ICS71.100.70

X42

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/ZHCA

化妝品緊致功效測(cè)試-

斑馬魚幼魚彈性蛋白基因相對(duì)表達(dá)量

測(cè)試方法

Firmnessefficacytestofcosmetics-Testmethodfor

relativeexpressionofelastingeneinzebrafishlarvae

（征求意見稿）

2021-##-##發(fā)布2021-##-##實(shí)施

浙江省健康產(chǎn)品化妝品行業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布

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化妝品緊致功效測(cè)試

斑馬魚幼魚彈性蛋白基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)試方法

1范圍

本文件規(guī)定了一種用于評(píng)價(jià)化妝品緊致功效的檢測(cè)方法。

本文件適用于化妝品及其原料緊致功效的檢測(cè)。

有以下特征的受試物不適用于本文件方法：受試物不能溶解于水或不能制備成能在水中均勻分散的懸浮

液。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡

是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T21808化學(xué)品魚類延長(zhǎng)毒性14天試驗(yàn)

3術(shù)語及定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

最大耐受濃度maximumtoleratedconcentration;MTC

以5dpf的斑馬魚幼魚未出現(xiàn)死亡（無心跳）和其他毒性效應(yīng)（水腫、軀干彎曲、肌肉紋理不清晰、對(duì)機(jī)械

刺激無反應(yīng)等）的濃度。

3.2

受精后天數(shù)daypost-fertilization;dpf

是指斑馬魚受精卵受精后的天數(shù)。

4方法原理

彈性蛋白是皮膚組織中彈性纖維的主要成分，能為肌膚提供結(jié)構(gòu)性支撐，讓肌膚免受老化、松弛的困擾，

對(duì)于維持組織的彈性和復(fù)原力至關(guān)重要。

彈性蛋白由二種類型的短肽段交替排列構(gòu)成，eln1、eln2負(fù)責(zé)編碼彈力蛋白不同的肽段，兩個(gè)基因共同負(fù)

責(zé)調(diào)控彈力蛋白的表達(dá)水平，使皮膚緊致，具有彈性。斑馬魚具有與人相似的彈性蛋白（eln1、eln2）基因。

通過檢測(cè)斑馬魚eln1、eln2基因相對(duì)表達(dá)量可表明受試物是否具有緊致功效。

5材料和試劑。

除非另有說明，所用試劑均為分析純。水為新制蒸餾水或去離子水，pH為6.5~8.5，電導(dǎo)率≤10μS/cm。

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5.1斑馬魚幼魚，野生型AB品系斑馬魚的幼魚。

5.2標(biāo)準(zhǔn)稀釋水，按附錄A中描述的方法配制。

5.3陽性對(duì)照樣品：20mg/mL的肌肽（L-Carnosine，CAS：305-84-0，純度≥98%）

5.4助溶劑：二甲亞砜（Dimethylsulfoxide，DMSO，CAS號(hào)，67-68-5，分析純?cè)噭?/p>

5.5iTaqTMUniversalSYBRGreenSupermix（dsDNA熒光染料）。

5.6FastQuantRTKit（WithgDNase）試劑盒（反轉(zhuǎn)錄試劑盒）

5.7RNA-QuickPurificationKit（RNA快速提取試劑盒）。

5.8引物序列：β-actin：上游5’-TCGAGCAGGAGATGGGAACC-3’，下游5’-

CTCGTGGATACCGCAAGATTC-3’；eln1：上游5’-AAAACCAGGTTACGGCTCTGT，下游5’-

TCCTCCTGGATAAGCTCCGTATC；eln2：上游5’-CGGAACAGGAACTGGCATTAGG，下游5’-

ACCACCAGGCCCAATTCC。

6儀器和設(shè)備

6.1生化培養(yǎng)箱：帶有溫控和進(jìn)風(fēng)裝置，溫度控制范圍5℃~50℃，精度±0.1℃。

6.2電子天平：分度值為0.1mg。

6.3體視顯微鏡：自帶白光光源，最小放大倍數(shù)為20倍。

6.4高速冷凍離心機(jī)：17000xg/13300rpm。

6.5超微量紫外-可見光分光光度計(jì)：用于測(cè)定RNA濃度和純度。

6.6普通PCR擴(kuò)增儀：用于反轉(zhuǎn)錄。

6.7熒光定量PCR儀：用于進(jìn)行q-PCR定量檢測(cè)。

6.8一般實(shí)驗(yàn)室常用器皿何設(shè)備。

7試驗(yàn)準(zhǔn)備

7.1受試物儲(chǔ)備液制備

根據(jù)受試物的自身特性，用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水配制成一定濃度的受試物儲(chǔ)備溶液，備用。

7.1.1水溶性或易在水中分散的受試物：稱取適量（0.01g~0.1g）受試物，用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水溶解并定容至10ml；

7.1.2在水溶液中難于溶解或分散的受試物：稱取適量（0.01g~0.1g）受試物，添加0.1ml助溶劑助溶，用標(biāo)準(zhǔn)稀

釋水溶解并定容至10ml。所有組別中的助溶劑濃度應(yīng)該保持一致，且濃度（質(zhì)量濃度或體積分?jǐn)?shù)）不大于

1%。同時(shí)，應(yīng)加設(shè)溶劑對(duì)照組試驗(yàn)，溶劑對(duì)照組不能對(duì)斑馬魚的存活有明顯或其它任何可觀察到的不利影

響，也不能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響。

7.2斑馬魚幼魚準(zhǔn)備

在體視顯微鏡下挑選足夠數(shù)量的發(fā)育正常的斑馬魚幼魚，置于標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中進(jìn)行孵育，容器的水溫控制在

（28.5±1.0）℃。

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8試驗(yàn)程序

8.1預(yù)試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)用于確定受試物的MTC，為正式試驗(yàn)的濃度設(shè)置提供參考。

8.1.1受試物稀釋液制備

將受試物儲(chǔ)備液用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水以2倍幾何級(jí)數(shù)稀釋至3~5個(gè)濃度系列，備用。

8.1.2受試物處理

選取發(fā)育正常的4dpf的斑馬魚幼魚，放入六孔板中，每孔30枚，在不傷害幼魚的情況下除去6孔板中的

標(biāo)準(zhǔn)稀釋水，向每孔中迅速加入3mL相應(yīng)濃度的受試物溶液。

蓋上培養(yǎng)板面板并用鋁箔紙包裹，在（28.5±1.0）℃生化培養(yǎng)箱中避光孵育，孵育后24小時(shí)（5dpf）后

進(jìn)行觀察，對(duì)斑馬魚的死亡和其它毒性效應(yīng)進(jìn)行記錄。

8.1.3MTC的確定

以5dpf的斑馬魚幼魚未出現(xiàn)死亡（無心跳）和其他毒性效應(yīng)（水腫、軀干彎曲、肌肉紋理不清晰、

對(duì)機(jī)械刺激無反應(yīng)等）的濃度。

8.2正式試驗(yàn)

8.2.1正式試驗(yàn)分組

按照以下方法進(jìn)行分組：

a）空白對(duì)照組：含斑馬魚幼魚及標(biāo)準(zhǔn)稀釋水，每次試驗(yàn)設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組即可。

b）陽性對(duì)照組：含有陽性對(duì)照樣品和斑馬魚幼魚，根據(jù)需要，每次試驗(yàn)設(shè)置一個(gè)陽性對(duì)照組即可。

c）受試物測(cè)試組：含有受試物和斑馬魚幼魚，受試物根據(jù)需要設(shè)置多個(gè)不同的濃度組。

d）溶劑對(duì)照組：含有助溶劑和斑馬魚幼魚，如果受試物配制過程中使用了助溶劑，則應(yīng)設(shè)置該組。

8.2.2受試物處理

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，確定正式試驗(yàn)的受試物濃度范圍，試驗(yàn)最高濃度組不得高于MTC。根據(jù)測(cè)試需要，將

受試物儲(chǔ)備液用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水以2倍幾何級(jí)數(shù)稀釋至3~5個(gè)濃度系列。

選取發(fā)育正常的4dpf斑馬魚幼魚，并隨機(jī)分配到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔30枚，在不傷害幼魚的情況下除

去六孔板中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋水，然后迅速向每孔中加入3ml相應(yīng)濃度的受試物稀釋液。每組試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

充分混勻后，蓋上培養(yǎng)板面板并用鋁箔紙包裹，在（28.5±1.0）℃生化培養(yǎng)箱中避光孵育至終點(diǎn)（即5

dpf，孵育時(shí)間共計(jì)24小時(shí)）。

8.2.4收樣及q-PCR

孵育結(jié)束后，將斑馬魚清洗干凈轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管，吸干魚水保存在-80℃條件下，備用。

用RNA快速提取試劑盒提取各組斑馬魚總RNA。利用超微量紫外-可見光分光光度計(jì)對(duì)總RNA濃度和純度

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進(jìn)行測(cè)定，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒在普通PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。利用dsDNA熒光染料進(jìn)行點(diǎn)板后用

熒光定量PCR儀檢測(cè)β-actin和eln1、eln2的基因表達(dá)。

9結(jié)果評(píng)價(jià)

9.1數(shù)據(jù)處理

9.1.1統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)算各組試驗(yàn)的平均值（Mean）及標(biāo)準(zhǔn)誤差（StandardError，SE）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用Mean±SE表示。使

用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，以空白對(duì)照組（或溶劑對(duì)照組）作為標(biāo)準(zhǔn)，比較各實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)表

達(dá)量，P<0.05表示有顯著性差異。

9.1.2緊致功效的定量計(jì)算

根據(jù)各實(shí)驗(yàn)組β-actin和eln1、eln2的C(t)，計(jì)算各濃度組受試物eln1、eln2的RNA相對(duì)表達(dá)量公式如下：

C(t)C(t)目的基因-C(t)-actin

C(t)C(t)空白對(duì)照組-C(t)受試物測(cè)試組

RNA相對(duì)表達(dá)量2^C(t)

如果受試物配制過程中使用了助溶劑，則公式中的空白對(duì)照組數(shù)值用溶劑對(duì)照組數(shù)值進(jìn)行替換。

9.2結(jié)果判定及說明

在試驗(yàn)滿足有效性的基礎(chǔ)上，受試物與正常/溶劑對(duì)照相比，eln1、eln2的RNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加

（P<0.05），說明受試物在該濃度下具有增加彈性蛋白（eln1、eln2）基因相對(duì)表達(dá)量的能力，可作為緊致功

效評(píng)價(jià)的證據(jù)支撐之一。

10試驗(yàn)有效性的條件

10.1預(yù)試驗(yàn)或正式試驗(yàn)中，空白對(duì)照組（如果使用了助溶劑，也包括溶劑對(duì)照組）斑馬魚的死亡率或異常率

不得超過10%，超過10%則該次試驗(yàn)視為失??；

10.2正式試驗(yàn)中，陽性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間的RNA相對(duì)表達(dá)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，且平均值之

差必須大于2倍的空白對(duì)照組組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），否則該次試驗(yàn)視為失敗。

10.3正式試驗(yàn)中，如果使用了助溶劑，溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組之間的RNA相對(duì)表達(dá)量不能存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上

的顯著性差異，否則該次試驗(yàn)視為失敗。

11試驗(yàn)報(bào)告

試驗(yàn)報(bào)告至少應(yīng)給出以下幾個(gè)方面的內(nèi)容：

a）檢驗(yàn)依據(jù)；

b）受試物和陽性對(duì)照的信息，包括與試驗(yàn)操作相關(guān)的理化性狀；

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c）斑馬魚來源和品系等相關(guān)信息；

d）試驗(yàn)條件和方法，包括試驗(yàn)具體步驟；

e）試驗(yàn)開始至完成的日期；

f）試驗(yàn)結(jié)果，包括測(cè)定數(shù)據(jù)、計(jì)算值、圖像數(shù)據(jù)等；

g）數(shù)據(jù)處理與結(jié)果評(píng)價(jià)方法；

h）結(jié)論。

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附錄A

（規(guī)范性）

標(biāo)準(zhǔn)稀釋水配制方法

A.1試劑

除非另有說明，所用試劑均為分析純。水為新制蒸餾水或去離子水，pH為6.5~8.5，電導(dǎo)率≤10μS/cm。

A.1.1碳酸氫鈉NaHCO3，CAS號(hào)：144-55-8）。

A.1.2氯化鉀（KCl，CAS號(hào)：7647-14-5）。

A.1.3氯化鈣（CaCl2·2H2O，CAS號(hào)：10035-04-8）。

A.1.4硫酸鎂（MgSO4·7H2O，CAS號(hào)：10034-99-8）。

A.2配制

A.2.1標(biāo)準(zhǔn)稀釋水儲(chǔ)備液的配制

分別稱取2.59g碳酸氫鈉，0.23g氯化鉀，11.76g二水合氯化鈣，4.93g七水合硫酸鎂用水溶解，定容至

1L容量瓶，備用

A.2.2標(biāo)準(zhǔn)稀釋水的配制

吸取2.5ml標(biāo)準(zhǔn)稀釋水儲(chǔ)備液于100ml容量瓶，用水定容至刻度，搖勻備用。

參考文獻(xiàn)

[1]MiaoM,BruceAEE,BhanjiT,etal.Differentialexpressionoftwotropoelastingenesinzebrafish[J].Matrix

Biology,2007,26(2):115-124.

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前言

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起

草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司提出。

本文件由浙江省健康產(chǎn)品化妝品行業(yè)協(xié)會(huì)（ZHCA）歸口。

本文件牽頭單位：杭州環(huán)特生物科技股份有限公司

本文件主要起草單位：

本文件起草單位：

本文件主要起草人：

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化妝品緊致功效測(cè)試

斑馬魚幼魚彈性蛋白基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)試方法

1范圍

本文件規(guī)定了一種用于評(píng)價(jià)化妝品緊致功效的檢測(cè)方法。

本文件適用于化妝品及其原料緊致功效的檢測(cè)。

有以下特征的受試物不適用于本文件方法：受試物不能溶解于水或不能制備成能在水中均勻分散的懸浮

液。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡

是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T21808化學(xué)品魚類延長(zhǎng)毒性14天試驗(yàn)

3術(shù)語及定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

最大耐受濃度maximumtoleratedconcentration;MTC

以5dpf的斑馬魚幼魚未出現(xiàn)死亡（無心跳）和其他毒性效應(yīng)（水腫、軀干彎曲、肌肉紋理不清晰、對(duì)機(jī)械

刺激無反應(yīng)等）的濃度。

3.2

受精后天數(shù)daypost-fertilization;dpf

是指斑馬魚受精卵受精后的天數(shù)。

4方法原理

彈性蛋白是皮膚組織中彈性纖維的主要成分，能為肌膚提供結(jié)構(gòu)性支撐，讓肌膚免受老化、松弛的困擾，

對(duì)于維持組織的彈性和復(fù)原力至關(guān)重要。

彈性蛋白由二種類型的短肽段交替排列構(gòu)成，eln1、eln2負(fù)責(zé)編碼彈力蛋白不同的肽段，兩個(gè)基因共同負(fù)

責(zé)調(diào)控彈力蛋白的表達(dá)水平，使皮膚緊致，具有彈性。斑馬魚具有與人相似的彈性蛋白（eln1、eln2）基因。

通過檢測(cè)斑馬魚eln1、eln2基因相對(duì)表達(dá)量可表明受試物是否具有緊致功效。

5材料和試劑。

除非另有說明，所用試劑均為分析純。水為新制蒸餾水或去離子水，pH為6.5~8.5，電導(dǎo)率≤10μS/cm。

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5.1斑馬魚幼魚，野生型AB品系斑馬魚的幼魚。

5.2標(biāo)準(zhǔn)稀釋水，按附錄A中描述的方法配制。

5.3陽性對(duì)照樣品：20mg/mL的肌肽（L-Carnosine，CAS：305-84-0，純度≥98%）

5.4助溶劑：二甲亞砜（Dimethylsulfoxide，DMSO，CAS號(hào)，67-68-5，分析純?cè)噭?/p>

5.5iTaqTMUniversalSYBRGreenSupermix（dsDNA熒光染料）。

5.6FastQuantRTKit（WithgDNase）試劑盒（反轉(zhuǎn)錄試劑盒）

5.7RNA-QuickPurificationKit（RNA快速提取試劑盒）。

5.8引物序列：β-actin：上游5’-TCGAGCAGGAGATGGGAACC-3’，下游5’-

CTCGTGGATACCGCAAGATTC-3’；eln1：上游5’-AAAACCAGGTTACGGCTCTGT，下游5’-

TCCTCCTGGATAAGCTCCGTATC；eln2：上游5’-CGGAACAGGAACTGGCATTAGG，下游5’-

ACCACCAGGCCCAATTCC。

6儀器和設(shè)備

6.1生化培養(yǎng)箱：帶有溫控和進(jìn)風(fēng)裝置，溫度控制范圍5℃~50℃，精度±0.1℃。

6.2電子天平：分度值為0.1mg。

6.3體視顯微鏡：自帶白光光源，最小放大倍數(shù)為20倍。

6.4高速冷凍離心機(jī)：17000xg/13300rpm。

6.5超微量紫外-可見光分光光度計(jì)：用于測(cè)定RNA濃度和純度。

6.6普通PCR擴(kuò)增儀：用于反轉(zhuǎn)錄。

6.7熒光定量PCR儀：用于進(jìn)行q-PCR定量檢測(cè)。

6.8一般實(shí)驗(yàn)室常用器皿何設(shè)備。

7試驗(yàn)準(zhǔn)備

7.1受試物儲(chǔ)備液制備

根據(jù)受試物的自身特性，用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水配制成一定濃度的受試物儲(chǔ)備溶液，備用。

7.1.1水溶性或易在水中分散的受試物：稱取適量（0.01g~0.1g）受試物，用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水溶解并定容至10ml；

7.1.2在水溶液中難于溶解或分散的受試物：稱取適量（0.01g~0.1g）受試物，添加0.1ml助溶劑助溶，用標(biāo)準(zhǔn)稀

釋水溶解并定容至10ml。所有組別中的助溶劑濃度應(yīng)該保持一致，且濃度（質(zhì)量濃度或體積分?jǐn)?shù)）不大于

1%。同時(shí)，應(yīng)加設(shè)溶劑對(duì)照組試驗(yàn)，溶劑對(duì)照組不能對(duì)斑馬魚的存活有明顯或其它任何可觀察到的不利影

響，也不能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響。

7.2斑馬魚幼魚準(zhǔn)備

在體視顯微鏡下挑選足夠數(shù)量的發(fā)育正常的斑馬魚幼魚，置于標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中進(jìn)行孵育，容器的水溫控制在

（28.5±1.0）℃。

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8試驗(yàn)程序

8.1預(yù)試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)用于確定受試物的MTC，為正式試驗(yàn)的濃度設(shè)置提供參考。

8.1.1受試物稀釋液制備

將受試物儲(chǔ)備液用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水以2倍幾何級(jí)數(shù)稀釋至3~5個(gè)濃度系列，備用。

8.1.2受試物