ICS71.100.70

Y42

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/ZHCAxxx-2022

化妝品緊致功效體外測(cè)試方法人源成纖

維細(xì)胞增殖試驗(yàn)

Methodforinvitrotestingofcosmeticfirmingefficacy–fibroblast

proliferationassay

（征求意見(jiàn)稿）

2022-xx-xx發(fā)布2023-xx-xx實(shí)施

浙江省健康產(chǎn)品化妝品行業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布

T/ZHCAxxx—xxxx

化妝品緊致功效體外測(cè)試方法人源成纖維細(xì)胞增殖試驗(yàn)

1范圍

本文件規(guī)定了一種化妝品緊致功效的體外測(cè)試方法。

本文件適用于采用人源成纖維細(xì)胞增殖試驗(yàn)評(píng)價(jià)化妝品及原料的緊致功效。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語(yǔ)及定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

成纖維細(xì)胞fibroblast

普遍存在于結(jié)締組織中的一種中胚層來(lái)源的細(xì)胞。分泌前膠原、纖連蛋白和膠原酶等細(xì)胞外基質(zhì)，

傷口愈合過(guò)程中可遷移到傷口進(jìn)行增殖。

3.2

細(xì)胞活性檢測(cè)cellactivityassay

測(cè)定活細(xì)胞數(shù)量和/或細(xì)胞總數(shù)的方法，如MTT法。

4試驗(yàn)原理

成纖維細(xì)胞是皮膚的主要細(xì)胞成分，分布在皮膚的真皮層內(nèi)，是疏松結(jié)締組織中最常見(jiàn)的細(xì)胞，

可以產(chǎn)生大量的膠原蛋白與彈性纖維，對(duì)維持皮膚的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和皮膚彈性起到重要作用。

成纖維細(xì)胞的活力與增殖率決定著皮膚的緊致度進(jìn)而影響到皮膚的狀態(tài)。成纖維細(xì)胞的活力下降，

數(shù)量減少，就會(huì)導(dǎo)致皮膚衰老。因此，可以通過(guò)測(cè)試樣品對(duì)人源成纖維細(xì)胞增殖情況的影響，來(lái)評(píng)價(jià)

樣品的緊致功效。

在體外，細(xì)胞增殖情況可以通過(guò)MTT法來(lái)檢測(cè)。MTT法，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，是一種通用的

細(xì)胞活性檢測(cè)方法。

5試劑和材料

5.1DMEM培養(yǎng)液：低糖，葡萄糖含量1g/L。

5.2胰蛋白酶-EDTA溶液：胰蛋白酶濃度0.25%。

5.3新生牛血清（NBS）。

T/ZHCAxxx—xxxx

5.4細(xì)胞培養(yǎng)液：含10%新生牛血清（5.3）的DMEM培養(yǎng)液（5.1）。

5.5噻唑藍(lán)（MTT）：CAS：298-93-1，分析純。

5.6二甲基亞砜（DMSO）：CAS：67-68-5，分析純。

5.7磷酸鹽緩沖液（PBS）：pH7.2~pH7.4。

5.8MTT溶液：稱取MTT（5.1）0.25g，溶于50ml的磷酸緩沖液（PBS）中，配制成質(zhì)量濃度為5mg/mL

MTT溶液，0.22μm濾膜過(guò)濾后，4℃避光保存，有效期：1周。臨用前，用DMEM培養(yǎng)液（5.1）稀釋

至0.5mg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5.9細(xì)胞：原代人源成纖維細(xì)胞（10代以內(nèi)）。

6儀器

6.1分析天平：分度值為0.0001g。

6.2二氧化碳培養(yǎng)箱。

6.3可調(diào)節(jié)移液器：1000μL、200μL、300μL多道移液器。

6.4超凈工作臺(tái)。

6.5離心機(jī)。

6.6倒置顯微鏡。

6.7細(xì)胞板振蕩器。

6.8酶標(biāo)儀。

7試驗(yàn)步驟

7.1預(yù)試驗(yàn)（細(xì)胞毒性試驗(yàn)）

7.1.1細(xì)胞接種

選用生長(zhǎng)良好的人源成纖維細(xì)胞，消化后用細(xì)胞培養(yǎng)液制備成約1~2104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接

種到96孔板中，每孔200μL，邊緣孔加入200μL的無(wú)菌PBS。放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h，

24h±2h后細(xì)胞融合度應(yīng)達(dá)到20%~30%，若不在20%~30%范圍內(nèi)，需調(diào)整細(xì)胞接種密度。每一次試驗(yàn)

都應(yīng)同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，空白對(duì)照組不接種細(xì)胞，只加相同體積的細(xì)胞培養(yǎng)液。

7.1.2加樣

吸掉培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，開(kāi)展加樣操作。預(yù)試驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和受試樣品組，空白

對(duì)照組和溶劑對(duì)照組加入含2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，受試樣品組加入一定濃度的受試樣品培

養(yǎng)液。每孔加液量均為200μL。加樣完畢后將96孔板放回二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

7.1.3半換液

孵育24h和48h后取出96孔板進(jìn)行半換液操作，空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組換含2%新生牛血清的

DMEM培養(yǎng)液，受試樣品組換含有受試樣品的培養(yǎng)液。

T/ZHCAxxx—xxxx

7.1.4MTT檢測(cè)

孵育72h后，吸掉培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔加入200μL0.5mg/mL的MTT溶液，于二氧化碳培養(yǎng)

箱中孵育培養(yǎng)4h±15min。孵育結(jié)束后，吸棄MTT溶液，每孔加入150μLDMSO，將96孔板放置于振

蕩器上，避光震搖10min。震搖結(jié)束后，置于酶標(biāo)儀，490nm處讀取吸光度值（OD值）。

7.1.5計(jì)算細(xì)胞存活率

受試樣品組平均值空白組平均值

細(xì)胞存活率

溶劑對(duì)照組平均值空白組平均值

OD?OD

%=×100

OD?OD

7.2正式試驗(yàn)（細(xì)胞增殖試驗(yàn)）

7.2.1試驗(yàn)濃度選擇

選擇細(xì)胞存活率達(dá)到90%左右的濃度作為起始濃度，下設(shè)1~3個(gè)濃度，作為正式試驗(yàn)的濃度。具體

濃度選擇可根據(jù)試驗(yàn)情況做出適當(dāng)調(diào)整。

7.2.2細(xì)胞接種

接種4塊96孔板，分別為0h、24h、48h和72h孔板。其余同7.1.1。

7.2.3加樣

0h孔板不需要加樣，直接進(jìn)行MTT檢測(cè)；24h、48h、72h孔板設(shè)空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、陽(yáng)

性對(duì)照組和受試樣品組，陽(yáng)性對(duì)照組加入含10%~20%血清的DMEM培養(yǎng)液，其余各組加樣同7.1.2。24

h、48h、72h孔板加樣方法和給樣濃度一致，每孔加液量均為200μL。加樣完畢后將孔板放置在二氧

化碳培養(yǎng)箱中分別孵育24h、48h、72h。

7.2.4半換液

陽(yáng)性對(duì)照組換含有10%~20%血清的DMEM培養(yǎng)液，其余同7.1.3。

7.2.5MTT檢測(cè)

分別測(cè)定0h、24h、48h和72h孔板的吸光度值，其余同7.1.4。

7.2.6計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)相對(duì)細(xì)胞活力

T/ZHCAxxx—xxxx

孵育各時(shí)間點(diǎn)各組平均值相應(yīng)空白組平均值

相對(duì)細(xì)胞活力

平均值空白組平均值

OD?OD

%=×100

0hOD?0hOD

7.3數(shù)據(jù)處理

7.3.1數(shù)據(jù)計(jì)算

計(jì)算溶劑對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組與受試樣品組相對(duì)細(xì)胞活力（%）的平均值（Mean）、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）、

變異系數(shù)（CoefficientofVariation，CV），CV=（SD/Mean）×100%。相對(duì)細(xì)胞活力以平均值±標(biāo)

準(zhǔn)差表示。

7.3.2統(tǒng)計(jì)分析

采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較各時(shí)間點(diǎn)受試樣品組、陽(yáng)性對(duì)照組與溶劑對(duì)照組相對(duì)細(xì)胞活力

的差異，P<0.05表明統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。

8結(jié)果判定

8.1試驗(yàn)成立的條件

8.1.1試驗(yàn)系統(tǒng)有效

a)每批次試驗(yàn)溶劑對(duì)照組均能檢出OD值增高的效果。

b)每批次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組相對(duì)細(xì)胞活力≥100%。

8.1.2試驗(yàn)平行性有效

各平行孔相對(duì)細(xì)胞活力的CV值≤20%。

8.2結(jié)果判定

評(píng)價(jià)樣品的緊致功效，需要受試樣品組相對(duì)細(xì)胞活力隨時(shí)間增大，高于溶劑對(duì)照組，且檢測(cè)值在

至少2個(gè)時(shí)間點(diǎn)與溶劑對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），則可判斷在該試驗(yàn)條件下，該濃度的受試

樣品具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的能力，為陽(yáng)性；若受試樣品組細(xì)胞活力只有1個(gè)時(shí)間點(diǎn)與溶劑對(duì)照組

具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），則需要重復(fù)試驗(yàn)，若重復(fù)結(jié)果表明仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），則判

斷為陽(yáng)性；若受試樣品組細(xì)胞活力只有1個(gè)時(shí)間點(diǎn)與溶劑對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），且無(wú)重

復(fù)性，或與溶劑對(duì)照組比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P≥0.05），則為陰性。

在所有試驗(yàn)濃度下，至少有一個(gè)濃度呈現(xiàn)陽(yáng)性，該樣品即可報(bào)告為具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖能力，

具有緊致功效。

9試驗(yàn)報(bào)告

T/ZHCAxxx—xxxx

試驗(yàn)報(bào)告至少應(yīng)給出以下幾個(gè)方面的內(nèi)容：

9.1試驗(yàn)依據(jù)；

9.2細(xì)胞名稱、來(lái)源、培養(yǎng)代數(shù)；

9.3樣品和陽(yáng)性對(duì)照的信息，包括廠家、性狀、配制方法、濃度等；

9.4試驗(yàn)條件和方法，包括試驗(yàn)具體步驟；

9.5試驗(yàn)結(jié)果、結(jié)論；

9.6試驗(yàn)日期；

9.7試驗(yàn)人簽字或單位簽章。

T/ZHCAxxx—xxxx

前??言

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院提出。

本文件由浙江省健康產(chǎn)品化妝品行業(yè)協(xié)會(huì)（ZHCA）歸口。

本文件起草單位：

本文件主要起草人：

T/ZHCAxxx—xxxx

化妝品緊致功效體外測(cè)試方法人源成纖維細(xì)胞增殖試驗(yàn)

1范圍

本文件規(guī)定了一種化妝品緊致功效的體外測(cè)試方法。

本文件適用于采用人源成纖維細(xì)胞增殖試驗(yàn)評(píng)價(jià)化妝品及原料的緊致功效。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語(yǔ)及定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

成纖維細(xì)胞fibroblast

普遍存在于結(jié)締組織中的一種中胚層來(lái)源的細(xì)胞。分泌前膠原、纖連蛋白和膠原酶等細(xì)胞外基質(zhì)，

傷口愈合過(guò)程中可遷移到傷口進(jìn)行增殖。

3.2

細(xì)胞活性檢測(cè)cellactivityassay

測(cè)定活細(xì)胞數(shù)量和/或細(xì)胞總數(shù)的方法，如MTT法。

4試驗(yàn)原理

成纖維細(xì)胞是皮膚的主要細(xì)胞成分，分布在皮膚的真皮層內(nèi)，是疏松結(jié)締組織中最常見(jiàn)的細(xì)胞，

可以產(chǎn)生大量的膠原蛋白與彈性纖維，對(duì)維持皮膚的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和皮膚彈性起到重要作用。

成纖維細(xì)胞的活力與增殖率決定著皮膚的緊致度進(jìn)而影響到皮膚的狀態(tài)。成纖維細(xì)胞的活力下降，

數(shù)量減少，就會(huì)導(dǎo)致皮膚衰老。因此，可以通過(guò)測(cè)試樣品對(duì)人源成纖維細(xì)胞增殖情況的影響，來(lái)評(píng)價(jià)

樣品的緊致功效。

在體外，細(xì)胞增殖情況可以通過(guò)MTT法來(lái)檢測(cè)。MTT法，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，是一種通用的

細(xì)胞活性檢測(cè)方法。

5試劑和材料

5.1DMEM培養(yǎng)液：低糖，葡萄糖含量1g/L。

5.2胰蛋白酶-EDTA溶液：胰蛋白酶濃度0.25%。

5.3新生牛血清（NBS）。

T/ZHCAxxx—xxxx

5.4細(xì)胞培養(yǎng)液：含10%新生牛血清（5.3）的DMEM培養(yǎng)液（5.1）。

5.5噻唑藍(lán)（MTT）：CAS：298-93-1，分析純。

5.6二甲基亞砜（DMSO）：CAS：67-68-5，分析純。

5.7磷酸鹽緩沖液（PBS）：pH7.2~pH7.4。

5.8MTT溶液：稱取MTT（5.1）0.25g，溶于50ml的磷酸緩沖液（PBS）中，配制成質(zhì)量濃度為5mg/mL

MTT溶液，0.22μm濾膜過(guò)濾后，4℃避光保存，有效期：1周。臨