冷凍電鏡技術(shù)方案演講人：日期:目錄CATALOGUE技術(shù)原理基礎(chǔ)核心技術(shù)與分支原位冷凍電鏡技術(shù)制樣流程與關(guān)鍵步驟設(shè)備系統(tǒng)與創(chuàng)新進(jìn)展應(yīng)用場(chǎng)景與前沿案例01技術(shù)原理基礎(chǔ)PART超低溫冷凍與玻璃態(tài)形成冷凍保護(hù)劑應(yīng)用使用甘油、蔗糖等冷凍保護(hù)劑降低溶液冰點(diǎn)，進(jìn)一步抑制冰晶生成，保護(hù)樣品微觀結(jié)構(gòu)完整性。03在極低溫條件下（約-180℃），水分子以非晶態(tài)固態(tài)形式存在，減少對(duì)樣品結(jié)構(gòu)的干擾，提高成像清晰度。02玻璃態(tài)水形成快速冷凍技術(shù)通過液態(tài)乙烷或丙烷等冷凍劑實(shí)現(xiàn)樣品超快速冷卻，避免冰晶形成，確保生物大分子保持天然構(gòu)象。01電子束散射與三維重構(gòu)彈性散射信號(hào)采集電子束穿透樣品時(shí)，與原子核及電子云發(fā)生相互作用，通過檢測(cè)散射角度差異獲取結(jié)構(gòu)信息。投影圖像對(duì)齊基于傅里葉變換和反投影算法，將二維圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為三維密度圖，解析目標(biāo)分子的空間構(gòu)象。利用數(shù)學(xué)算法對(duì)數(shù)千張二維投影圖像進(jìn)行空間對(duì)齊和分類，消除樣品傾斜帶來的成像誤差。三維密度圖重建場(chǎng)發(fā)射電子源通過CMOS或CCD傳感器直接記錄電子信號(hào)，避免傳統(tǒng)熒光屏的光子轉(zhuǎn)換損失，實(shí)現(xiàn)亞埃級(jí)分辨率。直接電子探測(cè)器像差校正技術(shù)應(yīng)用球差校正器和色差補(bǔ)償裝置，修正電子光學(xué)系統(tǒng)的像差，確保高分辨率成像的準(zhǔn)確性。采用高亮度、低能量擴(kuò)散的場(chǎng)發(fā)射電子槍，提供相干性極強(qiáng)的電子束，提升圖像信噪比。高分辨率成像機(jī)制02核心技術(shù)與分支PART單顆粒冷凍電鏡分析適用于病毒、蛋白質(zhì)復(fù)合物、核糖體等生物大分子的結(jié)構(gòu)研究，推動(dòng)藥物設(shè)計(jì)和功能機(jī)制探索。應(yīng)用范圍擴(kuò)展包括粒子挑選、二維分類、三維重構(gòu)等步驟，依賴高性能計(jì)算和深度學(xué)習(xí)算法提升結(jié)構(gòu)解析效率。數(shù)據(jù)處理流程采用快速冷凍技術(shù)（如液態(tài)乙烷冷凍）減少冰晶形成，確保樣品在近天然狀態(tài)下保持結(jié)構(gòu)完整性。樣品制備優(yōu)化通過低溫固定生物大分子，結(jié)合電子束照射和圖像重構(gòu)算法，實(shí)現(xiàn)亞納米級(jí)分辨率的三維結(jié)構(gòu)解析。高分辨率成像冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）三維斷層成像通過傾斜樣品臺(tái)獲取多角度投影圖像，重構(gòu)細(xì)胞或組織在原生狀態(tài)下的三維超微結(jié)構(gòu)。厚樣品處理結(jié)合聚焦離子束（FIB）減薄技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞或組織切片的原位高分辨率成像。動(dòng)態(tài)過程捕捉可觀察細(xì)胞器相互作用、病原體侵染等動(dòng)態(tài)事件，彌補(bǔ)傳統(tǒng)電鏡的靜態(tài)局限性。關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)與熒光顯微鏡或X射線顯微鏡聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)多尺度結(jié)構(gòu)功能關(guān)聯(lián)分析。冷凍蝕刻復(fù)型技術(shù)表面形貌揭示通過冷凍斷裂和金屬噴鍍復(fù)型，展示生物膜、細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)的表面特征（如蛋白質(zhì)分布、膜拓?fù)洌?。高?duì)比度成像利用鉑/碳陰影增強(qiáng)樣品表面凹凸細(xì)節(jié)，適用于研究脂質(zhì)雙層、膜蛋白組裝等。快速冷凍保留避免化學(xué)固定和脫水帶來的假象，更真實(shí)反映生物樣本的原始形態(tài)?；パa(bǔ)性應(yīng)用常與冷凍電鏡或X射線晶體學(xué)結(jié)合，驗(yàn)證復(fù)雜結(jié)構(gòu)的局部構(gòu)象或相互作用界面。03原位冷凍電鏡技術(shù)PART通過高壓冷凍或噴墨冷凍實(shí)現(xiàn)毫秒級(jí)樣品固定，保留生物大分子天然構(gòu)象及瞬時(shí)相互作用狀態(tài)?？焖倮鋬黾夹g(shù)采用液氮冷卻系統(tǒng)維持樣品處于-180℃以下，避免冰晶形成對(duì)樣品超微結(jié)構(gòu)的破壞。低溫環(huán)境控制結(jié)合微流控芯片技術(shù)，可捕捉酶催化、蛋白質(zhì)折疊等動(dòng)態(tài)過程的中間態(tài)結(jié)構(gòu)。時(shí)間分辨成像低溫動(dòng)態(tài)過程捕捉配備六極/八極電磁透鏡校正系統(tǒng)，將分辨率提升至亞埃級(jí)別（<1?），顯著改善高傾轉(zhuǎn)角度成像質(zhì)量。球差校正器優(yōu)化利用Zernike相位板增強(qiáng)弱相位物體對(duì)比度，使核酸鏈、脂質(zhì)膜等低反差結(jié)構(gòu)可視化。相位板技術(shù)應(yīng)用采用自動(dòng)曝光系統(tǒng)將單幀電子劑量控制在20e?/?2以下，減少輻射損傷對(duì)生物樣本的影響。電子劑量控制像差矯正與低劑量成像人工智能算法輔助處理深度學(xué)習(xí)去噪基于U-Net架構(gòu)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型可有效分離信號(hào)與噪聲，提升低劑量圖像的信噪比（SNR>5）。利用生成對(duì)抗網(wǎng)絡(luò)（GAN）預(yù)測(cè)缺失投影角度數(shù)據(jù)，將傳統(tǒng)迭代重構(gòu)耗時(shí)縮短80%以上。通過長(zhǎng)短期記憶網(wǎng)絡(luò)（LSTM）分析時(shí)序冷凍電鏡數(shù)據(jù)，模擬蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的能量景觀。三維重構(gòu)加速動(dòng)態(tài)軌跡預(yù)測(cè)04制樣流程與關(guān)鍵步驟PART高壓冷凍與玻璃化固定高壓冷凍技術(shù)采用超高壓（約2000巴）結(jié)合液氮快速冷卻，使生物樣品中的水分形成無定形冰，避免冰晶破壞樣品超微結(jié)構(gòu)。玻璃化固定原理通過高濃度冷凍保護(hù)劑（如蔗糖或甘油）置換細(xì)胞內(nèi)水分，實(shí)現(xiàn)非晶態(tài)固化，保留蛋白質(zhì)天然構(gòu)象和細(xì)胞器形態(tài)完整性。樣品厚度控制確保樣品厚度不超過10微米，以保證冷凍速率均勻性，避免因熱傳導(dǎo)差異導(dǎo)致的冰晶偽影。在-150℃以下真空環(huán)境中機(jī)械斷裂樣品，暴露膜結(jié)構(gòu)或蛋白復(fù)合物內(nèi)部界面，用于研究跨膜蛋白分布或脂雙層結(jié)構(gòu)。冷凍斷裂/蝕刻處理斷裂面選擇通過調(diào)節(jié)真空度和溫度（-95℃至-105℃）升華表面冰層，增強(qiáng)樣品表面拓?fù)鋵?duì)比度，但需避免過度蝕刻導(dǎo)致結(jié)構(gòu)塌陷。蝕刻參數(shù)優(yōu)化斷裂后立即進(jìn)行鉑/碳噴鍍，防止樣品表面因升華或污染導(dǎo)致的分辨率下降。低溫噴鍍防護(hù)鉑碳噴鍍與復(fù)型膜制備旋轉(zhuǎn)陰影技術(shù)以45°角旋轉(zhuǎn)樣品并噴鍍2-3nm鉑層，增強(qiáng)表面凹凸結(jié)構(gòu)的拓?fù)鋵?duì)比，配合垂直方向噴鍍10-20nm碳層形成支撐膜。01復(fù)型膜剝離將噴鍍后的樣品浸入氫氟酸或次氯酸鈉溶液溶解生物材料，保留鉑碳復(fù)型膜，經(jīng)去離子水清洗后撈取至銅網(wǎng)。02電子密度校準(zhǔn)通過標(biāo)準(zhǔn)樣品（如衍射光柵）驗(yàn)證噴鍍厚度均勻性，確保電鏡成像時(shí)信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)尺寸呈線性關(guān)系。0305設(shè)備系統(tǒng)與創(chuàng)新進(jìn)展PART高分辨率成像能力采用300kV高壓電子槍設(shè)計(jì)，顯著提升穿透深度與信噪比，可實(shí)現(xiàn)原子級(jí)分辨率（≤1.5?）的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析。場(chǎng)發(fā)射電子源技術(shù)配備肖特基場(chǎng)發(fā)射電子槍，提供高亮度、低能量擴(kuò)散的電子束，確保長(zhǎng)時(shí)間成像穩(wěn)定性與數(shù)據(jù)一致性。集成式防污染系統(tǒng)配置液氮冷卻的防污染冷阱，有效減少樣品表面碳?xì)浠衔锍练e，維持成像區(qū)域的潔凈度。自動(dòng)化校準(zhǔn)模塊內(nèi)置光束對(duì)中、像散校正及光闌對(duì)焦的AI驅(qū)動(dòng)校準(zhǔn)系統(tǒng)，降低人工干預(yù)需求，提升操作效率。300kV高壓冷凍電鏡冷凍傳輸與冷臺(tái)系統(tǒng)全封閉低溫傳輸鏈支持X-Y-Z軸平移與360°旋轉(zhuǎn)，配合低熱傳導(dǎo)材料，實(shí)現(xiàn)樣品精準(zhǔn)定位且溫度波動(dòng)控制在±0.5K以內(nèi)。多軸可調(diào)冷臺(tái)設(shè)計(jì)快速更換樣品機(jī)制實(shí)時(shí)溫度監(jiān)控反饋從樣品制備到電鏡觀察全程保持液氮溫區(qū)（-196℃），避免冰晶形成或樣品脫水導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)損傷。采用磁力耦合真空鎖裝置，可在30秒內(nèi)完成樣品桿切換，顯著減少溫度回升風(fēng)險(xiǎn)與停機(jī)時(shí)間。集成高靈敏度溫度傳感器與PID控制系統(tǒng)，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)液氮流量，確保樣品臺(tái)溫度穩(wěn)定性。低劑量電子束優(yōu)化方案分級(jí)曝光策略通過預(yù)掃描確定感興趣區(qū)域（ROI），僅對(duì)目標(biāo)區(qū)域施加高劑量電子束，將全局劑量控制在10-20e?/?2范圍內(nèi)。01脈沖電子束技術(shù)采用納秒級(jí)脈沖發(fā)射模式，減少連續(xù)輻照累積損傷，同時(shí)通過時(shí)間分辨檢測(cè)器捕捉瞬時(shí)信號(hào)。自適應(yīng)光闌調(diào)節(jié)根據(jù)樣品厚度自動(dòng)調(diào)整聚光鏡光闌孔徑，平衡電子通量與散射背景，優(yōu)化襯度與分辨率。機(jī)器學(xué)習(xí)去噪算法基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）的后處理系統(tǒng)，從低劑量原始數(shù)據(jù)中提取高信噪比結(jié)構(gòu)信息，提升三維重構(gòu)精度。02030406應(yīng)用場(chǎng)景與前沿案例PART膜蛋白結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制解析高分辨率三維重構(gòu)脂質(zhì)環(huán)境模擬冷凍電鏡通過單顆粒分析技術(shù)，可解析膜蛋白在近生理狀態(tài)下的高分辨率結(jié)構(gòu)，揭示其跨膜螺旋排布及活性位點(diǎn)構(gòu)象變化。動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)過程捕捉結(jié)合時(shí)間分辨冷凍技術(shù)，可捕獲膜蛋白在轉(zhuǎn)運(yùn)底物過程中的中間態(tài)結(jié)構(gòu)，闡明其構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化與能量耦合機(jī)制。通過納米圓盤或脂質(zhì)體樣本制備，研究膜蛋白在天然脂質(zhì)雙分子層中的相互作用網(wǎng)絡(luò)及功能調(diào)控規(guī)律。病毒入侵動(dòng)態(tài)過程觀測(cè)冷凍電鏡可解析病毒刺突蛋白的預(yù)融合與融合后狀態(tài)，揭示其與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合位點(diǎn)及構(gòu)象重排路徑。病毒表面蛋白構(gòu)象解析通過冷凍電子斷層掃描技術(shù)，重構(gòu)病毒-細(xì)胞膜接觸界面的三維結(jié)構(gòu)，闡明膜融合孔形成的關(guān)鍵分子事件。入侵復(fù)合體結(jié)構(gòu)分析解析中和抗體與病毒表面蛋白的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，為疫苗設(shè)計(jì)提供精確的抗原表位信息。抗體中和機(jī)制研究納米材料結(jié)晶演