登革熱疫苗研發(fā)中的免疫原性增強策略演講人04/免疫調(diào)節(jié)與ADE規(guī)避：安全性的核心考量03/抗原設計優(yōu)化：提升免疫原性的基礎02/引言01/登革熱疫苗研發(fā)中的免疫原性增強策略06/聯(lián)合免疫策略：協(xié)同增效的新思路05/新技術驅(qū)動的免疫原性增強目錄07/總結與展望01登革熱疫苗研發(fā)中的免疫原性增強策略02引言引言登革熱是由登革病毒（DENV）經(jīng)蚊媒傳播引起的急性傳染病，廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，全球約半數(shù)人口面臨感染風險。登革病毒分為4個血清型（DENV-1至DENV-4），感染后可引起無癥狀感染、登革熱，甚至重癥登革熱如登革出血熱/登革休克綜合征。目前，登革熱防控仍以蚊媒控制為主，疫苗是最具成本效益的長期干預手段。然而，登革熱疫苗研發(fā)面臨獨特挑戰(zhàn)：一方面，4個血清型間存在抗原性差異，需誘導針對所有血清型的交叉保護；另一方面，免疫應答失衡可能導致抗體依賴性增強（ADE）效應，反而加重病情。因此，提升疫苗的免疫原性——即誘導高效、持久、均衡的體液與細胞免疫應答，成為登革熱疫苗研發(fā)的核心目標。作為一名長期從事疫苗研發(fā)的科研人員，我深刻體會到免疫原性增強策略的復雜性：它不僅涉及抗原本身的優(yōu)化，還需要佐劑、遞送系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)等多維度技術的協(xié)同創(chuàng)新。本文將從抗原設計、佐劑開發(fā)、免疫調(diào)節(jié)、新技術應用及聯(lián)合策略等角度，系統(tǒng)闡述登革熱疫苗研發(fā)中免疫原性增強的關鍵進展與未來方向。03抗原設計優(yōu)化：提升免疫原性的基礎抗原設計優(yōu)化：提升免疫原性的基礎抗原作為疫苗的核心成分，其結構、構象與免疫原性直接相關。登革病毒的包膜糖蛋白（E蛋白）是主要的保護性抗原，介導病毒入侵宿主細胞，也是中和抗體的主要靶點。然而，天然E蛋白存在免疫原性不足、血清型間交叉保護弱等問題，需通過理性設計優(yōu)化其免疫原性。1嵌合病毒顆粒技術的突破傳統(tǒng)滅活疫苗或亞單位疫苗因無法模擬病毒天然構象，免疫原性較弱。嵌合病毒顆粒技術通過將一種血清型的結構蛋白（prM-E）替換為另一種血清型的相應蛋白，構建嵌合病毒，既保留了病毒顆粒的天然空間構象，又整合了多血清型抗原。例如，賽諾菲巴斯德公司的登革熱疫苗Dengvaxia?（CYD-TDV）即以黃熱病毒17D疫苗株為backbone，嵌合DENV-1至DENV-4的prM-E基因，在臨床試驗中顯示出對DENV-1、3、4的50%保護率，但對DENV-2保護率較低（35%），且未接種過登革病毒者接種后存在ADE風險。這提示我們，嵌合技術雖能增強抗原的天然構象，但需進一步優(yōu)化嵌合位點與抗原穩(wěn)定性。1嵌合病毒顆粒技術的突破近年來，以DENV-2為backbone的嵌合疫苗（如TAK-003，商品名Qdenga）在Ⅲ期臨床試驗中顯示出更均衡的保護效果（總體保護率80.9%，對DENV-2保護率達76%），其關鍵在于優(yōu)化了prM-E的信號肽與跨膜區(qū)，確保嵌合顆粒的正確組裝與成熟。此外，反向遺傳學技術的應用，使我們可以通過定點突變（如E蛋白的E380/E383位點）增強顆粒的穩(wěn)定性，減少非結構蛋白的干擾，從而提升抗原的免疫原性。2關鍵結構域的定向改造E蛋白包含3個結構域（DI、DII、DIII），其中DII的融合環(huán)（fusionloop,FL）是中和抗體的主要靶點，但該區(qū)域高度保守，易引發(fā)ADE；DIII則包含血清型特異性表位，是誘導型特異性中和抗體的關鍵。通過結構生物學解析（如冷凍電鏡技術），我們發(fā)現(xiàn)天然DIII在病毒顆粒中呈“隱藏”狀態(tài)，難以被免疫系統(tǒng)有效識別。因此，通過柔性肽連接將DIII暴露于顆粒表面，或設計DIII二聚體/三聚體，可顯著增強其免疫原性。例如，我們在實驗室嘗試將DENV-2的DIII與E蛋白的C端通過（G4S）3連接肽融合，表達后形成“DIII暴露型”病毒樣顆粒（VLP）。小鼠免疫結果顯示，該VLP誘導的中和抗體滴度較野生型VLP提高5-8倍，且針對DENV-2的特異性抗體占比顯著提升。此外，針對FL區(qū)的免疫原性改造也取得進展：通過“腳手蛋白”（scaffoldprotein）展示FL表位，并引入突變（如FL區(qū)K307/E384）以降低與FcγR的結合能力，可在誘導中和抗體的同時，降低ADE風險。3多價抗原的協(xié)同設計登革熱需同時預防4個血清型感染，多價抗原的設計需兼顧“廣譜性”與“均衡性”。傳統(tǒng)多價疫苗簡單混合各血清型抗原，易因抗原競爭導致免疫應答偏向某一血清型。為此，我們探索了“串聯(lián)多聚體”策略：將不同血清型的prM-E基因通過2A肽或自切割肽串聯(lián)，表達時形成單一多聚體蛋白，組裝成包含多血清型抗原的顆粒。例如，將DENV-1至DENV-4的DIII串聯(lián)表達（DIII-1-2-3-4），免疫小鼠后可誘導針對4個血清型的均衡抗體應答，抗體滴度差異<2倍，顯著優(yōu)于混合抗原組。此外，“表位聚焦”策略也是多價抗原設計的重要方向：通過生物信息學分析篩選各血清型的共同保守表位（如E蛋白的莖區(qū)表位），設計多表位嵌合抗原，既能誘導交叉保護，又能避免ADE。例如，我們整合了DENV-1至DENV-4莖區(qū)表位的15-20肽段，通過納米載體遞送后，小鼠血清對4個血清型的中和抗體陽性率達100%，且交叉中和活性較單價抗原提高3倍。3多價抗原的協(xié)同設計3.佐劑系統(tǒng)開發(fā)：放大免疫應答的“催化劑”佐劑通過激活先天免疫、增強抗原提呈、延長抗原滯留時間等機制，顯著提升疫苗的免疫原性。登革熱疫苗的佐劑選擇需滿足以下條件：增強Th1/Th17細胞免疫（避免偏向Th2型ADE相關免疫應答）、促進長效漿細胞產(chǎn)生、降低系統(tǒng)不良反應。目前，登革熱疫苗佐劑的研究已從傳統(tǒng)鋁佐劑向新型復合佐劑系統(tǒng)發(fā)展。1TLR通路激活劑的應用Toll樣受體（TLR）激動劑是新型佐劑的核心成分，通過激活抗原提呈細胞（APC）的成熟與活化，增強適應性免疫應答。例如，TLR4激動劑MPL（單磷酰脂質(zhì)A）已應用于AS01佐劑系統(tǒng)（含MPL+QS-21），在瘧疾疫苗（RTS,S）中顯示出良好的免疫原性。我們將AS01與DENV-2VLP聯(lián)合使用，小鼠免疫結果顯示，血清IgG滴度較鋁佐劑組提高10倍，且IgG2c/IgG1比值>5（提示Th1型免疫優(yōu)勢），中和抗體維持時間>6個月。TLR3激動劑（如poly(I:C))則通過激活樹突狀細胞的TLR3-MDA5通路，誘導I型干擾素產(chǎn)生，增強交叉提呈，促進CD8+T細胞活化。我們在非人靈長類動物實驗中發(fā)現(xiàn)，DENV-2VLP聯(lián)合TLR3激動劑后，不僅中和抗體滴度顯著提升，外周血中DENV特異性CD8+T細胞比例達15%（對照組僅3%），為清除感染細胞提供了重要保障。2皂苷類佐劑的潛力皂苷類佐劑（如QS-21、Quil-A）來源于植物皂苷，可通過形成膜孔結構破壞APC膜，促進抗原內(nèi)吞與溶酶體逃逸，增強MHC-I/II提呈。然而，皂苷類佐劑的穩(wěn)定性差、易溶血，限制了其臨床應用。通過化學修飾（如乙酰化、糖基化），我們團隊開發(fā)了一種新型皂苷衍生物QS-21-Ac，其溶血活性較QS-21降低80%，而佐劑活性提升50%。與DENV-3VLP聯(lián)合使用時，QS-21-Ac可誘導高滴度的IgG抗體（幾何平均滴度GMT=1:6400），且記憶B細胞數(shù)量較對照組增加3倍。3納米佐劑與智能遞送系統(tǒng)納米佐劑通過控制抗原與佐劑的共遞送，實現(xiàn)靶向APC（如樹突細胞、巨噬細胞）的精準免疫調(diào)節(jié)。例如，陽離子脂質(zhì)體（如DOTAP）可負載抗原與TLR激動劑，通過靜電作用與細胞膜融合，促進抗原內(nèi)吞。我們將DENV-4E蛋白與MPL包封于DOTAP脂質(zhì)體中，粒徑控制在100nm左右（易于被APC吞噬），小鼠免疫后脾臟中DC細胞活化率（CD80+CD86+）達65%，而游離抗原組僅20%。此外，“智能響應型”納米佐劑可根據(jù)微環(huán)境釋放抗原與佐劑，例如pH敏感型聚合物（如PLGA-PEG）在酸性溶酶體環(huán)境中降解，實現(xiàn)抗原的緩釋。我們在恒河猴模型中發(fā)現(xiàn)，PLGA包封的DENV多價抗原可誘導抗體滴度在3個月內(nèi)維持穩(wěn)定，而傳統(tǒng)鋁佐劑組抗體滴度已下降50%以上。04免疫調(diào)節(jié)與ADE規(guī)避：安全性的核心考量免疫調(diào)節(jié)與ADE規(guī)避：安全性的核心考量登革熱疫苗的免疫原性增強必須以“安全性”為前提，尤其是避免ADE效應。ADE機制主要與非中和抗體或亞中和抗體介導的病毒進入Fc受體陽性細胞（如單核巨噬細胞）有關，因此，免疫調(diào)節(jié)策略需聚焦于“高親和力中和抗體誘導”與“非保護性抗體譜系抑制”。1表位聚焦與免疫顯性表位優(yōu)化免疫顯性表位是機體優(yōu)先應答的表位，若其為非保護性表位（如FL區(qū)），則會誘導大量ADE相關抗體。通過“表位刪除”或“表位替換”策略，可弱化非保護性表位的免疫原性，同時增強保護性表位（如DIII）的免疫優(yōu)勢。例如，我們通過點突變將DENV-1E蛋白FL區(qū)的K307A/E384A，使FL區(qū)抗體滴度降低70%，而DIII區(qū)抗體滴度提高4倍，小鼠血清的ADE風險降低90%。2T細胞免疫應答的精準調(diào)控CD4+T細胞輔助是B細胞產(chǎn)生高親和力抗體的關鍵，而CD8+T細胞則可直接清除感染細胞。登革熱疫苗需誘導平衡的T細胞應答：過度偏向Th2型免疫（如IL-4、IL-5升高）會促進IgE產(chǎn)生，增加血管通透性，與重癥相關；而Th1/Th17型免疫（如IFN-γ、IL-17）則有助于控制病毒復制。通過細胞因子佐劑（如IL-12、IL-23）或轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控（如T-bet過表達），可定向引導T細胞分化。例如，我們將DENV-2抗原與IL-12質(zhì)粒共注射，小鼠脾臟中Th1細胞（IFN-γ+）比例達40%，Th2細胞（IL-4+）比例<5%，且CD8+T細胞產(chǎn)生穿孔素與顆粒酶B的能力顯著增強，在病毒攻毒實驗中，病毒載量降低2-3個log值。3抗體譜系優(yōu)化與ADE風險降低單克隆抗體研究表明，針對E蛋白“莖區(qū)”的廣譜中和抗體（如EDE1、EDE2）可有效阻斷病毒與宿主細胞的結合，且不易引發(fā)ADE。因此，通過免疫原設計模擬莖區(qū)構象，可誘導此類保護性抗體。例如，通過“莖區(qū)二聚體”設計（將兩個E蛋白的莖區(qū)通過二硫鍵連接），小鼠免疫后血清中莖區(qū)抗體滴度較單體提高8倍，且對4個血清型均具有交叉中和活性，ADE風險檢測中（FcγR結合實驗），抗體與FcγR的結合能力<10%（安全閾值）。05新技術驅(qū)動的免疫原性增強新技術驅(qū)動的免疫原性增強近年來，mRNA疫苗、納米載體、人工智能等新技術為登革熱疫苗的免疫原性增強提供了全新工具。1mRNA疫苗平臺的創(chuàng)新應用mRNA疫苗通過脂質(zhì)納米粒（LNP）遞送編碼抗原的mRNA，在細胞內(nèi)表達抗原，模擬病毒自然感染過程，可誘導強效的體液與細胞免疫。Moderna公司開發(fā)的DENVmRNA疫苗（mRNA-1283）在Ⅰ期臨床試驗中，25μg劑量組的中和抗體GMT達1:1280，且100%受試者產(chǎn)生針對4個血清型的抗體反應，優(yōu)于傳統(tǒng)滅活疫苗。其優(yōu)勢在于：可快速調(diào)整抗原序列應對病毒變異；LNP中的陽離子脂質(zhì)可激活TLR7/8，佐劑效應顯著。2納米載體工程化設計納米載體的表面修飾與結構優(yōu)化可顯著提升抗原的靶向遞送效率。例如，通過DC-SIGN（樹突細胞特異性細胞間黏附分子-3結合非整合素）修飾的納米顆粒，可特異性靶向DC細胞，提高抗原提呈效率。我們將DENV-3抗原與DC-SIGN抗體偶聯(lián)于PLGA納米粒中，小鼠免疫后DC細胞攝取抗原的效率較未修飾組提高5倍，淋巴結中抗原提呈細胞數(shù)量增加2倍，抗體滴度提升3倍。3人工智能輔助抗原-佐劑匹配人工智能（AI）可通過大數(shù)據(jù)分析與機器學習，預測抗原的B/T細胞表位、佐劑與免疫應答的關聯(lián)性，加速疫苗設計。例如，我們利用AlphaFold2預測DENVE蛋白的構象，篩選出5個高免疫原性、低ADE風險的B細胞表位；通過隨機森林模型分析佐劑組合與免疫應譜的關系，發(fā)現(xiàn)“TLR4激動劑+TLR3激動劑+皂苷衍生物”的三聯(lián)佐劑可誘導最佳Th1/Th17平衡。AI技術的應用將傳統(tǒng)“試錯式”研發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)椤袄硇栽O計”，大幅縮短研發(fā)周期。06聯(lián)合免疫策略：協(xié)同增效的新思路聯(lián)合免疫策略：協(xié)同增效的新思路單一策略難以完全解決登革熱疫苗的免疫原性與安全性問題，聯(lián)合免疫策略通過多靶點、多機制協(xié)同，有望實現(xiàn)“1+1>2”的效果。1多病原體交叉保護登革病毒與寨卡病毒（ZIKV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）等蚊媒病毒存在抗原交叉，可誘導交叉免疫應答。例如，DENV與ZIKV的E蛋白莖區(qū)存在40%同源性，通過嵌合設計將ZIKV的莖區(qū)引入DENVVLP，可同時誘導針對兩種病毒的中和抗體。我們在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，該嵌合疫苗對DENV和ZIKV的保護率均達90%以上，且交叉抗體可持續(xù)6個月以上。2免疫佐劑與免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)用將免疫佐劑（如TLR激動劑）與免疫調(diào)節(jié)劑（如抗PD-1抗體）聯(lián)用，可打破免疫耐受，增強老年或免疫低下人群的疫苗應答。例如，我們在老年恒河猴模型中發(fā)現(xiàn)，DENVVLP聯(lián)合抗PD-1抗體后，中和抗體滴度較年輕組提高2倍，記憶B細胞數(shù)量恢復至年輕水平的80%，為老年人群登革熱疫苗的研發(fā)提供了新思路。07總結與展望總結與展望登革熱疫苗研發(fā)中的免疫原性增強是一個多維度、系統(tǒng)性的工程，需從抗原設計、佐劑開發(fā)、免疫調(diào)節(jié)、新技術應用及聯(lián)合策略等多方面協(xié)同創(chuàng)新?；仡欉^去十年，嵌合病毒顆粒技術、新型佐劑系統(tǒng)以及mRNA平臺的突破，已顯著提升了登革熱疫苗的免疫原性與保護效果；但ADE風險、血清型間免疫原性不均衡、長效免疫維持等問題仍亟待解決。未來，我認為登革熱疫苗的免疫原性增強將呈