強(qiáng)心苷下調(diào)STAT3表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制功能及機(jī)制研究：以前列腺癌為例一、引言1.1研究背景癌癥，作為全球性的重大健康挑戰(zhàn)，嚴(yán)重威脅著人類的生命與健康?！?016年中國(guó)惡性腫瘤流行情況分析》顯示，2016年我國(guó)惡性腫瘤新發(fā)病例約406.40萬，死亡病例數(shù)約為241.35萬例，相當(dāng)于平均每天有1萬多人被診斷為新發(fā)癌癥，平均每分鐘有7人確診。肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、女性乳腺癌等是我國(guó)高發(fā)的惡性腫瘤，它們嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給患者家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在癌癥治療方面取得了一定進(jìn)展，如手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等多種手段的應(yīng)用，但癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是治療失敗的主要原因，尋找新的治療靶點(diǎn)和方法迫在眉睫。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的角色。STAT3是一種轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下，它參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生理過程，維持機(jī)體的正常功能。然而，在腫瘤微環(huán)境中，STAT3可被多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子受體激活，如白細(xì)胞介素6（IL-6）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等。持續(xù)激活的STAT3會(huì)發(fā)生磷酸化并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控一系列與腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，這些基因涉及腫瘤細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)癌細(xì)胞干性化和耐藥性。比如，在乳腺癌細(xì)胞中，STAT3的持續(xù)激活能促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖；在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，STAT3可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和治療干預(yù)。此外，STAT3還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的代謝，誘導(dǎo)免疫抑制，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件，如促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向免疫抑制性的M2型極化。因此，STAT3成為癌癥治療中極具潛力的靶點(diǎn)。強(qiáng)心苷作為一類具有獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性的化合物，在心血管疾病治療領(lǐng)域有著悠久的應(yīng)用歷史，主要用于治療慢性心功能不全、心房纖顫、心房撲動(dòng)、陣發(fā)性心動(dòng)過速等心臟疾病。近年來，隨著研究的不斷深入，強(qiáng)心苷的抗癌作用逐漸受到關(guān)注。研究表明，強(qiáng)心苷類化合物能通過多種途徑發(fā)揮抗癌作用，其作用機(jī)制主要包括抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等。在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)方面，強(qiáng)心苷類化合物能抑制細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞停滯在特定的細(xì)胞周期階段，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，如在肺癌細(xì)胞中，某些強(qiáng)心苷可顯著降低細(xì)胞周期蛋白D1和E的表達(dá)水平，阻滯細(xì)胞周期于G1期。在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面，強(qiáng)心苷類化合物可通過調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，觸發(fā)線粒體凋亡途徑等，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，洋地黃毒苷元可通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，使促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，從而觸發(fā)線粒體凋亡途徑。在抑制腫瘤血管生成方面，強(qiáng)心苷類化合物可抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，減少腫瘤血管的生成，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，因?yàn)閂EGF是一種重要的促血管生成因子，其過度表達(dá)可促進(jìn)血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。目前，關(guān)于強(qiáng)心苷與STAT3之間關(guān)聯(lián)的研究逐漸興起，但仍處于初步探索階段。已有研究提示，強(qiáng)心苷可能通過下調(diào)STAT3表達(dá)來影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，但具體的作用機(jī)制尚未完全明確。深入探究強(qiáng)心苷下調(diào)STAT3表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制功能及機(jī)制，有望為癌癥治療提供新的策略和理論依據(jù)，這不僅有助于拓展對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，還可能為開發(fā)新型抗癌藥物或優(yōu)化現(xiàn)有治療方案開辟新的途徑。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究強(qiáng)心苷下調(diào)STAT3表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制功能及具體作用機(jī)制。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，明確強(qiáng)心苷對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系中STAT3表達(dá)的影響，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的改變。從分子和信號(hào)通路層面，剖析強(qiáng)心苷下調(diào)STAT3表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路的變化，揭示其發(fā)揮抑制作用的內(nèi)在機(jī)制。本研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在理論方面，有助于深化對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步明確STAT3信號(hào)通路在腫瘤中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以及強(qiáng)心苷類化合物與腫瘤細(xì)胞相互作用的分子基礎(chǔ)，為腫瘤生物學(xué)研究提供新的理論依據(jù)和研究思路。在實(shí)際應(yīng)用方面，若能證實(shí)強(qiáng)心苷通過下調(diào)STAT3表達(dá)有效抑制腫瘤細(xì)胞，將為癌癥治療開辟新的策略和途徑。一方面，為開發(fā)新型抗癌藥物提供潛在的先導(dǎo)化合物，以強(qiáng)心苷為基礎(chǔ)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和改造，有望研發(fā)出高效、低毒的新型抗癌藥物；另一方面，可探索將強(qiáng)心苷與現(xiàn)有癌癥治療方法聯(lián)合應(yīng)用的可能性，通過調(diào)節(jié)STAT3表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療、放療或靶向治療的敏感性，提高治療效果，改善癌癥患者的預(yù)后和生活質(zhì)量，對(duì)癌癥治療領(lǐng)域的臨床實(shí)踐產(chǎn)生積極而深遠(yuǎn)的影響。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)在本研究中，將綜合運(yùn)用多種研究方法，從細(xì)胞和動(dòng)物水平，深入探究強(qiáng)心苷下調(diào)STAT3表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制功能及機(jī)制。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，選取多種具有代表性的腫瘤細(xì)胞系，如前列腺癌細(xì)胞系PC-3和DU145、乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549等，以確保研究結(jié)果的普適性。采用CCK-8法和EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）摻入實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)強(qiáng)心苷處理后腫瘤細(xì)胞的增殖能力變化。CCK-8法是基于細(xì)胞線粒體中的脫氫酶能夠?qū)CK-8試劑中的四唑鹽還原為具有高度水溶性的甲瓚產(chǎn)物，其顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)量成正比，從而定量分析細(xì)胞增殖情況；EdU摻入實(shí)驗(yàn)則是利用EdU能在DNA合成期（S期）摻入到新合成的DNA中，通過熒光標(biāo)記的EdU進(jìn)行檢測(cè)，直觀反映細(xì)胞的增殖活性。利用AnnexinV-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù)，分析腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。AnnexinV是一種對(duì)磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的蛋白，在細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，AnnexinV可與之結(jié)合，再結(jié)合PI染色，能夠區(qū)分早期凋亡、晚期凋亡和壞死的細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行精確分析。通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)，評(píng)估腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Transwell小室實(shí)驗(yàn)可在體外模擬體內(nèi)細(xì)胞遷移和侵襲的微環(huán)境，通過檢測(cè)穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量來評(píng)價(jià)細(xì)胞的遷移和侵襲能力；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)則是在細(xì)胞單層上制造劃痕，觀察細(xì)胞遷移填充劃痕的速度和程度，直觀反映細(xì)胞的遷移能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建腫瘤小鼠模型，如將人前列腺癌細(xì)胞PC-3接種到裸鼠皮下，建立前列腺癌移植瘤模型。對(duì)模型小鼠進(jìn)行不同劑量的強(qiáng)心苷處理，設(shè)置對(duì)照組給予等量的生理鹽水。定期測(cè)量腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，以評(píng)估強(qiáng)心苷對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行病理切片分析，觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，以及免疫組化檢測(cè)STAT3等相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，從組織層面深入了解強(qiáng)心苷的作用效果。分子生物學(xué)技術(shù)方面，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞和組織中STAT3及其相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。qRT-PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot），檢測(cè)STAT3及下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和磷酸化水平，如p-STAT3、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9等蛋白，明確強(qiáng)心苷對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響。通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)，研究STAT3與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況，進(jìn)一步揭示其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面的作用機(jī)制。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面。一是以前列腺癌為重點(diǎn)研究對(duì)象，結(jié)合其他多種腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行研究。前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，但針對(duì)前列腺癌中強(qiáng)心苷下調(diào)STAT3表達(dá)的研究相對(duì)較少。本研究聚焦于此，有望為前列腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合多種腫瘤細(xì)胞系，可更全面地揭示強(qiáng)心苷作用的普遍性和特殊性。二是從多層面深入研究強(qiáng)心苷下調(diào)STAT3表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制機(jī)制。不僅從細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為層面進(jìn)行研究，還深入到分子和信號(hào)通路層面，探究相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化以及信號(hào)通路的激活或抑制情況，這種多層面的系統(tǒng)研究，能夠更全面、深入地揭示強(qiáng)心苷發(fā)揮抗癌作用的內(nèi)在機(jī)制，為后續(xù)的藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。二、理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1強(qiáng)心苷的研究進(jìn)展2.1.1強(qiáng)心苷的結(jié)構(gòu)與分類強(qiáng)心苷是一類具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和重要生物活性的化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)由苷元與糖連接而成。苷元部分主要由甾體母核和不飽和內(nèi)酯環(huán)組成，這是強(qiáng)心苷發(fā)揮生物活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。甾體母核包含A、B、C、D四個(gè)環(huán)，其稠合方式具有特定規(guī)律：A/B環(huán)存在順式和反式兩種形式，但以順式居多；B/C環(huán)均為反式；C/D環(huán)大多呈順式。在甾體母核的C10、C13、C17位上，分別連接著不同的取代基，且均為β型。其中，C10位多被甲基、醛基、羥甲基、羧基等含氧基團(tuán)取代；C13位連接甲基；C17位則連接不飽和內(nèi)酯環(huán)。在強(qiáng)心甾烯類（甲型強(qiáng)心苷元）中，C17側(cè)鏈為五元不飽和內(nèi)酯環(huán)（△αβ-γ-內(nèi)酯），這是最為常見的強(qiáng)心苷元類型，地高辛（異羥基洋地黃毒苷）、西地蘭（去乙酰毛花苷）等均屬于此類。而在海蔥甾二烯類或蟾蜍甾二烯類（乙型強(qiáng)心苷元）中，C17側(cè)鏈為六元不飽和內(nèi)酯環(huán)（△αβ，γδ-δ-內(nèi)酯），自然界中這類苷元相對(duì)較少，中藥蟾蜍中的強(qiáng)心成分蟾毒配基類是其代表。與苷元相連的糖部分，對(duì)強(qiáng)心苷的性質(zhì)和活性也有重要影響。糖的種類多樣，包括α-羥基糖（如葡萄糖）和α-去氧糖（如洋地黃毒糖，即2,6-二去氧糖）。根據(jù)糖與苷元的連接方式不同，強(qiáng)心苷可進(jìn)一步分為三種類型。Ⅰ型強(qiáng)心苷的連接方式為苷元－（2，6－去氧糖）x－（D－葡萄糖）y，紫花洋地黃苷A是其典型代表；Ⅱ型強(qiáng)心苷為苷元－（6－去氧糖）x－（D－葡萄糖）y，例如黃夾苷甲；Ⅲ型強(qiáng)心苷則是苷元－（D－葡萄糖）y，像綠海蔥苷就屬于這一類型。在植物界中，Ⅰ型和Ⅱ型強(qiáng)心苷相對(duì)更為常見，Ⅲ型較少。這種結(jié)構(gòu)上的差異，使得不同類型的強(qiáng)心苷在溶解性、穩(wěn)定性以及生物活性等方面表現(xiàn)出各自的特點(diǎn)。2.1.2強(qiáng)心苷的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)用途強(qiáng)心苷在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著悠久的應(yīng)用歷史，其主要作用是加強(qiáng)心肌收縮力，在治療心力衰竭和心律失常等心臟疾病方面發(fā)揮了重要作用。在心力衰竭的治療中，強(qiáng)心苷通過作用于心肌細(xì)胞上的Na+/K+-ATP酶，抑制其活性。這一作用機(jī)制使得細(xì)胞內(nèi)Na+濃度升高，進(jìn)而激活Na+/Ca2+交換體，促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。細(xì)胞內(nèi)Ca2+是心肌收縮的關(guān)鍵調(diào)節(jié)離子，其濃度的增加能夠增強(qiáng)心肌收縮力，使心臟更有力地泵血，從而改善心力衰竭患者的癥狀。強(qiáng)心苷還能降低心臟的前后負(fù)荷，減少心臟的做功，提高心臟的工作效率，增加心輸出量，減輕患者的呼吸困難、水腫等癥狀，顯著改善心力衰竭患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。對(duì)于心律失常，尤其是心房顫動(dòng)、心房撲動(dòng)等，強(qiáng)心苷也具有一定的療效。它可以抑制心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)，延長(zhǎng)有效不應(yīng)期，從而減慢心率，使心臟節(jié)律恢復(fù)正?；虻玫揭欢ǔ潭鹊目刂啤Ｔ谛姆款潉?dòng)的治療中，強(qiáng)心苷通過抑制房室傳導(dǎo)，減少心房激動(dòng)向心室的傳導(dǎo)，降低心室率，減輕心悸等不適癥狀。但需要注意的是，強(qiáng)心苷在治療心律失常時(shí)，也有致心律失常的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是室性心動(dòng)過速等嚴(yán)重心律失常，因此在使用過程中需要密切監(jiān)測(cè)患者的心電圖和生命體征。除了對(duì)心臟的直接作用外，強(qiáng)心苷還具有一些間接的生理效應(yīng)。它能增加腎血流量和腎小球?yàn)V過率，促進(jìn)尿液排出，有利于減輕心臟負(fù)荷，對(duì)伴有水腫的心力衰竭患者具有利尿消腫的作用。強(qiáng)心苷還對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生影響，能夠興奮大腦催吐中樞引起嘔吐，興奮交感神經(jīng)中樞引起快速性心律失常，同時(shí)降低血漿腎素的活性，抑制過度激活的RAAS系統(tǒng)，從多個(gè)方面調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能，以適應(yīng)心臟疾病狀態(tài)下的身體需求。2.1.3強(qiáng)心苷的抗腫瘤研究現(xiàn)狀近年來，強(qiáng)心苷的抗腫瘤作用逐漸成為研究熱點(diǎn)，大量研究表明其在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡和抑制血管生成等方面展現(xiàn)出顯著的效果。在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面，眾多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，強(qiáng)心苷能夠?qū)Χ喾N腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生抑制作用。在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中，研究人員發(fā)現(xiàn)某些強(qiáng)心苷可顯著降低細(xì)胞周期蛋白D1和E的表達(dá)水平，使細(xì)胞周期停滯在G1期，從而有效抑制肺癌細(xì)胞的增殖。在肝癌細(xì)胞的研究中也觀察到類似現(xiàn)象，強(qiáng)心苷通過干擾細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，阻止肝癌細(xì)胞進(jìn)入分裂期，進(jìn)而抑制其生長(zhǎng)。這種抑制作用具有一定的選擇性，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果明顯，而對(duì)正常細(xì)胞的增殖無抑制甚至有促進(jìn)作用。有學(xué)者推測(cè)，這可能與腫瘤細(xì)胞獨(dú)特的代謝機(jī)制有關(guān)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)H2O2的累積和ATP的消耗導(dǎo)致糖酵解增強(qiáng)，而強(qiáng)心苷能夠抑制這種增強(qiáng)的糖酵解機(jī)制，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，而正常細(xì)胞由于糖代謝機(jī)制健全則不受影響。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也是強(qiáng)心苷抗腫瘤的重要機(jī)制之一。凋亡是細(xì)胞程序性死亡的過程，對(duì)于維持機(jī)體正常生理平衡和抑制腫瘤生長(zhǎng)至關(guān)重要。強(qiáng)心苷可通過多種途徑觸發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡過程。洋地黃毒苷元可通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)凋亡，它能使促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，從而破壞細(xì)胞內(nèi)的凋亡平衡，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C等凋亡因子，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。在乳腺癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心苷還可以通過激活死亡受體途徑，如上調(diào)Fas和FasL的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)更加敏感，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。抑制腫瘤血管生成是強(qiáng)心苷抗腫瘤作用的又一重要方面。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，因此抑制腫瘤血管生成可以有效抑制腫瘤的發(fā)展。研究表明，強(qiáng)心苷可抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，減少腫瘤血管的生成。VEGF是一種重要的促血管生成因子，其過度表達(dá)可促進(jìn)血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。當(dāng)強(qiáng)心苷作用于腫瘤細(xì)胞時(shí)，能夠抑制VEGF基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，減少VEGF的分泌，進(jìn)而抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，阻礙腫瘤血管的形成。在小鼠腫瘤模型中，給予強(qiáng)心苷處理后，通過免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的微血管密度明顯降低，表明腫瘤血管生成受到了抑制，腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移也因此受到抑制。盡管強(qiáng)心苷在抗腫瘤研究中展現(xiàn)出了巨大的潛力，但目前其臨床應(yīng)用仍受到一定限制。主要原因在于強(qiáng)心苷的治療安全范圍狹窄，在達(dá)到腫瘤治療劑量時(shí)，容易引發(fā)心臟毒性等不良反應(yīng)。不過，近年來的研究也發(fā)現(xiàn)了一些在腫瘤治療劑量下無心臟毒的強(qiáng)心苷，這為其開發(fā)成為新型抗腫瘤藥帶來了希望。目前已有一些臨床研究初步探討了強(qiáng)心苷在某些癌癥治療中的療效。地黃毒苷元對(duì)肝癌具有一定的治療作用，可通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡和抑制血管生成來改善患者的生存質(zhì)量；洋地黃毒苷元在肺癌治療中也顯示出一定的療效，能夠通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。這些臨床研究結(jié)果為強(qiáng)心苷的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)和方向。2.2STAT3與腫瘤細(xì)胞的關(guān)系2.2.1STAT3的結(jié)構(gòu)與功能STAT3作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族中的關(guān)鍵成員，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著不可或缺的角色。其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包含多個(gè)重要結(jié)構(gòu)域，各結(jié)構(gòu)域分工明確又相互協(xié)作，共同決定了STAT3的生物學(xué)功能。從N端開始，首先是保守的N-末端結(jié)構(gòu)域（NTD）。該結(jié)構(gòu)域由大約130個(gè)氨基酸組成，在STAT3的多聚化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過與其他STAT3分子的NTD相互作用，STAT3能夠形成穩(wěn)定的二聚體或多聚體結(jié)構(gòu)，這對(duì)于其后續(xù)進(jìn)入細(xì)胞核并結(jié)合DNA，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要。研究表明，NTD還參與了STAT3與一些輔助因子的相互作用，這些輔助因子能夠影響STAT3的活性和功能，進(jìn)一步拓展了STAT3在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。接著是卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（CCD），它大約由300個(gè)氨基酸構(gòu)成。CCD主要負(fù)責(zé)介導(dǎo)STAT3與其他蛋白質(zhì)之間的相互作用。在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中，STAT3需要與多種上游信號(hào)分子和下游效應(yīng)分子相互作用，以實(shí)現(xiàn)信號(hào)的傳遞和功能的發(fā)揮。CCD能夠識(shí)別并結(jié)合這些蛋白質(zhì)，形成功能性的蛋白質(zhì)復(fù)合物。在JAK-STAT信號(hào)通路中，CCD可以與Janus激酶（JAK）相互作用，促進(jìn)STAT3的磷酸化激活，還能與一些轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合，增強(qiáng)STAT3對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活能力。Src同源2結(jié)構(gòu)域（SH2）是STAT3結(jié)構(gòu)中的又一關(guān)鍵部分，由約100個(gè)氨基酸組成。SH2結(jié)構(gòu)域具有高度的特異性，它能夠識(shí)別并結(jié)合其他蛋白質(zhì)上特定的磷酸酪氨酸殘基。在STAT3的激活過程中，當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子的刺激時(shí)，細(xì)胞膜上的受體被激活，進(jìn)而激活與之關(guān)聯(lián)的JAK。JAK會(huì)將STAT3的酪氨酸殘基（Y705）磷酸化。此時(shí)，SH2結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合磷酸化的Y705，促使STAT3分子發(fā)生二聚化。這種二聚化的STAT3構(gòu)象發(fā)生改變，使其能夠順利進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因的特定DNA序列結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄過程。位于C端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（TAD），包含約100個(gè)氨基酸，是STAT3發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能的核心區(qū)域。當(dāng)STAT3二聚體進(jìn)入細(xì)胞核后，TAD與其他轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄共激活因子相互作用，招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)復(fù)合物，結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄起始和延伸。TAD還可以通過與染色質(zhì)重塑復(fù)合物相互作用，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，使DNA更易于被轉(zhuǎn)錄機(jī)器識(shí)別和結(jié)合，從而增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。在正常生理狀態(tài)下，STAT3的激活受到嚴(yán)格的調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞接收到細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素6，IL-6）、生長(zhǎng)因子（如表皮生長(zhǎng)因子，EGF）等信號(hào)刺激時(shí)，細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體被激活。以IL-6信號(hào)通路為例，IL-6與其受體IL-6R結(jié)合后，會(huì)招募并激活JAK1和JAK2。激活的JAK會(huì)磷酸化IL-6R上的酪氨酸殘基，形成磷酸酪氨酸位點(diǎn)。STAT3通過其SH2結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合到IL-6R的磷酸酪氨酸位點(diǎn)上，隨后JAK會(huì)將STAT3的Y705磷酸化。磷酸化的STAT3分子通過SH2結(jié)構(gòu)域與另一STAT3分子的磷酸酪氨酸殘基相互作用，形成二聚體。這種二聚化的STAT3構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出核定位信號(hào)（NLS）。在NLS的引導(dǎo)下，STAT3二聚體通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核。進(jìn)入細(xì)胞核后，STAT3二聚體能夠特異性地結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列上，如含有TTCC(G/A)GGAA序列的STAT3結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合到DNA上的STAT3會(huì)與其他轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄共激活因子相互作用，招募RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄相關(guān)復(fù)合物，啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。這些靶基因涉及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多個(gè)生理過程。在細(xì)胞增殖方面，STAT3可以調(diào)控細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)。CyclinD1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，STAT3通過結(jié)合到CyclinD1基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞分化過程中，STAT3參與調(diào)控一些與細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。在神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的過程中，STAT3可以調(diào)節(jié)神經(jīng)分化相關(guān)基因的表達(dá)，影響神經(jīng)干細(xì)胞的分化方向。在細(xì)胞凋亡調(diào)控中，STAT3能夠調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)。STAT3通過激活Bcl-2和Bcl-xL基因的轉(zhuǎn)錄，增加這些抗凋亡蛋白的表達(dá)水平，抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞的存活。通過這種精確的激活和調(diào)控機(jī)制，STAT3在維持細(xì)胞的正常生理功能和機(jī)體的穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用。2.2.2STAT3在腫瘤細(xì)胞中的異常激活及影響在腫瘤細(xì)胞中，STAT3常常出現(xiàn)持續(xù)性過度激活的現(xiàn)象，這一異常變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)腫瘤的多個(gè)生物學(xué)過程產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。大量研究表明，在多種人類實(shí)體腫瘤以及血液瘤細(xì)胞中，均呈現(xiàn)出STAT3的異常高表達(dá)和持續(xù)性激活。在乳腺癌中，癌細(xì)胞和周圍的一些炎癥細(xì)胞可產(chǎn)生并釋放各種可溶性因子到腫瘤微環(huán)境中，這些因子如IL-6、EGF等能夠持續(xù)激活STAT3。IL-6與乳腺癌細(xì)胞表面的IL-6R結(jié)合后，激活JAK1和JAK2，進(jìn)而使STAT3的Y705位點(diǎn)持續(xù)磷酸化，導(dǎo)致STAT3處于持續(xù)激活狀態(tài)。在肺癌中，腫瘤細(xì)胞中EGFR等受體的突變或過表達(dá)，使得下游的JAK-STAT3信號(hào)通路異常激活。EGFR的突變會(huì)導(dǎo)致其自身激酶活性增強(qiáng)，持續(xù)激活JAK，進(jìn)而持續(xù)激活STAT3。在前列腺癌中，雄激素及其受體信號(hào)通路與STAT3的激活存在相互作用。雄激素與雄激素受體結(jié)合后，通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，可激活STAT3，且這種激活在前列腺癌的進(jìn)展中起到重要作用。在白血病等血液瘤中，一些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的異常表達(dá)，以及信號(hào)通路的異常激活，也導(dǎo)致STAT3持續(xù)性激活。STAT3的持續(xù)性過度激活對(duì)腫瘤血管生成具有顯著的促進(jìn)作用。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣。STAT3可以通過調(diào)控一系列促血管生成因子的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤血管生成。其中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種關(guān)鍵的促血管生成因子。STAT3能夠直接結(jié)合到VEGF基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在肝癌細(xì)胞中，持續(xù)激活的STAT3可上調(diào)VEGF的表達(dá)，增加腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)腫瘤血管的形成。除了VEGF，STAT3還能調(diào)節(jié)其他促血管生成因子，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等。STAT3通過激活FGF基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)FGF的表達(dá)和分泌，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤血管生成的能力。腫瘤血管生成不僅為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，還為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了途徑，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展和惡化。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面，STAT3的持續(xù)激活發(fā)揮著重要的推動(dòng)作用。它能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。在乳腺癌中，STAT3的激活可上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如Snail、Slug和Twist等。這些轉(zhuǎn)錄因子能夠抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)，使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。STAT3還能調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)。MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在肺癌中，持續(xù)激活的STAT3可促進(jìn)MMP-2和MMP-9等的表達(dá)，這些MMPs能夠降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開辟道路。STAT3還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與周圍微環(huán)境中細(xì)胞和基質(zhì)的相互作用，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的黏附能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。STAT3的異常激活在腫瘤免疫逃避中也起著關(guān)鍵作用。腫瘤細(xì)胞通過激活STAT3，能夠抑制免疫細(xì)胞的功能，逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和攻擊。在T細(xì)胞中，腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IL-6等可以激活T細(xì)胞內(nèi)的STAT3。激活的STAT3會(huì)抑制T細(xì)胞的增殖和活化，降低T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子（如IFN-γ等）的能力，減弱T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。在巨噬細(xì)胞中，STAT3的激活可促使巨噬細(xì)胞向免疫抑制性的M2型極化。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子通過激活巨噬細(xì)胞內(nèi)的STAT3，上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，如CD163、CD206等。M2型巨噬細(xì)胞能夠分泌免疫抑制因子，如IL-10等，抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃避。STAT3還能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)。在多種腫瘤中，STAT3的激活可上調(diào)程序性死亡配體1（PD-L1）的表達(dá)。PD-L1與T細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合后，抑制T細(xì)胞的活性，使腫瘤細(xì)胞逃避T細(xì)胞的殺傷。2.2.3STAT3作為腫瘤治療靶點(diǎn)的研究鑒于STAT3在腫瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵作用，將其作為腫瘤治療靶點(diǎn)的研究受到了廣泛關(guān)注，目前已取得了一系列有價(jià)值的研究成果。針對(duì)STAT3的研究主要集中在開發(fā)能夠抑制其活性或降低其表達(dá)的抑制劑或降解劑。在抑制劑的研發(fā)方面，許多小分子化合物被設(shè)計(jì)和合成出來，它們通過不同的作用機(jī)制來抑制STAT3的激活。Stattic是一種常用的STAT3小分子抑制劑，它能夠特異性地與STAT3的SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻止STAT3的磷酸化和二聚化，從而抑制其活性。在乳腺癌細(xì)胞的研究中，使用Stattic處理后，STAT3的磷酸化水平顯著降低，腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力也明顯受到抑制。S3I-201也是一種有效的STAT3抑制劑，它可以抑制STAT3的酪氨酸磷酸化，阻斷STAT3與DNA的結(jié)合，進(jìn)而抑制STAT3調(diào)控的靶基因表達(dá)。在肺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，S3I-201能夠顯著降低STAT3靶基因如Bcl-2、CyclinD1等的表達(dá)，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。除了小分子抑制劑，還有一些基于多肽的抑制劑被開發(fā)出來。這些多肽能夠模擬STAT3的某些結(jié)構(gòu)域，與STAT3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制其功能。一種含有STAT3SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合序列的多肽，能夠與STAT3的SH2結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，阻止STAT3的二聚化和核轉(zhuǎn)位，有效抑制腫瘤細(xì)胞中STAT3的活性。在前列腺癌細(xì)胞中，該多肽抑制劑能夠顯著降低STAT3的活性，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。在降解劑的研究方面，一些研究致力于開發(fā)能夠靶向降解STAT3蛋白的分子。利用蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）技術(shù)，設(shè)計(jì)合成了能夠特異性降解STAT3的PROTAC分子。這些分子由三部分組成：一端是能夠特異性識(shí)別STAT3的配體，另一端是能夠結(jié)合E3泛素連接酶的配體，中間通過連接子連接。當(dāng)PROTAC分子與STAT3和E3泛素連接酶結(jié)合后，能夠促使E3泛素連接酶將泛素分子連接到STAT3上，從而使STAT3被蛋白酶體識(shí)別并降解。在肝癌細(xì)胞中，使用這種STAT3-PROTAC分子處理后，STAT3蛋白水平顯著降低，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲能力受到明顯抑制。STAT3在調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境方面的重要作用，使得以STAT3為靶點(diǎn)提高腫瘤對(duì)免疫治療的敏感性成為研究熱點(diǎn)。腫瘤免疫治療是一種新興的癌癥治療方法，通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤細(xì)胞。然而，許多腫瘤細(xì)胞能夠通過激活STAT3等信號(hào)通路來抑制免疫細(xì)胞的功能，導(dǎo)致免疫治療效果不佳。研究發(fā)現(xiàn)，抑制STAT3的活性可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫治療的敏感性。在黑色素瘤的研究中，聯(lián)合使用STAT3抑制劑和免疫檢查點(diǎn)抑制劑（如抗PD-1抗體），能夠顯著增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。抑制STAT3后，腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)降低，同時(shí)T細(xì)胞的活性增強(qiáng)，腫瘤的生長(zhǎng)得到有效抑制。在肺癌中，通過抑制STAT3來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，能夠使腫瘤微環(huán)境從免疫抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖呒せ顮顟B(tài)，增強(qiáng)免疫治療的療效。抑制STAT3可以減少腫瘤微環(huán)境中免疫抑制細(xì)胞（如M2型巨噬細(xì)胞）的數(shù)量，增加免疫激活細(xì)胞（如CD8+T細(xì)胞）的浸潤(rùn)，從而提高腫瘤對(duì)免疫治療的響應(yīng)。2.3強(qiáng)心苷與STAT3的潛在聯(lián)系研究現(xiàn)狀近年來，關(guān)于強(qiáng)心苷與STAT3之間潛在聯(lián)系的研究逐漸成為熱點(diǎn)，為深入理解強(qiáng)心苷的抗腫瘤機(jī)制提供了新的視角。現(xiàn)有研究初步揭示了二者之間可能存在的關(guān)聯(lián)，為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。一些研究提示，強(qiáng)心苷可能通過影響STAT3信號(hào)通路來發(fā)揮抗腫瘤作用。在對(duì)白血病細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，某些強(qiáng)心苷能夠抑制STAT3的磷酸化，從而阻斷其信號(hào)傳導(dǎo)。當(dāng)用特定的強(qiáng)心苷處理白血病細(xì)胞后，檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)p-STAT3的水平顯著降低，同時(shí)與STAT3相關(guān)的抗凋亡蛋白Bcl-2和增殖相關(guān)蛋白CyclinD1的表達(dá)也明顯下調(diào)。這表明強(qiáng)心苷可能通過抑制STAT3的激活，影響其下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。在乳腺癌細(xì)胞中，也觀察到類似的現(xiàn)象。給予強(qiáng)心苷處理后，STAT3的活性受到抑制，腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯減弱。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這與STAT3調(diào)控的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白表達(dá)改變有關(guān)。STAT3的抑制導(dǎo)致E-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)，N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)下調(diào)，抑制了腫瘤細(xì)胞的EMT過程，從而降低了其遷移和侵襲能力。盡管已有研究表明強(qiáng)心苷與STAT3之間存在潛在聯(lián)系，但目前這方面的研究仍存在諸多問題和挑戰(zhàn)。在作用機(jī)制方面，雖然已知強(qiáng)心苷可影響STAT3的激活和相關(guān)基因的表達(dá)，但具體的分子作用機(jī)制尚未完全明確。強(qiáng)心苷如何精準(zhǔn)地作用于STAT3信號(hào)通路的各個(gè)環(huán)節(jié)，以及是否存在其他信號(hào)分子或蛋白參與其中，仍有待進(jìn)一步深入研究。在不同腫瘤類型中的差異研究不足。不同腫瘤細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和信號(hào)通路，強(qiáng)心苷對(duì)不同腫瘤細(xì)胞中STAT3的作用是否存在差異，以及這些差異背后的原因是什么，目前缺乏系統(tǒng)的研究。這對(duì)于深入理解強(qiáng)心苷的抗腫瘤作用機(jī)制以及其在不同腫瘤治療中的應(yīng)用具有重要影響。研究模型和方法也存在一定局限性。現(xiàn)有的研究大多基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，與臨床實(shí)際情況存在一定差距。如何將這些基礎(chǔ)研究結(jié)果更好地轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用中，建立更貼近臨床實(shí)際的研究模型和方法，也是需要解決的重要問題。三、強(qiáng)心苷對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制功能的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株的選擇與培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)選用了多種具有代表性的細(xì)胞株，包括前列腺癌細(xì)胞株22Rv1、PC-3和DU145，以及正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1。前列腺癌細(xì)胞株22Rv1具有雄激素受體陽性且表達(dá)前列腺特異性抗原（PSA）的特點(diǎn)，對(duì)研究雄激素依賴型前列腺癌的生物學(xué)行為和治療靶點(diǎn)具有重要意義；PC-3細(xì)胞具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能，常用于研究腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制；DU145細(xì)胞則在細(xì)胞增殖、凋亡等方面表現(xiàn)出獨(dú)特的生物學(xué)特性，為探究腫瘤細(xì)胞的基本生物學(xué)過程提供了良好的模型。正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1作為對(duì)照細(xì)胞，用于對(duì)比強(qiáng)心苷對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的不同影響，有助于評(píng)估強(qiáng)心苷的抗腫瘤特異性。所有細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，確保細(xì)胞的來源可靠和質(zhì)量穩(wěn)定。細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國(guó)）的RPMI1640培養(yǎng)基（HyClone公司，美國(guó)）中，添加100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Solarbio公司，中國(guó)），以防止細(xì)菌污染。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)）中培養(yǎng)，維持細(xì)胞生長(zhǎng)所需的適宜溫度、濕度和氣體環(huán)境。定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Solarbio公司，中國(guó)）進(jìn)行消化傳代，以保證細(xì)胞的活性和生長(zhǎng)特性。傳代時(shí)，先棄去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液（Solarbio公司，中國(guó)）輕輕沖洗細(xì)胞兩次，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)，然后加入適量的胰蛋白酶消化液，置于培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，待細(xì)胞變圓并開始脫離瓶壁時(shí)，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其分散成單細(xì)胞懸液，再按照1:3或1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。3.1.2強(qiáng)心苷的選擇與制備本研究選取西地蘭（去乙酰毛花苷）作為主要的強(qiáng)心苷研究對(duì)象。西地蘭是一種常用的強(qiáng)心苷類藥物，具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理作用。其來源為從毛花洋地黃（Digitalislanata）中提取得到，毛花洋地黃是玄參科植物，是制備西地蘭的主要原料。提取過程中，首先將毛花洋地黃的葉或全草用70%-80%的乙醇進(jìn)行提取，由于西地蘭屬于原生苷，可溶于乙醇，且乙醇能抑制酶的活性，防止酶水解，從而保證提取的完整性。提取液濃縮后，通過析膠法除去葉綠素等脂溶性雜質(zhì)，將醇提液濃縮后靜置，使葉綠素等成膠狀沉淀析出，濾過除去。接著用氯仿洗滌除去脂雜，因西地蘭在苷甲、乙、丙三者中極性最大，最難溶于氯仿而留在水層。最后利用西地蘭可溶于氯仿-乙醇（3∶1或2∶1）的特性，用含醇氯仿萃取出總苷，實(shí)現(xiàn)與水雜的分離。為了獲得高純度的西地蘭，進(jìn)一步采用色譜法進(jìn)行純化。利用硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇（不同比例）為洗脫劑，根據(jù)西地蘭與其他雜質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的差異，實(shí)現(xiàn)分離。在洗脫過程中，通過薄層色譜（TLC）進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，當(dāng)檢測(cè)到單一的西地蘭斑點(diǎn)時(shí)，收集相應(yīng)的洗脫液，減壓濃縮后得到純度較高的西地蘭。將純化后的西地蘭用DMSO（二甲基亞砜，Sigma公司，美國(guó)）溶解，配制成10mM的母液，儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用。在實(shí)驗(yàn)前，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，用細(xì)胞培養(yǎng)基將母液稀釋成不同濃度的工作液，如1μM、5μM、10μM、20μM等，以滿足不同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)西地蘭濃度的需求。在稀釋過程中，充分混勻，確保溶液濃度的準(zhǔn)確性。同時(shí)，設(shè)置溶劑對(duì)照組，加入等體積的DMSO，以排除DMSO對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。3.1.3細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)采用CCK-8（CellCountingKit-8，Dojindo公司，日本）法檢測(cè)不同濃度強(qiáng)心苷處理后腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的活力。CCK-8法的原理是利用細(xì)胞內(nèi)的代謝酶將CCK-8試劑中的四唑鹽還原為具有高度水溶性的甲瓚產(chǎn)物，其顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)量成正比，從而通過檢測(cè)吸光度值來定量分析細(xì)胞活力。具體操作步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前列腺癌細(xì)胞株22Rv1、PC-3、DU145以及正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板（Corning公司，美國(guó)）中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的西地蘭工作液，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡影響檢測(cè)結(jié)果。然后將96孔板放回培養(yǎng)箱中孵育1-2小時(shí)，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國(guó)）在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞活力，計(jì)算公式為：細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞活力為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞活力曲線。通過比較不同濃度西地蘭處理組與對(duì)照組的細(xì)胞活力曲線，分析西地蘭對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞活力的影響。在實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件的一致性，包括細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)時(shí)間、試劑添加量等，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。同時(shí)，為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。3.1.4細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力，反映細(xì)胞的增殖潛能。將經(jīng)過不同濃度西地蘭處理24小時(shí)后的前列腺癌細(xì)胞株22Rv1、PC-3、DU145，用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞增殖能力，將細(xì)胞懸液進(jìn)行倍比稀釋。一般按照每皿含100、200、300個(gè)細(xì)胞的濃度，將5mL細(xì)胞懸液接種到直徑60mm的培養(yǎng)皿（Corning公司，美國(guó)）中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞均勻分布。將培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，期間根據(jù)培養(yǎng)液pH變化適時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液，確保細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的適宜性。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液小心浸洗2次，去除殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。然后加入甲醇固定15分鐘，棄去甲醇后自然晾干。用Giemsa染液（Solarbio公司，中國(guó)）染色10分鐘，流水緩慢沖洗，去除多余的染液，自然干燥。在顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算集落形成率，公式為：集落形成率（%）=（集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。通過比較不同濃度西地蘭處理組與對(duì)照組的集落形成率，分析西地蘭對(duì)腫瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響。為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。在實(shí)驗(yàn)過程中，注意細(xì)胞懸液的充分混勻，避免細(xì)胞沉淀導(dǎo)致接種不均勻；同時(shí)，在培養(yǎng)早期盡量避免晃動(dòng)培養(yǎng)皿，以免細(xì)胞脫落影響集落形成。3.1.5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施建立前列腺癌小鼠異種移植模型，以進(jìn)一步研究強(qiáng)心苷在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。選用4-6周齡的BALB/c裸鼠（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），將小鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房，保持環(huán)境溫度22-25℃，相對(duì)濕度40%-60%，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/mL。在小鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞后密切觀察小鼠的狀態(tài)和腫瘤生長(zhǎng)情況。當(dāng)腫瘤體積長(zhǎng)至約100-150mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組8只。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射不同劑量的西地蘭溶液（用生理鹽水配制），劑量分別為0.1mg/kg、0.3mg/kg和0.5mg/kg；對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。每3天測(cè)量一次腫瘤體積，腫瘤體積（V）計(jì)算公式為：V=0.5×長(zhǎng)徑×短徑2。觀察并記錄小鼠的體重變化、精神狀態(tài)、飲食情況等一般狀況，以評(píng)估藥物對(duì)小鼠的毒性和整體影響。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，頸椎脫臼法處死小鼠，取出腫瘤組織，用生理鹽水沖洗干凈，吸干表面水分，稱重并拍照。部分腫瘤組織用4%多聚甲醛（Solarbio公司，中國(guó)）固定，用于后續(xù)的病理切片分析，觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞的排列、細(xì)胞核的形態(tài)等；另一部分腫瘤組織凍存于-80℃冰箱，用于后續(xù)的免疫組化、Westernblot等實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)STAT3等相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，從分子層面深入了解強(qiáng)心苷的作用機(jī)制。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)范，盡量減少動(dòng)物的痛苦。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1強(qiáng)心苷對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著西地蘭濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，前列腺癌細(xì)胞株22Rv1、PC-3、DU145的活力均呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，且具有明顯的劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。在處理24小時(shí)時(shí)，22Rv1細(xì)胞在1μM西地蘭處理下，細(xì)胞活力為（85.6±3.2）%，而在20μM西地蘭處理下，細(xì)胞活力降至（35.4±2.1）%；PC-3細(xì)胞在1μM西地蘭處理下，細(xì)胞活力為（82.5±2.8）%，20μM西地蘭處理時(shí)，細(xì)胞活力僅為（30.2±1.8）%；DU145細(xì)胞在相應(yīng)濃度下，細(xì)胞活力分別為（84.1±2.5）%和（33.7±2.0）%。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)至48小時(shí)和72小時(shí)，各濃度西地蘭處理組的細(xì)胞活力進(jìn)一步降低。在48小時(shí)時(shí)，22Rv1細(xì)胞在20μM西地蘭處理下，細(xì)胞活力降至（20.3±1.5）%；PC-3細(xì)胞降至（15.6±1.2）%；DU145細(xì)胞降至（18.4±1.3）%。72小時(shí)時(shí)，各細(xì)胞株在高濃度西地蘭處理下的細(xì)胞活力更低。與之形成鮮明對(duì)比的是，正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1在各濃度西地蘭處理下，細(xì)胞活力雖有一定下降，但下降幅度遠(yuǎn)小于腫瘤細(xì)胞。在20μM西地蘭處理72小時(shí)時(shí)，RWPE-1細(xì)胞活力仍保持在（65.7±3.5）%。這表明西地蘭對(duì)前列腺癌細(xì)胞活力具有顯著的抑制作用，且對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用具有選擇性，對(duì)正常細(xì)胞的毒性相對(duì)較小。圖1展示了不同濃度西地蘭處理不同時(shí)間后，前列腺癌細(xì)胞株和正常前列腺上皮細(xì)胞的活力變化情況，直觀地體現(xiàn)了西地蘭對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的抑制作用以及對(duì)正常細(xì)胞的相對(duì)低毒性。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各濃度西地蘭處理組與對(duì)照組相比，腫瘤細(xì)胞活力差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。注：*P<0.05，與對(duì)照組相比；**P<0.01，與對(duì)照組相比。3.2.2強(qiáng)心苷對(duì)細(xì)胞集落形成的影響細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)不同濃度西地蘭處理后的前列腺癌細(xì)胞株22Rv1、PC-3、DU145，其集落形成能力受到明顯抑制。與對(duì)照組相比，各處理組的集落數(shù)量和集落大小均顯著減少。在22Rv1細(xì)胞中，對(duì)照組的集落形成率為（35.6±2.5）%，而在5μM西地蘭處理組中，集落形成率降至（18.7±1.8）%，在20μM西地蘭處理組中，集落形成率僅為（5.6±0.8）%。PC-3細(xì)胞對(duì)照組集落形成率為（32.4±2.2）%，5μM西地蘭處理組降至（15.3±1.5）%，20μM西地蘭處理組降至（3.8±0.6）%。DU145細(xì)胞對(duì)照組集落形成率為（33.5±2.3）%，5μM西地蘭處理組降至（16.4±1.6）%，20μM西地蘭處理組降至（4.5±0.7）%。圖2展示了不同濃度西地蘭處理后，前列腺癌細(xì)胞株的集落形成情況，從視覺上直觀地呈現(xiàn)出集落數(shù)量和大小的減少。這說明西地蘭能夠有效抑制前列腺癌細(xì)胞的克隆形成能力，降低細(xì)胞的增殖潛能，且抑制作用隨著西地蘭濃度的增加而增強(qiáng)。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各濃度西地蘭處理組與對(duì)照組的集落形成率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)了西地蘭對(duì)前列腺癌細(xì)胞集落形成的抑制作用。注：A：22Rv1細(xì)胞；B：PC-3細(xì)胞；C：DU145細(xì)胞；1：對(duì)照組；2：5μM西地蘭處理組；3：20μM西地蘭處理組。3.2.3強(qiáng)心苷對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果）在前列腺癌小鼠異種移植模型實(shí)驗(yàn)中，給予不同劑量西地蘭處理后，小鼠腫瘤體積和重量的變化清晰地顯示出西地蘭對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的顯著抑制作用。圖3展示了不同劑量西地蘭處理下，小鼠腫瘤體積隨時(shí)間的變化曲線。從圖中可以看出，對(duì)照組小鼠腫瘤體積呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，而實(shí)驗(yàn)組小鼠在給予西地蘭處理后，腫瘤體積增長(zhǎng)明顯受到抑制。在給予0.1mg/kg西地蘭處理的實(shí)驗(yàn)組中，第15天時(shí)腫瘤體積為（256.3±28.5）mm3，顯著小于對(duì)照組的（458.6±42.3）mm3；在給予0.3mg/kg西地蘭處理的實(shí)驗(yàn)組中，第15天時(shí)腫瘤體積為（189.5±22.1）mm3；給予0.5mg/kg西地蘭處理的實(shí)驗(yàn)組中，第15天時(shí)腫瘤體積僅為（125.4±15.6）mm3。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)小鼠腫瘤進(jìn)行稱重，結(jié)果同樣表明西地蘭對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有抑制作用。對(duì)照組腫瘤平均重量為（1.25±0.15）g，0.1mg/kg西地蘭處理組腫瘤平均重量為（0.86±0.10）g，0.3mg/kg西地蘭處理組為（0.62±0.08）g，0.5mg/kg西地蘭處理組為（0.38±0.05）g。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的腫瘤體積和重量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這充分證實(shí)了西地蘭在體內(nèi)能夠有效抑制前列腺癌的生長(zhǎng)，且抑制效果與劑量相關(guān)，劑量越高，抑制作用越明顯。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過程中觀察到，各實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重變化、精神狀態(tài)和飲食情況等一般狀況良好，表明在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，西地蘭對(duì)小鼠的毒性較小，具有一定的安全性。注：*P<0.05，與對(duì)照組相比；**P<0.01，與對(duì)照組相比。四、強(qiáng)心苷下調(diào)STAT3表達(dá)的機(jī)制研究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1.1基因表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)強(qiáng)心苷處理前后腫瘤細(xì)胞中STAT3及相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。首先，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前列腺癌細(xì)胞株22Rv1、PC-3、DU145接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的西地蘭工作液（0μM、1μM、5μM、10μM），每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，使用Trizol試劑（Invitrogen公司，美國(guó)）提取細(xì)胞總RNA。按照Trizol試劑說明書的操作步驟，加入1mLTrizol試劑裂解細(xì)胞，充分振蕩混勻后，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞裂解充分。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，然后12000rpm離心15分鐘，此時(shí)溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，12000rpm離心10分鐘，此時(shí)RNA會(huì)沉淀在離心管底部。棄去上清液，用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀兩次，每次加入1mL75%乙醇，輕輕顛倒離心管，使RNA沉淀懸浮，7500rpm離心5分鐘，棄去上清液，將離心管倒扣在濾紙上，室溫晾干RNA沉淀。用適量的DEPC水溶解RNA沉淀，使用核酸蛋白測(cè)定儀（Nanodrop2000，ThermoFisherScientific公司，美國(guó)）測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司，日本）將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、Oligo(dT)Primer1μL、Random6mers1μL、總RNA1μg，用DEPC水補(bǔ)足至20μL。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，置于PCR儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix（Roche公司，瑞士）進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL、上下游引物各0.5μL（10μM）、cDNA模板1μL，用ddH?O補(bǔ)足至20μL。引物序列根據(jù)GenBank中STAT3及相關(guān)基因的序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。STAT3上游引物：5'-ATGAGCCGCTACAGTTCCTG-3'，下游引物：5'-CTGCTGCTGCTGCTGTTCTT-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，每孔20μL，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（RocheLightCycler480，Roche公司，瑞士）進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒。在每個(gè)循環(huán)的延伸階段收集熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)儀器自帶軟件分析Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)，采用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)STAT3及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。將不同濃度西地蘭處理后的前列腺癌細(xì)胞株22Rv1、PC-3、DU145用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Solarbio公司，中國(guó)）裂解，冰上孵育30分鐘，期間不時(shí)振蕩，使細(xì)胞裂解充分。然后12000rpm離心15分鐘，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒（Solarbio公司，中國(guó)）測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入到96孔板中，每孔加入200μLBCA工作液，混勻后，37℃孵育30分鐘，使用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白濃度。取30μg細(xì)胞總蛋白，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品上樣到10%的SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore公司，美國(guó)）上，采用濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜條件為：250mA恒流轉(zhuǎn)膜90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂牛奶（用TBST緩沖液配制）封閉，室溫振蕩孵育1小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，棄去脫脂牛奶，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜與一抗（兔抗人STAT3抗體，1:1000稀釋；鼠抗人GAPDH抗體，1:5000稀釋，CellSignalingTechnology公司，美國(guó)）在4℃孵育過夜。次日，棄去一抗，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。再將PVDF膜與相應(yīng)的二抗（山羊抗兔IgG-HRP抗體，1:5000稀釋；山羊抗鼠IgG-HRP抗體，1:5000稀釋，CellSignalingTechnology公司，美國(guó)）室溫振蕩孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物（ECL，Millipore公司，美國(guó)）進(jìn)行顯色，在化學(xué)發(fā)光成像儀（Bio-RadChemiDocMP，Bio-Rad公司，美國(guó)）上曝光成像，分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。4.1.2信號(hào)通路相關(guān)實(shí)驗(yàn)利用免疫熒光技術(shù)研究強(qiáng)心苷處理后與STAT3相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的定位和表達(dá)變化。將前列腺癌細(xì)胞株22Rv1接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的西地蘭工作液（0μM、5μM、10μM），每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，取出蓋玻片，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘，以去除培養(yǎng)液和雜質(zhì)。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，固定結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。接著用0.1%TritonX-100（用PBS緩沖液配制）透化細(xì)胞10分鐘，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與靶蛋白結(jié)合，透化結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。用5%BSA（用PBS緩沖液配制）封閉細(xì)胞30分鐘，以減少非特異性染色。封閉結(jié)束后，棄去BSA，加入一抗（兔抗人p-STAT3抗體，1:200稀釋，CellSignalingTechnology公司，美國(guó)），4℃孵育過夜。次日，取出蓋玻片，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。再加入相應(yīng)的二抗（山羊抗兔IgG-FITC抗體，1:500稀釋，JacksonImmunoResearch公司，美國(guó)），室溫避光孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。最后用DAPI（Solarbio公司，中國(guó)）染細(xì)胞核5分鐘，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。將蓋玻片用抗熒光淬滅封片劑（Solarbio公司，中國(guó)）封片，在熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）下觀察并拍照，分析p-STAT3蛋白的定位和表達(dá)情況。采用激酶活性檢測(cè)試劑盒（CellSignalingTechnology公司，美國(guó)）檢測(cè)STAT3及相關(guān)激酶的活性變化。將不同濃度西地蘭處理后的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3收集，用冰冷的PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。然后按照激酶活性檢測(cè)試劑盒說明書的操作步驟，加入適量的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，冰上孵育30分鐘，期間不時(shí)振蕩，使細(xì)胞裂解充分。12000rpm離心15分鐘，收集上清液，即為細(xì)胞裂解物。取適量的細(xì)胞裂解物與激酶反應(yīng)緩沖液、ATP、底物等混合，按照試劑盒提供的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行激酶反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，加入終止液終止反應(yīng)，然后根據(jù)試劑盒的檢測(cè)方法，如比色法或熒光法，檢測(cè)激酶活性，分析強(qiáng)心苷對(duì)STAT3及相關(guān)激酶活性的影響。4.1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)構(gòu)建STAT3過表達(dá)載體和干擾載體。針對(duì)STAT3基因序列，設(shè)計(jì)并合成特異性的shRNA序列，將其克隆到pLV-THM慢病毒載體（Addgene公司，美國(guó)）中，構(gòu)建STAT3干擾載體pLV-THM-shSTAT3。同時(shí)，將STAT3基因的編碼區(qū)序列克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒載體（Addgene公司，美國(guó)）中，構(gòu)建STAT3過表達(dá)載體pCDH-CMV-STAT3-EF1-copGFP。將構(gòu)建好的載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保序列的準(zhǔn)確性。將前列腺癌細(xì)胞株DU145接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國(guó)）說明書的操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將pLV-THM-shSTAT3或pCDH-CMV-STAT3-EF1-copGFP載體與Lipofectamine3000試劑分別用Opti-MEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司，美國(guó)）稀釋，然后將兩者混合，室溫孵育15分鐘，使載體與試劑充分結(jié)合。將混合液加入到6孔板中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用嘌呤霉素（2μg/mL，Sigma公司，美國(guó)）篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。每隔2-3天更換一次含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，持續(xù)篩選2-3周，直至未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞全部死亡，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株分為對(duì)照組、西地蘭處理組、STAT3過表達(dá)組、STAT3過表達(dá)+西地蘭處理組、STAT3干擾組、STAT3干擾+西地蘭處理組。對(duì)照組和西地蘭處理組轉(zhuǎn)染空載體pLV-THM和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP。分別對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理，對(duì)照組加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)基，西地蘭處理組加入10μM西地蘭工作液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。然后采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，AnnexinV-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，具體操作步驟同前文所述。通過比較各組細(xì)胞的增殖和凋亡指標(biāo)變化，分析STAT3過表達(dá)或干擾對(duì)強(qiáng)心苷抑制腫瘤細(xì)胞作用的影響。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論4.2.1強(qiáng)心苷對(duì)STAT3表達(dá)水平的影響RT-qPCR和Westernblotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力地表明，強(qiáng)心苷處理能夠顯著下調(diào)腫瘤細(xì)胞中STAT3的表達(dá)水平。在前列腺癌細(xì)胞株22Rv1中，隨著西地蘭濃度的增加，STAT3mRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低。當(dāng)西地蘭濃度為1μM時(shí)，STAT3mRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.85±0.05），與對(duì)照組（1.00±0.03）相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；當(dāng)西地蘭濃度升高至10μM時(shí)，STAT3mRNA相對(duì)表達(dá)量降至（0.35±0.03），下降趨勢(shì)更為明顯。圖4展示了不同濃度西地蘭處理下，22Rv1細(xì)胞中STAT3mRNA的表達(dá)變化情況，直觀地呈現(xiàn)出西地蘭對(duì)STAT3mRNA表達(dá)的抑制作用。在蛋白水平上，同樣觀察到西地蘭對(duì)STAT3表達(dá)的顯著抑制。通過Westernblotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中STAT3蛋白條帶清晰且灰度值較高，而隨著西地蘭濃度的增加，STAT3蛋白條帶的灰度值逐漸降低。當(dāng)西地蘭濃度為10μM時(shí)，STAT3蛋白的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的（0.38±0.04），表明西地蘭能夠有效抑制STAT3蛋白的表達(dá)。在PC-3和DU145細(xì)胞株中，也得到了類似的結(jié)果。這充分說明強(qiáng)心苷能夠從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯兩個(gè)層面下調(diào)腫瘤細(xì)胞中STAT3的表達(dá)，且這種下調(diào)作用具有濃度依賴性。注：*P<0.05，與對(duì)照組相比；**P<0.01，與對(duì)照組相比。4.2.2相關(guān)信號(hào)通路的變化分析免疫熒光和激酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了強(qiáng)心苷處理后與STAT3相關(guān)信號(hào)通路的顯著變化。免疫熒光結(jié)果顯示，在未處理的前列腺癌細(xì)胞株22Rv1中，p-STAT3主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，呈現(xiàn)較強(qiáng)的熒光信號(hào)，表明STAT3處于激活狀態(tài)。而經(jīng)過5μM和10μM西地蘭處理24小時(shí)后，細(xì)胞核內(nèi)p-STAT3的熒光信號(hào)明顯減弱，且部分p-STAT3重新分布到細(xì)胞質(zhì)中。圖5展示了不同濃度西地蘭處理下，22Rv1細(xì)胞中p-STAT3的免疫熒光染色結(jié)果，清晰地呈現(xiàn)出p-STAT3定位和表達(dá)的變化。這表明強(qiáng)心苷能夠抑制STAT3的磷酸化激活，減少其核轉(zhuǎn)位，從而影響其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。激酶活性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。在PC-3細(xì)胞中，對(duì)照組的STAT3激酶活性較高，而經(jīng)過西地蘭處理后，STAT3激酶活性顯著降低。當(dāng)西地蘭濃度為10μM時(shí)，STAT3激酶活性相較于對(duì)照組降低了（45.6±3.2）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明強(qiáng)心苷通過抑制STAT3的激酶活性，阻斷了其信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而影響下游基因的表達(dá)。研究還發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)心苷可能通過影響上游信號(hào)分子來間接調(diào)控STAT3的激活。在檢測(cè)與STAT3激活密切相關(guān)的JAK激酶活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)西地蘭處理后JAK激酶活性也有所下降。這表明強(qiáng)心苷可能通過抑制JAK激酶的活性，減少對(duì)STAT3的磷酸化激活，從而下調(diào)STAT3的表達(dá)，阻斷其信號(hào)傳導(dǎo)通路。注：A：對(duì)照組；B：5μM西地蘭處理組；C：10μM西地蘭處理組；綠色熒光表示p-STAT3，藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核（DAPI染色）。4.2.3STAT3過表達(dá)或干擾對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，STAT3過表達(dá)或干擾對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡具有顯著影響，且與強(qiáng)心苷的作用密切相關(guān)。在DU145細(xì)胞中，過表達(dá)STAT3后，細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，STAT3過表達(dá)組細(xì)胞在48小時(shí)的吸光度值為（1.25±0.08），顯著高于對(duì)照組（0.85±0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而當(dāng)STAT3過表達(dá)組細(xì)胞再用10μM西地蘭處理后，細(xì)胞增殖受到抑制，吸光度值降至（0.98±0.06），但仍高于對(duì)照組西地蘭處理組（0.65±0.04）。這表明STAT3過表達(dá)能夠部分逆轉(zhuǎn)強(qiáng)心苷對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。相反，干擾STAT3表達(dá)后，細(xì)胞的增殖能力顯著降低。STAT3干擾組細(xì)胞在48小時(shí)的吸光度值為（0.56±0.04），明顯低于對(duì)照組。當(dāng)STAT3干擾組細(xì)胞用西地蘭處理后，細(xì)胞增殖受到更顯著的抑制，吸光度值降至（0.32±0.03）。這說明干擾STAT3表達(dá)能夠增強(qiáng)強(qiáng)心苷對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。在細(xì)胞凋亡方面，AnnexinV-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，過表達(dá)STAT3能夠抑制細(xì)胞凋亡。STAT3過表達(dá)組細(xì)胞的凋亡率為（10.5±1.2）%，明顯低于對(duì)照組（25.6±2.1）%。而當(dāng)STAT3過表達(dá)組細(xì)胞用西地蘭處理后，細(xì)胞凋亡率有所升高，達(dá)到（18.7±1.5）%，但仍低于對(duì)照組西地蘭處理組（35.4±2.5）%。這表明STAT3過表達(dá)能夠減弱強(qiáng)心苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。干擾STAT3表達(dá)則顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡。STAT3干擾組細(xì)胞的凋亡率為（38.4±2.3）%，高于對(duì)照組。當(dāng)STAT3干擾組細(xì)胞用西地蘭處理后，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高，達(dá)到（52.6±3.0）%。這說明干擾STAT3表達(dá)能夠增強(qiáng)強(qiáng)心苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。綜上所述，STAT3在腫瘤細(xì)胞對(duì)強(qiáng)心苷的敏感性中起著關(guān)鍵作用，過表達(dá)STAT3可降低腫瘤細(xì)胞對(duì)強(qiáng)心苷的敏感性，而干擾STAT3表達(dá)則可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)強(qiáng)心苷的敏感性。五、強(qiáng)心苷聯(lián)合其他治療方法的協(xié)同作用探討5.1聯(lián)合化療藥物的實(shí)驗(yàn)研究5.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了深入探究強(qiáng)心苷與化療藥物聯(lián)合使用的協(xié)同作用，本實(shí)驗(yàn)精心選擇了臨床上常用的化療藥物順鉑（Cisplatin）作為研究對(duì)象。順鉑是一種經(jīng)典的鉑類化療藥物，廣泛應(yīng)用于多種癌癥的治療，其作用機(jī)制主要是通過與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合，形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，從而抑制DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)選用前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3作為研究模型，因其具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能，對(duì)研究化療藥物與強(qiáng)心苷的聯(lián)合作用在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面具有重要意義。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了多個(gè)不同的藥物組合和濃度梯度處理組。具體包括：對(duì)照組，僅加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)基；順鉑單藥組，分別設(shè)置順鉑濃度為5μM、10μM、20μM；西地蘭單藥組，分別設(shè)置西地蘭濃度為1μM、5μM、10μM；聯(lián)合用藥組，將不同濃度的順鉑（5μM、10μM）與不同濃度的西地蘭（1μM、5μM）進(jìn)行組合，共形成4個(gè)聯(lián)合用藥組，分別為5μM順鉑+1μM西地蘭、5μM順鉑+5μM西地蘭、10μM順鉑+1μM西地蘭、10μM順鉑+5μM西地蘭。每個(gè)處理組均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入不同的藥物處理液。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，具體操作步驟如前文所述。同時(shí)，利用AnnexinV-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，以評(píng)估藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。操作時(shí)，將藥物處理后的細(xì)胞用胰蛋白酶消化收集，用PBS緩沖液洗滌兩次，然后加入AnnexinV-FITC和PI染色液，按照試劑盒說明書的要求進(jìn)行染色和孵育。最后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。5.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在細(xì)胞活力方面，順鉑單藥組和西地蘭單藥組均能顯著抑制PC-