的TGF－β信號(hào)通路，誘導(dǎo)其分泌大量MMP－9破壞細(xì)胞外基質(zhì)，或刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌內(nèi)皮素并活化單核細(xì)胞的NF－κB細(xì)胞通路，進(jìn)而調(diào)控SMCs的增殖并誘發(fā)動(dòng)脈粥樣斑塊的形成。吸煙是腹主動(dòng)脈瘤最重要的外界危險(xiǎn)因素，吸煙人群罹患腹主動(dòng)脈瘤的風(fēng)險(xiǎn)是不吸煙人群的四倍，煙草中的尼古丁經(jīng)代謝生成的古丁素，可氧化α1抗胰蛋白酶（α1－AT）中的蛋氨酸，降低α1－AT對(duì)彈力蛋白酶的抑制作用，導(dǎo)致動(dòng)脈壁中的彈力蛋白纖維降解。肥胖與腹主動(dòng)脈瘤相關(guān)，脂肪細(xì)胞釋放的瘦素和FABP4可誘導(dǎo)IL－18、IL－18r和NCC的表達(dá)，IL－18通過后兩者參與腹主動(dòng)脈瘤的形成。家族史也是腹主動(dòng)脈瘤的危險(xiǎn)因素之一，雖已發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因突變可能與腹主動(dòng)脈瘤相關(guān)，但這些基因突變?cè)诓煌蚁档幕颊咧胁痪吖餐?，遺傳因素在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚未明確。在CSE/H?S體系與疾病關(guān)聯(lián)的研究中，國(guó)外研究人員較早關(guān)注到CSE在心血管系統(tǒng)疾病中的作用，并針對(duì)其抑制劑展開探索，發(fā)現(xiàn)某些小分子化合物能夠抑制CSE活性，減少H?S生成，在高血壓動(dòng)物模型中，使用這些抑制劑后，血壓得到一定控制，血管平滑肌的異常增殖也得到緩解，表明CSE抑制劑在心血管疾病治療中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪性肝病中，肝臟CSE缺乏會(huì)促進(jìn)疾病發(fā)生發(fā)展，CSE/H?S系統(tǒng)可促進(jìn)法尼醇X受體(FXR)蛋白DBD區(qū)鋅指結(jié)構(gòu)Cys138/141位點(diǎn)發(fā)生巰基化修飾，促進(jìn)FXR對(duì)肝細(xì)胞糖代謝、脂質(zhì)代謝相關(guān)靶基因調(diào)控，減輕肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，對(duì)非酒精性脂肪肝起保護(hù)作用。在肺動(dòng)脈高壓研究中，首次揭示H?S通過過硫化修飾內(nèi)皮素A型受體（ETAR）蛋白第69位半胱氨酸巰基基團(tuán)，抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMC）增殖，從而抑制肺動(dòng)脈高壓。在主動(dòng)脈瘤/夾層研究中，發(fā)現(xiàn)較高血漿H?S與較低夾層發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，內(nèi)皮細(xì)胞CSE/H?S系統(tǒng)功能障礙通過降低PDI第343和400位點(diǎn)的巰基硫化修飾，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)皮損傷，促進(jìn)主動(dòng)脈瘤/夾層的發(fā)生，同時(shí)發(fā)現(xiàn)HDAC1-ZEB2-NuRD復(fù)合物調(diào)控CSE表達(dá)的新機(jī)制，以及H?S供體GYY4137和HDAC1抑制劑恩替諾特對(duì)主動(dòng)脈瘤/夾層的防治作用。然而，當(dāng)前研究仍存在不足。在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)制方面，雖然已明確多種危險(xiǎn)因素和相關(guān)病理過程，但各因素之間的相互作用及具體分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全闡明。對(duì)于CSE/H?S體系在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病中的作用研究較少，平滑肌細(xì)胞內(nèi)源性CSE/H?S如何參與腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病過程，以及其與其他已知發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)聯(lián)尚不明確，亟待進(jìn)一步深入探究。二、腹主動(dòng)脈瘤概述2.1定義與分類腹主動(dòng)脈瘤是一種較為常見的血管疾病，當(dāng)腹主動(dòng)脈的某一段因各種原因?qū)е缕渲睆綌U(kuò)張至正常直徑的1.5倍以上時(shí)，即可被定義為腹主動(dòng)脈瘤。正常情況下，腹主動(dòng)脈的直徑會(huì)因個(gè)體差異、性別、年齡、種族以及體表面積等因素而有所不同。一般來說，成年男性的腹主動(dòng)脈直徑平均值略大于女性，且隨著年齡的增長(zhǎng)，腹主動(dòng)脈直徑也會(huì)有一定程度的增加。腹主動(dòng)脈瘤按照形態(tài)學(xué)可分為囊狀動(dòng)脈瘤和梭狀動(dòng)脈瘤。囊狀動(dòng)脈瘤通常表現(xiàn)為動(dòng)脈壁的一側(cè)向外呈囊袋狀突出，瘤體與正常動(dòng)脈壁的連接較為狹窄，其形態(tài)猶如一個(gè)掛在動(dòng)脈上的小口袋。這種類型的動(dòng)脈瘤在腹主動(dòng)脈瘤中相對(duì)較為常見，其形成可能與局部動(dòng)脈壁的結(jié)構(gòu)薄弱以及血流動(dòng)力學(xué)異常有關(guān)。梭狀動(dòng)脈瘤則呈現(xiàn)為動(dòng)脈壁均勻性地向四周擴(kuò)張，瘤體的形狀類似梭子，兩端逐漸過渡到正常的動(dòng)脈管徑。梭狀動(dòng)脈瘤的發(fā)生往往與動(dòng)脈粥樣硬化等全身性疾病導(dǎo)致的動(dòng)脈壁廣泛受損有關(guān)，其病變范圍相對(duì)較大，對(duì)動(dòng)脈整體結(jié)構(gòu)和功能的影響也更為顯著。依據(jù)病因，腹主動(dòng)脈瘤又可分為動(dòng)脈粥樣硬化性動(dòng)脈瘤、非動(dòng)脈粥樣硬化性動(dòng)脈瘤和創(chuàng)傷性動(dòng)脈瘤等。動(dòng)脈粥樣硬化性動(dòng)脈瘤是最為常見的類型，其發(fā)病機(jī)制主要與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)。隨著年齡的增長(zhǎng)，尤其是在高血壓、高血脂、吸煙等危險(xiǎn)因素的長(zhǎng)期作用下，血液中的脂質(zhì)會(huì)逐漸在腹主動(dòng)脈內(nèi)膜下沉積，形成粥樣斑塊。這些斑塊會(huì)不斷進(jìn)展，導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、變硬，彈性下降，進(jìn)而使得動(dòng)脈壁的中層結(jié)構(gòu)受到破壞，在血流的沖擊下，局部動(dòng)脈壁逐漸向外擴(kuò)張，最終形成動(dòng)脈瘤。非動(dòng)脈粥樣硬化性動(dòng)脈瘤的病因較為復(fù)雜，其中一些與遺傳性疾病相關(guān)，如馬凡綜合征，這是一種常染色體顯性遺傳性結(jié)締組織疾病，由于編碼原纖維蛋白-1的基因突變，導(dǎo)致患者的結(jié)締組織異常，主動(dòng)脈中層彈力纖維減少、斷裂，使得主動(dòng)脈壁的強(qiáng)度降低，容易引發(fā)腹主動(dòng)脈瘤。此外，某些感染性因素，如梅毒螺旋體感染引起的梅毒性主動(dòng)脈炎，也可能破壞動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)，引發(fā)動(dòng)脈瘤。創(chuàng)傷性動(dòng)脈瘤則是由于腹部受到直接或間接的外力創(chuàng)傷，如車禍、高處墜落、暴力撞擊等，導(dǎo)致腹主動(dòng)脈壁破裂。如果破裂處被周圍的軟組織包裹，形成一個(gè)與動(dòng)脈腔相通的血腫，隨著時(shí)間的推移，血腫機(jī)化，就會(huì)形成創(chuàng)傷性腹主動(dòng)脈瘤。這種類型的動(dòng)脈瘤在發(fā)病時(shí)間和臨床表現(xiàn)上與其他類型有所不同，通常有明確的外傷史，且發(fā)病較為突然。2.2流行病學(xué)特征腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的重要疾病之一。在歐美國(guó)家，AAA的發(fā)病率相對(duì)較高。有研究表明，在65歲以上的人群中，AAA的發(fā)病率約為5%-10%，且男性發(fā)病率明顯高于女性，男性患者約為女性患者的3-8倍。美國(guó)的一項(xiàng)大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查顯示，每年新增AAA患者約有10萬人，每年因AAA死亡的人數(shù)超過1.5萬人，在死因順位中位居第13位。在歐洲，AAA同樣是一個(gè)不容忽視的健康問題，部分國(guó)家的AAA發(fā)病率甚至高達(dá)10%以上。在我國(guó)，雖然缺乏大規(guī)模的全國(guó)性流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，但從部分地區(qū)的研究結(jié)果來看，AAA的發(fā)病率也呈上升態(tài)勢(shì)。隨著人口老齡化的加劇、生活方式的改變以及高血壓、高血脂等危險(xiǎn)因素的增加，AAA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)逐漸提高。有學(xué)者對(duì)我國(guó)某地區(qū)的老年人群進(jìn)行篩查后發(fā)現(xiàn)，AAA的患病率約為3%-5%。而且，AAA的發(fā)病與年齡密切相關(guān)，隨著年齡的增長(zhǎng)，發(fā)病率顯著上升，70歲以上的老年人群是AAA的高發(fā)群體。在性別差異方面，與歐美國(guó)家相似，我國(guó)男性AAA的發(fā)病率也明顯高于女性，這可能與男性吸煙、飲酒等不良生活習(xí)慣更為普遍，以及雄激素對(duì)血管壁的影響等因素有關(guān)。不同種族之間，AAA的發(fā)病率也存在差異。白人的AAA發(fā)病率相對(duì)較高，而亞裔和西班牙裔人群的發(fā)病率較低。例如，有研究對(duì)比了白人、亞裔和西班牙裔人群的AAA發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)白人的AAA患病率為8.1%，而亞裔和西班牙裔人群的患病率均小于3.0%。這種種族差異可能與遺傳因素、生活環(huán)境以及飲食習(xí)慣等多種因素有關(guān)。在地域分布上，AAA的發(fā)病率也有所不同。歐美地區(qū)的發(fā)病率普遍高于亞非地區(qū)。據(jù)報(bào)道，美洲國(guó)家的AAA發(fā)病率為1.4%-2.3%，歐洲國(guó)家為4.0%-4.9%，澳洲為4.0%-7.2%，而我國(guó)香港地區(qū)報(bào)道的發(fā)病率為0.14%。這種地域差異可能與不同地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平、醫(yī)療條件、生活方式以及環(huán)境因素等有關(guān)。在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，人們的生活水平較高，飲食結(jié)構(gòu)中高脂肪、高膽固醇食物攝入較多，同時(shí)運(yùn)動(dòng)量相對(duì)較少，這些因素都可能增加AAA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，醫(yī)療條件的差異也會(huì)影響AAA的早期診斷和治療，進(jìn)而影響其發(fā)病率和死亡率。AAA的發(fā)病還與多種危險(xiǎn)因素密切相關(guān)。吸煙是AAA最重要的危險(xiǎn)因素之一，約80%的AAA患者有吸煙史。研究表明，相對(duì)于不吸煙者，現(xiàn)在仍吸煙者患AAA的風(fēng)險(xiǎn)為3-6倍，曾經(jīng)吸煙者的患病風(fēng)險(xiǎn)為1-2倍。吸煙會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而增加AAA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。動(dòng)脈粥樣硬化也是AAA的重要病因，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成會(huì)破壞血管內(nèi)膜，使動(dòng)脈壁的彈性降低，在血流的沖擊下，容易形成動(dòng)脈瘤。高血壓會(huì)增加血管壁的壓力，長(zhǎng)期的高血壓狀態(tài)可導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)受損，促進(jìn)AAA的發(fā)生和發(fā)展。有研究指出，高血壓患者患AAA的風(fēng)險(xiǎn)是血壓正常者的2-3倍。家族史也是AAA的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，先證者一級(jí)親屬的患病風(fēng)險(xiǎn)為一般人群的2-5倍。遺傳因素在AAA的發(fā)病中起著重要作用，目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)與AAA相關(guān)的基因突變，但這些基因突變?cè)诓煌蚁档幕颊咧胁痪吖餐?，遺傳因素在AAA發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚未完全明確。此外，高血脂、肥胖、慢性阻塞性肺疾病等因素也與AAA的發(fā)病存在一定關(guān)聯(lián)。2.3病理特征與臨床表現(xiàn)腹主動(dòng)脈瘤的病理變化主要集中在血管壁結(jié)構(gòu)的改變。正常的腹主動(dòng)脈壁由內(nèi)膜、中膜和外膜三層結(jié)構(gòu)組成，各層協(xié)同維持血管的正常形態(tài)和功能。在腹主動(dòng)脈瘤形成過程中，動(dòng)脈粥樣硬化起著關(guān)鍵作用。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成會(huì)導(dǎo)致內(nèi)膜增厚，這些斑塊主要由脂質(zhì)、膽固醇結(jié)晶、纖維組織以及炎性細(xì)胞等組成。隨著斑塊的不斷進(jìn)展，其會(huì)逐漸侵蝕動(dòng)脈壁中層，使中層的平滑肌細(xì)胞和彈性纖維受損、減少。研究表明，在腹主動(dòng)脈瘤患者的病變血管組織中，中層彈性纖維的含量明顯低于正常血管，這使得血管壁的彈性和強(qiáng)度顯著下降。此外，炎癥反應(yīng)在腹主動(dòng)脈瘤的病理過程中也扮演著重要角色，病變區(qū)域會(huì)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，如巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等。巨噬細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子和蛋白酶，其中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）能降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，包括膠原蛋白和彈性蛋白，進(jìn)一步破壞血管壁的結(jié)構(gòu)。正常情況下，血管壁中存在著MMPs的抑制劑，如組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs），以維持細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解平衡。然而，在腹主動(dòng)脈瘤中，MMPs的活性升高，而TIMPs的表達(dá)相對(duì)不足，導(dǎo)致這種平衡被打破，細(xì)胞外基質(zhì)過度降解，血管壁變薄、擴(kuò)張。在腹主動(dòng)脈瘤的早期階段，由于瘤體較小且未對(duì)周圍組織造成明顯壓迫，大多數(shù)患者通常沒有明顯的癥狀。這使得許多患者在疾病初期難以察覺，往往是在進(jìn)行其他疾病的檢查或體檢時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)。隨著瘤體的逐漸增大，部分患者可能會(huì)出現(xiàn)一些非特異性癥狀，如腹部隱痛、脹痛或不適感。這種疼痛通常較為輕微，容易被患者忽視或誤認(rèn)為是胃腸道等其他疾病引起的癥狀。當(dāng)瘤體進(jìn)一步增大，壓迫周圍組織和器官時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的壓迫癥狀。如果瘤體壓迫胃腸道，患者可能會(huì)出現(xiàn)腹脹、消化不良、惡心、嘔吐等消化系統(tǒng)癥狀。壓迫輸尿管時(shí)，可導(dǎo)致輸尿管梗阻，引起腎盂積水，患者會(huì)出現(xiàn)腰部疼痛、血尿等泌尿系統(tǒng)癥狀。若壓迫下腔靜脈，會(huì)阻礙下肢靜脈血液回流，導(dǎo)致下肢水腫。腹主動(dòng)脈瘤最危險(xiǎn)的情況是破裂，這是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。一旦瘤體破裂，高速、高壓的動(dòng)脈血會(huì)迅速噴射入腹腔或腹膜后間隙，短時(shí)間內(nèi)患者就會(huì)大量失血?；颊邥?huì)突然出現(xiàn)劇烈的腹痛或腰背部疼痛，這種疼痛通常難以忍受，常伴有大汗淋漓、面色蒼白、心慌、頭暈等癥狀。隨著出血量的增加，患者會(huì)迅速進(jìn)入失血性休克狀態(tài)，表現(xiàn)為血壓急劇下降、心率加快、意識(shí)模糊甚至昏迷。如果不及時(shí)進(jìn)行救治，患者往往會(huì)在短時(shí)間內(nèi)死亡。據(jù)統(tǒng)計(jì)，腹主動(dòng)脈瘤破裂后的死亡率高達(dá)85%-90%，即使患者能夠及時(shí)被送至醫(yī)院接受治療，手術(shù)的難度和風(fēng)險(xiǎn)也非常大，術(shù)后的并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率仍然較高。此外，瘤腔內(nèi)還可能形成血栓，當(dāng)血栓脫落時(shí)，可隨血流進(jìn)入腹主動(dòng)脈的分支血管，導(dǎo)致動(dòng)脈栓塞。如果栓塞發(fā)生在腸系膜動(dòng)脈，會(huì)引起腸道缺血、壞死，患者出現(xiàn)劇烈腹痛、嘔吐、血便等癥狀。若栓塞發(fā)生在下肢動(dòng)脈，會(huì)導(dǎo)致下肢缺血，出現(xiàn)下肢疼痛、麻木、發(fā)涼、皮膚蒼白等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肢體壞死。三、平滑肌細(xì)胞與腹主動(dòng)脈瘤的關(guān)系3.1平滑肌細(xì)胞在血管中的正常生理功能平滑肌細(xì)胞是構(gòu)成血管壁中膜的主要細(xì)胞成分，在維持血管的正常結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著舉足輕重的作用。從結(jié)構(gòu)角度來看，平滑肌細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，它們緊密排列在血管中膜，與周圍的細(xì)胞外基質(zhì)相互交織，共同構(gòu)成了一個(gè)堅(jiān)韌且富有彈性的結(jié)構(gòu)框架。細(xì)胞內(nèi)富含肌絲，這些肌絲是平滑肌細(xì)胞實(shí)現(xiàn)收縮功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。此外，平滑肌細(xì)胞還含有豐富的線粒體，為細(xì)胞的各種生理活動(dòng)提供充足的能量。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體則參與蛋白質(zhì)的合成與加工，確保細(xì)胞能夠合成并分泌維持血管正常結(jié)構(gòu)和功能所需的各種物質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分。在調(diào)節(jié)血管張力方面，平滑肌細(xì)胞起著核心作用。血管張力的穩(wěn)定對(duì)于維持正常的血壓和血液循環(huán)至關(guān)重要。平滑肌細(xì)胞通過自身的收縮和舒張來調(diào)節(jié)血管的口徑，進(jìn)而改變血管阻力和血流量。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)或需要調(diào)節(jié)局部組織的血液供應(yīng)時(shí)，平滑肌細(xì)胞會(huì)迅速做出反應(yīng)。例如，在運(yùn)動(dòng)時(shí)，為了滿足肌肉組織對(duì)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求增加，供應(yīng)肌肉的血管平滑肌細(xì)胞會(huì)舒張，使血管口徑增大，血流量增加。相反，在血壓升高時(shí)，血管平滑肌細(xì)胞會(huì)收縮，減小血管口徑，增加血管阻力，從而降低血壓。這種精確的調(diào)節(jié)機(jī)制主要依賴于一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路。神經(jīng)遞質(zhì)、激素等信號(hào)分子與平滑肌細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。以去甲腎上腺素為例，它作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與平滑肌細(xì)胞上的α1腎上腺素受體結(jié)合后，通過激活蛋白激酶C（PKC）通路，促使肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）磷酸化并激活。激活的MLCK進(jìn)一步催化肌球蛋白輕鏈磷酸化，使得肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，形成肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白復(fù)合物，引發(fā)平滑肌細(xì)胞收縮。而當(dāng)乙酰膽堿與平滑肌細(xì)胞上的M3膽堿受體結(jié)合時(shí)，會(huì)激活磷脂酶C（PLC）通路，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞舒張。平滑肌細(xì)胞還參與了血管的重塑過程。在生理狀態(tài)下，血管會(huì)根據(jù)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、代謝需求以及血流動(dòng)力學(xué)的變化進(jìn)行適應(yīng)性的重塑。平滑肌細(xì)胞在這個(gè)過程中能夠合成和分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖等。這些成分相互交織，形成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，賦予血管壁堅(jiān)韌的力學(xué)性能和良好的彈性。同時(shí)，平滑肌細(xì)胞還可以通過調(diào)節(jié)自身的增殖、遷移和凋亡等生物學(xué)行為，參與血管壁的結(jié)構(gòu)調(diào)整和修復(fù)。在血管受到輕微損傷時(shí)，平滑肌細(xì)胞會(huì)從收縮型表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚捅硇?，增殖并遷移到損傷部位，合成新的細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)血管的修復(fù)和重塑。3.2平滑肌細(xì)胞在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病中的異常變化在腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病過程中，平滑肌細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列顯著的異常變化，這些變化對(duì)血管壁的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換是腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病中的關(guān)鍵病理變化之一。在正常生理狀態(tài)下，血管平滑肌細(xì)胞主要以收縮型表型存在，其特征是表達(dá)高水平的收縮蛋白，如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、結(jié)蛋白（desmin）以及特定的肌球蛋白重鏈亞型（SM1和SM2）。收縮型平滑肌細(xì)胞具有發(fā)達(dá)的肌絲結(jié)構(gòu)，富含線粒體等細(xì)胞器，能夠有效地執(zhí)行收縮功能，維持血管的正常張力和形態(tài)。然而，在腹主動(dòng)脈瘤形成過程中，受到多種因素的刺激，平滑肌細(xì)胞會(huì)從收縮型表型向合成型表型轉(zhuǎn)換。合成型平滑肌細(xì)胞的收縮蛋白表達(dá)顯著降低，而與細(xì)胞增殖、遷移和合成細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，在腹主動(dòng)脈瘤組織中，α-SMA、SM1和SM2的表達(dá)明顯低于正常血管組織，而合成型表型標(biāo)志物，如胚胎型肌球蛋白重鏈（SMemb）的表達(dá)則顯著升高。這種表型轉(zhuǎn)換使得平滑肌細(xì)胞的收縮能力下降，無法有效地維持血管壁的張力。同時(shí)，合成型平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力增強(qiáng)，它們會(huì)遷移到血管內(nèi)膜下，增殖并合成大量細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致血管壁增厚、變硬，進(jìn)一步破壞血管的正常結(jié)構(gòu)和功能。平滑肌細(xì)胞的凋亡在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病中也起著重要作用。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，在維持組織穩(wěn)態(tài)和正常生理功能中具有重要意義。然而，在腹主動(dòng)脈瘤患者的血管組織中，平滑肌細(xì)胞的凋亡明顯增加。通過原位DNA末端標(biāo)記（TUNEL）技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腹主動(dòng)脈瘤組織中平滑肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著高于正常腹主動(dòng)脈組織。平滑肌細(xì)胞凋亡的增加導(dǎo)致血管壁中平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少，破壞了血管壁的正常結(jié)構(gòu)。平滑肌細(xì)胞是血管壁中主要的結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞，其數(shù)量的減少使得血管壁的強(qiáng)度和彈性下降，無法承受血流的沖擊，從而促進(jìn)腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)展。多種因素可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡，炎癥細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，能夠激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量活性氧（ROS）也可損傷平滑肌細(xì)胞的DNA和線粒體等細(xì)胞器，引發(fā)細(xì)胞凋亡。除了表型轉(zhuǎn)換和凋亡，平滑肌細(xì)胞的增殖異常也與腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病密切相關(guān)。在腹主動(dòng)脈瘤形成的早期階段，平滑肌細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)短暫的增殖現(xiàn)象。這是機(jī)體對(duì)血管損傷的一種代償性反應(yīng)，試圖通過平滑肌細(xì)胞的增殖來修復(fù)受損的血管壁。然而，這種增殖反應(yīng)往往是失控的，平滑肌細(xì)胞過度增殖，導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)紊亂。隨著疾病的進(jìn)展，平滑肌細(xì)胞的增殖能力逐漸下降，而凋亡增加，使得血管壁中平滑肌細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)一步減少。平滑肌細(xì)胞增殖異常與多種信號(hào)通路的失調(diào)有關(guān)，血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等生長(zhǎng)因子及其受體的異常激活，可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖。而一些抑癌基因的表達(dá)下調(diào)，如p53基因，也會(huì)導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞的增殖失控。平滑肌細(xì)胞的這些異常變化相互作用，共同促進(jìn)了腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生和發(fā)展。表型轉(zhuǎn)換使得平滑肌細(xì)胞從維持血管張力的收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性鲋澈瓦w移能力的合成型，為平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移提供了條件。而平滑肌細(xì)胞的過度增殖和遷移又進(jìn)一步破壞了血管壁的結(jié)構(gòu)，增加了細(xì)胞凋亡的風(fēng)險(xiǎn)。平滑肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致血管壁中平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少，使得血管壁的強(qiáng)度和彈性下降，無法承受血流的沖擊，從而促進(jìn)腹主動(dòng)脈瘤的擴(kuò)張。3.3相關(guān)研究案例分析國(guó)內(nèi)外諸多研究案例為深入理解平滑肌細(xì)胞功能異常如何導(dǎo)致腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展提供了豐富的證據(jù)。吳建秋和景在平選取豚鼠—大鼠異種移植腹主動(dòng)脈瘤模型，利用平滑肌細(xì)胞α2肌動(dòng)蛋白、增殖細(xì)胞核抗原抗體免疫組織化學(xué)檢測(cè)和原位末端DNA標(biāo)記法，動(dòng)態(tài)觀測(cè)術(shù)后1-4周相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示，1-2周移植腹主動(dòng)脈直徑中度擴(kuò)張，細(xì)胞增殖指數(shù)大于細(xì)胞凋亡指數(shù)；3-4周移植物顯著擴(kuò)張，細(xì)胞凋亡指數(shù)大于細(xì)胞增殖指數(shù)，且移植組血管平滑肌細(xì)胞凋亡與移植動(dòng)脈直徑呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。該研究清晰地表明，細(xì)胞增殖和凋亡貫穿于腹主動(dòng)脈損傷重構(gòu)的全過程，兩者平衡失調(diào)是導(dǎo)致腹主動(dòng)脈瘤形成和發(fā)展的重要因素。在腹主動(dòng)脈瘤形成的早期，平滑肌細(xì)胞的增殖本是機(jī)體對(duì)血管損傷的一種代償反應(yīng)，但這種增殖未能持續(xù)有效維持血管壁結(jié)構(gòu)，隨著病情發(fā)展，凋亡逐漸占據(jù)主導(dǎo)，使得血管壁中平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少，無法維持正常的血管壁強(qiáng)度和彈性，最終促進(jìn)了腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)展。張健等人對(duì)25例腹主動(dòng)脈瘤（AAA）和10例正常腹主動(dòng)脈組織進(jìn)行研究，采用原位DNA末端標(biāo)記（TUNEL）技術(shù)聯(lián)合抗-CD3、抗-CD20、抗-CD68及抗α-actin的免疫組化染色。研究發(fā)現(xiàn)，AAA中層平滑肌細(xì)胞數(shù)量為（38±8）SMC/HPF，較正常腹主動(dòng)脈的（179±16）SMC/HPF減少79.1%，P＜0.01；正常腹主動(dòng)脈TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞約為1.0%，AAA組織中則為8.6%，P＜0.01，且免疫組化染色顯示這些凋亡細(xì)胞多為平滑肌細(xì)胞。這一研究直接證實(shí)了AAA中層平滑肌細(xì)胞的凋亡是平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少的重要原因。平滑肌細(xì)胞數(shù)量的大幅減少，破壞了血管壁的正常結(jié)構(gòu)和功能，使其難以承受血流的沖擊，從而推動(dòng)了腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)展。北京大學(xué)鄭樂民團(tuán)隊(duì)在小鼠的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）中特異性敲除胃泌素蛋白D（GSDMD），并觀察血管緊張素II誘導(dǎo)的AAA模型。結(jié)果顯示，GSDMD的缺失改善了AAA的發(fā)生與發(fā)展，同時(shí)促進(jìn)VSMC向收縮型表型轉(zhuǎn)換。通過非靶向代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，VSMC特異性GSDMD敲除小鼠的血漿和主動(dòng)脈組織中的腐胺顯著減少。進(jìn)一步研究表明，高腐胺水平觸發(fā)了VSMC的促炎表型，并增加了小鼠對(duì)血管緊張素II誘導(dǎo)的AAA形成的易感性，而腐胺生成酶ODC1的過表達(dá)可促進(jìn)AAA的發(fā)生，用ODC1抑制劑二氟甲基鳥氨酸（DFMO）治療可減少血管緊張素II誘導(dǎo)的AAA形成。從機(jī)制上講，GSDMD增強(qiáng)了PERK-eIF-2α通路，進(jìn)而增強(qiáng)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-C/EBP同源蛋白(CHOP)信號(hào)，最后促進(jìn)了腐胺生成酶ODC1的合成，而腐胺通過上調(diào)C/EBPβ和NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的含量及磷酸化水平，促進(jìn)了平滑肌細(xì)胞向合成型轉(zhuǎn)化，在主動(dòng)脈中促進(jìn)了AAA的發(fā)生發(fā)展。該研究從分子機(jī)制層面揭示了平滑肌細(xì)胞相關(guān)因素對(duì)腹主動(dòng)脈瘤的影響，即平滑肌細(xì)胞中GSDMD通過影響腐胺合成，調(diào)控平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和炎癥反應(yīng)，最終影響腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展。四、CSE/H?S體系概述4.1CSE的生物學(xué)特性與功能胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）是一種在生物體內(nèi)具有關(guān)鍵作用的酶，其生物學(xué)特性與功能對(duì)維持機(jī)體正常生理狀態(tài)至關(guān)重要。CSE的基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，人類CSE基因位于第1號(hào)染色體短臂（1p36.11）上，包含11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子。通過對(duì)CSE基因序列的分析發(fā)現(xiàn)，其啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如Sp1、AP-1等，這些轉(zhuǎn)錄因子可通過與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控CSE基因的轉(zhuǎn)錄水平。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面，CSE是一種磷酸吡哆醛-5'-磷酸（PLP）依賴性酶，其相對(duì)分子質(zhì)量約為63kDa。CSE蛋白由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中催化結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與底物L(fēng)-胱硫醚結(jié)合，并在PLP的參與下催化其分解。研究表明，CSE蛋白的催化活性中心含有半胱氨酸殘基，這些殘基對(duì)于維持酶的催化活性至關(guān)重要。當(dāng)半胱氨酸殘基發(fā)生氧化或修飾時(shí)，CSE的活性會(huì)受到顯著影響。CSE在體內(nèi)的分布具有明顯的組織特異性。在心血管系統(tǒng)中，CSE主要表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞。免疫組化研究顯示，在主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈等血管組織中，CSE蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，且在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)水平較高。在肝臟中，CSE也有一定程度的表達(dá)，參與肝臟的代謝過程。而在神經(jīng)系統(tǒng)中，CSE的表達(dá)相對(duì)較低，但在某些特定的神經(jīng)元群體中仍可檢測(cè)到其存在。這種組織特異性分布使得CSE能夠在不同組織中發(fā)揮獨(dú)特的生理功能。CSE的主要功能是催化L-胱硫醚分解，生成L-半胱氨酸、α-酮丁酸和H?S。這一過程在生物體內(nèi)的H?S生成中起著關(guān)鍵作用。H?S作為一種新型氣體信號(hào)分子，參與了眾多生理功能的調(diào)節(jié)。在心血管系統(tǒng)中，CSE催化生成的H?S能夠調(diào)節(jié)血管張力。當(dāng)血管平滑肌細(xì)胞受到刺激時(shí)，CSE活性增強(qiáng)，H?S生成增加，H?S可作用于血管平滑肌細(xì)胞上的鉀離子通道，使鉀離子外流增加，細(xì)胞膜超極化，從而導(dǎo)致血管平滑肌舒張，血管擴(kuò)張。研究表明，給予CSE抑制劑后，血管組織中H?S生成減少，血管張力升高，提示CSE-H?S體系在維持血管正常舒張功能中具有重要作用。在細(xì)胞增殖和凋亡方面，CSE-H?S體系也發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。在血管平滑肌細(xì)胞中，適量的H?S可以抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，用H?S供體處理血管平滑肌細(xì)胞后，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)降低，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1的表達(dá)也受到抑制，同時(shí)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)增加，Bcl-2的表達(dá)減少，表明H?S能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。這一調(diào)節(jié)作用對(duì)于維持血管壁細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有重要意義，可防止血管平滑肌細(xì)胞過度增殖導(dǎo)致的血管壁增厚和狹窄。CSE還參與了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。在氧化應(yīng)激條件下，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平升高，會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷。CSE生成的H?S具有抗氧化作用，可通過清除ROS，減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注損傷模型中，給予CSE激活劑，可增加心肌組織中H?S含量，降低ROS水平，減少心肌細(xì)胞凋亡，改善心臟功能。在炎癥反應(yīng)中，CSE-H?S體系可抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥因子的釋放。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥模型中，H?S能夠抑制巨噬細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的激活，減少炎癥因子TNF-α、IL-6等的表達(dá)和釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)。4.2H?S的生理功能與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑H?S在心血管系統(tǒng)中展現(xiàn)出多方面的生理功能，對(duì)維持心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵作用。在血管舒張方面，H?S是一種重要的血管舒張因子。大量研究表明，它能夠直接作用于血管平滑肌細(xì)胞，調(diào)節(jié)血管張力。其作用機(jī)制主要與鉀離子通道和氯離子/碳酸氫根離子交換體有關(guān)。H?S可以激活血管平滑肌細(xì)胞膜上的ATP敏感性鉀離子通道（KATP通道），使鉀離子外流增加，細(xì)胞膜超極化。細(xì)胞膜的超極化狀態(tài)使得電壓依賴性鈣離子通道難以開放，細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流減少，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低。而鈣離子是平滑肌細(xì)胞收縮的關(guān)鍵信號(hào)分子，其濃度降低會(huì)使得平滑肌細(xì)胞的收縮能力減弱，從而實(shí)現(xiàn)血管舒張。在一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射H?S供體后，觀察到其動(dòng)脈血壓明顯下降，血管內(nèi)徑增大，進(jìn)一步證實(shí)了H?S的血管舒張作用。研究還發(fā)現(xiàn)，H?S可以通過調(diào)節(jié)氯離子/碳酸氫根離子交換體，影響細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡，進(jìn)而影響血管平滑肌的舒張功能。當(dāng)H?S作用于血管平滑肌細(xì)胞時(shí)，會(huì)促進(jìn)氯離子外流和碳酸氫根離子內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)pH值升高，這種細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變有助于血管平滑肌的舒張。在抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移方面，H?S同樣發(fā)揮著重要作用。血管平滑肌細(xì)胞的過度增殖和遷移是動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。H?S可以通過多種途徑抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。H?S能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）在細(xì)胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)換過程中起著關(guān)鍵作用，它的表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖。而H?S可以抑制CyclinD1的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1期，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖。H?S還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路來影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。ERK信號(hào)通路的激活會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，而H?S可以抑制ERK的磷酸化，使其活性降低，進(jìn)而抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，用H?S供體處理血管平滑肌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖活性明顯降低，遷移能力也受到顯著抑制，細(xì)胞中CyclinD1的表達(dá)減少，ERK的磷酸化水平降低。H?S還參與了心肌功能的調(diào)節(jié)。在心肌細(xì)胞中，H?S可以調(diào)節(jié)心肌的收縮力和心率。研究表明，H?S能夠作用于心肌細(xì)胞膜上的離子通道，如L型鈣離子通道和鉀離子通道，影響心肌細(xì)胞的電生理特性，從而調(diào)節(jié)心肌的收縮和舒張功能。適量的H?S可以增強(qiáng)心肌的收縮力，改善心臟的泵血功能。當(dāng)心肌缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)，心肌組織中H?S的生成會(huì)減少，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷加重。而外源性給予H?S可以減輕心肌缺血再灌注損傷，保護(hù)心肌細(xì)胞。其機(jī)制可能與H?S的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用有關(guān)。H?S可以清除心肌細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS），減少氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。H?S還可以抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)心肌細(xì)胞的損害。H?S能夠抑制心肌細(xì)胞的凋亡，減少心肌細(xì)胞的死亡，從而保護(hù)心臟功能。H?S參與心血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑較為復(fù)雜，涉及多個(gè)信號(hào)分子和通路。除了上述提到的KATP通道、ERK信號(hào)通路等，H?S還可以通過調(diào)節(jié)蛋白激酶G（PKG）信號(hào)通路來發(fā)揮作用。一氧化氮（NO）是一種重要的血管舒張因子，它可以激活鳥苷酸環(huán)化酶（GC），使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，進(jìn)而激活PKG。PKG的激活會(huì)導(dǎo)致血管平滑肌舒張。研究發(fā)現(xiàn)，H?S可以與NO相互作用，協(xié)同調(diào)節(jié)血管張力。H?S可以通過增加細(xì)胞內(nèi)cGMP水平，激活PKG，從而發(fā)揮血管舒張作用。H?S還可以通過調(diào)節(jié)其他信號(hào)分子，如磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路、核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路等，參與心血管系統(tǒng)的生理和病理過程。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞存活、增殖和抗凋亡等方面發(fā)揮著重要作用，H?S可以激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的存活和抗凋亡。而NF-κB信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，H?S可以抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，減少炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)心血管系統(tǒng)的損害。4.3平滑肌細(xì)胞內(nèi)CSE/H?S體系的特點(diǎn)在平滑肌細(xì)胞中，CSE的表達(dá)呈現(xiàn)出一定的特異性。免疫組化和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)表明，CSE蛋白在血管平滑肌細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)。通過對(duì)不同血管部位的平滑肌細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中CSE的表達(dá)水平相對(duì)較高，而小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)水平略低。在細(xì)胞內(nèi)的定位方面，CSE主要分布于平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，與其他參與細(xì)胞代謝和信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白相互作用。利用免疫熒光技術(shù)對(duì)平滑肌細(xì)胞進(jìn)行染色觀察，可清晰看到CSE在細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)出均勻分布的狀態(tài)，且與線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器存在一定程度的共定位現(xiàn)象，這暗示著CSE可能與這些細(xì)胞器的功能密切相關(guān)。平滑肌細(xì)胞內(nèi)CSE的活性也具有獨(dú)特之處。CSE的活性受到多種因素的調(diào)節(jié)，其中底物濃度、輔酶水平以及細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)等對(duì)其活性影響較大。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)L-胱硫醚的濃度增加時(shí)，CSE的活性會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)，從而促進(jìn)H?S的生成。研究表明，在體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞中，向培養(yǎng)基中添加適量的L-胱硫醚，細(xì)胞內(nèi)H?S的含量會(huì)顯著上升，說明底物濃度對(duì)CSE活性的正向調(diào)節(jié)作用。輔酶磷酸吡哆醛-5'-磷酸（PLP）是CSE發(fā)揮催化作用所必需的，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)PLP水平降低時(shí)，CSE的活性會(huì)受到抑制。通過干擾細(xì)胞內(nèi)PLP的合成或攝取，可觀察到平滑肌細(xì)胞中CSE活性下降，H?S生成減少。細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)也會(huì)影響CSE的活性，氧化應(yīng)激條件下，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平升高，可導(dǎo)致CSE蛋白中的半胱氨酸殘基發(fā)生氧化修飾，從而降低CSE的活性。在過氧化氫處理的平滑肌細(xì)胞中，CSE的活性明顯降低，H?S生成減少，而給予抗氧化劑后，CSE活性和H?S生成量有所恢復(fù)。與其他細(xì)胞類型相比，平滑肌細(xì)胞內(nèi)CSE/H?S體系存在明顯差異。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，雖然也存在CSE的表達(dá)，但表達(dá)水平相對(duì)較低。通過對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中CSEmRNA和蛋白表達(dá)水平的定量分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞中CSE的表達(dá)量?jī)H為平滑肌細(xì)胞的1/3-1/2。這使得內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)H?S的生成量也相對(duì)較少。在生理功能方面，平滑肌細(xì)胞內(nèi)CSE/H?S體系主要參與血管張力的調(diào)節(jié)、平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移等過程。而內(nèi)皮細(xì)胞中H?S的功能更多地與血管內(nèi)皮的完整性、抗血栓形成以及調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞與血液中細(xì)胞成分的相互作用有關(guān)。在肝臟細(xì)胞中，CSE的表達(dá)模式和功能也與平滑肌細(xì)胞不同。肝臟細(xì)胞中CSE參與肝臟的代謝過程，如參與蛋氨酸代謝循環(huán)，調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)的氧化還原狀態(tài)等。而平滑肌細(xì)胞內(nèi)CSE/H?S體系主要關(guān)注對(duì)血管功能的調(diào)節(jié)。這些差異表明，CSE/H?S體系在不同細(xì)胞類型中具有特異性的表達(dá)和功能，以適應(yīng)各細(xì)胞類型的生理需求。五、平滑肌細(xì)胞內(nèi)源性CSE/H?S在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病中的作用機(jī)制5.1對(duì)血管壁細(xì)胞外基質(zhì)代謝的影響在正常生理狀態(tài)下，血管壁細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成與降解保持著精細(xì)的平衡，這對(duì)于維持血管壁的結(jié)構(gòu)完整性和正常功能至關(guān)重要。平滑肌細(xì)胞在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們能夠合成和分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖等。這些成分相互交織，形成了一個(gè)堅(jiān)韌且富有彈性的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，賦予血管壁良好的力學(xué)性能，使其能夠承受血流的沖擊。正常血管壁中存在著一系列的酶和調(diào)節(jié)因子，它們共同維持著ECM代謝的平衡?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族在ECM降解過程中扮演著重要角色，而組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）則可以抑制MMPs的活性，防止ECM過度降解。在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病過程中，這一平衡被打破，導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)受損。平滑肌細(xì)胞內(nèi)源性CSE/H?S體系對(duì)血管壁細(xì)胞外基質(zhì)代謝有著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，CSE/H?S體系能夠影響MMPs和TIMPs的表達(dá)與活性。在體外實(shí)驗(yàn)中，給予血管平滑肌細(xì)胞H?S供體處理后，發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活性顯著降低。MMP-2和MMP-9是兩種重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，它們能夠降解膠原蛋白和彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分。H?S通過抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活性，減少了細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而有助于維持血管壁的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，H?S可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)對(duì)MMPs的調(diào)控。H?S能夠抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路的激活。在血管平滑肌細(xì)胞受到刺激時(shí)，MAPK信號(hào)通路會(huì)被激活，進(jìn)而促進(jìn)MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活性。而H?S可以抑制MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵激酶的磷酸化，使其活性降低，從而減少M(fèi)MP-2和MMP-9的表達(dá)和分泌。H?S還可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性來影響MMPs的表達(dá)。核因子κB（NF-κB）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它可以調(diào)控MMP-2和MMP-9等基因的轉(zhuǎn)錄。H?S能夠抑制NF-κB的活化，減少其與MMPs基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，從而降低MMPs的表達(dá)水平。CSE/H?S體系對(duì)TIMPs的表達(dá)也有調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，H?S供體處理血管平滑肌細(xì)胞后，TIMPs的表達(dá)水平升高。TIMPs可以與MMPs結(jié)合，形成復(fù)合物，從而抑制MMPs的活性。H?S通過促進(jìn)TIMPs的表達(dá)，增強(qiáng)了對(duì)MMPs的抑制作用，進(jìn)一步維持了細(xì)胞外基質(zhì)代謝的平衡。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過構(gòu)建CSE基因敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠血管壁中MMP-2和MMP-9的活性明顯升高，而TIMPs的表達(dá)降低，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解增加，血管壁結(jié)構(gòu)受損。給予這些小鼠H?S供體干預(yù)后，MMP-2和MMP-9的活性得到抑制，TIMPs的表達(dá)升高，血管壁的結(jié)構(gòu)和功能得到一定程度的改善。細(xì)胞外基質(zhì)的異常代謝會(huì)導(dǎo)致血管壁強(qiáng)度下降，這是腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白和彈性蛋白等成分被過度降解時(shí)，血管壁的彈性和韌性降低，無法承受血流的沖擊。在長(zhǎng)期的血流壓力作用下，血管壁逐漸擴(kuò)張，形成動(dòng)脈瘤。膠原蛋白是血管壁中重要的結(jié)構(gòu)蛋白，它賦予血管壁一定的強(qiáng)度和韌性。彈性蛋白則使血管壁具有良好的彈性，能夠在心臟收縮和舒張時(shí)發(fā)生相應(yīng)的擴(kuò)張和回縮。當(dāng)這些成分減少時(shí)，血管壁的力學(xué)性能發(fā)生改變，容易出現(xiàn)局部擴(kuò)張和變形。研究表明，在腹主動(dòng)脈瘤患者的血管組織中，膠原蛋白和彈性蛋白的含量明顯低于正常血管組織，且MMPs的活性升高，TIMPs的表達(dá)相對(duì)不足。這種細(xì)胞外基質(zhì)代謝的失衡導(dǎo)致血管壁強(qiáng)度下降，增加了腹主動(dòng)脈瘤破裂的風(fēng)險(xiǎn)。5.2對(duì)血管炎癥反應(yīng)的調(diào)控在腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病進(jìn)程中，血管炎癥反應(yīng)貫穿始終，是推動(dòng)疾病發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。炎癥細(xì)胞的大量浸潤(rùn)和炎癥因子的過度釋放，會(huì)對(duì)血管壁的結(jié)構(gòu)和功能造成嚴(yán)重破壞。巨噬細(xì)胞作為炎癥反應(yīng)的重要參與者，在腹主動(dòng)脈瘤病變部位大量聚集。它們通過吞噬作用清除病原體和受損細(xì)胞，但同時(shí)也會(huì)釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子會(huì)進(jìn)一步激活其他免疫細(xì)胞，形成級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)不斷加劇。T淋巴細(xì)胞也在腹主動(dòng)脈瘤的炎癥過程中發(fā)揮重要作用，不同亞型的T淋巴細(xì)胞具有不同的功能，輔助性T細(xì)胞1（Th1）和Th17細(xì)胞可分泌促炎細(xì)胞因子，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)；而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）則具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。當(dāng)Treg細(xì)胞功能受損或數(shù)量減少時(shí)，無法有效抑制炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)展。平滑肌細(xì)胞內(nèi)源性CSE/H?S體系對(duì)血管炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用。研究表明，H?S可以抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化。在體外實(shí)驗(yàn)中，用H?S供體處理巨噬細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的遷移能力受到抑制，其向炎癥部位的浸潤(rùn)減少。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，H?S可以通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表面的趨化因子受體表達(dá)來實(shí)現(xiàn)這一作用。趨化因子受體如CC趨化因子受體2（CCR2）在巨噬細(xì)胞的遷移過程中起著關(guān)鍵作用，H?S能夠降低CCR2的表達(dá)，使巨噬細(xì)胞對(duì)趨化因子的趨化反應(yīng)減弱，從而抑制其向炎癥部位的遷移。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予CSE基因敲除小鼠血管緊張素II刺激誘導(dǎo)腹主動(dòng)脈瘤形成，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，CSE基因敲除小鼠血管壁中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯增加。而給予這些小鼠H?S供體干預(yù)后，巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著減少，表明CSE/H?S體系在體內(nèi)也能夠抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。CSE/H?S體系還能夠抑制炎癥因子的釋放。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥模型中，用H?S供體處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的含量顯著降低。其機(jī)制與H?S對(duì)NF-κB信號(hào)通路的抑制作用密切相關(guān)。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起著核心調(diào)控作用。在正常情況下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，與炎癥因子基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。而H?S可以抑制IKK的活性，使IκB不被磷酸化，從而阻止NF-κB的活化和核轉(zhuǎn)位。研究發(fā)現(xiàn)，H?S能夠使IKKα和IKKβ的磷酸化水平降低，減少IκB的降解，進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，最終減少炎癥因子的釋放。CSE/H?S體系對(duì)血管炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用還體現(xiàn)在對(duì)炎癥相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)上。除了NF-κB信號(hào)通路外，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中也起著重要作用。MAPK信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多條途徑。在炎癥刺激下，MAPK信號(hào)通路被激活，可促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和細(xì)胞的增殖、遷移等。H?S可以抑制MAPK信號(hào)通路的激活。在體外實(shí)驗(yàn)中，用H?S供體處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平明顯降低。進(jìn)一步研究表明，H?S可以通過調(diào)節(jié)上游激酶的活性來抑制MAPK信號(hào)通路。例如，H?S可以抑制Raf-1激酶的活性，Raf-1是ERK信號(hào)通路的上游激酶，其活性降低會(huì)導(dǎo)致ERK的磷酸化減少，從而抑制MAPK信號(hào)通路的激活。CSE/H?S體系通過抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化、抑制炎癥因子的釋放以及調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)信號(hào)通路，對(duì)血管炎癥反應(yīng)起到重要的調(diào)控作用。在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病過程中，CSE/H?S體系功能的異?？赡軙?huì)導(dǎo)致血管炎癥反應(yīng)失控，進(jìn)而促進(jìn)腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)展。因此，深入研究CSE/H?S體系對(duì)血管炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于理解腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義。5.3對(duì)平滑肌細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換、增殖和凋亡在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用，而平滑肌細(xì)胞內(nèi)源性CSE/H?S體系對(duì)這些過程具有重要的調(diào)節(jié)作用。在平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換方面，正常情況下，血管平滑肌細(xì)胞主要以收縮型表型存在，具有典型的形態(tài)和功能特征，能夠維持血管的正常張力。然而，在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病過程中，多種因素會(huì)刺激平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?。合成型平滑肌?xì)胞的收縮蛋白表達(dá)降低，而增殖和遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)增加，導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)和功能異常。研究表明，CSE/H?S體系可以抑制平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換。在體外實(shí)驗(yàn)中，用H?S供體處理血管平滑肌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中收縮型表型標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)增加，而合成型表型標(biāo)志物胚胎型肌球蛋白重鏈（SMemb）的表達(dá)降低。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，H?S可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路來影響平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換。H?S能夠抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路的激活。MAPK信號(hào)通路的激活會(huì)促進(jìn)平滑肌細(xì)胞從收縮型向合成型轉(zhuǎn)換，而H?S可以抑制MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵激酶的磷酸化，使其活性降低，從而抑制平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換。H?S還可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性來影響平滑肌細(xì)胞的表型。血清反應(yīng)因子（SRF）和心肌素（Myocardin）是維持平滑肌細(xì)胞收縮型表型的重要轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，H?S可以促進(jìn)SRF和Myocardin與平滑肌細(xì)胞特異性基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，增強(qiáng)這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而維持平滑肌細(xì)胞的收縮型表型。平滑肌細(xì)胞的增殖在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病過程中也經(jīng)歷了復(fù)雜的變化。在腹主動(dòng)脈瘤形成的早期階段，平滑肌細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)短暫的增殖現(xiàn)象，這是機(jī)體對(duì)血管損傷的一種代償性反應(yīng)。然而，隨著疾病的進(jìn)展，平滑肌細(xì)胞的增殖逐漸失控，過度增殖的平滑肌細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)紊亂。研究表明，CSE/H?S體系對(duì)平滑肌細(xì)胞的增殖具有抑制作用。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，用H?S供體處理血管平滑肌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖活性明顯降低。通過檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)H?S可以使細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)減少，細(xì)胞周期停滯在G1期，從而抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，H?S可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的抑制。H?S能夠抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路的激活。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖，而H?S可以抑制PI3K的活性，減少Akt的磷酸化，從而抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。H?S還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路來影響平滑肌細(xì)胞的增殖。ERK信號(hào)通路的激活會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖，而H?S可以抑制ERK的磷酸化，使其活性降低，進(jìn)而抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病過程中，平滑肌細(xì)胞的凋亡增加，這會(huì)導(dǎo)致血管壁中平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少，破壞血管壁的正常結(jié)構(gòu)和功能。研究表明，CSE/H?S體系可以抑制平滑肌細(xì)胞的凋亡。在體外實(shí)驗(yàn)中，用H?S供體處理血管平滑肌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)減少，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡率明顯降低。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，H?S可以通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡信號(hào)通路來抑制平滑肌細(xì)胞的凋亡。在細(xì)胞凋亡過程中，線粒體膜電位會(huì)下降，細(xì)胞色素C會(huì)從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活下游的凋亡蛋白酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。H?S可以通過抑制線粒體膜電位的下降，減少細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制線粒體凋亡信號(hào)通路的激活，減少平滑肌細(xì)胞的凋亡。H?S還可以通過調(diào)節(jié)其他凋亡相關(guān)信號(hào)通路，如死亡受體信號(hào)通路，來抑制平滑肌細(xì)胞的凋亡。死亡受體信號(hào)通路的激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而H?S可以抑制死亡受體相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，從而抑制死亡受體信號(hào)通路的激活，減少平滑肌細(xì)胞的凋亡。5.4對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管內(nèi)壁的一層單層扁平上皮細(xì)胞，在維持血管穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著不可或缺的作用。它不僅是血液與血管壁之間的物理屏障，還參與了血管張力調(diào)節(jié)、抗血栓形成、炎癥反應(yīng)調(diào)控以及物質(zhì)交換等多種生理過程。正常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞通過合成和釋放一系列血管活性物質(zhì)，如一氧化氮（NO）、前列環(huán)素（PGI?）和內(nèi)皮素-1（ET-1）等，來維持血管的正常功能。NO是一種重要的血管舒張因子，由內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）催化L-精氨酸生成，它能夠激活鳥苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，導(dǎo)致血管平滑肌舒張。PGI?也具有強(qiáng)大的血管舒張和抗血小板聚集作用，可抑制血小板的黏附和聚集，防止血栓形成。而ET-1則是一種強(qiáng)效的血管收縮因子，它通過與血管平滑肌細(xì)胞上的受體結(jié)合，激活相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致血管平滑肌收縮。在生理狀態(tài)下，這些血管活性物質(zhì)之間保持著精細(xì)的平衡，共同維持著血管的正常張力和功能。平滑肌細(xì)胞內(nèi)源性CSE/H?S體系對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能有著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，H?S可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO和PGI?，增強(qiáng)血管的舒張功能。在體外實(shí)驗(yàn)中，用H?S供體處理血管內(nèi)皮細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)eNOS的活性增強(qiáng)，NO的釋放量增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，H?S可以通過激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路，使eNOS的絲氨酸1177位點(diǎn)磷酸化，從而增強(qiáng)eNOS的活性，促進(jìn)NO的合成和釋放。H?S還可以通過調(diào)節(jié)環(huán)氧化酶（COX）的活性，促進(jìn)PGI?的合成和釋放。COX是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶，H?S可以通過抑制COX-2的降解，增加COX-2的表達(dá)，從而促進(jìn)PGI?的合成。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，給予CSE基因敲除小鼠血管緊張素II刺激誘導(dǎo)腹主動(dòng)脈瘤形成，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，CSE基因敲除小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中NO和PGI?的釋放量明顯減少，血管舒張功能受損。而給予這些小鼠H?S供體干預(yù)后，NO和PGI?的釋放量增加，血管舒張功能得到改善。CSE/H?S體系還能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放ET-1，減少血管的收縮反應(yīng)。在體外實(shí)驗(yàn)中，用H?S供體處理血管內(nèi)皮細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ET-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，H?S可以通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路的激活，減少ET-1基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低ET-1的表達(dá)和釋放。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，給予CSE基因敲除小鼠血管緊張素II刺激誘導(dǎo)腹主動(dòng)脈瘤形成，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，CSE基因敲除小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中ET-1的釋放量明顯增加，血管收縮功能增強(qiáng)。而給予這些小鼠H?S供體干預(yù)后，ET-1的釋放量減少，血管收縮功能得到抑制。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常與腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷或功能失調(diào)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致血管活性物質(zhì)的釋放失衡，血管舒張功能減弱，收縮功能增強(qiáng)，從而促進(jìn)腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生和發(fā)展。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷會(huì)導(dǎo)致NO和PGI?的釋放減少，ET-1的釋放增加，使得血管壁處于收縮狀態(tài)，血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，對(duì)血管壁的壓力增大。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷還會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的黏附和浸潤(rùn)增加，炎癥反應(yīng)加劇，進(jìn)一步破壞血管壁的結(jié)構(gòu)和功能。在腹主動(dòng)脈瘤患者的血管組織中，常?？梢杂^察到血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能異常，表現(xiàn)為eNOS活性降低，NO釋放減少，ET-1表達(dá)和釋放增加等。因此，平滑肌細(xì)胞內(nèi)源性CSE/H?S體系通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，維持血管活性物質(zhì)的平衡，對(duì)于預(yù)防和治療腹主動(dòng)脈瘤具有重要意義。六、研究方法與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)6.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)本研究選用大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（A7r5細(xì)胞），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、1%青霉素-鏈霉素雙抗（Solarbio公司）的DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone公司）中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。將培養(yǎng)的A7r5細(xì)胞隨機(jī)分為以下幾組：正常對(duì)照組：正常培養(yǎng)A7r5細(xì)胞，不做任何處理，作為基礎(chǔ)對(duì)照，用于觀察細(xì)胞的正常生物學(xué)行為。模型組：采用脂多糖（LPS，Sigma公司）刺激A7r5細(xì)胞構(gòu)建腹主動(dòng)脈瘤細(xì)胞模型，LPS終濃度為10μg/mL，作用24小時(shí)，以模擬體內(nèi)炎癥環(huán)境下平滑肌細(xì)胞的病理變化。CSE過表達(dá)組：將攜帶CSE基因的過表達(dá)質(zhì)粒（由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存）轉(zhuǎn)染至A7r5細(xì)胞中，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000（Invitrogen公司）按照說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，篩選出穩(wěn)定過表達(dá)CSE的細(xì)胞株，然后用10μg/mLLPS刺激24小時(shí)，研究CSE過表達(dá)對(duì)腹主動(dòng)脈瘤細(xì)胞模型的影響。CSE抑制組：使用CSE特異性抑制劑炔丙基甘氨酸（PAG，Sigma公司）處理A7r5細(xì)胞，PAG終濃度為100μM，預(yù)處理1小時(shí)后，再加入10μg/mLLPS刺激24小時(shí)，觀察抑制CSE活性后對(duì)腹主動(dòng)脈瘤細(xì)胞模型的作用。H?S供體組：給予A7r5細(xì)胞H?S供體硫氫化鈉（NaHS，Sigma公司）處理，NaHS終濃度為100μM，作用24小時(shí)，然后加入10μg/mLLPS刺激24小時(shí)，探究外源性補(bǔ)充H?S對(duì)腹主動(dòng)脈瘤細(xì)胞模型的影響。針對(duì)各實(shí)驗(yàn)組，我們?cè)O(shè)定了多維度的檢測(cè)指標(biāo)和方法。在蛋白表達(dá)檢測(cè)方面，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）來測(cè)定相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。具體操作如下：收集各組細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液（Solarbio公司）裂解細(xì)胞，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒（ThermoFisherScientific公司）測(cè)定蛋白濃度，將等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離，隨后轉(zhuǎn)至PVDF膜（Millipore公司）上。用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)后，加入一抗孵育過夜，一抗包括抗CSE抗體（Abcam公司）、抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體（CellSignalingTechnology公司）、抗基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）抗體（Abcam公司）、抗基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）抗體（Abcam公司）、抗腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抗體（Proteintech公司）等，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，再加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（Proteintech公司）室溫孵育1小時(shí)。洗膜后，利用化學(xué)發(fā)光底物（ThermoFisherScientific公司）進(jìn)行顯影，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin（Proteintech公司）作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。細(xì)胞增殖能力檢測(cè)采用CCK-8法（Dojindo公司）。將各組細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)時(shí)，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，用酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司）在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（OD）值，以O(shè)D值反映細(xì)胞增殖活性。運(yùn)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)（Corning公司）檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。在上室中加入無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞（2×10?個(gè)/孔），下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。孵育24小時(shí)后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定遷移到下室的細(xì)胞15分鐘，結(jié)晶紫染色10分鐘，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)量，以此評(píng)估細(xì)胞遷移能力。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法（BDBiosciences公司）結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌2次，按照試劑盒說明書加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15分鐘，再加入適量結(jié)合緩沖液，通過流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur）檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，使用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。6.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選用6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，小鼠體重控制在20-25g。小鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的SPF級(jí)動(dòng)物房，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建腹主動(dòng)脈瘤小鼠模型采用血管緊張素II（AngII）皮下滲透泵聯(lián)合腹主動(dòng)脈部分結(jié)扎的方法。具體操作如下：小鼠用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，將其仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒鋪巾。在腹部正中做一長(zhǎng)約1.5-2cm的切口，鈍性分離暴露腎下腹主動(dòng)脈。使用6-0絲線在腎下腹主動(dòng)脈處進(jìn)行部分結(jié)扎，使血管直徑縮窄至原來的50%左右。隨后，將含有AngII（1000ng/kg/min）的皮下滲透泵（Alzet2004型，DurectCorporation）植入小鼠背部皮下，縫合切口。術(shù)后給予小鼠青霉素（40萬U/kg）肌肉注射，連續(xù)3天，預(yù)防感染。將小鼠隨機(jī)分為以下4組，每組10只：正常對(duì)照組：小鼠僅進(jìn)行假手術(shù)操作，即暴露腹主動(dòng)脈但不進(jìn)行結(jié)扎和AngII泵植入，術(shù)后給予正常飼養(yǎng)。模型組：按照上述方法構(gòu)建腹主動(dòng)脈瘤模型，術(shù)后給予正常飼養(yǎng)。CSE基因敲低組：在構(gòu)建腹主動(dòng)脈瘤模型前，通過尾靜脈注射攜帶CSEshRNA的腺相關(guān)病毒（AAV-shCSE），以敲低小鼠體內(nèi)CSE的表達(dá)。注射劑量為1×1012vg/kg，注射后1周進(jìn)行腹主動(dòng)脈瘤模型構(gòu)建。H?S供體干預(yù)組：在構(gòu)建腹主動(dòng)脈瘤模型后，每天給予小鼠腹腔注射H?S供體GYY4137（50mg/kg），連續(xù)干預(yù)28天。正常對(duì)照組和模型組給予等量的生理鹽水腹腔注射。在實(shí)驗(yàn)過程中，觀察小鼠的一般狀況，包括精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)等。每周測(cè)量小鼠的體重，記錄體重變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠用過量戊巴比妥鈉（100mg/kg）腹腔注射處死，迅速取出腹主動(dòng)脈，進(jìn)行以下檢測(cè)：腹主動(dòng)脈直徑測(cè)量：使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腹主動(dòng)脈瘤部位的最大直徑，并與正常對(duì)照組小鼠的腹主動(dòng)脈直徑進(jìn)行比較，計(jì)算擴(kuò)張倍數(shù)。同時(shí)，采用超聲心動(dòng)圖（VisualSonicsVevo2100）在實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腹主動(dòng)脈直徑的變化，評(píng)估動(dòng)脈瘤的發(fā)展情況。組織病理學(xué)檢測(cè)：將腹主動(dòng)脈標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚度為4μm。進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察血管壁的組織結(jié)構(gòu)變化，包括內(nèi)膜、中膜和外膜的厚度，平滑肌細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量等。采用Masson染色觀察血管壁中膠原蛋白的分布和含量變化。通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)α-SMA、MMP-2、MMP-9等蛋白的表達(dá)定位，以評(píng)估平滑肌細(xì)胞的表型和細(xì)胞外基質(zhì)的代謝情況。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）：提取腹主動(dòng)脈組織的總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)。加入一抗孵育過夜，一抗包括抗CSE抗體、抗α-SMA抗體、抗MMP-2抗體、抗MMP-9抗體、抗TNF-α抗體等，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，再加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1小時(shí)。洗膜后，利用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯影，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：提取腹主動(dòng)脈組織的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。引物序列根據(jù)GenBank中相應(yīng)基因的序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。通過2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因。檢測(cè)的目的基因包括CSE、α-SMA、MMP-2、MMP-9、TNF-α等。6.3臨床樣本分析本研究納入20例腹主動(dòng)脈瘤患者作為病例組，患者均來自[醫(yī)院名稱]血管外科住院部，入選標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)CT血管造影（CTA）或磁共振血管造影（MRA）檢查確診為腹主動(dòng)脈瘤，且符合國(guó)際通用的腹主動(dòng)脈瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)，即腹主動(dòng)脈直徑超過正常直徑的1.5倍。同時(shí)，選取10例因其他腹部疾病行手術(shù)治療且腹主動(dòng)脈正常的患者作為對(duì)照組，這些患者在手術(shù)中經(jīng)術(shù)中探查及術(shù)后影像學(xué)檢查確認(rèn)腹主動(dòng)脈無病變。所有患者在術(shù)前均簽署了知情同意書，本研究方案獲得了[醫(yī)院倫理委員會(huì)名稱]的批準(zhǔn)。在樣本收集方面，于手術(shù)過程中獲取腹主動(dòng)脈瘤患者的瘤壁組織及正常對(duì)照組的腹主動(dòng)脈組織。在獲取瘤壁組織時(shí)，避開血栓及明顯壞死區(qū)域，選取瘤體中部的血管壁組織，以確保樣本的代表性。對(duì)于正常對(duì)照組的腹主動(dòng)脈組織，選取腎動(dòng)脈水平以下的腹主動(dòng)脈段，同樣避開周圍脂肪及結(jié)締組織。樣本獲取后，立即用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，去除血液及雜質(zhì)。將部分組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于后續(xù)的組織病理學(xué)檢測(cè)，固定時(shí)間為24-48小時(shí)。另一部分組織迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)。在組織病理學(xué)檢測(cè)中，將固定好的組織進(jìn)行石蠟包埋，制成厚度為4μm的切片。進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察血管壁的組織結(jié)構(gòu)，包括內(nèi)膜、中膜和外膜的厚度，平滑肌細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量，以及有無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。采用Masson染色觀察血管壁中膠原蛋白的分布和含量變化。通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)α-SMA、MMP-2、MMP-9等蛋白在血管組織中的表達(dá)定位，以評(píng)估平滑肌細(xì)胞的表型和細(xì)胞外基質(zhì)的代謝情況。在免疫組織化學(xué)染色過程中，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)CSE、α-SMA、MMP-2、MMP-9、TNF-α等蛋白的表達(dá)水平。從-80℃冰箱中取出凍存的組織樣本，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上充分研磨裂解組織，然后進(jìn)行超聲破碎，使細(xì)胞充分裂解。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離，隨后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)后，加入一抗孵育過夜，一抗包括抗CSE抗體、抗α-SMA抗體、抗MMP-2抗體、抗MMP-9抗體、抗腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抗體等，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，再加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗室溫孵育1小時(shí)。洗膜后，利用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯影，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)CSE、α-SMA、MMP-2、MMP-9、TNF-α等基因的mRNA表達(dá)水平。從-80℃冰箱中取出凍存的組織樣本，使用Trizol試劑提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。引物序列根據(jù)GenBank中相應(yīng)基因的序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變