ICS65.120DB41河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB41/T1728—2018本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由河南省畜牧局提出并歸口。本標準起草單位:河南海瑞正檢測技術(shù)有限公司、河南省獸藥飼料監(jiān)察所、河南省種牛遺傳性能測定中心。本標準主要起草人:朱慧慧、陸靜、方忠意、李靈平、周永亮、黃好強、麻曉燕、王洋洋、范曉燕、魏金銷。DB41/T1728—20181飼料添加劑丁酸梭菌的測定微生物法本標準規(guī)定了飼料添加劑丁酸梭菌的檢測方法微生物法。本標準適用于飼料及飼料添加劑中丁酸梭菌的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定3培養(yǎng)基或材料3.1亞硫酸鐵瓊脂培養(yǎng)基:見附錄A中A.1。3.20.85%生理鹽水:見附錄A中A.2。3.3產(chǎn)酸指示培養(yǎng)基:見附錄B中B.1。3.4明膠培養(yǎng)基。3.5淀粉水解培養(yǎng)基。3.6革蘭氏染色配套試劑:見附錄A中A.3。3.7胰蛋白胨大豆瓊脂(TSW)。注：除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑。水應符合4儀器設(shè)備4.1天平:感量0.01g。4.2粉碎機。4.3高壓滅菌器。4.4恒溫培養(yǎng)箱。4.5電熱鼓風干燥箱。4.6拍擊式勻質(zhì)器。4.7厭氧罐（配厭氧產(chǎn)氣袋）。4.8超凈工作臺。4.9移液器:100μL～1000μL。4.10顯微鏡。4.11酒精燈。4.12試管架。4.13滅菌試管:15mL。4.14滅菌平皿:直徑90mm。DB41/T1728—201825測定步驟5.1試樣稀釋及培養(yǎng)5.1.1無菌條件下稱取試樣25g(mL)樣品，加入裝有225mL0.85%滅菌生理鹽水的勻質(zhì)袋中，然后用勻質(zhì)器拍打2min～3min，制成1:10的均勻稀釋液。5.1.2用移液器移取1:10稀釋液1mL，注入含有9mL0.85%滅菌生理鹽水的試管中，充分混勻后，5.1.3按上述操作方法，10倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋一次。5.1.4選擇2～3個適宜稀釋度，用移液器移取1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿，同時用1mL無菌生理鹽水作對照。然后將涼至50℃左右的培養(yǎng)基注入平皿中，小心轉(zhuǎn)動培養(yǎng)基使試樣與培養(yǎng)基充分混勻。5.1.5待培養(yǎng)基凝固后迅速將平皿倒置于培養(yǎng)箱中，37℃厭氧培養(yǎng)18h～24h，觀察菌落形態(tài)。5.2菌落特征亞硫酸鐵瓊脂培養(yǎng)基上，菌落圓形，較小、規(guī)則、實心，剛開始為黑色，放置1d～2d時間黑色褪為白色。5.3確證試驗從平皿中選出5個特征菌落進行確證試驗，在胰蛋白胨大豆瓊脂平皿上進行純化。挑選純化的菌落做革蘭氏染色和生化試驗，生化試驗項目如表1。確證結(jié)果:革蘭氏染色為陽性菌，菌體呈桿狀，能形成圓形或橢圓形芽孢，菌體中部膨大呈梭形。生化試驗不水解明膠，水解淀粉，可以利用蜜二糖和葡萄糖產(chǎn)酸，不利用松三糖，鼠李糖和山梨醇，即可判定為丁酸梭菌。表1生化鑒定項目淀粉水解蜜二糖松三糖葡萄糖結(jié)果-++---+6結(jié)果計算與報告6.1計算每塊平板上的丁酸梭菌菌落數(shù)a，使用式（1）計算:a=×C…………（1）式中:a----計算每塊平板上的丁酸梭菌菌落數(shù)；b----挑選后經(jīng)證實為丁酸梭菌的菌落數(shù)；A----挑選平板上用于驗證的菌落數(shù)；C----平板上的所有特征菌落數(shù)。最終結(jié)果按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則修約至整數(shù)。DB41/T1728—201836.2樣品中丁酸梭菌數(shù)的計算方法與報告選擇兩個連續(xù)稀釋度平板（每個稀釋度至少有一塊平板），其上經(jīng)確證后的丁酸梭菌數(shù)介于30~300之間，通過式（2）計算，即為1mL或1g樣品中的丁酸梭菌菌數(shù)N:式中:N——樣品中丁酸梭菌菌數(shù)；Σa——所有平板經(jīng)確證后的丁酸梭菌菌數(shù)的總和；n1第一個稀釋的平均數(shù)；n2第二個稀釋的平均數(shù)；d——第一個稀釋度的稀釋因子（未經(jīng)稀釋的液體樣品的d值為1）。按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則將計算出的結(jié)果保留兩位有效數(shù)字，也可將樣品的丁酸梭菌菌落數(shù)記DB41/T1728—20184培養(yǎng)基和試劑A.1硫酸亞鐵培養(yǎng)基A.1.1成分胰蛋白胨15.0g大豆蛋白胨5.0g酵母粉5.0g偏重亞硫酸鈉1.0g檸檬酸鐵銨1.0g瓊脂20.0g蒸餾水1000mLA.1.2制法將上述成分置于燒杯中加熱溶解，分裝于三角瓶中；121℃高壓滅菌15min。A.20.85%生理鹽水稱取氯化鈉（分析純）8.5g，溶于1000mL蒸餾瓶中。分裝于三角瓶中，121℃高壓滅菌15min。A.3革蘭氏染色A.3.1結(jié)晶紫染色液A.3.1.1成分結(jié)晶紫95%乙醇20mL1%草酸氨溶液80mLA.3.1.2制法將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。A.3.2革蘭氏碘液A.3.2.1成分碘碘化鉀2.0g蒸餾水300mLA.3.2.2制法將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。DB41/T1728—20185A.3.3沙黃復染液A.3.3.1成分沙黃95%乙醇蒸餾水90mLA.3.3.2制法將沙黃溶解于乙醇中，用蒸餾水稀釋。DB41/T1728—20186培養(yǎng)基和試劑B.1產(chǎn)酸指示培養(yǎng)基B.1.1成分磷酸氫二銨氯化鉀0.2g硫酸鎂0.2g酵母膏0.2g0.04%溴甲酚紫瓊脂蒸餾水B.