ICSCCS65.020.30B4141IDB41/T2067—2020本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由河南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：新鄉(xiāng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、河南科技學(xué)院、河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。本文件主要起草人：荊汝頂、秦保亮、李春艷、杜海燕、王英華、馮春花、朱方兵、馬健、?？煽?、孫照霞、王超、胡元春、郝曉鵬、姜金慶、劉長(zhǎng)忠、常衛(wèi)波、趙智燦、李磊。DB41/T2067—20201奶牛場(chǎng)布魯氏菌病凈化技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了奶牛場(chǎng)布魯氏菌病的診斷、凈化、維持、生物安全與防護(hù)等要求。本文件適用于獨(dú)立封閉飼養(yǎng)規(guī)模100頭以上奶牛場(chǎng)布魯氏菌病的凈化。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18646—2018動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.布魯氏菌病防治技術(shù)規(guī)范.2007中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部.跨省調(diào)運(yùn)乳用種用動(dòng)物產(chǎn)地檢疫規(guī)程.2019中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.病死及病害動(dòng)物無(wú)害化處理技術(shù)規(guī)范.20173術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1布魯氏菌病由布魯氏菌屬細(xì)菌引起的人獸共患傳染病。3.2布魯氏菌病凈化對(duì)奶牛場(chǎng)采取一系列防控措施，用血清學(xué)檢測(cè)血清均為陰性，奶牛場(chǎng)連續(xù)2年無(wú)個(gè)體發(fā)病和無(wú)感染狀態(tài)，即達(dá)到布魯氏菌凈化標(biāo)準(zhǔn)。4診斷4.1臨床診斷4.1.1流行特點(diǎn)布魯氏菌病（以下簡(jiǎn)稱“布病”）是由布魯氏菌引起的一種細(xì)胞內(nèi)寄生疾病，主要侵害動(dòng)物的淋巴系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)。病畜主要通過(guò)流產(chǎn)物、精液和乳汁排菌，污染環(huán)境。母畜比公畜，成年畜比幼年畜發(fā)病多。在母畜中，第一次妊娠母畜發(fā)病較多。帶菌動(dòng)物，尤其是病畜的流產(chǎn)胎兒、胎衣是主要傳染源。消化道、呼吸道、生殖道是主要的感染途徑，也可通過(guò)損傷的皮膚、黏膜等感染。常呈地方性流行。4.1.2臨床癥狀潛伏期一般為14d～180d。最顯著癥狀是懷孕母畜發(fā)生流產(chǎn)，流產(chǎn)后可能發(fā)生胎衣滯留和子宮內(nèi)膜炎，從陰道流出污穢不潔、惡臭的分泌物。新發(fā)病的畜群流產(chǎn)較多；老疫區(qū)畜群發(fā)生流產(chǎn)的較少，但2DB41/T2067—2020發(fā)生子宮內(nèi)膜炎、乳房炎、關(guān)節(jié)炎、胎衣滯留、久配不孕的較多。公畜往往發(fā)生睪丸炎、附睪炎或關(guān)節(jié)4.1.3剖檢病變警示——對(duì)本病疑似病例剖檢采樣過(guò)程中應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照相關(guān)生物安全要求，防止病原微生物擴(kuò)散及人員感染。主要病變?yōu)樯称鞴俚难仔詨乃?，脾、淋巴結(jié)、肝、腎等器官形成特征性肉芽腫（布病結(jié)節(jié)）。有的可見(jiàn)關(guān)節(jié)炎。胎兒主要呈敗血癥病變，漿膜和黏膜有出血點(diǎn)和出血斑，皮下結(jié)締組織發(fā)生漿液性、出血性炎癥。4.2實(shí)驗(yàn)室診斷4.2.1血清學(xué)診斷4.2.1.1虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT按GB/T18646—2018規(guī)定）4.2.1.2乳牛全乳環(huán)狀試驗(yàn)(MRT)（按GB/T18646—2018規(guī)定）4.2.1.3試管凝集試驗(yàn)(SAT)（按GB/T18646—2018規(guī)定）4.2.1.4補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)（按GB/T18646—2018規(guī)定）4.2.1.5間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（iELISA按GB/T18646—2018規(guī)定）4.2.1.6競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA按GB/T18646—2018規(guī)定）4.2.2病原學(xué)診斷警示——以下病原學(xué)操作包括但不僅限于涂片染色鏡檢、分離培養(yǎng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)中涉及細(xì)菌活菌操作等，均應(yīng)在BSL-3級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，操作人員應(yīng)采取針對(duì)性防護(hù)措施。4.2.2.1涂片染色鏡檢按《布魯氏菌病防治技術(shù)規(guī)范》要求采集流產(chǎn)胎衣、絨毛膜水腫液、肝、脾、淋巴結(jié)、胎兒胃內(nèi)容物等組織，按GB/T18646—2018規(guī)定制成抹片，布魯氏菌體染成紅色球桿狀小桿菌，而其它菌為藍(lán)色。4.2.2.2分離培養(yǎng)按《布魯氏菌病防治技術(shù)規(guī)范》要求，新鮮病料可用胰蛋白瓊脂面或血液瓊脂斜面、肝湯瓊脂斜面、3%甘油0.5%葡萄糖肝湯瓊脂斜面等培養(yǎng)基培養(yǎng)；若為陳舊病料或污染病料，可用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。組織樣品、陰道沖洗液、精液、關(guān)節(jié)液、胃內(nèi)容物、乳樣按GB/T18646—2018規(guī)定處理，每份樣品均一式兩份，分別置于普通培養(yǎng)箱和5%～10%二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)3d～10d。4.2.2.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)主要包括普通PCR和熒光定量PCR，普通PCR操作方法按GB/T18646—2018第4章13節(jié)布魯氏菌Bruce-Ladder檢測(cè)方法操作，熒光定量PCR可按商品化試劑盒操作。4.3結(jié)果判定4.3.1具有4.1時(shí)，判定為疑似病例。4.3.2符合4.1，且4.2.1.1或4.2.1.2陽(yáng)性時(shí)，判定為患病奶牛。4.3.3未免疫場(chǎng)奶牛的結(jié)果判定如下：a)4.2.1.1或4.2.1.2或4.2.1.5陽(yáng)性時(shí)，判定為疑似患病奶牛；b)4.2.1.3或4.2.1.4或4.2.1.6或4.2.2診斷陽(yáng)性時(shí)，判定為患病奶牛；c)符合疑似患病奶牛但4.2.1.3或4.2.1.4或4.2.1.6陰性時(shí)，30d后應(yīng)重新采樣檢測(cè)，4.2.1.1或4.2.1.3或4.2.1.4或4.2.1.6陽(yáng)性的判定為患病奶牛。4.3.4免疫場(chǎng)動(dòng)物的結(jié)果判定如下：a)開(kāi)展奶牛場(chǎng)布魯氏菌病凈化應(yīng)連續(xù)兩年以上未進(jìn)行布病疫苗免疫；b)免疫場(chǎng)奶牛最后一次布病疫苗免疫后間隔二年后，按照4.3.3進(jìn)行判定；DB41/T2067—20203c)對(duì)免疫背景不清的奶牛場(chǎng)，具有4.1時(shí)，按照4.2.2.3普通PCR進(jìn)行毒株鑒別，田間流行毒株檢測(cè)陽(yáng)性的按患病動(dòng)物處置。5凈化5.1凈化要求以奶牛場(chǎng)為單位，連續(xù)2年無(wú)臨床病例，且按4.2.1血清學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果連續(xù)1年以上無(wú)陽(yáng)性。5.2技術(shù)路線按照檢測(cè)、隔離、撲殺相結(jié)合的策略，對(duì)奶牛場(chǎng)進(jìn)行凈化；疑似病例一旦確診為布病陽(yáng)性牛，直接撲殺；同欄疑似病例及陰性牛群分別進(jìn)行隔離觀察，間隔3個(gè)月后按4.2.1進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果仍為陽(yáng)性者進(jìn)行撲殺，同時(shí)加強(qiáng)消毒和提高綜合飼養(yǎng)管理水平等措施，提高布病凈化工作效果。5.3凈化過(guò)程5.3.1犢牛檢測(cè)、隔離、撲殺犢牛于20日齡時(shí)采用4.2.1.1琥紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）或4.2.1.5間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（iELISA）進(jìn)行第一次普檢，100～120日齡時(shí)，進(jìn)行第二次普檢。對(duì)檢出陽(yáng)性牛隔離并采用4.2.1.3試管凝集試驗(yàn)(SAT)或4.2.1.6競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）進(jìn)行復(fù)核，對(duì)確診陽(yáng)性畜進(jìn)行撲殺；間隔3個(gè)月再次普檢，撲殺確診陽(yáng)性牛。陰性牛參照假定健康牛群管理。5.3.2布病疑似牛群檢測(cè)、隔離、撲殺采用4.2.1.1琥紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）或4.2.1.5間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（iELISA）對(duì)污染牛群進(jìn)行普檢，以后每間隔3個(gè)月進(jìn)行1次普檢，對(duì)檢出陽(yáng)性牛隔離并采用4.2.1.3試管凝集試驗(yàn)(SAT)或4.2.1.6競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）進(jìn)行復(fù)核，對(duì)確診陽(yáng)性牛進(jìn)行撲殺，直至全部陰性。5.3.3假定健康牛群檢測(cè)每年春、秋兩季各進(jìn)行一次普檢，采用4.2.1.1琥紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）或4.2.1.5間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（iELISA）初篩，疑似陽(yáng)性牛按5.3.2進(jìn)行處置管理。5.3.4持續(xù)監(jiān)測(cè)5.3.4.1連續(xù)2次以上試管凝集試驗(yàn)(SAT)或競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）檢測(cè)結(jié)果均陰性的畜群為布病凈化畜群，否則按照凈化步驟循環(huán)進(jìn)行。5.3.4.2每次樣品的采集、檢測(cè)、陽(yáng)性牛的處理均應(yīng)在10天內(nèi)完成。5.3.4.3凈化畜群建立后，每6個(gè)月按全群20%的比例采集血清樣品進(jìn)行1次抗體監(jiān)測(cè)，以持續(xù)維持凈化畜群的健康狀態(tài)。5.3.4.4按照《跨省調(diào)運(yùn)乳用種用動(dòng)物產(chǎn)地檢疫規(guī)程》進(jìn)行檢疫，奶牛引入必須來(lái)自于非疫區(qū)，調(diào)入后應(yīng)隔離飼養(yǎng)45d，經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)檢疫合格后，方可混群飼養(yǎng)。6生物安全與防護(hù)6.1人員防護(hù)6.1.1采樣人員防護(hù)DB41/T2067—20204采樣前，采樣人員需佩戴一次性醫(yī)用乳膠手套、口罩、帽子、鞋套，著工作服，必要時(shí)佩戴護(hù)目鏡。對(duì)采樣器械進(jìn)行消毒。采樣結(jié)束后，收集采樣物品進(jìn)行消毒處理，并更換衣服清洗消毒。6.1.2檢測(cè)人員防護(hù)應(yīng)在符合相應(yīng)級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室中操作，病原分離培養(yǎng)需在BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室操作，未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料和滅活性實(shí)驗(yàn)在BSL-2級(jí)實(shí)驗(yàn)室操作。檢測(cè)人員需佩戴一次性醫(yī)用乳膠手套、口罩、帽子、鞋套，著工作服、護(hù)目鏡。6.1.3飼養(yǎng)人員防護(hù)進(jìn)入圈舍佩戴口罩、穿工作服、膠鞋等必備的防護(hù)用品，避免破損皮膚接觸牲畜的排泄物、分泌物。犢牛助產(chǎn)和處理流產(chǎn)胎兒、死胎兒時(shí)，除備有工作服、橡皮圍裙、帽子、口罩和膠鞋外，還應(yīng)戴乳膠手套和長(zhǎng)袖橡膠手套，備有接羔袋和消毒液，禁止赤手接觸流產(chǎn)胎兒，接產(chǎn)后進(jìn)行自身清洗消毒。6.2環(huán)境消毒6.2.1地面消毒采用氫氧化鈉和生石灰等堿類消毒劑。用2%氫氧化鈉水溶液，噴灑6h～12h后用清水沖洗干凈，生石灰應(yīng)加等重量的水，均勻?yàn)⒉加谛柘緢?chǎng)所。6.2.2圈舍消毒可選用2%燒堿等有效消毒藥進(jìn)行噴灑消毒。6.2.3設(shè)施工具消毒對(duì)金屬設(shè)施、設(shè)備采取火焰、熏蒸等方