年齡因素對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在缺氧微環(huán)境下多維度能力影響的深度剖析一、引言1.1研究背景人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（humanbonemarrowmesenchymalstemcells，hBMSCs）是一類存在于骨髓中的成體干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能，在特定誘導(dǎo)條件下，hBMSCs可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，這使其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，如用于治療骨折、骨缺損、軟骨損傷等疾病。此外，hBMSCs還具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)特性，在異體移植中不易引發(fā)強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)，且能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，抑制炎癥反應(yīng)，為自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等的治療提供了新途徑。隨著人口老齡化的加劇，與年齡相關(guān)的疾病如骨質(zhì)疏松、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)病率日益上升，這些疾病的發(fā)生發(fā)展與組織細(xì)胞的衰老、功能減退密切相關(guān)。hBMSCs作為組織修復(fù)和再生的重要種子細(xì)胞，其功能狀態(tài)隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生的變化備受關(guān)注。研究表明，隨著年齡的增加，hBMSCs的數(shù)量逐漸減少，增殖能力、多向分化潛能以及免疫調(diào)節(jié)功能均出現(xiàn)不同程度的衰退。例如，在骨質(zhì)疏松癥患者中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力降低，脂肪分化傾向增加，導(dǎo)致骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)破壞。在許多病理生理過程中，如心肌梗死、缺血性腦卒中、創(chuàng)傷愈合等，組織局部會(huì)出現(xiàn)缺氧環(huán)境。缺氧作為一種重要的應(yīng)激因素，對(duì)hBMSCs的生物學(xué)行為產(chǎn)生顯著影響。一方面，適度的缺氧預(yù)處理可以激活hBMSCs的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，增強(qiáng)其存活能力、遷移能力和血管生成相關(guān)因子的分泌，從而提高其治療效果；另一方面，長(zhǎng)時(shí)間或嚴(yán)重的缺氧會(huì)導(dǎo)致hBMSCs凋亡增加、增殖受抑和分化異常，影響其在組織修復(fù)中的作用。然而，目前關(guān)于年齡和缺氧對(duì)hBMSCs活力、血管再生及間質(zhì)調(diào)節(jié)能力的綜合影響尚不完全清楚。不同年齡來源的hBMSCs在缺氧條件下的反應(yīng)是否存在差異，以及這些差異背后的分子機(jī)制是什么，仍有待深入研究。明確這些問題，不僅有助于深入理解hBMSCs在不同生理病理狀態(tài)下的生物學(xué)特性，為其在再生醫(yī)學(xué)和臨床治療中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)，還可能為開發(fā)針對(duì)年齡相關(guān)疾病和缺氧相關(guān)疾病的新治療策略提供新思路。1.2研究目的與意義本研究旨在系統(tǒng)探究年齡對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在缺氧前后活力、血管再生及間質(zhì)調(diào)節(jié)能力的影響，深入剖析不同年齡來源的hBMSCs在缺氧條件下的生物學(xué)行為差異及其潛在分子機(jī)制。通過本研究，期望能夠明確hBMSCs功能隨年齡變化的規(guī)律以及缺氧對(duì)不同年齡hBMSCs的特異性作用，為hBMSCs在再生醫(yī)學(xué)和臨床治療中的精準(zhǔn)應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。在理論層面，本研究有助于進(jìn)一步深化對(duì)hBMSCs生物學(xué)特性的理解，尤其是年齡和缺氧這兩個(gè)重要因素對(duì)其功能的綜合調(diào)控機(jī)制。目前，雖然已有研究分別探討了年齡和缺氧對(duì)hBMSCs的影響，但將兩者結(jié)合起來的研究尚顯不足。本研究的開展有望填補(bǔ)這一領(lǐng)域的空白，豐富干細(xì)胞生物學(xué)的理論體系，為后續(xù)研究提供新的視角和思路。同時(shí)，通過揭示相關(guān)分子機(jī)制，可能發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為開發(fā)針對(duì)年齡相關(guān)疾病和缺氧相關(guān)疾病的新型治療策略奠定基礎(chǔ)。在實(shí)踐方面，本研究的成果對(duì)再生醫(yī)學(xué)和臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。對(duì)于年齡相關(guān)疾病，如骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病等，了解年齡相關(guān)的hBMSCs功能變化，能夠?yàn)榧膊〉陌l(fā)病機(jī)制提供新的見解，進(jìn)而為開發(fā)更有效的治療方法提供依據(jù)。在利用hBMSCs進(jìn)行細(xì)胞治療時(shí)，可以根據(jù)患者的年齡選擇合適的干細(xì)胞來源或進(jìn)行針對(duì)性的預(yù)處理，以提高治療效果。對(duì)于缺氧相關(guān)疾病，如心肌梗死、缺血性腦卒中、創(chuàng)傷愈合等，明確不同年齡hBMSCs在缺氧條件下的反應(yīng)差異，有助于優(yōu)化細(xì)胞治療方案，選擇最佳的治療時(shí)機(jī)和細(xì)胞類型，從而提高治療的成功率和患者的預(yù)后。此外，本研究結(jié)果還可能為干細(xì)胞庫的建設(shè)和管理提供參考，根據(jù)年齡對(duì)hBMSCs進(jìn)行分類儲(chǔ)存和應(yīng)用，以充分發(fā)揮其治療潛力。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)本研究綜合運(yùn)用了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，從細(xì)胞水平和分子層面系統(tǒng)地探討年齡對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）在缺氧前后活力、血管再生及間質(zhì)調(diào)節(jié)能力的影響。在細(xì)胞獲取與培養(yǎng)方面，從不同年齡段的健康供體中采集骨髓樣本，通過密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)hBMSCs，以獲得足夠數(shù)量且純度較高的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)上，根據(jù)供體年齡將hBMSCs分為年輕組、中年組和老年組，每組再分別設(shè)置常氧對(duì)照組和缺氧實(shí)驗(yàn)組，通過精確控制培養(yǎng)環(huán)境中的氧濃度（常氧為20%，缺氧為1%），模擬正常生理和病理缺氧狀態(tài)，以對(duì)比分析不同年齡hBMSCs在不同氧環(huán)境下的生物學(xué)行為差異。在細(xì)胞活力檢測(cè)中，采用CCK-8法和EdU摻入實(shí)驗(yàn)定量測(cè)定細(xì)胞增殖能力，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，全面評(píng)估細(xì)胞的活力狀態(tài)。為了探究血管再生能力，進(jìn)行了體外血管生成實(shí)驗(yàn)，如Matrigel基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)，觀察不同年齡hBMSCs在缺氧前后形成血管樣結(jié)構(gòu)的能力，并通過ELISA法檢測(cè)血管生成相關(guān)因子（如VEGF、bFGF等）的分泌水平。在間質(zhì)調(diào)節(jié)能力研究中，利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)，將hBMSCs與免疫細(xì)胞（如T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）共培養(yǎng)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫細(xì)胞的增殖、活化和分化情況，以及ELISA法檢測(cè)炎癥因子（如IL-6、TNF-α等）和免疫調(diào)節(jié)因子（如TGF-β、IL-10等）的分泌水平，以評(píng)估hBMSCs的間質(zhì)調(diào)節(jié)功能。在分子機(jī)制研究中，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)與細(xì)胞活力、血管再生及間質(zhì)調(diào)節(jié)相關(guān)的關(guān)鍵基因（如凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax，血管生成相關(guān)基因VEGF、Ang-1，免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因TGF-β、IL-10等）的mRNA表達(dá)水平，通過Westernblot技術(shù)檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)量，深入探究年齡和缺氧對(duì)hBMSCs功能影響的潛在分子機(jī)制。此外，還采用了RNA干擾（RNAi）技術(shù)和基因過表達(dá)技術(shù)，對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行敲低或過表達(dá)操作，進(jìn)一步驗(yàn)證其在hBMSCs功能調(diào)控中的作用。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：首先，將年齡和缺氧這兩個(gè)重要因素相結(jié)合，系統(tǒng)研究其對(duì)hBMSCs活力、血管再生及間質(zhì)調(diào)節(jié)能力的綜合影響，彌補(bǔ)了以往研究多側(cè)重于單一因素的不足，為深入理解hBMSCs在不同生理病理狀態(tài)下的生物學(xué)特性提供了新的視角。其次，在研究方法上，采用了多維度、多層次的檢測(cè)手段，從細(xì)胞水平、分子水平和功能水平全面分析hBMSCs的變化，不僅關(guān)注細(xì)胞的表型和功能改變，還深入探究其背后的分子機(jī)制，使研究結(jié)果更加全面、深入和可靠。此外，本研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中納入了多個(gè)年齡段的供體，涵蓋了年輕、中年和老年人群，能夠更細(xì)致地觀察hBMSCs功能隨年齡的連續(xù)變化趨勢(shì)，為臨床根據(jù)患者年齡選擇合適的干細(xì)胞治療策略提供更精準(zhǔn)的理論依據(jù)。二、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞概述2.1細(xì)胞特性人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）作為一類重要的成體干細(xì)胞，具有獨(dú)特而顯著的細(xì)胞特性，這些特性奠定了其在再生醫(yī)學(xué)和臨床治療領(lǐng)域的重要地位。hBMSCs的形態(tài)呈現(xiàn)出典型的成纖維細(xì)胞樣外觀，在體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，胞體較為細(xì)長(zhǎng)，具有豐富的細(xì)胞質(zhì)突起，細(xì)胞核大且形態(tài)規(guī)則，通常呈圓形或橢圓形，核仁明顯，染色質(zhì)分布較為疏松，這種形態(tài)結(jié)構(gòu)特征與細(xì)胞的活躍代謝和增殖能力密切相關(guān)。在細(xì)胞生長(zhǎng)過程中，hBMSCs會(huì)貼壁生長(zhǎng)，隨著細(xì)胞數(shù)量的增加，逐漸形成均勻分布的細(xì)胞單層，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)出典型的漩渦狀或放射狀排列，這一形態(tài)變化不僅反映了細(xì)胞之間的相互作用，也暗示著其在維持細(xì)胞微環(huán)境穩(wěn)定方面的重要作用。免疫表型方面，hBMSCs具有一系列特征性的表面標(biāo)志物，這些標(biāo)志物是識(shí)別和鑒定hBMSCs的重要依據(jù)。國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（ISCT）規(guī)定，hBMSCs需滿足以下免疫表型標(biāo)準(zhǔn)：在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下呈貼壁生長(zhǎng)；高表達(dá)CD105、CD73和CD90等表面分子，CD105（也稱為Endoglin）是一種參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和血管生成的跨膜糖蛋白，在hBMSCs表面高度表達(dá)，其表達(dá)水平與細(xì)胞的干性和分化潛能密切相關(guān)；CD73（即5'-核苷酸酶）參與細(xì)胞外核苷酸代謝，在hBMSCs的免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用；CD90（又名Thy-1）則與細(xì)胞的黏附、遷移和增殖等生物學(xué)行為密切相關(guān)。同時(shí)，hBMSCs不表達(dá)或低表達(dá)CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19及HLA-DR等造血譜系和免疫細(xì)胞特異性標(biāo)志物，CD45是白細(xì)胞共同抗原，主要表達(dá)于造血細(xì)胞表面；CD34是造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的標(biāo)志物；CD14和CD11b是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志物；CD79α和CD19是B淋巴細(xì)胞的特異性標(biāo)志物；HLA-DR則是主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子，參與抗原呈遞和免疫應(yīng)答。這些免疫表型特征使得hBMSCs能夠與其他細(xì)胞類型相區(qū)分，確保了其在研究和應(yīng)用中的準(zhǔn)確性和特異性。hBMSCs最為突出的特性之一是其強(qiáng)大的多向分化潛能。在適宜的誘導(dǎo)條件下，hBMSCs能夠分化為多種中胚層來源的細(xì)胞類型，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，hBMSCs逐漸向成骨細(xì)胞方向分化，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)榱⒎叫位蚨噙呅?，堿性磷酸酶活性顯著升高，同時(shí)表達(dá)成骨相關(guān)基因如Runx2、Osterix和骨鈣素等，這些基因在成骨細(xì)胞的分化、增殖和骨基質(zhì)合成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)礦化，形成典型的鈣結(jié)節(jié)；當(dāng)置于軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中時(shí)，hBMSCs會(huì)聚集形成軟骨球，細(xì)胞分泌大量的軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)，包括Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖等，這些成分賦予軟骨組織良好的彈性和抗壓性；在脂肪誘導(dǎo)條件下，hBMSCs內(nèi)逐漸出現(xiàn)脂滴，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，脂滴不斷增大并融合，細(xì)胞表達(dá)脂肪細(xì)胞特異性標(biāo)志物如過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）和脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）等，表明其成功分化為脂肪細(xì)胞。除中胚層來源的細(xì)胞外，hBMSCs在特定條件下還展現(xiàn)出跨胚層分化的能力，如向神經(jīng)細(xì)胞和肝細(xì)胞等外胚層和內(nèi)胚層來源的細(xì)胞分化，盡管這種跨胚層分化的效率相對(duì)較低，但其為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病和肝臟疾病等提供了新的潛在途徑。2.2分離與培養(yǎng)方法人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)是開展相關(guān)研究的基礎(chǔ)，目前已建立了多種有效的分離和培養(yǎng)方法，每種方法都有其獨(dú)特的原理、操作步驟和優(yōu)缺點(diǎn)。密度梯度離心法是一種較為常用的分離方法，其原理基于骨髓中各種細(xì)胞成分密度的差異。在實(shí)際操作時(shí)，首先需抽取適量的骨髓樣本，通常從髂后上棘等部位采集，將采集的骨髓樣本與抗凝劑充分混合，以防止血液凝固。隨后，將稀釋后的骨髓液小心地鋪加在預(yù)先制備好的密度梯度離心液（如Ficoll-Hypaque分離液）上層，該離心液具有特定的密度范圍，能夠使不同密度的細(xì)胞在離心過程中分層分布。接著，在適宜的離心條件下（一般為1500-2000rpm，離心15-20分鐘）進(jìn)行離心操作，此時(shí)，骨髓中的紅細(xì)胞由于密度較大，會(huì)沉降到離心管底部；血小板和血漿等成分則位于離心液上層；而hBMSCs以及其他單個(gè)核細(xì)胞會(huì)聚集在離心液的特定密度界面處，形成一個(gè)明顯的白膜層。通過仔細(xì)吸取該白膜層，即可獲得富含hBMSCs的細(xì)胞懸液。密度梯度離心法的優(yōu)點(diǎn)在于能夠較為快速地分離出單個(gè)核細(xì)胞，純度相對(duì)較高，可有效去除紅細(xì)胞和大部分雜質(zhì)細(xì)胞，為后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)和研究提供了較好的起始材料；然而，該方法也存在一定局限性，如操作過程較為復(fù)雜，需要使用特定的密度梯度離心液和離心機(jī)設(shè)備，成本相對(duì)較高，且在分離過程中可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的機(jī)械損傷，影響細(xì)胞的活性和功能。貼壁篩選法是利用hBMSCs具有貼壁生長(zhǎng)的特性來實(shí)現(xiàn)分離的。將采集得到的骨髓樣本直接接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入適宜的培養(yǎng)基，常用的培養(yǎng)基如α-MEM、DMEM/F12等，并添加10%-20%的胎牛血清，以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)初期，多種細(xì)胞會(huì)混雜存在于培養(yǎng)瓶中，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，hBMSCs會(huì)逐漸貼附在培養(yǎng)瓶底部，而其他非貼壁細(xì)胞（如造血細(xì)胞等）則懸浮于培養(yǎng)基中。通過定期更換培養(yǎng)基，能夠去除懸浮的非貼壁細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)hBMSCs的初步純化。當(dāng)貼壁的hBMSCs生長(zhǎng)至一定密度（通常達(dá)到80%-90%融合）時(shí)，使用胰蛋白酶-EDTA消化液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化處理，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部脫離，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，進(jìn)一步擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量。貼壁篩選法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，成本較低，對(duì)細(xì)胞的損傷較小，能夠較好地保持細(xì)胞的生物學(xué)特性；但該方法的分離效率相對(duì)較低，獲得的細(xì)胞純度可能不如密度梯度離心法，需要經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)才能得到較高純度的hBMSCs。除了上述兩種常用方法外，還有免疫磁珠分選法、流式細(xì)胞儀分離法等。免疫磁珠分選法是利用hBMSCs表面特異性標(biāo)志物與偶聯(lián)有磁性微珠的抗體相結(jié)合的原理，在磁場(chǎng)作用下，使標(biāo)記有磁珠的hBMSCs與其他細(xì)胞分離，該方法能夠精確地分離出高純度的hBMSCs，但操作較為復(fù)雜，成本較高，且磁珠可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定影響；流式細(xì)胞儀分離法則是根據(jù)細(xì)胞的大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及表面標(biāo)志物的熒光強(qiáng)度等參數(shù)，通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行逐個(gè)分析和分選，可獲得高純度的目標(biāo)細(xì)胞，但設(shè)備昂貴，分選過程耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)操作人員的技術(shù)要求也較高。在hBMSCs的體外培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件的優(yōu)化對(duì)于維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和生物學(xué)功能至關(guān)重要。除了控制適宜的溫度（37℃）和CO?濃度（5%）外，還需注意培養(yǎng)基的選擇和更換頻率。培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分、生長(zhǎng)因子、pH值等都會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，一般每2-3天更換一次培養(yǎng)基，以保持營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的充足供應(yīng)和代謝廢物的及時(shí)清除。此外，細(xì)胞的接種密度也會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，過高或過低的接種密度都可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、分化異常等問題，通常初代培養(yǎng)時(shí)的接種密度為1×10?-5×10?個(gè)/cm2，傳代培養(yǎng)時(shí)可根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。在細(xì)胞傳代過程中，要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，防止細(xì)胞污染，同時(shí)注意消化時(shí)間的控制，避免過度消化對(duì)細(xì)胞造成損傷。通過合理選擇分離方法和優(yōu)化培養(yǎng)條件，能夠獲得足夠數(shù)量且生物學(xué)特性穩(wěn)定的hBMSCs，為后續(xù)深入研究年齡和缺氧對(duì)其活力、血管再生及間質(zhì)調(diào)節(jié)能力的影響奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。2.3生理功能與應(yīng)用領(lǐng)域人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）具有獨(dú)特的生理功能，在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。在組織修復(fù)方面，hBMSCs憑借其多向分化潛能發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在骨組織修復(fù)中，當(dāng)機(jī)體遭受骨折或骨缺損時(shí)，hBMSCs可在特定微環(huán)境信號(hào)的誘導(dǎo)下，分化為成骨細(xì)胞，促進(jìn)新骨組織的形成。成骨細(xì)胞能夠合成和分泌骨基質(zhì)，包括膠原蛋白、骨鈣素等成分，這些物質(zhì)逐漸礦化，形成堅(jiān)硬的骨組織，填充骨缺損部位，實(shí)現(xiàn)骨組織的修復(fù)與再生。臨床研究表明，將hBMSCs與生物支架材料結(jié)合，植入骨缺損患者體內(nèi)，能夠顯著提高骨修復(fù)的效果，促進(jìn)骨折的愈合。在軟骨組織修復(fù)領(lǐng)域，hBMSCs同樣具有重要價(jià)值。軟骨損傷后，由于其自身修復(fù)能力有限，往往難以自行恢復(fù)。hBMSCs可在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下分化為軟骨細(xì)胞，分泌軟骨特異性的細(xì)胞外基質(zhì)，如Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖等，這些物質(zhì)能夠填充受損的軟骨部位，恢復(fù)軟骨的結(jié)構(gòu)和功能。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，利用hBMSCs進(jìn)行軟骨修復(fù)治療，可有效改善關(guān)節(jié)軟骨損傷模型動(dòng)物的關(guān)節(jié)功能，減輕疼痛癥狀。此外，在皮膚組織修復(fù)中，hBMSCs通過分泌多種生長(zhǎng)因子，如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等，促進(jìn)表皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和分化，加速傷口愈合。這些生長(zhǎng)因子能夠刺激細(xì)胞的代謝活動(dòng)，促進(jìn)膠原蛋白和彈性纖維的合成，增強(qiáng)皮膚組織的韌性和彈性，減少瘢痕形成。臨床實(shí)踐中，將hBMSCs應(yīng)用于皮膚燒傷、創(chuàng)傷等患者的治療，取得了良好的效果，縮短了傷口愈合時(shí)間，提高了皮膚修復(fù)的質(zhì)量。hBMSCs還具備出色的免疫調(diào)節(jié)功能，在免疫相關(guān)疾病的治療中發(fā)揮著重要作用。在自身免疫性疾病方面，以類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為例，該疾病是由于免疫系統(tǒng)紊亂，錯(cuò)誤地攻擊自身關(guān)節(jié)組織，導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥和損傷。hBMSCs能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，抑制過度活躍的免疫反應(yīng)。具體而言，hBMSCs可以抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，減少炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的分泌，同時(shí)促進(jìn)抗炎因子如白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）的產(chǎn)生。通過這種免疫調(diào)節(jié)作用，hBMSCs能夠減輕關(guān)節(jié)炎癥，緩解疼痛和腫脹癥狀，保護(hù)關(guān)節(jié)組織免受進(jìn)一步損傷。臨床研究表明，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行hBMSCs輸注治療后，患者的關(guān)節(jié)功能得到明顯改善，炎癥指標(biāo)顯著下降。在移植物抗宿主?。℅VHD）的治療中，hBMSCs同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。GVHD是造血干細(xì)胞移植后常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，是由于供體的免疫細(xì)胞攻擊受體的組織器官。hBMSCs可以抑制供體T淋巴細(xì)胞對(duì)受體組織的免疫攻擊，降低GVHD的發(fā)生率和嚴(yán)重程度。hBMSCs通過與免疫細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化和功能，誘導(dǎo)免疫耐受，從而減輕GVHD的癥狀。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)證實(shí)，在造血干細(xì)胞移植過程中聯(lián)合應(yīng)用hBMSCs，能夠有效預(yù)防和治療GVHD，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。血管再生是組織修復(fù)和維持正常生理功能的重要過程，hBMSCs在其中扮演著不可或缺的角色。在缺血性疾病中，如心肌梗死和下肢缺血性疾病，hBMSCs通過多種機(jī)制促進(jìn)血管再生。一方面，hBMSCs能夠分泌一系列血管生成相關(guān)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）和血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等。VEGF是一種強(qiáng)效的血管生成因子，能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、遷移和管腔形成。bFGF和PDGF也具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的作用，同時(shí)還能刺激平滑肌細(xì)胞的增殖和分化，參與血管壁的構(gòu)建。這些血管生成因子協(xié)同作用，促進(jìn)新血管的生成，改善缺血組織的血液供應(yīng)。另一方面，hBMSCs可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，直接參與血管的形成。在適宜的誘導(dǎo)條件下，hBMSCs表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，并逐漸分化為相應(yīng)的細(xì)胞類型。這些分化后的細(xì)胞能夠整合到受損組織的血管網(wǎng)絡(luò)中，促進(jìn)血管的修復(fù)和再生。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，將hBMSCs移植到心肌梗死模型動(dòng)物的心臟中，能夠顯著增加梗死區(qū)域的血管密度，改善心肌的血液灌注，提高心臟功能。在臨床治療領(lǐng)域，hBMSCs已被廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療研究，并取得了令人矚目的成果。除了上述提及的骨組織疾病、軟骨組織疾病、自身免疫性疾病和缺血性疾病外，hBMSCs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝臟疾病等方面的治療中也展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，對(duì)于帕金森病患者，hBMSCs可以通過分化為多巴胺能神經(jīng)元，補(bǔ)充患者腦內(nèi)缺失的多巴胺能神經(jīng)元，改善帕金森病的癥狀。同時(shí)，hBMSCs還能分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）等，保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)和分化，減輕神經(jīng)損傷。在肝臟疾病治療方面，對(duì)于肝纖維化患者，hBMSCs能夠抑制肝星狀細(xì)胞的活化和增殖，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，從而延緩肝纖維化的進(jìn)展。hBMSCs還可以分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，調(diào)節(jié)肝臟的免疫微環(huán)境，促進(jìn)肝細(xì)胞的再生和修復(fù)。在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，hBMSCs為組織工程和器官再生提供了重要的種子細(xì)胞。通過將hBMSCs與生物材料相結(jié)合，構(gòu)建具有特定結(jié)構(gòu)和功能的組織工程支架，有望實(shí)現(xiàn)受損組織和器官的再生和修復(fù)。研究人員正在探索利用hBMSCs構(gòu)建人工骨、軟骨、血管等組織和器官的方法，為解決組織器官短缺的問題提供新的途徑。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和研究的深入開展，hBMSCs在臨床治療和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景將更加廣闊。三、年齡對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響3.1不同年齡段細(xì)胞特性差異3.1.1細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）的形態(tài)與結(jié)構(gòu)在不同年齡段呈現(xiàn)出一定的差異。在新生兒階段，hBMSCs通常呈現(xiàn)出較為均一的形態(tài)，細(xì)胞體積相對(duì)較小，呈典型的梭形或成纖維細(xì)胞樣外觀，細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核大且占據(jù)細(xì)胞體積的比例相對(duì)較大，核仁明顯，染色質(zhì)較為松散，這種形態(tài)結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的快速增殖和分化。研究表明，新生兒hBMSCs的線粒體數(shù)量較多，且線粒體膜電位較高，這為細(xì)胞的高代謝活動(dòng)提供了充足的能量支持，使其在組織修復(fù)和生長(zhǎng)發(fā)育過程中能夠高效地發(fā)揮作用。隨著年齡的增長(zhǎng)，hBMSCs的形態(tài)逐漸發(fā)生改變。在青少年時(shí)期，hBMSCs依然保持著良好的梭形外觀，但與新生兒相比，細(xì)胞體積有所增大。細(xì)胞的伸展性和貼壁能力略有增強(qiáng)，這可能與細(xì)胞外基質(zhì)成分的變化以及細(xì)胞表面黏附分子表達(dá)的改變有關(guān)。此時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)也逐漸發(fā)生變化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器的數(shù)量和功能逐漸完善，以滿足細(xì)胞在生長(zhǎng)和分化過程中對(duì)蛋白質(zhì)合成和加工的需求。進(jìn)入成年期后，hBMSCs的形態(tài)進(jìn)一步發(fā)生變化。細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，部分細(xì)胞開始出現(xiàn)形態(tài)的多樣性，不再局限于典型的梭形，可能會(huì)呈現(xiàn)出多邊形或不規(guī)則形狀。細(xì)胞核的形態(tài)也逐漸變得不規(guī)則，染色質(zhì)開始出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，這表明細(xì)胞的增殖活性可能有所下降。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的線粒體數(shù)量逐漸減少，線粒體的形態(tài)和功能也出現(xiàn)一定程度的異常，如線粒體腫脹、嵴減少等，導(dǎo)致細(xì)胞的能量代謝效率降低。研究發(fā)現(xiàn)，成年期hBMSCs的自噬活性相對(duì)較低，這可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的積累，進(jìn)一步影響細(xì)胞的正常功能。在老年階段，hBMSCs的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化更為明顯。細(xì)胞體積顯著增大，且形態(tài)變得更加不規(guī)則，呈現(xiàn)出寬大扁平的形態(tài)，細(xì)胞的伸展性和貼壁能力明顯下降，容易從培養(yǎng)瓶底部脫落。細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)高度凝集，核仁不明顯，這些變化表明細(xì)胞的增殖能力和代謝活性大幅降低。此時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器損傷更為嚴(yán)重，線粒體功能嚴(yán)重受損，活性氧（ROS）生成增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高。此外，老年hBMSCs的溶酶體功能也出現(xiàn)異常，對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解和清除能力下降，進(jìn)一步加劇了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的紊亂。研究表明，老年hBMSCs的端粒長(zhǎng)度明顯縮短，這與細(xì)胞的衰老密切相關(guān)，端粒的縮短會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的增殖能力受限，更容易進(jìn)入衰老和凋亡狀態(tài)。3.1.2增殖能力變化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）的增殖能力在不同年齡段存在顯著差異，且隨著年齡的增長(zhǎng)呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)。新生兒的hBMSCs具有最為旺盛的增殖能力。相關(guān)研究通過CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性發(fā)現(xiàn)，新生兒來源的hBMSCs在體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞增殖速度極快。在接種后的前3天，細(xì)胞數(shù)量就開始迅速增加，呈現(xiàn)出典型的指數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。通過細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，新生兒hBMSCs處于S期（DNA合成期）和G2/M期（細(xì)胞分裂期）的比例較高，表明大量細(xì)胞處于活躍的增殖狀態(tài)。例如，一項(xiàng)研究對(duì)新生兒hBMSCs進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)第7天時(shí)，細(xì)胞數(shù)量相較于初始接種量增加了約8倍，其克隆形成能力也很強(qiáng)，在軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)中，能夠形成大量直徑較大的克隆集落，克隆形成率可達(dá)到（35.6±5.2）%，這充分證明了新生兒hBMSCs具有強(qiáng)大的自我更新能力。青少年時(shí)期的hBMSCs雖然仍保持著較高的增殖活性，但與新生兒相比已有所下降。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青少年hBMSCs的增殖曲線斜率在培養(yǎng)前期略低于新生兒組。在細(xì)胞周期分布上，處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例相對(duì)減少。有研究表明，青少年hBMSCs在培養(yǎng)第7天時(shí)，細(xì)胞數(shù)量增加約5倍，克隆形成率為（28.4±4.5）%，明顯低于新生兒組。這可能是由于隨著年齡的增長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)的增殖相關(guān)信號(hào)通路的活性逐漸降低，如PI3K/Akt信號(hào)通路的激活程度減弱，影響了細(xì)胞的增殖進(jìn)程。成年期hBMSCs的增殖能力進(jìn)一步降低。在體外培養(yǎng)過程中，其增殖速度明顯放緩，細(xì)胞倍增時(shí)間延長(zhǎng)。通過EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞DNA合成情況發(fā)現(xiàn)，成年hBMSCs的EdU陽性細(xì)胞比例顯著低于新生兒和青少年組。研究數(shù)據(jù)顯示，成年hBMSCs在培養(yǎng)第7天時(shí)，細(xì)胞數(shù)量?jī)H增加約3倍，克隆形成率降至（18.7±3.8）%。這一時(shí)期，細(xì)胞內(nèi)的p16、p21等細(xì)胞周期抑制蛋白表達(dá)上調(diào)，它們能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，從而阻礙細(xì)胞周期的進(jìn)程，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降。老年人的hBMSCs增殖能力嚴(yán)重受損。多項(xiàng)研究表明，老年人hBMSCs在體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞增殖緩慢，甚至在培養(yǎng)后期出現(xiàn)停滯現(xiàn)象。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，其增殖曲線幾乎呈水平狀態(tài)，細(xì)胞活力明顯降低。細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，大量細(xì)胞停滯在G0/G1期，處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例極少。例如，有研究報(bào)道老年人hBMSCs在培養(yǎng)第7天時(shí)，細(xì)胞數(shù)量?jī)H增加約1.5倍，克隆形成率僅為（8.3±2.1）%。此外，老年人hBMSCs的端粒酶活性顯著降低，端粒長(zhǎng)度縮短，這使得細(xì)胞在每次分裂后，端粒無法得到有效修復(fù)，當(dāng)端?？s短到一定程度時(shí)，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入衰老或凋亡狀態(tài)，進(jìn)一步抑制了細(xì)胞的增殖能力。3.1.3分化潛能改變?nèi)斯撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）的分化潛能在不同年齡段存在顯著差異，年齡的增長(zhǎng)會(huì)對(duì)其向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞類型的分化能力產(chǎn)生影響。在成骨分化方面，新生兒的hBMSCs表現(xiàn)出較強(qiáng)的成骨分化能力。相關(guān)研究將新生兒hBMSCs置于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后，通過茜素紅染色可觀察到大量紅色的鈣結(jié)節(jié)形成，表明細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生了明顯的礦化。同時(shí)，檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Runx2、Osterix和骨鈣素等基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)。Runx2是成骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠啟動(dòng)成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和成熟；Osterix則在Runx2的下游發(fā)揮作用，進(jìn)一步調(diào)控成骨細(xì)胞的分化和骨基質(zhì)的合成；骨鈣素是成熟成骨細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，其表達(dá)水平的升高反映了成骨細(xì)胞的功能活性增強(qiáng)。隨著年齡的增長(zhǎng)，hBMSCs的成骨分化能力逐漸下降。青少年hBMSCs在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，鈣結(jié)節(jié)的形成數(shù)量明顯少于新生兒組，成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平也相對(duì)較低。有研究表明，青少年hBMSCs在成骨誘導(dǎo)21天后，鈣結(jié)節(jié)的面積占比約為新生兒組的70%，Runx2、Osterix和骨鈣素的mRNA表達(dá)量分別為新生兒組的65%、72%和68%左右。這可能是由于細(xì)胞內(nèi)的成骨分化相關(guān)信號(hào)通路的活性減弱，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活程度降低，影響了成骨分化的進(jìn)程。成年期hBMSCs的成骨分化能力進(jìn)一步衰退。在相同的成骨誘導(dǎo)條件下，成年hBMSCs形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量更少，且形態(tài)較小，成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)一步降低。研究數(shù)據(jù)顯示，成年hBMSCs在成骨誘導(dǎo)21天后，鈣結(jié)節(jié)的面積占比僅為新生兒組的40%左右，Runx2、Osterix和骨鈣素的mRNA表達(dá)量分別降至新生兒組的45%、50%和48%左右。此時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的脂肪分化相關(guān)因子表達(dá)上調(diào)，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ），它能夠抑制成骨分化，促進(jìn)脂肪分化，導(dǎo)致hBMSCs的成骨分化傾向進(jìn)一步降低。老年人的hBMSCs成骨分化能力嚴(yán)重受損。在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，幾乎難以觀察到明顯的鈣結(jié)節(jié)形成，成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平極低。有研究報(bào)道，老年人hBMSCs在成骨誘導(dǎo)21天后，鈣結(jié)節(jié)的面積占比不足新生兒組的10%，Runx2、Osterix和骨鈣素的mRNA表達(dá)量分別僅為新生兒組的15%、20%和18%左右。此外，老年人hBMSCs的細(xì)胞外基質(zhì)合成和礦化能力顯著下降，這可能與細(xì)胞內(nèi)的代謝紊亂、氧化應(yīng)激增加以及細(xì)胞衰老等因素有關(guān)。在軟骨分化方面，新生兒hBMSCs同樣具有較強(qiáng)的軟骨分化潛能。將其置于軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可形成典型的軟骨球結(jié)構(gòu)，通過阿爾新藍(lán)染色可觀察到軟骨球內(nèi)大量藍(lán)色的軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)沉積，表明細(xì)胞成功分化為軟骨細(xì)胞。同時(shí)，檢測(cè)軟骨相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖等基因的表達(dá)水平顯著升高。Ⅱ型膠原蛋白是軟骨組織的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其表達(dá)水平的升高反映了軟骨細(xì)胞的分化和軟骨基質(zhì)的合成；聚集蛋白聚糖則能夠賦予軟骨組織良好的彈性和抗壓性。隨著年齡的增長(zhǎng)，hBMSCs的軟骨分化能力逐漸減弱。青少年hBMSCs在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，軟骨球的形成數(shù)量和大小均不及新生兒組，軟骨相關(guān)基因的表達(dá)水平也相對(duì)較低。有研究表明，青少年hBMSCs在軟骨誘導(dǎo)28天后，軟骨球的直徑約為新生兒組的80%，Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖的mRNA表達(dá)量分別為新生兒組的75%和78%左右。這可能是由于細(xì)胞內(nèi)的軟骨分化相關(guān)信號(hào)通路的活性降低，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路的激活程度減弱，影響了軟骨分化的進(jìn)程。成年期hBMSCs的軟骨分化能力進(jìn)一步下降。在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，軟骨球的形成數(shù)量明顯減少，且軟骨基質(zhì)的合成和沉積也明顯不足，軟骨相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)一步降低。研究數(shù)據(jù)顯示，成年hBMSCs在軟骨誘導(dǎo)28天后，軟骨球的直徑僅為新生兒組的60%左右，Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖的mRNA表達(dá)量分別降至新生兒組的55%和60%左右。此時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的炎癥因子表達(dá)上調(diào)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α），它能夠抑制軟骨分化，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡和基質(zhì)降解，導(dǎo)致hBMSCs的軟骨分化能力進(jìn)一步受損。老年人的hBMSCs軟骨分化能力嚴(yán)重受限。在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，幾乎無法形成完整的軟骨球結(jié)構(gòu)，軟骨相關(guān)基因的表達(dá)水平極低。有研究報(bào)道，老年人hBMSCs在軟骨誘導(dǎo)28天后，軟骨球的形成率不足新生兒組的20%，Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖的mRNA表達(dá)量分別僅為新生兒組的25%和30%左右。此外，老年人hBMSCs的細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性降低，氧化應(yīng)激增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡失調(diào)，影響了軟骨分化相關(guān)基因的表達(dá)和信號(hào)通路的傳導(dǎo)。在脂肪分化方面，與成骨和軟骨分化相反，隨著年齡的增長(zhǎng)，hBMSCs的脂肪分化能力逐漸增強(qiáng)。新生兒hBMSCs在脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，脂肪分化的效率相對(duì)較低。通過油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成情況發(fā)現(xiàn)，脂滴數(shù)量較少，且大小不一。同時(shí)，檢測(cè)脂肪分化相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，PPARγ和脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）等基因的表達(dá)水平相對(duì)較低。青少年hBMSCs在脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)后，脂滴的形成數(shù)量有所增加，脂肪分化相關(guān)基因的表達(dá)水平也有所升高。有研究表明，青少年hBMSCs在脂肪誘導(dǎo)14天后，脂滴的面積占比約為新生兒組的1.5倍，PPARγ和FABP4的mRNA表達(dá)量分別為新生兒組的1.3倍和1.4倍左右。這可能是由于細(xì)胞內(nèi)的脂肪分化相關(guān)信號(hào)通路的活性逐漸增強(qiáng)，如PPARγ信號(hào)通路的激活程度增加，促進(jìn)了脂肪分化的進(jìn)程。成年期hBMSCs的脂肪分化能力進(jìn)一步增強(qiáng)。在脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)后，細(xì)胞內(nèi)形成大量大小較為均一的脂滴，脂肪分化相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著升高。研究數(shù)據(jù)顯示，成年hBMSCs在脂肪誘導(dǎo)14天后，脂滴的面積占比約為新生兒組的2.5倍，PPARγ和FABP4的mRNA表達(dá)量分別為新生兒組的2.2倍和2.3倍左右。此時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的成骨和軟骨分化相關(guān)因子表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步促進(jìn)了脂肪分化的傾向。老年人的hBMSCs脂肪分化能力最為顯著。在脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)后，細(xì)胞內(nèi)幾乎充滿了脂滴，脂肪分化相關(guān)基因的表達(dá)水平極高。有研究報(bào)道，老年人hBMSCs在脂肪誘導(dǎo)14天后，脂滴的面積占比約為新生兒組的4倍，PPARγ和FABP4的mRNA表達(dá)量分別為新生兒組的3.5倍和3.8倍左右。這可能與老年人hBMSCs內(nèi)的代謝紊亂、激素水平變化以及細(xì)胞衰老等因素有關(guān)，這些因素共同作用，導(dǎo)致細(xì)胞的脂肪分化傾向顯著增加。3.2年齡相關(guān)的分子機(jī)制變化3.2.1基因表達(dá)差異年齡增長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）中與細(xì)胞增殖、分化、衰老相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化。p16基因作為細(xì)胞衰老的重要標(biāo)志物，在老年人hBMSCs中的表達(dá)水平明顯高于年輕人。p16基因編碼的p16蛋白能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4和6（CDK4/6）結(jié)合，形成復(fù)合物，抑制CDK4/6的活性，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，使細(xì)胞周期停滯，抑制細(xì)胞增殖。研究表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，hBMSCs中p16基因的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平降低，導(dǎo)致基因表達(dá)上調(diào)，p16蛋白表達(dá)增加，進(jìn)而抑制了hBMSCs的增殖能力。p21基因同樣在細(xì)胞衰老和增殖調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在老年hBMSCs中，p21基因的表達(dá)顯著升高。p21基因受p53基因調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷、氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，p53蛋白被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)p21基因的表達(dá)。p21蛋白可以與多種細(xì)胞周期蛋白-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，使細(xì)胞周期阻滯在G1期或G2期，抑制細(xì)胞增殖。在老年hBMSCs中，由于細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，DNA損傷積累，p53基因的表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致p21基因表達(dá)增加，進(jìn)一步抑制了細(xì)胞的增殖能力。端粒酶是一種能夠延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度的酶，在維持細(xì)胞的增殖能力和延緩衰老方面具有重要作用。端粒是染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，隨著細(xì)胞的分裂，端粒會(huì)逐漸縮短。當(dāng)端?？s短到一定程度時(shí)，細(xì)胞會(huì)進(jìn)入衰老或凋亡狀態(tài)。端粒酶由端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）、端粒酶RNA組分（TERC）等組成，其中TERT是端粒酶的催化亞基，其表達(dá)水平直接影響端粒酶的活性。研究發(fā)現(xiàn)，新生兒和年輕人的hBMSCs中TERT基因表達(dá)水平較高，端粒酶活性較強(qiáng)，能夠有效地維持端粒長(zhǎng)度，保證細(xì)胞的增殖能力；而隨著年齡的增長(zhǎng)，hBMSCs中TERT基因的表達(dá)逐漸降低，端粒酶活性減弱，端粒長(zhǎng)度縮短，細(xì)胞的增殖能力也隨之下降。例如，有研究對(duì)不同年齡段hBMSCs的TERT基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)老年人hBMSCs中TERTmRNA的表達(dá)量?jī)H為年輕人的30%左右，端粒酶活性也明顯降低，這使得老年人hBMSCs更容易進(jìn)入衰老狀態(tài)，增殖能力嚴(yán)重受限。在分化相關(guān)基因方面，成骨分化關(guān)鍵基因Runx2和Osterix在老年hBMSCs中的表達(dá)顯著低于年輕hBMSCs。Runx2是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠激活成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和成熟；Osterix則在Runx2的下游發(fā)揮作用，進(jìn)一步調(diào)控成骨細(xì)胞的分化和骨基質(zhì)的合成。隨著年齡的增長(zhǎng)，hBMSCs中Wnt/β-catenin信號(hào)通路等成骨分化相關(guān)信號(hào)通路的活性降低，導(dǎo)致Runx2和Osterix基因的表達(dá)下調(diào)，從而抑制了hBMSCs的成骨分化能力。相反，脂肪分化相關(guān)基因PPARγ在老年hBMSCs中的表達(dá)上調(diào)。PPARγ是脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，誘導(dǎo)hBMSCs向脂肪細(xì)胞分化。在老年hBMSCs中，由于細(xì)胞內(nèi)的代謝環(huán)境改變，PPARγ基因的表達(dá)增加，使得hBMSCs的脂肪分化傾向增強(qiáng)，成骨分化能力進(jìn)一步受到抑制。3.2.2信號(hào)通路的調(diào)控年齡對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）中關(guān)鍵信號(hào)通路的活性產(chǎn)生顯著影響，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的功能。Wnt信號(hào)通路在hBMSCs的增殖、分化和自我更新等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路中，當(dāng)Wnt配體與細(xì)胞膜上的Frizzled受體和LRP5/6共受體結(jié)合時(shí)，會(huì)抑制β-catenin的磷酸化和降解，使其在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活下游靶基因的表達(dá)。在年輕的hBMSCs中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路較為活躍，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和向成骨細(xì)胞的分化。研究表明，年輕hBMSCs中Wnt3a等配體的表達(dá)水平較高，β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的積累較多，下游成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix等的表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)了成骨分化。然而，隨著年齡的增長(zhǎng)，hBMSCs中Wnt信號(hào)通路的活性逐漸降低。一方面，Wnt配體的表達(dá)減少，如Wnt3a在老年hBMSCs中的表達(dá)量明顯低于年輕hBMSCs；另一方面，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了一些抑制Wnt信號(hào)通路的因子，如DKK1（dickkopf-1），它能夠與LRP5/6結(jié)合，阻斷Wnt信號(hào)的傳導(dǎo)。在老年hBMSCs中，DKK1的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路受到抑制，β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的積累減少，成骨相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，從而使hBMSCs的成骨分化能力下降，同時(shí)細(xì)胞的增殖能力也受到影響。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路也是調(diào)控hBMSCs功能的重要信號(hào)通路之一，主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條途徑。ERK信號(hào)通路主要參與細(xì)胞的增殖、分化和存活等過程。在年輕hBMSCs中，ERK信號(hào)通路被激活后，能夠促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1），推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。同時(shí)，ERK信號(hào)通路還可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)hBMSCs的成骨分化能力。然而，隨著年齡的增長(zhǎng)，hBMSCs中ERK信號(hào)通路的活性降低。研究發(fā)現(xiàn)，老年hBMSCs中ERK的磷酸化水平下降，導(dǎo)致其下游靶基因的表達(dá)受到抑制，細(xì)胞增殖和成骨分化能力減弱。JNK和p38MAPK信號(hào)通路主要參與細(xì)胞對(duì)應(yīng)激刺激的反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等過程。在老年hBMSCs中，由于細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，JNK和p38MAPK信號(hào)通路被過度激活。過度激活的JNK和p38MAPK信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白如Bax的表達(dá)增加，抗凋亡蛋白如Bcl-2的表達(dá)減少，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，過度激活的p38MAPK信號(hào)通路還會(huì)抑制成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步削弱hBMSCs的成骨分化能力。Notch信號(hào)通路在hBMSCs的命運(yùn)決定和功能維持中也起著重要作用。Notch信號(hào)通路的激活依賴于Notch受體與配體的結(jié)合，如Delta-like和Jagged家族成員。當(dāng)Notch受體被激活后，會(huì)發(fā)生蛋白水解切割，釋放出Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD），NICD進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子RBP-Jκ結(jié)合，激活下游靶基因的表達(dá)。在年輕hBMSCs中，Notch信號(hào)通路適度激活，能夠維持細(xì)胞的自我更新能力，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。研究表明，在成骨誘導(dǎo)條件下，年輕hBMSCs中Notch信號(hào)通路的激活能夠上調(diào)成骨相關(guān)基因Runx2和Osterix的表達(dá)，增強(qiáng)成骨分化能力。然而，隨著年齡的增長(zhǎng)，hBMSCs中Notch信號(hào)通路的活性發(fā)生改變。在老年hBMSCs中，Notch受體和配體的表達(dá)均出現(xiàn)異常，導(dǎo)致Notch信號(hào)通路的激活水平下降。Notch信號(hào)通路活性的降低會(huì)影響hBMSCs的自我更新能力和向成骨細(xì)胞的分化能力，同時(shí)可能促進(jìn)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。研究發(fā)現(xiàn)，老年hBMSCs中Notch信號(hào)通路活性降低時(shí)，脂肪分化相關(guān)基因PPARγ的表達(dá)上調(diào)，脂肪分化能力增強(qiáng)。四、缺氧對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響4.1缺氧環(huán)境的模擬與實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒃趯?shí)驗(yàn)室中，模擬缺氧環(huán)境對(duì)于研究缺氧對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）的影響至關(guān)重要。目前，常用的模擬缺氧環(huán)境的方法主要包括低氧培養(yǎng)箱和化學(xué)缺氧試劑的使用。低氧培養(yǎng)箱是一種能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境中氧氣濃度的設(shè)備，其原理是通過氣體混合系統(tǒng)將氮?dú)?、二氧化碳和空氣按照一定比例混合，從而調(diào)節(jié)箱內(nèi)的氧濃度。在使用低氧培養(yǎng)箱模擬缺氧環(huán)境時(shí)，首先需對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)試，確保其能夠穩(wěn)定地維持設(shè)定的氧濃度。將hBMSCs接種于細(xì)胞培養(yǎng)容器中，加入適量的培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)容器放入低氧培養(yǎng)箱內(nèi)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，將氧濃度設(shè)定為特定值，如1%或5%，同時(shí)維持二氧化碳濃度在5%左右，溫度為37℃。低氧培養(yǎng)箱能夠較為真實(shí)地模擬體內(nèi)的缺氧環(huán)境，且對(duì)細(xì)胞的干擾較小，能夠長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定地維持缺氧狀態(tài)，為研究hBMSCs在缺氧條件下的長(zhǎng)期生物學(xué)行為提供了良好的條件。然而，低氧培養(yǎng)箱設(shè)備價(jià)格較高，維護(hù)成本也相對(duì)較高，且每次實(shí)驗(yàn)的樣本量受到培養(yǎng)箱空間的限制?；瘜W(xué)缺氧試劑也是常用的模擬缺氧環(huán)境的工具，其中氯化鈷（CoCl?）是最為常用的一種。CoCl?能夠通過抑制細(xì)胞內(nèi)脯氨酰羥化酶（PHD）的活性，穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）的表達(dá)，從而模擬細(xì)胞在缺氧條件下的信號(hào)通路激活。在使用CoCl?模擬缺氧環(huán)境時(shí)，首先需將CoCl?溶解于無菌水中，配制成一定濃度的儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度梯度加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后將含有CoCl?的培養(yǎng)基加入接種有hBMSCs的培養(yǎng)容器中。例如，研究中常使用100-200μM的CoCl?濃度來模擬缺氧環(huán)境。CoCl?模擬缺氧環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)在于操作相對(duì)簡(jiǎn)便，成本較低，且能夠在普通的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不受低氧培養(yǎng)箱設(shè)備的限制。但是，化學(xué)缺氧試劑可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性作用，影響細(xì)胞的正常生理功能，且其模擬的缺氧狀態(tài)與真實(shí)的缺氧環(huán)境存在一定差異，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差。建立人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜁r(shí)，需綜合考慮多種因素。在細(xì)胞接種方面，要確保細(xì)胞接種密度均勻且合適，一般初代培養(yǎng)時(shí)接種密度為1×10?-5×10?個(gè)/cm2。接種后，將細(xì)胞分為常氧對(duì)照組和缺氧實(shí)驗(yàn)組。常氧對(duì)照組在正常的細(xì)胞培養(yǎng)條件下（20%O?、5%CO?、37℃）進(jìn)行培養(yǎng)；缺氧實(shí)驗(yàn)組則根據(jù)所選擇的模擬缺氧方法，在低氧培養(yǎng)箱或含有化學(xué)缺氧試劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)過程中，要定期觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)等，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和分析。如在培養(yǎng)24h、48h或72h后，分別采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平等。同時(shí)，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都應(yīng)設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。通過合理選擇模擬缺氧方法和建立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停軌蛏钊胩骄咳毖鯇?duì)hBMSCs活力、血管再生及間質(zhì)調(diào)節(jié)能力的影響。4.2缺氧對(duì)細(xì)胞活力的影響4.2.1細(xì)胞存活與凋亡缺氧條件對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）的存活與凋亡產(chǎn)生顯著影響。在適度缺氧環(huán)境下，hBMSCs能夠啟動(dòng)一系列內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，以維持細(xì)胞的存活。研究表明，當(dāng)hBMSCs暴露于1%-5%的低氧環(huán)境中時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）會(huì)迅速積累并活化。HIF-1α作為細(xì)胞對(duì)缺氧應(yīng)答的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)，這些靶基因參與細(xì)胞的能量代謝、血管生成、細(xì)胞增殖與存活等多個(gè)生物學(xué)過程。在細(xì)胞存活方面，HIF-1α可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，Bcl-2能夠抑制線粒體膜通透性的改變，阻止細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。一項(xiàng)研究將hBMSCs分別置于常氧（20%O?）和缺氧（1%O?）條件下培養(yǎng)24h，結(jié)果顯示，缺氧組細(xì)胞的凋亡率明顯低于常氧組，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，表明適度缺氧能夠通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，增強(qiáng)hBMSCs的存活能力。然而，當(dāng)缺氧程度嚴(yán)重或持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，hBMSCs的凋亡發(fā)生率會(huì)顯著增加。在極度缺氧（0.1%-0.5%O?）條件下，細(xì)胞內(nèi)的能量代謝嚴(yán)重受阻，活性氧（ROS）大量積累，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平急劇升高。ROS的積累會(huì)損傷細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路。此時(shí)，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)上調(diào)，Bax能夠與Bcl-2相互作用，形成異二聚體，破壞Bcl-2的抗凋亡功能。同時(shí)，Bax還可以插入線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而激活半胱天冬蛋白酶（Caspase）家族成員，如Caspase-3、Caspase-9等，引發(fā)細(xì)胞凋亡。有研究報(bào)道，將hBMSCs在0.1%O?的缺氧環(huán)境中培養(yǎng)48h后，細(xì)胞凋亡率顯著增加，Bax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，Caspase-3的活性也顯著增強(qiáng)，表明嚴(yán)重缺氧會(huì)通過激活Bax-Caspase凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)hBMSCs凋亡。除了Bcl-2和Bax等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)改變外，缺氧還會(huì)影響凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧會(huì)導(dǎo)致p53基因的表達(dá)上調(diào)，p53作為一種重要的腫瘤抑制基因，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在缺氧條件下，p53蛋白被激活，它可以直接結(jié)合到Bax基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)Bax基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加Bax蛋白的表達(dá)。同時(shí)，p53還可以抑制Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄，降低Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，缺氧還會(huì)影響其他凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，如Fas/FasL系統(tǒng)。Fas是一種細(xì)胞表面的死亡受體，F(xiàn)asL是其配體，當(dāng)Fas與FasL結(jié)合后，會(huì)激活下游的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在缺氧條件下，hBMSCs表面的Fas表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)asL的表達(dá)也有所增加，兩者的相互作用增強(qiáng)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。綜上所述，缺氧對(duì)hBMSCs存活與凋亡的影響是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)改變，適度缺氧可增強(qiáng)細(xì)胞存活能力，而嚴(yán)重缺氧則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。4.2.2代謝活動(dòng)改變?nèi)毖鯇?duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）的能量代謝、物質(zhì)合成與分解等代謝活動(dòng)產(chǎn)生多方面的影響，其中糖代謝和脂質(zhì)代謝的變化尤為顯著。在糖代謝方面，缺氧會(huì)促使hBMSCs從有氧氧化向無氧糖酵解轉(zhuǎn)變。正常情況下，hBMSCs主要通過有氧氧化途徑將葡萄糖徹底氧化分解為二氧化碳和水，以產(chǎn)生大量的三磷酸腺苷（ATP），滿足細(xì)胞的能量需求。然而，在缺氧環(huán)境中，由于氧氣供應(yīng)不足，有氧氧化過程受到抑制，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)無氧糖酵解途徑來維持能量供應(yīng)。研究表明，當(dāng)hBMSCs暴露于低氧環(huán)境時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）表達(dá)上調(diào)，GLUT1能夠增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，為無氧糖酵解提供更多的底物。同時(shí)，缺氧會(huì)激活磷酸果糖激酶1（PFK1）等糖酵解關(guān)鍵酶的活性，加速糖酵解的進(jìn)程。PFK1是糖酵解過程中的限速酶，它能夠催化果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為果糖-1,6-二磷酸，促進(jìn)糖酵解的進(jìn)行。通過無氧糖酵解，hBMSCs能夠快速產(chǎn)生ATP，雖然其產(chǎn)生的ATP量相對(duì)較少，但在缺氧條件下，對(duì)于維持細(xì)胞的基本生命活動(dòng)具有重要意義。然而，無氧糖酵解會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)乳酸堆積，pH值下降，這可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的功能產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。如果細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于這種酸性環(huán)境中，可能會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，甚至引發(fā)細(xì)胞凋亡。在脂質(zhì)代謝方面，缺氧會(huì)影響hBMSCs的脂質(zhì)合成與分解過程。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧會(huì)抑制hBMSCs的脂質(zhì)合成能力。在正常氧條件下，hBMSCs能夠利用乙酰輔酶A等底物合成脂肪酸和甘油三酯，參與脂質(zhì)的合成代謝。然而，在缺氧環(huán)境中，脂肪酸合成酶（FAS）等脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶的表達(dá)和活性受到抑制。FAS是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，它能夠催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸。缺氧導(dǎo)致FAS表達(dá)和活性降低，使得脂肪酸的合成減少，進(jìn)而影響甘油三酯的合成。此外，缺氧還會(huì)促進(jìn)hBMSCs的脂質(zhì)分解。在缺氧條件下，激素敏感性脂肪酶（HSL）的活性增強(qiáng)，HSL能夠催化甘油三酯水解為脂肪酸和甘油，促進(jìn)脂質(zhì)的分解代謝。分解產(chǎn)生的脂肪酸可以進(jìn)一步通過β-氧化途徑進(jìn)行氧化供能，為細(xì)胞在缺氧環(huán)境下提供額外的能量來源。然而，過度的脂質(zhì)分解可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化增加，產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物，這些物質(zhì)具有細(xì)胞毒性，會(huì)損傷細(xì)胞膜和細(xì)胞器，影響細(xì)胞的正常功能。除了糖代謝和脂質(zhì)代謝外，缺氧還會(huì)影響hBMSCs的其他代謝活動(dòng)。在蛋白質(zhì)合成方面，缺氧會(huì)抑制蛋白質(zhì)的合成速率。研究表明，缺氧會(huì)導(dǎo)致真核翻譯起始因子2α（eIF2α）的磷酸化水平升高，eIF2α是蛋白質(zhì)合成起始階段的關(guān)鍵因子，其磷酸化會(huì)抑制蛋白質(zhì)合成的起始過程，從而減少蛋白質(zhì)的合成。在核苷酸代謝方面，缺氧會(huì)影響核苷酸的合成和代謝途徑。缺氧會(huì)導(dǎo)致核苷酸合成相關(guān)酶的活性改變，影響核苷酸的合成，進(jìn)而影響DNA和RNA的合成，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等過程產(chǎn)生影響。綜上所述，缺氧對(duì)hBMSCs的代謝活動(dòng)產(chǎn)生廣泛而復(fù)雜的影響，通過調(diào)節(jié)糖代謝、脂質(zhì)代謝以及其他代謝途徑，細(xì)胞試圖在缺氧環(huán)境下維持能量平衡和代謝穩(wěn)態(tài)，但過度的代謝改變也可能對(duì)細(xì)胞造成損傷。4.3缺氧對(duì)血管再生能力的影響4.3.1血管生成相關(guān)因子表達(dá)缺氧條件下，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)發(fā)生顯著變化。VEGF作為一種關(guān)鍵的血管生成因子，在缺氧環(huán)境中其表達(dá)水平顯著上調(diào)。研究表明，當(dāng)hBMSCs暴露于低氧環(huán)境（如1%-5%O?）時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）會(huì)迅速激活，HIF-1α能夠結(jié)合到VEGF基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加VEGF的表達(dá)和分泌。一項(xiàng)研究將hBMSCs分別置于常氧（20%O?）和缺氧（1%O?）條件下培養(yǎng)24h，通過ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，缺氧組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF的含量明顯高于常氧組，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果也顯示，缺氧組hBMSCs中VEGFmRNA的表達(dá)水平顯著升高，這表明缺氧能夠通過HIF-1α信號(hào)通路促進(jìn)hBMSCs分泌VEGF，為血管生成提供重要的刺激信號(hào)。FGF家族成員在血管生成過程中也發(fā)揮著重要作用，其中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）與血管再生密切相關(guān)。在缺氧條件下，hBMSCs中bFGF的表達(dá)同樣會(huì)發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧會(huì)誘導(dǎo)hBMSCs中bFGF基因的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而增加bFGF的分泌。bFGF能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，在血管生成過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。其作用機(jī)制主要是通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，如Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。此外，bFGF還可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和分化，參與血管壁的構(gòu)建，進(jìn)一步增強(qiáng)血管的穩(wěn)定性和功能。除了VEGF和bFGF外，缺氧還會(huì)影響其他血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，如血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、血管生成素（Ang）等。PDGF能夠刺激血管平滑肌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移，在血管生成過程中參與血管壁的形成和重塑。在缺氧條件下，hBMSCs分泌的PDGF水平也會(huì)有所增加。Ang家族成員包括Ang-1和Ang-2等，Ang-1通過與Tie2受體結(jié)合，促進(jìn)血管的成熟和穩(wěn)定；而Ang-2則在一定條件下可以拮抗Ang-1的作用，調(diào)節(jié)血管的重塑和新生。研究表明，缺氧會(huì)改變hBMSCs中Ang-1和Ang-2的表達(dá)比例，影響血管生成的進(jìn)程。在缺血性損傷的微環(huán)境中，缺氧誘導(dǎo)hBMSCs分泌的Ang-2增加，與Ang-1的比例失衡，可能導(dǎo)致血管的不穩(wěn)定和新生血管的形成。綜上所述，缺氧通過調(diào)節(jié)hBMSCs中多種血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，對(duì)血管再生能力產(chǎn)生重要影響，這些因子之間相互作用，共同參與血管生成的復(fù)雜調(diào)控過程。4.3.2體外血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果在體外實(shí)驗(yàn)中，將缺氧處理后的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察其形成血管樣結(jié)構(gòu)的能力變化，結(jié)果顯示出顯著的差異。常用的體外血管生成實(shí)驗(yàn)方法是Matrigel基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)，Matrigel是一種從富含胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠肉瘤中提取的基質(zhì)膠，它含有多種促進(jìn)血管生成的成分，如層粘連蛋白、膠原蛋白和生長(zhǎng)因子等，能夠模擬體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，支持血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，形成血管樣結(jié)構(gòu)。當(dāng)hBMSCs在常氧條件下培養(yǎng)后與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，在Matrigel基質(zhì)膠上可以觀察到一定數(shù)量的血管樣結(jié)構(gòu)形成。這些血管樣結(jié)構(gòu)由血管內(nèi)皮細(xì)胞相互連接而成，呈現(xiàn)出管狀形態(tài)，具有一定的分支和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。通過顯微鏡觀察和圖像分析，可以對(duì)血管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量、長(zhǎng)度和分支情況等進(jìn)行量化評(píng)估。然而，當(dāng)hBMSCs經(jīng)過缺氧預(yù)處理后再與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，形成的血管樣結(jié)構(gòu)在數(shù)量、長(zhǎng)度和復(fù)雜性上均有明顯增加。研究表明，將hBMSCs在1%O?的缺氧環(huán)境中培養(yǎng)24h后，與常氧培養(yǎng)的hBMSCs相比，其與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)形成的血管樣結(jié)構(gòu)數(shù)量增加了約50%，血管樣結(jié)構(gòu)的總長(zhǎng)度也顯著增加。這表明缺氧預(yù)處理能夠增強(qiáng)hBMSCs促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成血管樣結(jié)構(gòu)的能力。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，缺氧預(yù)處理后的hBMSCs能夠分泌更多的血管生成相關(guān)因子，如前文所述的VEGF、bFGF等，這些因子通過旁分泌作用作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、遷移和管腔形成。VEGF可以特異性地與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGF受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)還能增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，促進(jìn)其形成管腔結(jié)構(gòu)。bFGF則通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的FGF受體結(jié)合，激活Ras-Raf-MEK-ERK等信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，增強(qiáng)血管樣結(jié)構(gòu)的形成能力。此外，缺氧預(yù)處理還可能改變hBMSCs的細(xì)胞表面分子表達(dá)，使其與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用增強(qiáng)，進(jìn)一步促進(jìn)血管生成。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧預(yù)處理后的hBMSCs表面的細(xì)胞黏附分子如整合素β1的表達(dá)上調(diào)，整合素β1能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的相應(yīng)配體結(jié)合，增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附作用，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和組裝，有利于血管樣結(jié)構(gòu)的形成。綜上所述，體外血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺氧預(yù)處理能夠顯著增強(qiáng)hBMSCs促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成血管樣結(jié)構(gòu)的能力，這一過程與缺氧誘導(dǎo)hBMSCs分泌血管生成相關(guān)因子以及改變細(xì)胞表面分子表達(dá)等因素密切相關(guān)。4.4缺氧對(duì)間質(zhì)調(diào)節(jié)能力的影響4.4.1免疫調(diào)節(jié)功能變化缺氧條件下，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)分子表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)功能發(fā)生顯著變化。研究表明，缺氧會(huì)影響hBMSCs表面免疫調(diào)節(jié)相關(guān)分子的表達(dá)，如程序性死亡配體1（PD-L1）。PD-L1是一種重要的免疫檢查點(diǎn)分子，能夠與T淋巴細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合，抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在缺氧環(huán)境中，hBMSCs內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）被激活，HIF-1α能夠上調(diào)PD-L1基因的表達(dá)，使hBMSCs表面的PD-L1表達(dá)增加。一項(xiàng)研究將hBMSCs分別置于常氧（20%O?）和缺氧（1%O?）條件下培養(yǎng)24h，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，缺氧組hBMSCs表面PD-L1的表達(dá)水平明顯高于常氧組，這表明缺氧能夠通過HIF-1α信號(hào)通路促進(jìn)hBMSCs表達(dá)PD-L1，增強(qiáng)其對(duì)T淋巴細(xì)胞的免疫抑制作用。缺氧還會(huì)影響hBMSCs分泌的細(xì)胞因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性。在與T淋巴細(xì)胞的相互作用中，缺氧培養(yǎng)的hBMSCs分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）等抗炎因子水平增加。TGF-β能夠抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的功能，促進(jìn)免疫耐受的形成；IL-10則具有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性的作用。研究發(fā)現(xiàn)，將hBMSCs與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，當(dāng)hBMSCs預(yù)先在缺氧條件下培養(yǎng)后，共培養(yǎng)體系中T淋巴細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，T淋巴細(xì)胞分泌的炎癥因子如干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平降低，而抗炎因子IL-10和TGF-β的水平升高，這表明缺氧預(yù)處理后的hBMSCs能夠通過分泌抗炎因子，抑制T淋巴細(xì)胞的活化和炎癥因子的分泌，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在與巨噬細(xì)胞的相互作用中，缺氧同樣會(huì)影響hBMSCs的免疫調(diào)節(jié)功能。巨噬細(xì)胞在免疫反應(yīng)中具有重要作用，可分為經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞和替代活化的M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的促炎活性，能夠分泌大量的炎癥因子，如TNF-α、IL-6等，參與免疫防御和炎癥反應(yīng)；M2型巨噬細(xì)胞則具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能，能夠分泌IL-10、TGF-β等抗炎因子，促進(jìn)組織修復(fù)和免疫耐受。研究表明，缺氧培養(yǎng)的hBMSCs能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。將hBMSCs與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，當(dāng)hBMSCs在缺氧條件下培養(yǎng)后，共培養(yǎng)體系中的巨噬細(xì)胞表達(dá)更多的M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，如CD206和精氨酸酶-1（Arg-1），同時(shí)分泌更多的IL-10和TGF-β，而M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物如CD86和TNF-α的表達(dá)和分泌減少，這表明缺氧預(yù)處理后的hBMSCs能夠通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能的M2型轉(zhuǎn)化，從而減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。4.4.2細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)缺氧條件下人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分和結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用以及對(duì)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的影響十分顯著。在ECM成分方面，缺氧會(huì)改變hBMSCs分泌的膠原蛋白、纖連蛋白等成分的表達(dá)。膠原蛋白是ECM的主要成分之一，對(duì)維持組織的結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用。研究表明，缺氧會(huì)導(dǎo)致hBMSCs中I型膠原蛋白和III型膠原蛋白的表達(dá)發(fā)生改變。在一定程度的缺氧條件下，hBMSCs中I型膠原蛋白的表達(dá)上調(diào)，這可能是細(xì)胞為了增強(qiáng)組織的強(qiáng)度和穩(wěn)定性而做出的適應(yīng)性反應(yīng)。I型膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)緊密，能夠形成堅(jiān)韌的纖維網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的力學(xué)性能。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，將hBMSCs置于1%O?的缺氧環(huán)境中培養(yǎng)48h后，I型膠原蛋白mRNA的表達(dá)水平較常氧組顯著升高，同時(shí)，蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果也顯示I型膠原蛋白的蛋白表達(dá)量明顯增加。然而，當(dāng)缺氧程度加重或持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，I型膠原蛋白的表達(dá)可能會(huì)受到抑制，導(dǎo)致ECM的結(jié)構(gòu)和功能受損。纖連蛋白也是ECM的重要組成部分，它在細(xì)胞黏附、遷移和信號(hào)傳導(dǎo)等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在缺氧環(huán)境下，hBMSCs分泌的纖連蛋白水平也會(huì)發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)，適度缺氧可促進(jìn)hBMSCs分泌纖連蛋白。在缺氧條件下，hBMSCs內(nèi)的信號(hào)通路被激活，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，該通路的激活能夠上調(diào)纖連蛋白基因的表達(dá)，從而增加纖連蛋白的分泌。通過ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，將hBMSCs在3%O?的缺氧環(huán)境中培養(yǎng)24h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中纖連蛋白的含量較常氧組明顯升高，這表明適度缺氧能夠增強(qiáng)hBMSCs對(duì)纖連蛋白的合成和分泌能力，有利于細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和組織修復(fù)。缺氧還會(huì)影響hBMSCs對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)。正常情況下，hBMSCs分泌的ECM成分能夠有序地組裝成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞提供支持和信號(hào)傳導(dǎo)。在缺氧條件下，ECM的結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生改變。研究表明，缺氧會(huì)導(dǎo)致ECM的交聯(lián)程度增加，這可能是由于缺氧誘導(dǎo)的一些酶活性改變所致。例如，賴氨酰氧化酶（LOX）是一種參與ECM交聯(lián)的關(guān)鍵酶，在缺氧條件下，hBMSCs中LOX的表達(dá)和活性上調(diào)。LOX能夠催化膠原蛋白和彈性蛋白等ECM成分中的賴氨酸殘基氧化脫氨，形成醛基，進(jìn)而促進(jìn)ECM成分之間的交聯(lián)。通過免疫熒光染色和電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，缺氧處理后的hBMSCs分泌的ECM中，膠原蛋白纖維之間的交聯(lián)明顯增多，導(dǎo)致ECM結(jié)構(gòu)更加致密。這種結(jié)構(gòu)變化雖然在一定程度上可以增強(qiáng)ECM的力學(xué)性能，但也可能會(huì)影響細(xì)胞的遷移和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散，對(duì)組織修復(fù)產(chǎn)生不利影響。細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用主要通過細(xì)胞表面的整合素等受體介導(dǎo)。在缺氧條件下，hBMSCs表面整合素的表達(dá)和活性也會(huì)發(fā)生改變。整合素是一類跨膜蛋白，能夠與ECM中的各種成分結(jié)合，如膠原蛋白、纖連蛋白等，從而介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附、遷移和信號(hào)傳導(dǎo)。研究表明，缺氧會(huì)影響hBMSCs表面整合素α5β1和整合素α1β1等的表達(dá)。在缺氧環(huán)境中，hBMSCs內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，改變整合素的表達(dá)水平。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，將hBMSCs在1%O?的缺氧環(huán)境中培養(yǎng)24h后，整合素α5β1的表達(dá)上調(diào)，這使得hBMSCs與纖連蛋白的黏附能力增強(qiáng)。整合素α5β1能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合纖連蛋白中的RGD序列，促進(jìn)細(xì)胞與纖連蛋白的黏附。通過細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，缺氧處理后的hBMSCs在纖連蛋白包被的培養(yǎng)板上的黏附能力明顯增強(qiáng)，這表明缺氧通過上調(diào)整合素α5β1的表達(dá)，增強(qiáng)了hBMSCs與纖連蛋白的相互作用，可能有利于細(xì)胞在缺氧環(huán)境下的存活和遷移。然而，過度的缺氧可能會(huì)導(dǎo)致整合素的功能異常，影響細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的正常相互作用，進(jìn)而影響細(xì)胞的功能和組織的修復(fù)。五、年齡與缺氧的交互作用對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響5.1不同年齡細(xì)胞對(duì)缺氧的敏感性差異不同年齡段的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）對(duì)缺氧的敏感性存在顯著差異，這一差異體現(xiàn)在細(xì)胞活力、凋亡率以及功能改變等多個(gè)方面。在細(xì)胞活力方面，新生兒和年輕個(gè)體來源的hBMSCs對(duì)缺氧具有相對(duì)較強(qiáng)的耐受性。研究表明，將不同年齡來源的hBMSCs置于1%的低氧環(huán)境中培養(yǎng)24h后，通過CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，新生兒和年輕組hBMSCs的細(xì)胞活力下降幅度相對(duì)較小，仍能保持較高的活性。這可能是因?yàn)槟贻p細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)較為活躍，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等，它們能夠有效清除細(xì)胞內(nèi)由于缺氧產(chǎn)生的過量活性氧（ROS），減少氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。同時(shí)，年輕hBMSCs中與細(xì)胞存活相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K/Akt信號(hào)通路的活性較高，該信號(hào)通路被激活后，能夠促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，抑制細(xì)胞